Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Мутации в гене K-RAS у больных колоректальным раком

На правах рукописи

005014908

Беляева Анна Валерьевна

МУТАЦИИ В ГЕНЕ К-КА8 У БОЛЬНЫХ

КОЛОРЕКТАЛЬНЫМ РАКОМ: ЭПИДЕМИОЛОГИЯ И КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

специальности: 14.01.12 - онкология 03.01.04 - биохимия

1 2 МДР 2012

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2012

005014908

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт онкологии имени H.H. Петрова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Ведущее научное учреждение

ГБОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Минздравсоцразвития России

Защита состоится «_13_» _марта_2012г. в 14.00 часов на заседании

диссертационного совета Д 208.052.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт онкологии имени H.H. Петрова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (197758, Санкт-Петербург, Песочный, ул. Ленинградская, д.68).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ онкологии им. Н.Н.Петрова» Минздравсоцразвития России по адресу 197758, Санкт-Петербург, Песочный, ул. Ленинградская, 68, на сайте www.niioncologii.ru и на сайте ВАК.

Автореферат разослан «_10_»_февраля_2012 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Семенов Игорь Иванович

Гуляев Алексей Викторович Имянитов Евгений Наумович

Гафтон Георгий Иванович Комов Вадим Петрович

Общая характеристика работы Актуальность проблемы

Колоректальный рак (КРР) является одним из наиболее частых онкологических заболеваний: ежегодно в мире диагностируется более 1 млн. 200 тыс. карцином толстой кишки и отмечается около 700 тыс. смертей от данной патологии [Cancer incidence..., 2007]. В США в 2010 году было зарегистрировано 142 570 новых случаев колоректального рака [Jemal A. et al., 2010]. В России аналогичный показатель в 2007 г. составил 54 738, в Санкт-Петербурге в 2008 году было выявлено 2666 заболевших КРР [«Злокачественные новообразования...», 2007; Мерабишвили В.М., 2010]. В экономически развитых странах на колоректальный рак приходится примерно 9-14% случаев онкологических заболеваний. КРР в России занимает третье ранговое место как в структуре онкологической заболеваемости (10%), так и смертности (10,6%), что практически не отличается от аналогичных показателей в США [Мерабишвили В.М., 2007; Чиссов В.И. и соавт., 2007; Jemal A. et al., 2010]. В Санкт-Петербурге, начиная с 2005 г., смертность от КРР у женщин заняла первое место, обогнав смертность от рака молочной железы, и составила 19% в структуре онкологической смертности в 2007 г. [Мерабишвили В.М., 2007, 2008].

Частота возникновения КРР характеризуется большими географическими колебаниями. Так, в государствах Юго-Восточной Азии КРР выявляется примерно в 10-20 реже, чем в странах Европы, США, Японии. При этом в последние годы повсеместно отмечается тенденция к росту заболеваемости и смертности от КРР.

В настоящее время доказано, что основным механизмом развития злокачественных опухолей, в том числе и рака толстой кишки, являются соматические генетические повреждения. Одним из наиболее значимых событий в молекулярном патогенезе КРР является активирующая мутация в онкогене K-ras. Уже в конце 80-х годов XX века были начаты работы по систематическому исследованию статуса генов семейства ras в опухолях у человека, и было обнаружено, что мутации в гене K-ras выявляются почти в половине случаев КРР [Vogelstein В. et al., 1988]. В 1990 г. Fearon и Vogelstein предложили генетическую модель последовательной трансформации аденомы толстой кишки в аденокарциному, согласно которой мутация в гене K-ras, запуская постоянное деление клеток, приводит к переходу ранней аденомы в аденому с выраженной дисплазией. В последующие годы эта модель была подтверждена многими экспериментальными работами и в настоящее время считается классической [Fearon Е., Vogelstein В., 1990].

В последующие годы в разных странах проводились исследования частоты мутации в гене K-ras и анализ ее взаимосвязи с клиническим течением КРР. В частности, было достоверно установлено, что опухоли с мутацией K-ras практически не отвечают на терапию ингибиторами рецептора эпидермального фактора роста (epidermal growth factor receptor, EGFR) [Van Cutsem E. et al.,

2008]. Являясь частью сигнального каскада, продукт гена K-ras - белок K-ras -передает сигнал к делению клетки, поступающий с EGFR. Мутированный К-ras находится в состоянии постоянной активации вне зависимости от статуса EGFR, поэтому инактивация данного рецептора в опухолях с мутацией не сопровождается терапевтическим эффектом.

Встречаемость мутации K-ras в опухолях толстой кишки, по данным различных авторов, колеблется от 30 до 50% [Andreyev Н. et al., 1998, Brink М. et al., 2003, Hsieh J.S. et al., 2005, Kaji E. et al., 2011]. Вариации в частоте мутаций K-ras принято объяснять популяционными различиями в образе жизни и характера питания в различных регионах мира [Мартынюк В.В., 2000]. Влияние пола и возраста на статус гена K-ras при КРР остается предметом для дискуссий [Breivik J. et al., 1994, Arber N. et al., 2000, Krtolica K. et al., 2007, Yuan Y. et al., 2010]. Имеются отдельные указания на связь мутации гена K-ras с курением [Diergaarde В., 2003], однако эти наблюдения также требуют подтверждающих исследований. Исследуется взаимосвязь мутаций в гене с такими клинико-морфологическими параметрами КРР, как локализация и гистологическое строение опухоли [Schimanski С. et al., 1999, Frattini М. et al., 2004, Lbchtenborg M. et al., 2005]. Сведения о прогностической значимости статуса гена K-ras характеризуются значительными противоречиями [Conlin A. et al., 2005; Roth A.D. et al., 2009].

Цель настоящего исследования - изучение частоты, спектра и клинического значения мутаций в гене K-ras в аденокарциномах толстой кишки.

Задачи исследования:

1. Изучить частоту и спектр мутаций в гене K-ras в опухолях толстой кишки у больных КРР.

2. Сопоставить распределение мутаций с антропометрическими данными пациентов.

3. Изучить влияние экзогенных интоксикаций (курения и профессиональных вредностей) на статус гена K-ras в опухолях у больных КРР.

4. Изучить частоту мутаций в гене K-ras в опухолях различных отделов толстой кишки.

5. Проанализировать взаимосвязь мутаций в гене K-ras с клинико-морфологическими параметрами и степенью распространения опухолевого процесса.

6. Изучить влияние мутаций в гене K-ras на отдаленные результаты лечения больных КРР.

Положения, выносимые на защиту

1. Более чем в трети аденокарцином толстой кишки выявляются мутации в гене К-га8.

2. Наблюдается связь мутаций в гене К-гав с полом и возрастом больных КРР.

3. Курение влияет на возникновение мутаций в 13 кодоне гена К-гая.

4. Частота и спектр мутаций в гене К-гав варьирует в опухолях, развивающихся в различных отделах толстой кишки.

5. У больных КРР с мутациями в гене К-гав чаще обнаруживаются метастазы в регионарных лимфатических узлах.

Научная новизна

• Впервые в России на большом клиническом материале (207 больных КРР) установлена частота мутаций в гене К-гаэ при КРР.

• Впервые обнаружено влияние курения и профессиональных вредностей на частоту мутации в кодоне 13 гена К-гав.

• Впервые обнаружено преобладание мутаций в кодоне 13 у больных с локализацией опухоли в дистальных отделах толстой кишки (сигмовидной и прямой).

• Впервые обнаружено благоприятное влияние мутаций в гене К-га$ на отдаленные результаты лечения больных с низкодифференцированным раком толстой кишки.

• Впервые обнаружено, что у больных КРР с К-гав мутациями частота регионарных метастазов выше по сравнению с больными с диким типом гена К-гаэ.

Научная и практическая значимость

Полученные данные о достаточно высокой частоте мутаций К-гав при КРР (около 40%) и корреляции К-гав мутаций с некоторыми клииико-морфологическими параметрами позволяют выдвинуть гипотезу о существовании, по крайней мере, двух вариантов патогенеза заболевания, имеющих различное клиническое течение. Следовательно, определение К-гав мутаций можно использовать как в качестве предиктивного маркера для определения чувствительности к терапии антителами к ЕОРН, так и в качестве прогностического маркера. При этом значение этого показателя будет

зависеть от его сочетания с другими клинико-морфологическими параметрами.

Обнаруженное влияние курения и профессиональных вредностей на частоту мутации в кодоне 13 гена K-ras позволяет предполагать чувствительность именно кодона 13 к токсическим воздействиям, что расширяет наши представления о молекулярных механизмах воздействия хронических интоксикаций, что требует дальнейшего изучения. В этом плане обнаруженное преобладание мутаций в кодоне 13 у больных раком сигмовидной и прямой кишки позволяет предположить, что в этиопатогенезе этих локализаций КРР определенное место занимает хроническая интоксикация.

Внедрение в практику

Результаты работы были внедрены и применяются при обследовании и лечении больных КРР в ФГБУ «НИИ онкологии им. проф. H.H. Петрова» Минздравсоцразвития России.

Структура диссертации:

диссертация изложена на 150 страницах и состоит из введения, обзора литературы, трех глав собственных исследований, выводов и практических рекомендаций. Текст иллюстрирован 22 таблицами, 47 рисунками. Указатель литературы содержит 146 названий работ отечественных и зарубежных авторов.

Апробация работы:

материалы диссертации были доложены на конференции молодых ученых ФГБУ «НИИ онкологии им. проф. H.H. Петрова» Минздравсоцразвития России (Санкт-Петербург, март 2011), конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения - 2011» (Санкт-Петербург, апрель 2011), конференции «Современные принципы диагностики и лечения колоректального рака» (Москва, май 2011), XI Всероссийской конференции молодых ученых «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Москва, ноябрь 2011).

Содержание работы Материалы и методы исследования

Для решения поставленных в ходе работы задач было проведено ретроспективное исследование частоты мутаций в гене K-ras у больных КРР. На первом этапе исследования были проанализированы клшшко-лабораторные данные о 317 больных КРР, находившихся на лечении в клинике НИИ онкологии им. H.H. Петрова в 2005-2006 гг. При анализе гистологических заключений диагноз «аденокарцшюма толстой кишки» был подтвержден у 262 больных. Доступными для исследования в архиве лаборатории

патоморфологии оказались 212 опухолевых образцов, залитых в парафиновые блоки, от 207 больных. Сведения, полученные из историй болезни и амбулаторных карт, заносились в специально разработанные для этого исследования анкеты. В дальнейшем из собранного материала были созданы базы данных по различным параметрам исследования. Всего в исследовании анализировалось 17 параметров, характеризующих организм больного и опухолевый процесс. Для оценки влияния различных параметров было создано 19 баз данных, которые далее обрабатывались с применением математических методов статистики. Среди параметров, характеризующих организм больного, изучались следующие: пол, возраст, вес, индекс массы тела, наследственность, курение, наличие профессиональных и иных вредностей, наличие других доброкачественных и злокачественных опухолей, вид и объем полученного лечения. Среди параметров, характеризующих опухолевый процесс, анализировались стадия заболевания по системе TNM, глубина инвазии, наличие регионарных и отдаленных метастазов, локализация, дифференцировка и гистологический тип опухоли.

Для изучения мутаций в гене K-ras были использованы клинические данные и биологические образцы от 207 больных КРР. 212 опухолевых образцов были представлены в 196 случаях первичной опухолью, в 11 случаях - материалом из метастатического очага, в 5 - из рецидивного. При этом у троих больных удалось исследовать образцы и первичной опухоли, и отдаленных метастазов, а у одной больной - образцы местного рецидива первичной опухоли и образцы метахронной опухоли толстой кишки.

На основании клинических данных и гистологического исследования операционного материала были рестадированы 199 больных согласно 7-му изданию классификации TNM (AJCC Cancer Staging Handbook. Seventh Edition, 2010). Распределение больных по стадиям заболевания оказалось следующим: у 5 (2.5%) больных был установлен диагноз рака in situ (стадия 0), у 31 (15.6%) - стадия I, у 68 (34.2%) - стадия II, у 46 (23.1%) - стадия III и у 49 (24.6%) - стадия IV. Гистологический тип и степень дифференцировки опухоли определялась в соответствии с классификацией ВОЗ (Pathology and Genetics of Tumours of the Digestive System, 2000).

Больные были прослежены в сроки от 53 до 77 месяцев. Отдаленные результаты удалось проследить у 152 больных. Информация об исходе заболевания и наличии рецидива была получена с помощью телефонных контактов с пациентами и их родственниками, путем анализа данных амбулаторных карт и, в случае повторных госпитализаций пациентов, историй болезни. Данные об исходе заболевания для пациентов - жителей Санкт-Петербурга, связь с которыми не удалось установить, были получены из базы данных Популяционного ракового регистра Санкт-Петербурга (руководитель -д.м.н., проф. В.М. Мерабишвили).

Срезы с парафиновых блоков толщиной 15 мкм наносились на предметные стекла и подвергались гистологическому исследованию на наличие опухолевой ткани. Под контролем световой микроскопии определялись

участки, содержащие более 40% опухолевых клеток. Исследованный микропрепарат сопоставлялся с парафиновым блоком. С участка парафинового блока, соответствующего наибольшему количеству опухолевых клеток, по данным исследования микропрепарата, выполнялась стереотаксическая микродиссекция. Из полученного материала выделяли ДНК.

Методика определения статуса гена K-ras

• Выделение ДНК

Срезы опухолевой ткани депарафинизировались в двух сменах ксилола по 5 минут. Затем образцы промывались в двух сменах 96% этанола по 2 минуты. После тщательного удаления этанола к тканям добавлялись лизирующий буфер (10 ммоль Tris-HCl (рН=8.0), 0.1 ммоль ЭДТА; рН=8.0, 2% натрия додецилсульфат) и протеиназа К (20 мг/мл). Инкубация образцов проводилась при 60°С в течение 8-16 часов до полного лизиса тканей. Далее осуществлялась фенол-хлороформная экстракция. К лизату добавлялся однократный объем нейтрального фенола и 0,3 объема смеси хлороформ-изоаминовый спирт (24:1). После интенсивного десятиминутного встряхивания пробы центрифугировались при 15000 g в течение 20 минут. Затем надосадочная жидкость (супернатант) отбиралась в чистые пробирки, в которые добавляли 0,1 объема ЗМ ацетата Na (рН=4.0), 0,3 объема хлороформа. После интенсивного встряхивания образцы центрифугировались при 15000g в течение 20 минут. Супернатант отбирался в чистые эппендорфы. К пробам добавлялся раствор гликогена (20 мг/мл) в качестве ко-осадителя и 1 объем холодного изопропанола. Пробы выдерживались при температуре -20°С в течение не менее трех часов. Затем пробирки центрифугировались при 15000 g в течение 30 минут. Изопропанол удалялся, а полученный осадок однократно промывался в 70% этаноле в течение 10 минут. После тщательного удаления этанола осадок подсушивался в термостате при 40°С, а затем растворялся в 30 мкл стерильной воды при 65°С в течение 10 мину т. Раствор ДНК хранился при -20°С до использования в полимеразной цепной реакции (ПЦР).

• ПЦР

Праймеры для ПЦР-амплификации фрагментов, включающих кодоны 12, 13, 61 и 146 гена K-ras, приведены в таблице. ПЦР-амплификация проводилась в конечном объеме 20 мкл. В состав реакционной смеси входили: 1 мкл раствора ДНК; 0,5 единиц ДНК-полимеразы; однократный ПЦР буфер (pH 8.3); 2,5 мМ MgC12; по 200 мкМ каждого из четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов (dATP, dCTP, dGTP, dTTP); 0,3 мкМ прямого и обратного праймеров; интеркалирующий краситель Eva Green I (20Х раствор).

Таблица 1

Праймеры, использованные для детекции мутаций в гене K-ras

Вид мутации Последовательность нуклеотидов Размер фрагмента (число нуклеотидных последовательностей)

KRAS1F AATGACTGAATATAAACTTGTG G 122

KRAS1R CAAGATTTACCTCTATTGTTGG

M13-KRASc61F TGTAAAACGACGGCCAGTACCT GTCTCTTGGATATTCTC 106

M13-KRASc61R AGCGGATAACAATTTCACACAG GTACTGGTCCCTCATTGCAC

KRAScl46F GTAGACACAAAACAGGCTCAG 102

KRAScl46R TGTATTTATTTCAGTGTTACTTAC

Реакция начиналась с фазы активации Taq-полимеразы при температуре 95°С в течение 10 минут. Последующие 40 - 45 циклов ПЦР состояли из фаз денатурации (при температуре 95°С в течение 15 секунд), отжига (при температуре 60°С в течение 30 секунд) и элонгации (при температуре 72°С в течение 60 секунд). Продукт ПЦР анализировался посредством высокоточного анализа кинетики плавления (high-resolution melting, HRM) на приборах CFX96 (Bio-Rad, USA) или RotorGene 6000 (Corbett Research, Australia) с шагом повышения температуры каждую секунду на 0,1° в интервале с 72°С до 92°С. При выявлении отличий кривой плавления от контрольных образцов дикого типа продукт реакции подвергался секвенированию.

• Секвенирование ДНК

Очистку ПЦР-продукта проводили с использованием наборов PCR-Clean-up kit (Axygen, USA). Очищенный амплификат добавляли в сиквенсную реакцию в количестве 5 мкл, смесь для реакции также включала 3 мкл DTCS mix (Beckman Coulter, USA), 1 мкл прямого праймера 5'-TCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAA-3' (до конечной концентрации 2 пкмоль) и стерильную воду до конечного объема 20 мкл. Секвенирование проводилось с помощью набора GenomeLab DTCS Quick Start Kit (Beckman

Coulter, USA) согласно рекомендациям производителя. Продукт реакци секвенирования после преципитации этанолом разбавлялся в 40 мл SLS (Sampl Loading Solution, Beckman Coulter, USA) и подвергался капиллярном электрофорезу в системе генетического анализа CEQ 8000 (Beckman Coulte USA).

Методы статистической обработки результатов исследования

В исследовании использовались пакеты прикладных программ: Statistica for Windows 8.0- для статистического анализа, MS Office 2007 - для организации и формирования матрицы данных, а также построения графиков и диаграмм.

В ходе исследования применялись различные процедуры и методы статистического анализа. Для оценки количественных показателей производились: определение числовых характеристик переменных; оценка соответствия эмпирического закона распределения количественных переменных теоретическому закону нормального распределения по критерию Шапиро-Уилка; оценка значимости различий количественных показателей в независимых выборках по U-критерию Манна-Уитни (Mann-Whitney U Test); оценка значимости различий количественных показателей в связанных выборках по критерию Вилкоксона (Wilcoxon Matched Pairs Test). Для проверки гипотезы о происхождении групп, сформированных по качественному признаку, из одной и той же популяции, проводилась оценка на основе построения таблиц сопряжённости наблюдаемых и ожидаемых частот; применялся критерий Хи-квадрат Пирсона (Pearson Chi-square), при его неустойчивости использовался двусторонний точный тест Фишера (Fisher exact test). Оценка степени влияния качественного фактора на дисперсию количественных показателей проводилась с использованием дисперсионного рангового метода ANOVA Kruskal-Wallis H-test. Для оценки силы и направления связи между количественными показателями с использованием коэффициента корреляции Пирсона R. Для переменных, распределение которых достоверно отличалось от закона нормального распределения, использовался коэффициента корреляции Спирмена. Анализ показателей выживаемости пациентов и возникновения прогрессии заболевания в одной и в нескольких группах, а также оценку влияния факторов на выживаемость больных осуществляли с помощью таблиц времени жизни, метода Каплана-Мейера, регрессионной модели пропорциональных рисков Кокса и дискриминантного анализа [Реброва О.Ю., 2003; Юнкеров В.И. и соавт., 2005; Мерабишвили В.М., 2010].

Результаты и обсуждение

При исследовании 212 образцов опухолей (196 - первичных, 5 -рецидивных, 11 - метастатических) от 207 больных было обнаружено 82 мутации в гене K-ras. У 77 больных выявлено по одной мутации в образце опухоли. У одной больной, как в первичной опухоли, так и в удаленном синхронном одиночном метастазе из легкого выявлена идентичная мутация в

кодоне12. При проведении дальнейшего анализа с целью более точной обработки данных было решено учитывать отдельно мутацию в первичной опухоли при анализе первичных опухолей, а мутацию в отдаленном метастазе - отдельно при анализе только материала из метастазов. Лишь у одной больной были обнаружены сразу два вида K-ras мутации - в кодоне 12 и кодоне 146. У данной больной был первично-множественный метахронный рак толстой кишки, в клинику она поступила с рецидивом в зоне анастомоза спустя 2 года после правосторонней гемиколэктомии и метахронной опухолью сигмовидной кишки. При этом в опухоли сигмовидной кишки было обнаружено сразу две мутации в гене K-ras - в кодонах 12 и 146, а в местном рецидиве опухоли слепой кишки также выявлена мутация в кодоне 12 гена К-ras.

Таким образом, всего из 207 больных мутации в гене K-ras были выявлены в опухолях толстой кишки у 79 пациентов, частота обнаружения мутаций в гене K-ras в опухолях у исследованных больных КРР составила 38,2%. Полученные нами данные, с одной стороны, соответствуют данным, полученным в крупных мультицентровых исследованиях о том, что мутация в гене K-ras обнаруживается примерно у трети больных раком толстой кишки [Andreyev H.J. et al., 1998; Andreyev H.J. et al., 2001]. С другой стороны, учитывая возможные географические колебания генетических мутаций, отражающие диетические и другие особенности исследуемой популяции, которые наблюдаются при эпидемиологических исследованиях, полученная нами частота в 38,2% вполне может соответствовать выявляемой частоте мутаций в популяции Северо-Западного региона России.

Из 196 образцов первичных опухолей мутации в гене K-ras были обнаружены в 72 образцах (36,7%). Из пяти образцов рецидивных опухолей в двух были обнаружены мутации в гене K-ras (40,0%), причем обе обнаруженные мутации были выявлены в рецидивных опухолях в зоне межкишечного анастомоза. 8 мутаций были обнаружены в 11 образцах из отдаленных метастазов (72,7%). Одновременное исследование образцов первичной опухоли и синхронных либо метахронных отдаленных метастазов были произведено у трех больных. При этом у одной больной мутация в гене K-ras была обнаружена как в первичной опухоли, так и в отдаленном метастазе.

Из выявленных 82 мутаций наиболее часто мутации в гене K-ras обнаруживались в кодоне 12-51 мутация (62,2%). В два раза реже мутации выявлялись в кодоне 13 - в 23 образцах (28,0%). Мутации в кодонах 61 и 146 были достаточно редким событием и встречались с одинаковой частотой (по 4,9% каждый). Также были проанализированы виды мутаций в каждом из исследованных кодонов (табл.2).

Таблица 2

Спектр обнаруженных соматических мутаций в гене К-гая

Кодон Вид замены Количество замен

Нуклеотидная аминокислотная N %

12 ОС глицин—»аланин 3/212 1,4

ОТ глицин—»валин 17/212 8,0

от глицин—»цистеин 11/212 5,2

Э>А глицин—»аспартат 18/212 8,5

0>А глицин—»серин 2/212 0,9

13 ОА глицин—»цистеин 1/212 0,5

ОА глицин—»аспартат 22/212 10,4

61 0>С глицин—»гистидин 2/212 0,9

А>Т глицин—»лейцин 2/212 0,9

146 С>Т аланин—»валин 1/212 0,5

ОА аланин—»тирозин 2/212 0,9

ОТ аланин—»серии 1/212 0,5

Связь мутации в гене К-гав с полом, возрастом и семейным онкологическим анамнезом

Мутации в гене К-гав были обнаружены у 49 из 115 женщин и у 30 из 92 мужчин. Частота мутаций среди женщин составила 42,6%, среди мужчин -32,6% (р=0,08). У женщин 35 мутаций было выявлено в кодоне12, что составило 30,4% от общего числа женщин, 11 мутаций - в кодоне 13 (9,6%), одна мутация - в кодоне 61 (0,9%), 2 мутации в кодоне 146 (1,7%). У мужчин мутации в кодоне 12 были выявлены в 14 случаях, мутаций в кодоне 13 - у 12 мужчин, в кодоне 61 - у трех мужчин, мутация в кодоне 146 была выявлена только у одного мужчины (15,2%, 13,0%, 3,3% и 1,1% от общего числа мужчин, соответственно). Таким образом, частота мутаций в кодоне 12 у женщин вдвое превышала аналогичный показатель у мужчин (30,4% и

15,2%, соответственно, р<0,01). Частота мутаций в других кодонах среди женщин и мужчин была сопоставима.

Средний возраст всех больных, вошедших в наше исследование, составил 63,3± 11,1 лет. Средний возраст больных с мутацией в гене К-гах и без мутации существенно не отличался и составлял 62,7±10,9 лет и 64,1 ±11,4 лет, соответственно, р=0.39. Тем не менее, частота мутаций в различных возрастных группах несколько варьировала (рис. 1).

40,5%

29,7% 32,4%

22,2%

80% 70% 60%

>х 1

га 50% я 40%

н

0

§ 30%

1

20% 10% 0

¿ЗЭлет 40-49 лет 50-59лет 60-б9лет 70-79лет 580лет возраст больных

Рис. 1. Частота мутации в гене К-гав у больных разных возрастных групп

Максимальная частота мутаций наблюдалась среди больных старше 80 лет (у пяти из шести больных). Также довольно высокая частота мутации отмечена среди больных моложе 40 лет: у 4 из 7 больных. У больных старше 40 и моложе 80 лет мутация в гене К-гав была выявлена у 70 из 194 больных (36,1%), т.е. примерно у трети больных данного возраста. Однако, учитывая небольшое число наблюдений больных моложе 40 и старше 80 лет, не получено статистически значимых различий в частоте мутаций в гене К-газ у больных разных возрастных групп.

Случаи опухолевых заболеваний у родственников были выявлены у 77 из 207 больных (37,2%); мутации в гене К-гая были выявлены у 26 пациентов из этой категории (33,8%). У больных с неотягощенным семейным онкологическим анамнезом мутации в опухоли определялись чаще - у 53 из 130 больных (40,8%), однако достоверных различий выявить не удалось (р>0,05). Отсутствие достоверных различий у больных с разным семейным анамнезом может свидетельствовать о том, что мутация в гене К-гая не

связана с наследственным характером злокачественных опухолей и ее возникновение определяется другими факторами патогенеза.

Связь частоты мутации в гене К-гаБ с воздействием экзогенных канцерогенов

Связи мутаций в гене К-гав с курением посвящены единичные работы, и лишь одна из них подтверждает связь мутаций гена К-гав с курением [В1е^аагс1е В., 2003]. При анализе связи этих параметров были использованы данные о курении в анамнезе, отмеченные в первичной медицинской документации у 205 из 207 исследованных больных. Из них продолжали курить или курили в прошлом 48 человек (23,4%), некурящих было 157 человек (76,6%). Мутации в гене К-гах были обнаружены у 17 курящих и 62 некурящих больных (35,4% и 39,5%, соответственно). Из 79 больных с мутацией курильщики составляли 21,5%. Доля курильщиков среди больных с диким типом гена была сопоставима и составляла 24,6%.

Был также проанализирован спектр мутаций в гене К-гая у курящих больных в сравнении с некурящими (табл. 3).

Таблица 3

Спектр мутаций в гене К-гая у курящих и некурящих больных КРР

Курящие Некурящие Всего

Локализация мутации п % N % п %

12 кодон 5 29,4 44 71,0 49 62,0

13 кодон 10 58,8 13 21,0 23 28,4

61 кодон 1 5,9 3 4,8 4 4,9

146 кодон 1 5,9 2 3,2 3 4,9

Всего 17 100,0 62 59,3 79 100,0

При этом было выявлено, что частота мутации в кодоне 12 вдвое меньше у курящих больных по сравнению с общей группой больных и почти втрое меньше по сравнению с группой некурящих. В то же время частота мутаций в кодоне 13 вдвое больше частоты мутации у больных общей группы и почти втрое больше, чем у некурящих больных (р=0,02, рис. 2).

Несмотря на то, что курильщики составляют менее четверти от всех больных КРР, в опухолях у курильщиков было выявлено 10 из 23 мутаций в 13 кодоне (43,5%). Это дает основания предполагать, что табакокурение является одной из основных причин мутаций именно в 13 кодоне гена К-гаБ.

1,2

0,8

га н О

Й 0,6

га у

0,4 0,2 0

64,6%

2,1% 2,1%

20,8% 10,4%

■ дикий тип

60,5% 61,8% ■ 146 кодон

* 61кодон

1,39 0 1,49 £ ■ 13 кодон

8,3% 1,99 11,1% ■ 12 кодон

28,0% 23,7%

курящие

некурящие

все больные

Рис. 2. Частота различных мутаций в гене К-га* у курящих и некурящих больных в сравнении с общей группой больных

Данные о наличии или отсутствии профессиональных либо других вредностей удалось найти в медицинской документации 206 больных. Данные о каких либо видах вредности были обнаружены у 32 больных (15,5%). Основными видами вредностей были контакты с химическими реагентами - у 11 больных из 32 (34,4%), воздействие ионизирующего излучения - у 8 больных (25,0%), воздействие сверхвысоких частот - у пяти больных (15,6%), контакт с пылью - у трех больных (9,4%) и воздействие высоких температур -у двух больных (6,3%). Еще у трех больных (9,4%) вид вредности указан не был.

У 32 больных с указанием на вредность в анамнезе было выявлено 14 мутаций в гене К-гав, что составило 43,8%. У 174 больных без указания на вредность мутация была выявлена у 65 больных, что составило 37,4%. Достоверных различий в частоте мутации в гене К-гав между группами больных с указанием на вредность и без него получено не было (р>0,05).

У больных с указанием на вредность среди выявленных мутаций в гене К-га8 было 7 мутаций в кодоне 12 и 7 мутаций - в кодоне 13, что составило по 21,9% от общего числа больных, подвергавшихся вредным воздействиям. Мутаций в кодонах 61 и 146 в этой группе больных выявлено не было. У

больных, не имевших контакт с потенциально вредными агентами, было выявлено 42 мутации в кодоне 12, 16 мутаций в кодоне 13, 4 мутации в кодоне 61 и 3 мутации в кодоне 146. Частота мутаций в каждом из кодонов у этой группы больных составила 24,1%, 9,2%, 2,3% и 1,7%, соответственно (рис.3).

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% ЭО% 30% 10% 0%

56,3% 32%

21,9% 1,7% 2.3%

21,9% 24>1%

а дикий тип ■ 146 кодон п 61 коДОН □ 1 3 кодон О 12 кодон

наличие вредностей

Рис. 3. Частота различных мутаций в гене К-гав у больных,

подвергавшихся и не подвергавшихся вредным воздействиям в анамнезе

Полученные результаты свидетельствуют о том, что у курильщиков и больных, подвергавшихся воздействию профессиональных и иных видов вредностей, значительно чаще выявляется мутация в кодоне 13 гена К-гав (р=0,06) и удельный вес данной мутации в этих группах больных существенно превышает таковой в группе больных без указанных вредных воздействий (Р=0,03).

Связь мутации в гене К-гаБ с основными характеристиками опухолевого

процесса

Связь мутации в гене К-гаБ с локализацией опухоли

Среди больных КРР, вошедших в исследование, больных раком ободочной кишки было 97 (46,9%), больных раком прямой кишки - 110 (53,1%). Был произведен расчет частоты мутаций в гене К-гав в зависимости от локализации опухоли. Среди больных раком ободочной кишки мутации была выявлена у 31 больного (32,0%), дикий тип гена - у 66 больных (68,0%). У больных раком прямой кишки мутации выявлялись несколько чаще и были обнаружены у 48 из 110 больных, что составило 43,6% (р=0,08).

Была проанализирована частота мутации в гене К-гая в опухолях, располагающихся в различных отделах ободочной кишки. Точная локализация опухоли была указана в 74 из 80 случаев опухолей с мутациями в гене К-гаБ. Таким образом, анализ связи места мутации в гене К-гаэ с точной локализацией опухоли был проведен среди 45 опухолей с мутацией в кодоне

16

12, 19 опухолей с мутацией в кодоне 13, четырех опухолей с мутацией в кодоне 61 и трех опухолей с мутацией в кодоне 146 (рис. 4). При анализе частоты мутаций в опухолях, локализующихся в различных отделах прямой кишки, мутация выявлена в девяти из 27 опухолей ректосигмоидного и верхнеампулярного отдела (33,3%), в 12 из 31 опухолей среднеампулярного отдела (38,7%) ив 17 из 34 опухолей нижнеампулярного отдела прямой кишки (50,0%).

Рис. 4. Спектр мутаций в гене K-ras в опухолях различных отделов ободочной и прямой кишки

На основании проведенного анализа было установлено, что частота мутаций в опухолях нижних отделов прямой кишки существенно превышает аналогичный показатель в опухолях вышележащих отделов прямой кишки. Подавляющее большинство мутаций в кодоне 13 происходят в опухолях сигмовидной и прямой кишки (р=0,04, рис. 4). Все обнаруженные мутации в кодоне выявляются только в опухолях прямой кишки 61. Данные литературы по вопросу связи K-ras -мутации с локализацией опухоли в толстой кишке весьма противоречивы, однако большинство авторов все же указывает на большую частоту мутаций в дистально расположенных опухолях [Breivik J. Et al., 1994; Ahnen D.J. et al., 1998; Brink M. et al„ 2003; Luch-tenborg M. et al., 2005]. Полученные нами данные согласуются с представлением большинства авторов о преобладании K-ras - мутации в дистальных отделах толстой кишки, что, возможно, связано с более долгим нахождением каловых масс в терминальных отделах толстой кишки.

Связь мутации в гене K-ras с гистологическим типом и степенью дифференцировки опухоли

У 184 из 207 (88,9%) больных КРР опухоли были представлены аденокарциномой и у 23 (11,1%) - муцинозным раком. У больных с аденокарциномой мутации в гене K-ras были выявлены в 68 случаях (37,0%), с муцинознойаденокарциномой-в 11 (47,8%) (р>0,05).

Степень дифференцировки опухоли была определена у 188 исследованных больных. У 20 больных (10,6%) была высокодифференцированная опухоль, у 137 (72,9%) - умеренно дифференцированная и у 31 больного (16,5%) -низкодифференцированная опухоль толстой кишки. Мутация в гене K-ras была обнаружена в 10 опухолях с высокой степенью дифференцировки (50,0%), 48 случаях умеренно дифференцированных опухолей (35,0%) выявлены мутации и в 11 низкодифференцированных опухолях (35,5%). Таким образом, достоверных различий в частоте мутаций в опухолях с различной степенью дифференцировки выявлено не было (р=0,10).

Связь частоты мутации в гене K-ras с распространением опухоли • Связь частоты мутации в гене K-ras с глубиной инвазии опухоли

Глубина инвазии опухолью стенки кишки на основании гистологического заключения установлена у 185 больных. У 5 больных (2,7%) опухоль не проникала глубже собственной пластинки либо мышечного слоя слизистой и классифицировалась как рак in situ, у 7 больных (3,8%) опухоль прорастала подслизистый слой (Т1), у 32 (17,3%) - инфильтрировала мышечный слой (Т2), у 104 больных (56,2%) опухоль прорастала субсерозную оболочку либо врастала в околокишечную клетчатку на неперитонизированных участках кишки (ТЗ), у 27 (14,6%) прорастала висцеральную брюшину (Т4а), у 10 больных (5,4%) морфологически было подтверждено истинное врастание опухоли в соседние органы и структуры (Т4Ь).

При анализе показателя Т достоверной связи между глубиной инвазии и мутацией в гене K-ras получено не было (р=0,19). Однако была отмечена некоторая тенденция уменьшения частоты мутации с увеличением глубины инвазии опухоли. При распределении исследованных больных на две группы: с выходом за пределы стенки кишки (Т3-4Ь) и без него (Tis-T2) было обнаружено, что в опухолях, ограниченных кишечной стенкой, мутации в гене K-ras определялись несколько чаще, чем в опухолях, выходящих за пределы стенки кишки - 47,7% и 33,3%, соответственно, р=0,08.

• Анализ частоты мутации в гене K-ras в зависимости от поражения регионарных лимфатических узлов

Некоторые исследователи обнаружили связь между мутацией в гене K-ras и лимфогенным метастазированием опухолей толстой кишки [Pajkos G. et al., 2000; Hsieh et al., 2005; Hirata et al., 2007; Chang Y.S. et al., 2009]. В нашем

исследовании оценка поражения регионарных лимфатических узлов у 185 больных проводилась на основании результатов гистологического исследования операционного материала. Из 185 больных метастазы в регионарные лимфатические узлы были выявлены и гистологически верифицированы у 72 больных (38,9%, табл. 4).

Среди всех больных, у которых было оценено поражение регионарных лимфатических узлов, мутация в гене K-ras была обнаружена у 68 больных (36,8%).

Таблица 4

Сопоставление частоты поражения регионарных лимфатических узлов в группах больных КРР с мутантным и диким типом гена К-гаэ

Состояние регионарных лимфатических узлов Больные с мутацией Больные с диким типом гена Всего

п % N % п %

N0 35 51,5 78 66,7 ИЗ 61,1

N+ 33 48,5 39 33,3 72 38,9

Всего 68 100,0 117 100,0 185 100,0

При этом мутация была выявлена менее чем у трети больных без поражения лимфатических узлов и почти у половины больных с метастазами в регионарные лимфатические узлы (30,1% и 46,8%, соответственно, р=0,04). При анализе частоты регионарных метастазов у больных с мутацией и без нее также выявлено, что среди больных КРР с мутацией поражение регионарных лимфатических узлов метастазами встречается значительно чаще по сравнению с аналогичным показателем у больных с диким типом гена К-гав (48,5%о и 33,3%, соответственно, р=0,04, табл.4).

Анализ частоты мутации в гене К-га$ в зависимости от наличия отдаленных

метастазов

Из данного исследования были исключены трое больных, у которых материалом для исследования служили образцы из метахронных отдаленных метастазов. Из 204-х исследованных больных на момент госпитализации в стационар синхронные отдаленные метастазы были выявлены у 49 (24,0%). Среди больных с отдаленными метастазами у 20 больных (40,8%) выявлена мутация в гене К-гая, у 29 больных (59,2%) - дикий тип гена. Среди больных без синхронных отдаленных метастазов мутация выявлена у 57 больных

(36,8%), дикий тип гена - у 98 больных (63,2%). Связи мутации в гене К-гаэ с количеством и локализацией отдаленных метастазов выявлено не было.

• Связь мутации в гене K-ras со стадией заболевания

Среди больных, у которых определение мутации было проведено в образцах первичной опухоли, у 120 (60,8%) выявлен дикий тип гена K-ras и у 78 (39,2%) - мутация в данном гене. Распределение больных по стадиям среди больных с мутацией в гене K-ras и без нее было следующим: рак in situ - 5,3% и 0,8%, соответственно, I стадия - 17,1% и 14,6%, соответственно, II стадия -22,4% и 41,5%, III стадия - 28,9% и 19,5%, IV стадия - 26,3% и 23,6%, соответственно. Таким образом, частота установления II стадии рака толстой кишки среди больных с диким типом гена K-ras значительно превышает частоту II стадии среди больных с мутацией, тогда как III стадия, напротив чаще выявляется у больных с мутацией в данном гене (41,5% и 22,4%) и 28,9% и 19,5%, соответственно, р=0,02).

Анализ прогностической значимости мутации в гене K-ras у больных КРР

Общая выживаемость больных с мутацией в гене K-ras и без нее достоверно не отличалась. Однако выживаемость после первого года наблюдения у больных с мутацией была ниже вплоть до окончания пятого года наблюдения (рис. 5). Вероятно, это могло быть связано с тем, что, согласно полученным нами данным, доля больных с мутацией была существенно выше среди больных с III и IV стадией заболевания, имеющих гораздо худший прогноз, а среди больных со II стадией с более благоприятным прогнозом доля больные с мутацией составляли не более четверти больных.

100%

СЛ

л Р о о

24 36 48 60 время, месяцы

- больные

с диким типом гена

больные с мутацией в гене

Рис. 5. Выживаемость больных КРР с мутацией и диким типом гена К-гав

Был проведен анализ влияния клинических факторов (возраст, пол больного, степень дифференцировки, локализация опухоли, стадия заболевания, наличие поражения регионарных лимфатических узлов) и изучаемого генетического маркера - мутации в гене К-га8 - на общую выживаемость больных КРР.

Достоверные различия в выживаемости больных с мутацией в гене К-га8 и диким типом гена были выявлены только в связи со степенью дифференцировки опухолей толстой кишки.

Было обнаружено, что среди больных с низкодифференцированной опухолью с диким типом гена выживаемость была достоверно ниже по сравнению с больными с аналогичной степенью дифференцировки с мутацией в гене К-гаэ и по сравнению с выживаемостью больных с умереннодифференцированными опухолями и диким типом гена К-гаБ (р=0,02) (рис. 6). Вероятно, низкодифференцированная опухоль у больных с мутацией является результатом длительного злокачественного процесса, длительность которого привела к снижению дифференцировки исходной высокодифференцированной опухоли, развившейся на фоне мутации в гене К-гав и имеющей более длительное, и, как следствие, относительно более благоприятное течение процесса.

36 48 60 время, месяцы

- больные с умеренно

дифференцированной опухолью с диким типом гена

больные с умеренно дифференцированной опухолью с мутацией в гене

больные с низко дифференцированной опухолью с диким типом гена

больные с низко диффер енцир ованной опухолью с мутацией в гене

Рис. 6. Общая выживаемость больных КРР с умеренной и низкой степенью дифференцировки опухоли в зависимости от статуса гена К-гак

На основании результатов проведенного исследования можно заключить, что мутация в гене К-гав влияет на патогенез и течение опухолевого процесса, в том числе лимфогенное метастазирование. Влияние К-га к мутации на прогноз также определяется связью с такими исследованными параметрами,

как пол, возраст больных и степень дифференцировки опухоли, но сама по себе мутация не является самостоятельным независимым фактором прогноза заболевания.

ВЫВОДЫ

1. Частота мутаций в гене К-гаэ в опухолях у больных КРР составляет 38,2%. Распределение мутаций в гене К-гав по кодонам составило: кодон 12 -62,2 %, кодон 13 - 28,0 %, кодон 61 - 4,9 %, кодон 146 - 4,9 %.

2. Мутации в кодоне 12 выявляются в два раза чаще в карциномах толстой кишки у женщин по сравнению с мужчинами (30,4% и 15,2%, соответственно, р<0,01).

3. Частота мутаций в кодоне 13 у курильщиков более чем вдвое больше по сравнению с некурящими больными (20,8% и 8,3%, соответственно, р=0,02).

4. Частота мутации в кодоне 13 у больных с наличием профессиональных вредностей в анамнезе в два раза больше по сравнению больными, не имевшими вредностей в анамнезе (21,9% и 9,2%, соответственно, р=0,03).

5. Частота и спектр мутаций в гене К-гав варьирует в опухолях, развивающихся в различных отделах толстой кишки. Большинство мутаций в кодоне 13 (78,2%) отмечается в опухолях сигмовидной и прямой кишки, в то время как большинство мутаций в кодоне 12 (73,3%) наблюдается в проксимально лежащих отделах толстой кишки (р=0,04).

6. У больных КРР с мутацией в гене К-гая метастазы в регионарных лимфатических узлах встречаются достоверно чаще по сравнению с аналогичным показателем у больных с диким типом гена К-гав (48,5% и 33,3%, соответственно, р=0,04).

7. В группе больных с низкодифференцированными опухолями толстой кишки мутация в гене К-гав была ассоциирована с лучшей отдалённой выживаемостью (у больных с мутацией 5-летняя выживаемость составляла 51,8% по сравнению с 33,4% у больных с диким типом гена, р=0,02).

Практическая значимость

1. С учетом полученных в исследовании данных о частоте мутантного (38,2%) и дикого (61,8%) типа гена К-гаэ в аденокарциномах толстой кишки и имеющихся данных рандомизированных исследований об эффективности терапии ингибиторами ЕСЕК только у больных с диким типом гена, данный вид терапии может быть рекомендован к применению примерно у 60% больных КРР.

2. Полученные данные о том, что частота регионарных метастазов у больных с мутациями в гене K-ras значительно выше, чем у больных с диким типом гена, необходимо учитывать при планировании неоадъювантного и адъювантного лечения больных КРР.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Беляева A.B.. Моисеенко А.Б., Гуляев A.B. Современные представления о прогностических факторах колоректалыюго рака. // Вопросы онкологии. - 2011. - Т. 57. - №3. - С. 279-285.

2. Беляева A.B.. Суспицын E.H., Янус Г.А., Имянитов E.H., Иевлева А.Г., Гуляев A.B. Эпидемиология и клиническое значение мутации в гене KRAS у российских больных колоректальным раком. // Вопросы онкологии (приложение). - 2011. - Т.57. - №2. - С. 9-10.

3. Беляева A.B.. Суспицын E.H., Имянитов E.H., Гуляев A.B., Моисеенко А.Б. Значение статуса гена KRAS в определении злокачественного потенциала и клиническом течении опухолей толстой кишки. // Поволжский онкологический вестник. - 2011. - №1. - С. 21-22.

4. Беляева A.B.. Суспицын E.H., Имянитов E.H., Иевлева А.Г., Гуляев A.B., Моисеенко А.Б., Корнилов A.B.. Значение мутации в гене KRAS в клиническом течении колоректгального рака. / Материалы II съезда колопроктологов стран СНГ. - Одесса. 18-20 мая 2011. - С. 82-83.

5. Беляева A.B.. Имянитов E.H., Гуляев A.B., Моисеенко А.Б., Корнилов A.B. Роль мутации в гене K-ras в патогенезе и клиническом течении колоректалыюго рака. // Современные принципы диагностики и лечения колоректального рака: материалы конференции, посвященные памяти профессора В.И.Кныша. - Москва. 26-27 мая 2011. - С. 18.

6. Беляева A.B.. Янус Г.А., Суспицын E.H., Имянитов E.H., Гуляев A.B., Моисеенко А.Б. Частота мутации гена KRAS у больных раком толстой кишки и ее значение в определении злокачественного потенциала и клиническом течении опухолей толстой кишки. //Актуальные вопросы клинической онкологии: сборник научных трудов. - Санкт-Петербург: Аграф +, 2011. -С.90-91.

7. Belyaeva А.У.. Yanus G.A., Imyanitov E.N., Suspitsin E.N., Goulyaev A.V., Ievleva A.G., Moiseenko A.B. Significance of mutation in K-RAS gene in pathogenesis and clinical course of colorectal cancer. // European Journal of Cancer. - 2011. - V.47. Supplement 1. № 6065.

8. Беляева A.B.. Янус Г.А., Суспицын E.H., Зайцева O.A., Яцук О.С., Гуляев A.B., Имянитов E.H. Клинико-патогенетическне особенности колоректалыюго рака у больных с диким и мутантным типом гена k-ras. // Онкохирургия. - 2011. - Т. 3. - №4. - С. 15-16.

9. Беляева A.B.. Янус Г.А., Суспицын E.H., Зайцева O.A., Яцук О.С., Моисеенко А.Б., Гуляев A.B., Имянитов E.H. Возрастные и клиннко-патогенетические особенности колоректального рака, ассоциированные со статусом гена k-ras. // Успехи геронтологии. - 2012. — Т.25. - №1. - С.40-45.

Благодарности

Выражаю глубокую признательность за постоянное внимание и содействие моим научным руководителям, д.м.п., проф. A.B. Гуляеву и д.м.н., проф. E.H. Имянитову. Высказываю искреннюю благодарность за всестороннюю помощь в выполнении работы своим друзьям и коллегам -сотрудникам лаборатории молекулярной онкологии, лаборатории морфологии опухолей, популяционного ракового регистра и отделения абдоминальной онкологии.

Отпечатано в типографии ООО «УНИ-ПРИНТ» Заказ №42-0208-26. Формат бумаги 60x84/16. Тираж 100 шт. 191119, Санкт-Петербург, ул. Звенигородская, д. 11 Тел./факс: 740-11-80 www.740-ll-80.ru