Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Выявление новых антикоагулянтов прямого действия в ряду органических соединений различной химической структуры

На правах рукописи

Дрозд Наталья Николаевна

ВЫЯВЛЕНИЕ НОВЫХ АНТИКОАГУЛЯНТОВ ПРЯМОГО ДЕЙСТВИЯ В РЯДУ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ РАЗЛИЧНОЙ ХИМИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ

14.03.06. - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

1 8 2010

Москва-2009

003491941

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Гематологический научный центр РАМН (ГНЦ РАМН, г. Москва)

Научные консультанты: доктор медицинских наук, профессор Макаров Владимир Александрович доктор химических наук, профессор Варламов Валерий Петрович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Лобанова Елена Георгиевна

доктор биологических наук Минеева Майя Федоровна

доктор медицинских наук, профессор Сейфулла Рошен Джафарович

Ведущая организация: ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет Росздрава

Защита состоится "_"_2010 года в_часов на заседании диссертационного

совета Д 001.024.01 при НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН по адресу: 125315 г. Москва, ул. Балтийская, д.8

С диссертацией можно ознакомиться в Ученой части НИИ фармакологии имени В.В. За-кусоваРАМН по адресу: 125315 г. Москва, ул. Балтийская, д.8

Автореферат разослан "_"_20.... г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Е.А.Вальдмад

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Тромбозы развиваются в результате дисбаланса прокоагулянтных, ангикоагу-лянтных и фибринолитичсских процессов в системе свертывания крови млекопитающих, отражающего сложное взаимодействие между генетическими или приобретенными факторами риска [Segal G.V. и др. 2009; Shakoor H. и др., 2009; Colman R.W. и др., 2006]. Тромбоэмболические осложнения - распространенная медицинская проблема, связанная со значительной заболеваемостью и смертностью [Thakor A.S. и др., 2009; Cohen А.Т., 2007; Frutos P.G. и др. 2007].

Для профилактики и лечения тромбозов наряду с анти агрегатами, прямыми фиб-ринолитиками и антагонистами витамина К используют прямые антикоагулянты (AK) [De Caterina R., 2009]. К непосредственно ингибирующим активность тромбина (Т) относят такие полипептады для парентерального введения как лепирудин, аргагробан, бивалиру-дин; дтя перорального введения - дабигатран [Roberts LN 2009; Steffel J, Lílscher TF. 2009; Alban S/ 2008]. Ингибиторы активности активированного фактора десять (Xa) - риварок-сабан, апиксабан и эдоксабан - используют per os [Fonseca RJ. и др. 2008; Hoppensteadt DA. 2008]. Препараты для парентерального введения на основе гликозаминогликанов ин-гибируют активность тромбина и фактора Ха активируя антитромбин (AT) или другие серпины [Castañon М.М. и др, 2007; Hernández-Espinosa D. И др., 2007; Qiu X и др., 2006; Richard В. И др., 2006; Gomez К. И др., 2005; Raman R И др., 2005; Petitou M. И др., 2004]. К ним относят нашвные нефракционированные гепарины (НФГ) со средней молекулярной массой (ММ) 15 кДа (получают из легких крупного рогатого скота или слизистой оболочки кишечника свиней), сулодексид (выделяют из слизистой оболочки кишечника свиней; содержит 80% НФГ и 20% сульфата дерматана), полусинтетические низкомолекулярные гепарины (НМГ) с ММ 4-7 кДа и отношением активностей против фактора Ха и тромбина (aXa/alla) от 1,5 до 4,5 [Atkinson HM и др, 2009; Raju NC и др., 2009; Heerspink HL и др, 2008; Henry M.L. и др. 2008; Eikelboom J.W. и др. 2002], а также синтетические пенгасахариды ингибирующие активность только фактора Ха с помощью AT - фондапа-ринукс (арикстра) и идрапаринукс - [De Caterina R. 2009; Steffel J и др., 2009].

Актуальность выбранной темы связанна с тем, что:

1. Используемые в настоящее время АК прямого действия не удовлетворяют полностью

потребности практической медицины; при несомненной эффективности у НФГ, НМГ,

синтетических олигосахаридов есть недостатки (зависимость от AT, невозможность инги-

3

бировать активность Т связанного со сгустком и пр.) [Segal G.V. и др. 2009; Shakoor H. и др., 2009; Sakamoto S. и др., 2008]; прямые ингибиторы тромбина и фактора Ха действуют непродолжительно и не имеют антидотов [De Caterina R., 2009; McCullough P.A. и др., 2004].

2. В Российской Федерации отсутствует собственное производство дня наработки субстанций нефракмионированных гепаринов.

3. В Российской Федерации есть существенная сырьвая база полисахаридов растительного и животного прохождения для получения новых соединений с аншкоагулянтной активностью.

Цель и задачи работы

Цель исследования - анализ структуры и антикоагулякпюй (АК) активности натуральных и химически модифицированных полисахаридов растительного/животного происхождения и синтетических фукозилированных олигосахарвдов, выявление потенциальных антикоагулянтов прямого действия.

Для достижения этой цели последовательно решали следующие задачи;

• Выявление связи между антикоагулянтной активностью и молекулярной массой, степенью сульфатирования, степенью замещения, моносахаридным составом 290 нативкых и полусинтетических сульфатов полисахаридов и 5 синтетических фукозилированных олигосахаридов.

• Определение механизма антикоагулянтного действия сульфатированных хитозанов с молекулярной массой 65 -123 кДа и количеством серы 11,1-15,4 %.

• Сравнение способов определений антитромбиповой активности сульфатированных хитозанов с молекулярной массой 20 - 123 кДа (количество серы 8,8 -16,9%) в системах in vitro и ex vivo.

• Выбор в результате анализа связи между АК активностью и молекулярной массой оптимальных способов деполимеризации НФГ или сульфатов хитозана для получения образцов с отношением активностей аХа /alla в диапазоне 1,5 - 3,0.

• Сравнение специфических антикоагулянтных активностей (alla и аХа) натуральных и химически модифицированных сульфатированных полисахаридов (СП) растительного происхождения (фукоиданы, сульфаты галакгоманнана, целлюлозы, пектина, крахмала).

• Определение фармакодинамических параметров наиболее перспективных образцов НМГ, сульфатов хитозана, фукоиданов, сульфата галактоманнана при введениях экспериментальным животным.

• Сравнение антигромботической и геморрагической активностей наиболее перспективных образцов НМГ, фукоиданов, сульфатов хитозана и галактоманнана, с используемыми в клинической практике нефракциокированными и низкомолекулярными гепаринами.

• Разработка метода выбора поликатионов для нейтрализации аитикоагулянпюй активности и количественного определения сульфатироваиных полисахаридов в биологических жидкостях.

• Выявление наиболее активного прямого ингибитора тромбина среди синтетических производных пептидов (Z-AIa-Ala-Arg-P/p* TFA; Z-Ala-Ala-Arg-Mi*HBr; Ас-Тгр-Arg-Mf*HCl; Fta-Gly-Arg-Pip* TFA; Ac-Trp-Arg-Pip* TFA).

• Оценка возможности применения комбинации экспериментального концентрата антитромбина человека с нефракционированным гепарином и пара-аминобензойной кислоты в качестве антитромботических средств на модели венозного стаза у крыс.

Основпые положения, выносимые па защиту

• Исследованные СП растительного, животного и синтетического происхождения ингибируют фибриногенсвертывающую и амидолитическую активности тромбина и фактора Ха при участии плазменного ингибитора сериновых протеаз - антитромбина.

• АК активность исследованных СП растительного, животного и синтетического происхождения зависит от молекулярной массы, степени сульфагирования, введения монофосфатных, ацетатных, карбоксиметильных, амидоэтильных групп.

• Сульфат протамина нейтрализует амидолитическую и фибриногенсвертывающую антитромбиновую (alla) и шгги-фактор Ха (аХа) активности НМГ с молекулярной массой (ММ) 4,7 и 6,8 кДа, СХ с ММ 9,0 кДа, фукоиданов из F. evanescens и L ci-chorioides в гравиметрических отношениях антидот/антикоагулянт от 0,5 до 1,5. Хитозаны с ММ 16 кДа (степень дезацетилирования - СД 91%) и 21 кДа (СД 61%) нейтрализуют антитромбиновую активность НФГ 15 кДа, НМГ с ММ 4,7 кДа и сульфата хитозана (СХ) с ММ 9,0 кДа.

• Фармакодинамическис (ФД) параметры НМГ с ММ 4,7; 5,4 и 6,8 кДа при подкожном введении кроликам сопоставимы с ФД параметрами фраксипарина. Внутри-

венное введение крысам и кроликам смеси СХ (ММ 75 кДа, степень сульфатарова-ния - СС 1Д5) и НФГ в весовом соотношении 1:1, фукоиданов из водорослей К емапгзсет и I. асИогШекз, сульфатированного галактоманнана (СГМ, ММ 127 кДа, СС - 1,46) приводит к возрастанию АК активности плазмы и длительности действия с увеличением дозы.

• НМГ с ММ 4,7; 5,4 и 6,8 кДа в одинаковой степени и также эффективно, как и фраксипарин, препятствуют развитию экспериментального тромбоза у крыс; геморрагическая активность НМГ с ММ 4,7; 5,4 кДа и фраксипарина одинакова Ан-титромботическое действие СХ с ММ 75 кДа (СС 1,25) и фукоидана из К шотмсегм сопоставимо с действием НФГ при в/в введении крысам, но геморрагический эффект ниже. 100% противотромботический эффект сульфатированного галактоманнана (ММ 127 кДа) достигается в 2 раза меньшей дозой, чем фукоиданом из водоросли Р. еуапезсепз.

• Экспериментальный концентрат АТ человека (56 - 100 ЕДОсг) в сочетании с НФГ (30-50 ЕД/кг) и пара-аминобензойная кислота (0,5; 1,5 и 3,0 мг/кг) предотваращают развитие тромбоза на модели венозного стаза у крыс при внутривенном введении.

• Синтетические пептиды г-А1а-А1а-А^-Лр* ТБА; 2-А1а-А1а-Аг£-МГ*НВг; Ас-Ттр-А^-МРНС1; р1а-01у-А^-Р1р* ТТА; Ас-Тгр-А^-Рф* ТРА ингибируют активность тромбина; при внутривенном введении Р1а-С1у-Аг§-Р1р* ТРА крысам антикоагу-лянтная активность плазмы возрастает с увеличением дозы.

• С помощью биоспецифичного электрофореза в геле агарозы можно фиксировать комплексы между СП растительного, животного, синтетического происхождения и поликатионами (сульфат протамина и хигозаны с ММ 6-21 кДа и СД - 61-93%).); размеры пиков преципитации зависят от ММ, степени сульфатирования и АК активности сульфатов полисахаридов.

Научная новизна и теоретическое значение

Проведены широкомасштабные сравнительные исследования специфической анти-коагуляной активности 290 нэтивных и модифицированных сульфатов полисахаридов, выделенных из растительного материала или тканей млекопитающих и членистоногих. Получены новые сведения о зависимости структура - антикоагулянтное действие для низкомолекулярных гепаринов, фукоиданов из бурых водорослей, сульфатов хитозана, целлюлозы, галактоманнанов, крахмала и пектинов.

Осуществлен комплексный анализ по выявлению низкомолекулярных гепаринов с

6

антитромботической активностью, полученных посредством направленных изменений макромолекул нефракционированных гепаринов хитинолитическим, целлюлолитическим, протеолитическим ферментными комплексами, а также лизоцимом, палашом и химот-рипсином, никогда ранее для этой цели не использовавшимися.

Установлены особенности как механизма реализации ингибирования активности тромбина и фактора Ха, так и образования комплексов между поликатионами и сульфати-рованными полисахаридами, с последующим выбором антидота для нейтрализации анти-коагулянтной активности.

Разработаны и апробированы методологические аспекты детализации молекулярных механизмов шггикоагулянтного действия фукоиданов из бурых водорослей, сульфатов целлюлозы и галакгоманнанов из травянистых и древовидных растений, сульфатов картофельного крахмала, сульфатов пектинов из травянистых растений, синтетических оли-госахаридов фукоидалового типа и синтетических производных пептидов, с выявлением наиболее активных соединений и анализом фармакодинамических параметров, антитромботической и геморрагической активностей, в сравнении с используемыми в клинической практике антикоагулянтами прямого действия. Экспериментально обоснована возможность конструирования новых лекарственных препаратов для профилактики и лечения тромбозов на основе исследованных соединений.

Разработан алгоритм адекватной оценки специфической антитромбиновой активности сульфатированных хигозанов. В результате анализа связи между молекулярной массой и антикоагулянтной активностью, с помощью направленных модификаций получены низкомолекулярные сульфаты хитозана с высокой ингибиторной активностью по отношению к активированному фактору десять (Ха).

Создана композиция, состоящая из нефракционированного гепарина и экспериментального концентрата антитромбина человека. Эта композиция и пара-аминобензойная кислота демонстрируют антигромботическую активность на модели венозного стаза у крыс.

Практическое значение работы

Разработаны методические указания по изучению антикоагулянтной активности фармакологических веществ и включены в Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (Москва, 2000).

Разработан метод выбора антидота для нейтрализации антикоагулянтной активности сульфатированных полисахаридов на основе фиксирования комплексов между антикоагу-

лянтами и поликатионами (патент на изобретение РФ "Способ обнаружения комплексов между гепаринами и поликатионами" № 2370271).

Ресурсная обеспеченность и патентная защищенность (6 патентов, 4 положительных решения по заявкам) являются предпосылками для получения антитромботаческих лекарственных средств на основе нативных и полусинтетических сульфатированных полисахаридов растительного и животного происхождения, синтетических фукозилированных олигосахаридов и производных пептидов, а также композиции экспериментального концентрата антитромбина человека и нефракционированного гепарина и пара-аминобензойной кислоты.

Рекомендованы для дальнейшей разработки акгавные соединения - для парентерального введения: низкомолекулярный гепарин с ММ 6,8 кДа ; низкомолекулярный гепарин с ММ 5,4 кДа ; механическая смесь сульфата хитозана (ММ 75 кДа; СС 1,26) и нефракционированного гепарина (в весовом соотношении 1:1); фукоидан (ММ 20-40 кДа) из водоросли Fucus evanescens; сульфатированный галактоманнан (ММ 127 кДа;СС 1.46); для введения per os: пара-аминобензойная кислота.

Практическое внедрение результатов исследований На основе патента на изобретение "Способ определения активности антитромбина" № 2195673 фирмой "Технология-Стандарт" производится набор для определения активности антитромбина в плазме.

На основе патента на изобретение "Способ получения очищенного активированного фактора X свертывания крови" № 2221578 в лаборатории стандартизации методов контроля препаратов плазмы ГНЦ РАМН созданы (производятся НПО "Ренам") наборы для определения способности гепаринов ингибировать фибриногенсвертывающую и амидоли-тическую активности фактора Ха.

Публикации результатов исследования. Основные положения и результаты отражены в 48 публикациях.; из 40 статей 2 опубликованы в зарубежных журналах, 4 представлены главами в книгах, 16 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации основных научных результатов докторских диссертаций. По теме диссертации получено 6 патентов.

Связь работы с научной тематикой организации. Работа выполнена в рамках НИР ГНЦ РАМН (номера государственной регистрации НИР: 01200501366,2005-2009 г.г. "Разработка новых средств для профилактики тромбозов и остановки кровотечений" и 01200001744, 2004-2005 г.г. "Разработка новых средств диагностики и лечения тромбозов и ДВС-синдрома").

Личный вклад соискателя. Автор самостоятельно определяла направление исследований, осуществляла поиск перспективных, с точки зрения антикоагулянпюй активности, органических соединений разной структуры и осуществляла контакты с предполагаемыми соавторами - химиками. А также, планировала ход экспериментов, самостоятельно получала результаты ко всем главам диссертации, анализировала результаты и формулировала выводы.

Апробация работы Основные результаты и положения предлагаемой работы за период с 1995 по 2004 г.г. были представлены на 20 Всесоюзных/Всероссийских и 12 Международных съездах, конгрессах, симпозиумах, конференциях; за последние 5 лет : 30, 33 Конгрессы Федерации Европейских биохимических обществ: Будапешт (2005), Афины (2008); Вторая Европейская школа по биореологии, Варна (Болгария), 2006; 14 Конференция Европейского общества по клинической гемореологии и микроциркуляции, Дрезден, 2007; II Всероссийская конференция по клинической гсмостазиологии и гемореологии в сердечно-сосудистой хирургии, 2005, Москва; Первая международная научно-практическая конференция «Биологические и медицинские технологии; от научных результатов - к инновационным разработкам» 2005, Москва; Актуальные вопросы трансфу-зиологии и клинической медицины, 2005, Киров; Международная конференция "Геморео-логия в макро- и микроциркуляции", Ярославль, 2005; П Всероссийская конференция Всероссийской Ассоциации по изучению тромбозов, геморрагий и патологии сосудов им. АА.Шмидга-Б.А.Кудряшова, Ярославль 2005; Вторая Международная научно - практическая конференция «Перспективы развития биотехнологий в России», Пущино (Московская обласп.), 2005; Третья Международная Научно-практическая Конференция МЕД-БИОТЕК «Актуальные вопросы инновационной деятельности в биологии и медицине», Москва 2006; Ш съезд фармакологов России Фармакология -практическому здравоохранению, Санкт-Петербург, 2007; 3 Всероссийская конференция "Клиническая гемосгазио-логия и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии", 2007, Москва; III съезд фармакологов России Фармакология -практическому здравоохранению, Санкт-Петербург, 2007; V Всероссийская конференция-школа «Химия и технология растительных веществ», Уфа 2008; "IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов" Новосибирск 2008; Всероссийская конференция с международным участием "Тромбозы, кровоточивость, ДВС-синдром: современные подходы к диагностике и лечению" Москва 2008; IV Всероссийской конференции по клинической гемосгазиологии и гемореологии в сердечно-сосудистой хирургии (с международным участием), Москва 2009; XII научно-

практическая конференция "Химия - XXI век: новые технологии, новые продукты", Ке-

9

мерово, 2009; VII Всероссийская научная конференция "Химия и медицина" Орхимед-2009, Уфа; Конференция "Химическая биология - фундаментальные проблемы бионано-технологии", Новосибирск, 2009.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, глав обзора литературы, материалов и методов исследования, а также 7 глав собственных результатов, заключения, выводов, рекомендаций, списка литературы и приложения (445 страниц); число рисунков 123, таблиц 114. Список цитированной литературы включает 788 наименований, в том числе 62 работы на русском и 726 - на иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выделение, анализ химического состава и структуры соединений для исследования ангикоагуляшной активности проводили в следующих организациях: нефракцио-нированные сульфаты хитозана (СХ) с ММ 20-123 кДа и степенью сульфатирования (СС) 0,62-1,86 исследовали на кафедре технологии химических волокон Московского государственного текстильного университета им. А.Н. Косыгина [Вихорева Г.А. и др., 1990]; низкомолекулярные СХ с ММ 1,6 - 40 кДа и содержанием серы 6,1 -16,8% исследовали на кафедре технологии химических волокон Московского государственного текстильного университета им. А.Н. Косыгина и в лаборатории инженерии ферментов Центра "Биоинженерия" РАН [Vichoreva G.A. и др. 2004; Банникова Г.Е и др. 2002]; химически модифицированные хитозаны, низкомолекулярные гепарины с ММ 1,6 - 9,0 кДа и хитозаны с ММ 4-21 кДа и степенью дезацегилирования 61-93 % - в лаборатории инженерии ферментов Центра "Биоинженерия" РАН [Ильина A.A. и др. 2007; Банникова Г.Е и др. 2002]. Выделение, изучение химического состава и структуры фукоиданов из бурых морских водорослей Охотского моря Fucus evanescens, Laminaria cichorioides, Laminaria japónica, lindaría pinnatifida, Laminaria gurjanavae, Costaria Costata, а также деполимеризацию фу-коиданазой, десульфатирование, освобождение от белков и полифенолов проводили в лаборатории химии ферментов Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН (Владивосток) [Kusaykin M. и др., 2008; Шевченко Н.М. и др., 2007; Zvyagintseva T.N. и др, 2005]. Ферментативное расщепление экстрактом из гепатопанкреаса камчатского краба фукоидана из водоросли Laminaria saccharina с целью получения фрагментов полисахарида с меньшей ММ, сульфатирование альгиновой кислоты из бурой водоросли Macrocystis purifera и создание наноструктур на основе сульфата альгиноовой кислоты осуществляли в лаборатории инженерии ферментов Центра "Биоинженерия" РАН [Ильина A.B. и др., 2009]; фракционирование фукоидана из водоросли Laminaria saccharina ме-

ходом ионообменной хроматографии с целью получения фракций, обогащенных фукозой и сульфатными группами проводили в лаборатории химии гликоньюгагов Института органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН [Cumashi А. и др., 2007]. Сульфатированные низкомолекулярные галакгоманнаны (СГМ) из семян Cyamopsis Tetragonoloba (L.) Taub, с MM 12,6 - 245,6 кДа, гуаровую камедь из Cyamópsis tetragonólobus (L.) Taub., галеговую камедь Galega orientalis Lam, софоровую камедь из семян софоры японской (Styphnolo-bium japonicum), камедь Локуст бин (Locust Bean), полисахаридные ионные комплексы, компонентами которых служили галакгозилированный хитозан, N-сукцинилхитозан и сульфатированный галактоманнан в разных весовых пропорциях, карбоксиметилирован-ные галакгоманнаны с ММ 141 кДа и содержанием групп SCV2 - 48,8 - 62,8 % и наноструктуры на основе ГМ из семян Cyamopsis Tetragonoloba (L.) Taub, получали в лаборатории инженерии ферментов Центра "Биоинженерия" РАН и в лаборатории инженерной эн-зимологии Института биохимии им. A.II. Баха РАН [Ильина A.D. и др., 2005,2006,2007; Местсчкина Н.М. и др., 2008]. Выделение, изучение химического состава, структуры и химическое модифицирование целлюлозы и крахмала осуществляли в Институте химии Коми научного центра УрО РАН (Сыктывкар) [Торлопов М.А. и др., 2006,2007,2008]. Выделение, изучение химического состава, структуры и химическое модифицирование сульфатов пектина из травянистых растений осуществляли в отделе молекулярной иммунологии и биотехнологии Института физиологии Коми НЦ УрО РАН (Сыктывкар) [Оводов Ю.С. и др. 2008]. Сульфатированную целлюлозу из древесины пихты, осины, соломы пшеницы и цианидины из коры березы, ели, сосны, лиственницы, кедра получали в лаборатории каталитической химии угля и биомассы института химии и химической технологии СО РАН (Красноярск) и на кафедре органической химии Сибирского федерального университета (Красноярск) [Кузнецова С.А. и др. 2006,2007, 2008Д009]. Фукозилирован-ные олигосахариды синтезировали в лаборатории гликоконыогатов Института органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН [Устюжанина Н. и др, 2007; Крылов В. и др. 2008,2009]. Производные пептидов: Z-Ala-Ala-Arg-P¡/>*TFA; Z-Ala-Ala-Arg-Mf*HBr; Ас-Trp-Arg-MPHCl; Fta-Gly-Arg-Pip*TOA; (Ac-Trp-Arg-Pip*TOA синтезировали в лаборатории химии белка ГосНИИгенетика. Выделение, изучение химического состава и струету-ры экспериментального концентрата антитромбина человека осуществляли в лаборатории фракционирования белков плазмы ГНЦ РАМН [Ажигирова М.А. и др. 2006].

Выделение кофактора гепарина II (ГК) из плазмы крови человека осуществляли по [Sheehan J.P. и др., 1994]. Электрофоретический анализ ГК проводили в полиакри-

ламидном геле с додецилсульфатом натрия по [Tollefsen D.M., 1997].

11

Для получения плазмы человека, лишенной антитромбина (AT) использовали метод [Hoogendoorn H. и др., 1980]. Нефракционированный гепарин (153 alla ЕД/мг) связывали с CNBr-активированной сефароза 4В (Pharmacia Fine Chemicals) по [Miller-Andresson M. и др. 1974].

Комплексы бычьего AT с сульфатом хитозана (СХ, alla активность - 20 ЕД/мг) получали инкубацией растворов AT ( Sigma, 5 мг/мл) и СХ (7,6 мг/мл) в молярном соотношении 1:1 в 0,01М трис-HCl буфере рН 7,4, содержащем 0Д5М NaCl, в течение 15 мин при 20 °С [Башков Г.В., 1987]. Содержание белка в комплексах определяли спектрофотометрически, принимая А1%28о (1 см) для AT быка = 6,0 [Chuang Y.J. и др., 2001]. Концентрацию СХ определяли спекгрофотомегрически при длине волны 220 нм [Bernkop-Schnurch А., 2000] и по окрашиванию азуром [Mori Т. и др., 1998].

Ракетный биоспецифичный электрофорез [DrozdN.N. и др., 2001] комплексов АК с поликатионами (сульфат протамииа и хитозаны с ММ 4-21 кДа) проводили в слое 1% агарозы в 0,1М натрий фосфатном буфере рН 6,8. Пластины с высохшим гелем сканировали, переводили изображение в формат JPG и оценивали высоту и площадь пиков преципитации с помощью программы PhotoM 1,31.

Турбидичетрическое титрование [Мазов М.Ю. и др., 1983] антикоагулянтов (0,25 мг/мл) проводили сульфатом протамина ("Spark" или "Sigma") и хитозанами с ММ 4-21 кДа (0,25 мг/мл).

Ингибирование фибриногенсвертывающей и амидолитической активности тромбина посредством антитромбииа, кофактора гепарина П и образцов СХ: влияние СХ на каталитическую активность тромбина (Т) по отношению к фибриногену определяли по [Kiphuth I.C. и др., 2008]. Влияние АК на ингибирующую активность AT по отношению к Т оценивали по [Machovich R. И др., 1986] и определяли константы псевдопервого порядка ингибирования тромбина посредством AT и ГК в присутствии АК. AT выделяли по [Башков Г.В. и др., 1989]. Константы ингибирования второго порядка взаимодействия АТ-Т рассчитывали (согласно модели [Griffith M.J., 1982]) по скорости ингибирования I нМ Т (Sigma) 10-тью нМ AT (Sigma) в 0,1 M триэтаноламин-HCl буфере рН 7,8 содержащем 0,1 M NaCl и 0,1 % полиэтпенгликоль 6000 при 37 °С в присутствии 0,2 мкМ хромогенного субстрата S 2238 [Scully M.F. и др., 1989].

Определение антикоагулянтиой активности соединений in vitro: влияние АК на внутренний, внешний и общий пути свертывания крови оценивали используя общепринятые тесты - время свертывания крови (ВСК) [Lee R.I., 1913], время рекальцификации (BP)

[Kennedy С.С. и др., 1973], активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ)

12

[Stuart R.K. и др., 1971], протромбиновое время (ПВ) [Rosenberg R.D., 1977], тромбииовое время (ТВ) [Teien A.N., 1975], тромбин-Са время (Т-Са) [Колмен Р.У., 1988]. Для определений применяли наборы отечественных (Ренам, Технология стандарт) и зарубежных (Sigma, Biopool, Roche) фирм. Специфическую AK активность образцов in vitro определяли по ингибированию фибриногенсвертывающей и амидолитической активностям тромбина (антитромбиновая, анти- фактор lia, alla активность) [Coyne Е., 1981; Teien A.N. и др. 1977] и фактора Ха (активность против фактора Ха, апти-фактор Ха, аХа активность) [Teien A.N. и др., 1976; Yin Е.Т. и др., 1973] в плазме человека или экспериментальных животных с использованием Международных стандартов НФГ или НМГ. Определение alla активности с использованием теста АЧТВ проводили по [Coyne Е. И др., 1981], с использованием ингибирования амидолитической активности тромбина - по [Teien A.N. и др., 1977; Yin Е.Т. и др., 1973]. Определение аХа активности по ингибированию фибриногенсвертывающей активности фактора Ха проводили по [Yin Е.Т., 1973], по ингибированию амидолитической активности фактора Ха - по [Rezaie A.R., 2006; Teien A.N. и др., 1976]. 1С5о рассчитывали по [Motuisky H.J., 2003].

Нейтрализацию антикоагулянтной активности in vitro исследуемых СП поликатионами проводили в тестах по ингибированию фибриногенсвертывающей или амидолитической активностей тромбина и фактора Ха [Racanelli А. И др., 1989; Toijemanea L. И ДР., 2008].

Анализ ингибирования генерации тромбина (ГТ) проводили по [Sollier C.B. и др., 2004]. Под кривой ГТ находили площадь (AUC [Motuisky HJ., 2003]) и рассчитывали процент ингибирования: [AUC(TT) контроль - AUC(TT) с НМГ]/АиС(ГТ) контроль [Lor-meau J.C.,1993].

Агрегацию тромбоцитов исследовали по [Born G.V., 1962]. Число тромбоцитов определяли по поглощению 0,4 мл богатой тромбоцитами плазмы кроликов или человека при 800 нм [Walkowiak В. И др., 1989] и на счетчике форменных элементов фирмы "Coultronix" (Франция).

Антикоагулянтная активность образцов in vivo. Экспериментальные исследования выполнены на 327 кроликах Шиншилла обоего пола массой 2,5-4,5 кг и на 720 крысах-самцах Wistar массой 250-400 г, полученных из питомника РАМН "Столбовая", находившихся на стандартной диете в боксированных помещениях с соблюдением всех правил и международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных работах (European Convention

for the'Protection of Vertebrate Animals used for Experimental and Other Scientific Purposes.

13

Ctrasbourg, 1986). Разброс животных в группе по массе тела не превышал ± 10%. Животные контрольных и опытных групп одного пола, возраста, получены из питомника одновременно. Фармакологическую активность исследуемых образцов определяли при в/в или п/к введениях кроликам или крысам. Внутривенное введение АК кроликам осуществляли в краевую вену уха, крысам - в левую яремную вену; подкожное введение кроликам проводили в складку со стороны спины. В качестве отрицательного контроля использовали введение физиологического раствора. В качестве положительного контроля применяли растворы НФГ или фраксипарина. Кровь у кроликов отбирали методом капель из краевой вены противоположного уха, кровь у крыс забирали in противоположной яремной вены в пластиковую пробирку с 0,11 М раствором CéHsChNa в соотношении 9:1. Для получения бедной тромбоцитами плазмы пробирки откручивали при 1400g 20 мин. Аши-Иа [Teien A.N., 1975] и аХа [Yin Б.Т. и др., 1973] активности плазмы крыс оценивали в разные интервалы времени после введения. Кровь для исследования отбирали до введения и через 5-300 мин после в/в введения или через 60, 120, 180,240, 300 мин и 24,48 час после п/к введения. Для расчета фармакокинетических параметров данные представляли в виде полулогарифмических графиков выведения исследуемого вещества с использованием затем электронного ресурса SuramitPK.com.

Антитромбнновую активность образцов СХ в системе ex vivo рассчитывали на базе кривых выведения АК после в/в введения кроликам. В основу методики положено математическое описание действия НФГ, предложенное ранее [De Swart С. И др., 1982].

Активность плазминогена [Markwardt F., Klocking Н.Р., 1977] в плазме кроликов и крыс после введения антикоагулянтов определяли с использованием набора НПО "Ре-нам" Реахром-Плазминоген. Активность протеина С [Yang L. и др., 2002] в плазме кроликов и крыс после введения антикоагулянтов определяли с использованием набора НПО "Ренам" Реахром-Протеин-С.

Исследование антитромботической активности проводили на модели венозного стаза у крыс по {Wessler S. и др.,1959]. Эфективность антитромботической активности оценивали: 1. по форме тромба, извлеченного из перевязанного участка вены (в баллах); пересчет системы баллов на процент предотвращения тромбоза проводили по [Holmer Е. и др., 1986]; 2. по весу влажного тромба на аналитических весах. 3. по концентрации белка в гомогенате тромба [Кочетков Г.А., 1980]. Геморрагическую активность АК определяли на крысах самцах Wistar весом 200-250 г [Hobbelen P.M. и др., 1987].

Оценка значимости различий двух средних арифметических рядов экспериментальных данных проводили по t критерию Сгьюдента. Для определения связи между дву-

14

мя признаками в рядах экспериментальных данных использовали корреляционный анализ, для определения достоверности вывода о влиянии фактора на результативный признак F

использовали дисперсионный анализ [Дюк В., 1997]. Статистическую обработку результа-<

тов проводили с использованием программ Bíostat, SSPS, StagraphicsPlus.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Влияние аминополисахаридов - низкомолекулярных гепаринов (НМГ) и суль-фатироваяных хитозанов (СХ) па свертывание крови человека и экспериментальных животных in vitro и in vivo..

1. Антикоагуляитная активность низкомолекулярных гепаринов, полученных с помощью ферментативного гидролиза нефракционированных гепаринов.

Для выбора перспективно«« НМГ анализировали АК активность гепаринов, полученных деполимеризацией НФГ разных фирм производителей, из тканей крупного рогатого скота (КРС) или свиней, с использованием хитанолитического, протеолитического, целлюлолигического ферментных комплексов (ФК) юга протеолитических ферментов. Критериями отбора перспективных образцов НМГ служили: аХа активность не менее 70 ЕД/мг и отношение активностей аХа/аПа более 1. На рис.1, приведена АК активность некоторых (получены деполимеризацией НФГ впервые использованным с этой целью хити-нолнтическим ФК продуцируемым штаммом Streptomyces kurssanovii) НМГ. Антитромби-новая активность НМГ с ММ 1,6- 7,4 кДа уменьшается в 3-25 раз (в сравнении с НФГ) со снижением ММ (г = 0,75-0,97; р<0,05). Активность пропив активированного фактора X достигает 170-190 ЕД/мг, отношение активностей аХа/аПа - более 4. Величина аХа активности полученных НМГ возрастает с увеличением ММ при гидролизе НФГ из слизистой оболочки кишечника свиней (i=0,88); в значительно меньшей степени подобная связь прослеживается для НМГ, полученных гидролизом НФГ из легких КРС (р=0,35). Максимальное отношение активностей аХа/аПа у НМГ, полученных деполимеризацией НФГ их легких КРС в 1,5 раза больше, чем у гепаринов, полученных деполимеризацией НФГ из слизистой оболочки кишечника свиней. Однако в диапазоне ММ 1,6-2,7 кДа аХа активность НМГ из слизистой кишечника свиней больше, чем у НФГ; то есть, на АК акгавность НМГ (в указашшых пределах ММ) влияет тип ткани НФГ. Количество и состояние (иммобилизованный или в растворе) ФК, а также время действия и температурный режим играют роль при получении антикоагулянтов с высокой активностью.

Рис. 1 Антикоагулянтная активность некоторых низкомолекулярных гепаринов (НМГ), полученных гидролизом нефракционированных гепаринов (НФГ) хитинолитическим ферментным комплексом (ФК) Зггер1отусе$ кигязапочп (содержит четыре хитиназы, хито-заназу, Ы-ацетил-О-глюкозоаминидазу и протеазу; иммобилизован на силохроме); по оси X - молекулярная масса, кДа; * - (р<0,05- 0,001} достоверность различий с антикоагулянт-ной активностью НФГ.

250 * | 200 -X § 150 1 рмо i S0- I 0 - * -т m Dlllt «•Sa 1

МкДэ 4КД» 5,4 КД» 14 кД. Мел* хуля рнм маем; кД«

Рис. 2 Антикоагулянтная активность НМГ, полученных гидролизом НФГ из легких КРС (ОАО "Синтез") ФК протеаза С (на основе штамма Асгетотит сИгузоёепит; в состав входят сериновая протеаза I, сериновая протеаза II, нейтральная протеаза, карбоксипепти-даза, аминопептидаза ) иммобилизованным на поливиниловом спирте; * - (р<0,05- 0,001) достоверность различий с АК активностью НФГ.

При снижении ММ НМГ до 3,4-5,8 кДа, полученных гидролизом НФГ из легких крупного рогатого скота протеолитическим ФК протеаза С, достоверно снижается alla активность, аХа активность возрастает и максимум составляет 208±9 ЕД/мг; отношение активностей аХа/а11а достигает 1,5-2,5 раза (рис. 2).

Анти Ха активность НМГ, полученных гидролизом НФГ папаином составляет -140-220 ЕД/мг (рис.3). Отношение активностей при гидролизе иммобилизованными ферментами достигает 1,3. Однако при гидролизе ферментами в растворе отношение активностей aXa/alla возрастает до 1,7-2,5 за счет снижения alla активности.

Отношение активностей aXa/alla НМГ полученных гидролизом НФГ из легких КРС химотрипсином и целловиридином [ФК карбогидраз целлюлолитического действия штамма Trichoderma reesei (viride)] составляет 1,3, хотя максимальная аХа достигает 160180 ЕД/мг. НМГ с ММ 6,8 и 9,3 кДа, полученные гидролизом НФГ лизоцимом, продемонстрировали отношения активностей 1,3. Некоторые авторы в работах последних лет рассматривают преимущества НМГ с оптимальными ММ в диапазоне 9-12 кДа, так называемые гепарины со средней ММ (СМГ). Геморрагическая активность СМГ несколько выше, чем у НМГ, но их АК активность успешнее нейтрализуется, что увеличивает безопасность таких лекарственных средств [Alban S. и др., 2002].

5 s

iâ к

Ь

я о

5.3*4»

6-8*0»

1*»

(шпаинСВиопрогрмс^имиобялтомнт смлохром*

6ДКД1 4Hfiß 7,5*0«

папаии папаии {"Sema" ) папами

("биопрофвсс") •раетаора Рбнопрофче")

иммобилюомм iptcnop«

на ЛВС

Рис. 3 Антикоагулянтная активность НМГ, полученных гидролизом НФГ из легких крупного рогатого скота (ОАО "Белмедпрепарат") папаином; по оси X - молекулярная масса, кДа; * - (р<0,05- 0,001) достоверность различий с АК активностью НФГ._

Таким образом, для получения НМГ с отношением активностей аХа/аПа больше 1 (в основном, за счет снижения антигромбиновой активности) можно использовать для гидролиза НФГ (из легких крупного рогатого скота или слизистой оболочки кишечника свиней) неспецифические ферментные комплексы и ферменты. Способность ингибировать активированный фактор X, у некотрых фракций НМГ, в сравнении с исходными НФГ достоверно увеличивается на 8-13 %. Это может свидетельствовать о том, что при гид-

17

ролизе НФГ использованными неспецифическими ФК и ферментами не затрагиваются последовательности сахаридов, ответственные за связь с плазменным ингибитором сери-новых протеаз - аигитромбииом [Bisio А. и др., 2009]. Снижение антитромбиновой активности НМГ с уменьшением ММ закономерно [Atkinson Н.М. и др. 2009].

Для определения возможности комплексообразования между полученными НМГ (гидролиза НФГ ФК Slreptomyces kurssanovii или протеаза С) и поликатионами [хитозан (СД 61-85% и ММ 4-21 кДа) и сульфат протамина (ПСТ)] использовали биоспецифичный электрофорез и турбидиметрическое титрование. Добавляя факции НМГ в лунки геля ага-розы с поликатионами наблюдаем пики преципитации комплексов полианион-поликатион, появляющиеся в результате электрофореза [Weeke В., 1973]. На рис. 4 и 5 показаны сканированные изображения пиков преципитации после электрофореза. Размеры пиков преципитации (высота и площадь) тесно коррелируют с ММ и специфическими АК активностями НМГ (ruu= 0,6-0,93; т»щ=0,55-0,92; г„ха= 0,73- 0,93), что предполагает применение этого метода для выбора наиболее активных НМГ, при анализе большого количества образцов. Структурные характеристики поликатионов-хитозанов влияют на размеры пиков преципитации. Так, с увеличением ММ при СД 85% и с увеличением СД при ММ 21 кДа увеличивается высота пиков преципитации. При анализе результатов турбидимет-рического титрования показано, что с увеличение степени дезацетилирования хитозанов увеличивается сила положительной связи с ММ исследуемых НМГ. Дня появления комплексов на 1 мг НМГ требуется 0,8 - 1,4 мг ПСТ и хитозанов. Определение связи между ММ, антикоагулянтной активностью НМГ, структурными характеристиками хитозанов и размерами пиков преципитации позволило выбрать наиболее оптимальные поликатионы.

Известно, что ПСТ частично нейтрализует АК активность НМГ, используемых в клинической практике [Crowther М.А. и др., 2002]. Однако ПСТ полностью нейтрализует аХа и alla активности НМГ с ММ 4,7; 5,1 и 7,4 кДа (получены гидролизом НФГ ФК S. kurssanovii) в исследованиях с применением амидолитических тестов; гравиметрическое отношение антидот : аятикоагулянт= (0,7 -1):1.

Но при нейтрализации ингибирования НМГ с ММ 7,0 кДа [гидролиз НФГ лизоци-мом) фибриногенсвертывающей активности тромбина (гравиметрическое отношение ан-тидот:ангикоа1улянт= (0,5 -1): 1] остаточная alla активность составила 20%, по отношению к контролю, что совпало с данными по нейтрализации антитромбиновой активности НФГ. Хитозан с ММ 21 кДа и СД 61% нейтрализует ингибирование НМГ с ММ 7,0 кДа (гидролиз НФГ лизоцимом) фибриногенсвертывающей активности тромбина. Антитромбиновая

активнотсь НМГ-7,0 снижается более, чем в 1,5 раза, при весовом отношении поликатион:

18

полианион = 0,3. Хитозаны с ММ 16 и 21 кДа (степень дезацетилирования 91 и 61%) нейтрализуют на 25-100% ингибирование НМГ с ММ 2,7 - 7,4 кДа и НФГ амидолитической активности тромбина. Таким образом, alla и аХа активное™ некоторых полученных НМГ можно нейтрализовать ПСТ и хитозанами с ММ 16 и 21 кДа в амидолитических и коагу-лологических тестах. Нейтрализация осуществляется за счет появления комплексов поликатион - полианион.

» » » * ». • »»»»«» »i

i

: ;;

;

'А ■

2а 2Ь За ЗЬ 4в 4b 1а 5а 5Ь 6а

ЗЬ За

6а 1Ь

1а 16 1в 2а 26 2в ЗаЗбЗв 4а 46 4в 5а 56 5в

Рис. 4. Электрофорез гепаринов в агарозном геле с сульфатом протамина (А) и хитозаном (В, ММ 16 кДа, СД=-91%); количество АК в лунках: а-1,25 мкг, Ь-2,5 мкг; номер лунки: 1-НФГ 15 кДа; 2- НМГ 5,1 кДа; 3- НМГ 7,4 кДа; 4- 4,7 кДа; 5- 4,0 кДа; 6-2,7 кДа.

Рис. 5. Электрофорез гепаринов с хитозанами в геле агарозы (А - хитозан-HCl, СД 85%, ММ 10 кДа; Б - хитозан-HCl,СД 93%, ММ 7,4 кДа); номер лунки: 1- НФГ 14 кДа; 2- НМГ 7,4 кДа; 3- 5,1 кДа; 4- 4,7 кДа; 5 - 4,0 кДа; концентрация АК в лунках: а - 0,25; б - 0,5; в - 1 мг/мл._

На основе патента (Ks 2221578 от 24.10.2002 г. "Способ получения очищенного активированного фактора X свертывания крови"), полученного нами в соавторстве с сотрудниками лаборатории стандартизации методов контроля препаратов плазмы ГНЦ РАМН разработан набор "РеаХром-гепарин" (НПО "Репам") позволяющий определять аХа активность плазмы при введениях НМГ экспериментальным животным и человеку, а также оценивать удельную аХа активность разрабатываемых НМГ и других соединений. Достоверность определений аХа активности с помощью набора "РеаХром-гепарин" НПО Ренам, в сравнении с определениями набором Berichrom heparin (Dade Behring), подтверждается статистическими параметрами, обычно используемыми в исследованиях такого рода.

Фармакодинамические (ФД) параметры НМГ с ММ 4,7 кДа и 5,4 кДа (НМГ-4,7; НМГ-5,4 при в/в введении кроликам в дозах 0,3 - 3,0 мг/кг и при п/к введении в дозах 3 -30 мг/кг ) и НМГ-6,8 (при п/к введении в дозах 70 - 300 аХа ЕД/мг) по alla, аХа активностям и времени свертывания плазмы в тестах ВСК и АЧТВ соответствуют ФД параметрам коммерческого НМГ эноксапарина [Alban S. и др., 2002] и совпадают с ФД параметрами фраксипарина, который использовали для сравнения. Сравнение отношений aXa/alla активностей плазмы кроликов после п/к введения исследуемых НМГ с отношением специфических активностей показало увеличение первых до 0,87-1,74 (для НМГ-4,7), 0,98-10,46 (для НМГ-5,4) и 1,25-3,44 (для НМГ-7,0). Подобное может свидетельствовать о возможном влиянии этих АК на выброс из эндотелия сосудов ингибитора внешнего пути свертывания [Harenberg J. И др., 2002]; известно, что уровень этого ингибитора в плазме повышается в 2-4 раза при п/к или в/в введении НМГ [Demirkan А. и др., 2002].

НМГ-4,7 (alla - 68±8 ЕД/мг; аХа -155±23 ЕД/мг; отношение активностей aXa/alla -2,3), НМГ- 5,4 (alla - И0±11 ЕД/мг; аХа - 168±19 ЕД/мг; отношение активностей aXa/alîa - 1,53) и НМГ-6,8 (alla - 115±13 ЕД/мг, аХа - 152±10 ЕД/мг; отношение активностей aXa/alla - 1,32) в одинаковой степени и также эффективно, как и фраксипарин, препятствуют развитию экспериментального тромбоза у крыс (рис. 6). Такие показатели как: форма тромба в баллах, вес влажного тромба, содержание белка при дозах 39 - 390 ЕД/кг у НМГ-4,7 и НМГ- 5,4, сопоставимы с такими же показателями для фраксипарина. По всей вероятности, НМГ-4,7 и НМГ-5,4 обладают сравнимой противотромботической активностью в силу того, что НМГ-4,7 имеет меньшую величину специфических активностей, но большее соотношение активностей aXa/alla, а НМГ-5,4 - несмотря на меньшее отношение

активностей aXa/alla демонстрирует большую величину специфических активностей. Геморрагическая активность НМГ с ММ 4,7; 5,4 кДа и фраксипарина одинакова.

Таким образом, деполимеризация НФГ из легких КРС или слизистой оболочки тонкого кишечника свиней посредством неспецифических гидролаз, приводит к получению образцов НМГ с высокими аХа активностями до 150 -200 ЕД/мг, что сравнимо с аХа активностью коммерческих НМГ. За снижением ММ НМГ следует снижение alla активности и увеличение отношения активностей аХа/ alla до 4. Использование биоспецифичного электрофореза, способа фиксирования комплексов между гепаринами и сульфатом прота-мина/хитозанами (СД 61-85% и ММ 6-21 кДа), облегчает выбор эффективного антидота Специфическую АК активность полученных НМГ можно успешно нейтрализовать с помощью сульфата протамина. Обнаружен образец хитозана, который частично (на 42%) нейтрализует alla активность НМГ (в весовом соотношении 3:1). С увеличением дозы НМГ-4,7 (гидролиз S. kurss.), НМГ-5,4 (гидролиз протеазой С) и НМГ-6,8 (гидролиз лизо-цимом) увеличиваются alla и аХа активности плазмы кроликов при в/в и п/к введениях. При п/к введении полученных НМГ кроликам период полувыведения сопоставим с периодом полувыведения фраксипарина в одинаковых дозах. Антитромботическая и геморрагическая активности НМГ-4,7 (гидролиз НФГ S. kurss.) и НМГ-5,4 (гидролиз НФГ протеазой С) сравнимы с таковыми у фраксипарина. В 2008 г. осуществили первый этап токсикологических испытаний НМГ-6,8 по программе Фармкомигста в лаборатории лекарственной токсикологии НИИЭК ФГУ «РКНПК» Росздрава. Социально-экономическая значимость результатов бесспорна, так как НМГ-6,8 может быть в 3-8 раз дешевле существующих на рынке Российской Федерации импортируемых НМГ.

2. Влияние сульфатированных хитозанов с молекулярной массой 20-123 кДа на свертывающую систему крови в экспериментах in vitro в in vivo.

В связи с тем, что сырьевая база НМГ снижается, так как мировые производители переходят на источник НФГ из слизистой оболочки кишечника свиней, а также отсутствие отечественных производителей НФГ, повысился интерес к АК средствам на основе сульфатированных хитозанов. Хитозан - производное природного биополимера - хитина, второго (после целлюлозы) по распространенности в природе органического вещества, запасы которого возобновляются и практически неисчерпаемы. Мы исследовали АК активность образцов сульфатов хитозана с ММ 20-123 кДа и степенью сульфатирования 0,621,86. Наибольшие alla активности (35-40 ЕД/мг), определенные по Фармакопейной статье

с плазмой овец in vitro, показали образцы с ММ 55 до 82 кДа и количеством серы 15-17%.

21

Активности против фактора Ха не обнаружено. Не обнаружено и какой-либо связи между АК активностью и ММ в представленном диапазоне (г = - 0,3; р< 0,05). В тоже время, отмечено снижение alla активности с уменьшением содержания серы (г = 0,6; р<0,05).

Расчет alla активности сульфатов хитозана in vivo проводили по графикам кривых выведения. При этом, допускали, что кинетика элиминации образцов при в/в введении нелинейна, а также линейное приближение зависимости антикоагулянтного эффекта от дозы СХ. Антитромбиновую активность выражали по отношению к рабочему стандарту, прокалиброванному в единицах активности Международного стандарта НФГ. Максимальные alla активности СХ составили 42-52 ЕДмг. При сравнении alla активностей, рассчитанных по Фармакопейной статье, и при в/в введении кроликам отмечали несовпадение величин специфических активностей (рис. 7). Подобное может найти объяснение в разной чувствительности плазмы овец и кроликов для некотрых образцов, что может быть связано с различиями в структурной формуле исследуемых веществ.

С целью подтверждения адекватности определения alla активности в системе in vivo проводили сравнительный анализ фармакоки-нетических (ФК) параметров, полученных на основании математической модели и измеренных с помощью определения количества СХ при проведении биоспецифичного электрофореза с хлоридом цетилпи-ридиния [Drozd N. и др., 2002]. Коэффициенты корреляции для периодов полувыведения соответствовали в среднем 0,98, а для констант элиминации (- 0,97). Подобное свидетельствует о высокой достоверности результатов, полученных с помощью линейной ФК модели, а, следовательно, достоверно и снижение анти-тромбиновой активности для некотрых образцов в системе in vivo.

Образцы СХ с ММ 20-123 кДа и СС 0,62-1,86 обнаружили alla активность 0,5-40,0 ЕД/мг (in vitro) и 0,5—52 ЕД/мг (in vivo). Анти-На активность образцов СХ зависит от ММ и СС. Наиболее активные и длительно действующие продукты имеют СС не ниже 1,6 и

60 |50

£4Н

S зо Н в

Й 20-] «

•3 10

Din vivo ■In vitro

ш iliL

1 3 5 7 9 11 13 15 номер СХ

Рис.7. Сопоставление антитромбиновой активности образцов СХ, измеренной по Фармакопейной статье (in vitro), и при внутривенном введении кроликам (in vivó)

ММ 61-75 кДа. Эти параметры следует принять за оптимум, к которому необходимо стремиться при отработке технологии получения аналогов НФГ на основе СХ

НФГ образует с антитромбином (AT) эквимолярный стехиометрический комплекс [Sugahara К. И до., 2003]. Нами показано, что СХ с ММ 75 кДа (содержание серы 13,7%) и AT объединяются в эквимолярном комплексе. На этом же образце СХ исследовали механизм АК действия. Исходя из определенного сходства структурной организации и специфического действия, оказываемого НФГ и СХ на инактивацию свертывания крови по внутреннему и внешнему путям, исследовали влияние последнего на alla активность плазмы в условиях реакций псевдо-первого порядка. Показано, что СХ в конечной концентрации 0,2 ЕД/мл катализирует инактивацию свертывающей активности плазмы плазменными ингибиторами с константой ингибирования псевдо-первого порядка 0,24 мин-1. Для достижения одинаковой скорости инактивации свертывающей активности плазмы плазменными ингибиторами в присутствии НФГ и СХ, последнего требуется в 2,5 раза больше.

СХ ускоряет инактивацию тромбина AT и кофактора гепарина II (ГКII) в реакциях с фибриногеном. Константы ингибирования псевдо-первого порядка свертывающей активности тромбина AT в присутствии НФГ (0,03 ЕД/мл) или СХ (0,032 ЕД/мл) сопоставимы и равны 0,43 мин-1 и 0,46 мин-1, соответственно. Константы ингибирования свертывающей активности тромбина ГК II в присутствии НФГ (2 ЕД/мл) или СХ (2 ЕД/мл) составили 0,31 мин-1 и 0,28 мин-1, соответственно. Для достижения 50% ингибирования свертывающей активности тромбина ГК II в присутствии СХ последнего требовалось в 100 раз больше, чем для блокирования активности фермента ангитромбином.

С увеличением концентрации СХ снижается не только каталитическая активность Т по отношению к основному субстрату - фибриногену, но и амидолитическая активность Т (способность расщеплять синтетический хромогенный субстрат, с отделением п-нитроанилида и развитием желтого окрашивания). Исследовали влияние образцов СХ с ММ 45, 75 и 82 кДа на кинетику взаимодействия между AT и Т. Для анализа отобрали СХ с близкими значениями alla активности по Фармакопейной статье (27, 35 и 37 ЕД/мг) и различными по ФД кривым (13, 12 и 52 ЕД/мг). Более сульфатированный образец СХ с ММ 82 кДа (количество серы 15,9%) показал большую alla активность, рассчитанную в системе in vivo. Результаты свидетельствуют о корреляции межу alla активностью образцов СХ in vivo и аффинностью к AT и Т. Константы диссоциации между AT и Т в присутствии образцов СХ составили 16-190 нМ и не коррелировали с alla активностью, измеренной в системе in vitro по Фармакопейной статье. Таким образом, установлено, что для

23

адекватной оценки специфической alla активности образов СХ необходимо использовать для расчета анализ линеаризированных фармакодинмических кривых.

Применяя плазму лишенную AT можно определить необходимость наличия этого серпина для осуществления АК активности ГАГ [Hoogendoorn К. И др., 1980]. Полученная нами плазма человека, лишенная AT содержала 4±1% функционально активного AT (в нормальной плазме - 97±5%). Уровень AT определяли с помощью набора фирмы Технология-стандарт, в разработке которого мы принимали непосредственное участие; получен патент на изобретение № 2195673 от 06.12.2000 г. "Способ определения активности антитромбина ИГ. При сравнении влияния НФГ и образцов СХ с ММ 82 кДа и ММ 123 кДа на время свертывания плазмы без AT в тестах АЧТВ, ТВ и ГепаКлот не отмечали достоверных изменений с увеличением концентрации АК. При анализе ингибирования амидолити-ческой активности Т, также не наблюдали изменений с увеличение концентрации АК в плазме без AT.

При использовании модели венозного стаза у крыс (с активацией внутреннего пути свертывания) наблюдали антитромботическую активность СХ с ММ 75 кДа и содержанием серы 13,7% (Дрозд Н.Н., 1991). При в/в введении СХ в единицах антитромбиновой активности, геморрагический эффект ниже, в сравнении с эффектом НФГ, что можно объяснить незначительным влиянием на тромбоциты и низким агрегационным воздействием СХ при активации аденозиндифосфорной кислотой. ПСТ нейтрализует alla активность СХ в гравиметрическом соотношении 1:1.

Хиторин - механическая смесь СХ (ММ 75 кДа, СС 1,25) и НФГ в весовом соотношении 1:1, Антитромбиновая активность хиторина составляет 80 ЕД/мг, аХа - 83 ЕД/мг. Хиторин можно использовать в/в в дозе 4 мг/кг, что в единицах активности составляет 320 alla ЕД/мг и 332 аХа ЕД/мг. Период полувыведения равен 120 мин, полностью исчезает из кровяного русла через 4 час. Для быстрой нейтрализации АК эффекта в организме можно использовать ПСТ, с которым составляющие компоненты хиторина создают эквимолярные комплексы. При в/в введении хиторина число тромбоцитов снижается в меньшей степени, чем при введении НФГ в такой же дозе. Достоверного снижения числа тромбоцитов в течение 6 час после введения, в сравнении с контролем, не наблюдали. По сравнению с НФГ, хиторин проявляет меньшую геморрагическую активность, почти в два раза. Антитромботическое (АТБ) действие на модели венозного стаза у крыс сопоставимо с действием НФГ. Таким образом, в/в введение экспериментальным животным хиторина вместо НФГ приводит к снижению геморрагического эффекта с сохранением АК и АТБ

активностей. Курс лечения хиторином может стоить дешевле, чем курс лечения НФГ, так как стоимость 1 мг СХ в 10-70 раз меньше, чем стоимость 1 мг НФГ.

3. Антикоагулянтная активность иизкомолекулярных сульфатов хитозана

Исследовали АК активность низкомолекулярных сульфатов хитозана (НМСХ) с ММ 1,6 - 25,0 кДа, полученных несколькими независимыми методами. Антатромбиновая активность НМСХ с ММ 4,5-25 кДа [получены гидролизом высокомолекулярных СХ с ММ 75, 82 и 125 кДа ФК Streptomyces kurssanavii (шифр ХФ)] некоторых фракций образцов с ММ 82 и 125 кДа (рис.8) незначительно возрастает. Однако, для СХ с ММ 75 кДа такого эффекта не наблюдали. Какой-либо связи alla активности с ММ не отмечено. Активность НМСХ против фактора Ха составила 0-3 ЕД/мг, СХ - 0 ЕД/мг. Для получения образцов НМСХ с большей АК активностью использовали СХ с ММ 25 кДа (исходные СХ с ММ 75 кДа - СХ К2, 82 кДа - СХ К1 и 125 кДа - СХ КЗ) и буфер с рН 6,0 (рис. 9). У НМСХ полученных из СХ с ММ 75 и 125 кДа аХа активность увеличивается с уменьшением ММ. Анти-фактор Ха активность полученных НМСХ выше в 1,5-2,0 раза, чем у НМСХ, полученных непосредственно их СХ с ММ 75,82 и 125 кДа.

40

S

К

а го -Sis ¡10 1 S

0

1 о

* . illi.IlliLlIl!

« « - И- 3- Г. Я - „-

СХК1 СХК2 СХКЗ _мапвкуяярщи шая, ад» _

Рис. 8. Антатромбиновая активность образцов СХ с ММ 4,5 - 125 кДа. Сульфатаровали хитозан краба (Биопрогресс, Россия). После гидролиза (рН 4,5) СХ с ММ 75, 82 и 125 кДа ФК Streptomyces kurs. получали фракции НМСХ с ММ 4,5; 6; 8,5; 15 и 25 кДа; * - (р<0,05) достоверность различий с alla активностью СХ с ММ 75, 82 и 125 кДа._

Рис. 9. Антикоагулянтная активность образцов СХ с ММ 1,6-15 кДа. Для получения НМСХ с ММ 1,6; 2,5; 3,7; 5,3 и 15 кДа (с большей аХа активностью) из СХ с ММ 25 кДа ферментативный гидролиз осуществляли при рН 6,0; * - (р<0,05) достоверность различий с АК активностью СХ с ММ 25 кДа.

Анти-фактор Ха активность до 50 -120 ЕД/мг появилась у СХ полученных сульфа-тированием низкомолекулярных образцов (рис. 10). Максимальная аХа активность НМСХ с ММ 25 - 70 кДа (шифр ХЭ), полученных с помощью экструзионного дезацетилирования высокомолекулярных СХ составила 52-61 ЕД/мг, отношение активностей аХа/ alla =1,4 - 22,0 (рис. 10 Б). При сульфагаровании низкомолекулярных СХ, полученных кислотным гидролизом хитозана получили образцы НМСХ с ММ 8-25 кДа (шифр ХК), аХа активности составили 51-131 ЕД/мг, отношение активностей аХа/ alla= 7 — 21 (рис. 10 В). При сульфатировании низкомолекулярных образцов, полученных ферментативным гидролизом Streptomyces hirssanavii, получили образец (ММ 29 кДа, получен из СХ-гидрохлорида) с высокими аХа активностью (68 ± 5 ЕД/мг) и отношением активностей аХа/ alla (5,2) (рис. 10 В). Образцы ММ 1,6-25 кДа (получены из СХ с ММ 50 или 300 кДа, рис. 10 А) показали невысокую антикоагулянтную активность.

ijhjl. .ы.ьш

мсхицда, фсрмктапмным гидоелиаом

на СХ 300 кДа, фармктимммгедеолшом

i §

£

X

Рис. 10. Антикоагулянтная активность сульфатированных НМСХ, полученных кислотным (ХК) / ферментным (ХФ) гидролизами или экструзионным дезацети-лированием (ХЭ).

Сульфатирование низкомолекулярных образцов осуществляли на кафедре технологии химических волокон Московского государственного текстильного университета; ось X - молекулярная масса, кДа; ось У - антикоагулянтная активность, ЕД/мг

СХ с ММ 30 кДа, полученный из исходного хитозана, как СХ с ММ 25 кДа и 35 кДа, полученные из ХЭ-45 кДа, демонструют незначительное отношение активностей с

aXa/alIa, что коррелирует с относительно высокой средней ММ образцов и с низким содержанием низкомолекулярных фракций, а также подтверждается высокими alla активностями (37-85 ЕД/мг) и фактом, что и нефракционированный сульфат хигозана из ХЭ-45 с ММ 25 кДа и его фракция с ММ 15 кДа характеризуются более низкой alla активностью, соответственно более высоким отношением активностей aXa/alIa. Очевидно, что ММ 15 кДа не достаточно низка, для того чтобы аХа активность возрастала. Даже понижение ММ СХ до 11 кДа (получен ферментативным гидролизом хитозана) не обеспечивает достижение высокой аХа активности. И только два образца СХ со средней ММ 8-10 кДа (получены из хитозана ХК), и, очевидно, более обогащенные низкомолекулярными фракциями, демонстрируют довольно высокую аХа активность, в 4-5 раз превышающую alla активность. С уменьшением ММ образцов СХ аХа активность возрастает. Коэффициент корреляции между аХа активностью и ММ составляет г =-0,64. Изменение содержания серы, в пределах 15,7-16,2 %, фактически не влияет на активность (г = 0,03). Для alla активности обнаружена положительная корреляция с ММ (г = 0,69) и содержанием серы (г = 0,38). При сульфатировании хитозанов происходит существенное снижение степени полимеризации полимеров - в 2-4 раза, что обеспечивает получение СХ, ММ которых находится на уровне таковых коммерческих образцов НФГ (10-20 кД), но превышает ММ НМГ. Анализ связи между структурными элементами исследуемых аминогликанов и АК активностью позволил заключить, что: 1. Данные относительно зависимости аЛа активности образцов СХ от ММ противоречивы (от умеренной степени зависимости до отсутствия таковой), по всей вероятности, в силу различия способов приготовления образцов СХ. Однако это не помешало всем исследованным образцам СХ, независимо от способа приготовления, продемонстрировать умеренно-сильную связь аХа активности с ММ. 2. С увеличением количества серы alla активность образцов СХ возрастает, при этом связь не сильная. Анти - Ха активность исследованных СХ либо возрастает с увеличение количества серы, либо не зависит от содержания серы.

Химически модифицированные полисахариды привлекают большой интерес, так как, изменяя структуру можно добиться увеличения АК активности. При карбоксимети-лировании СХ с ММ 56 кДа антитромбиновая активность увеличивается в 10 раз, аХа - в 6 раз.

С помощью биоспецифичного электрофореза в геле агарозы продемонстрировано наличие комплексов между СХ с ММ 9-40 кДа (количество серы-12,0т16,8%, alla активность 13-58 ЕД/мг, аХа активность 2-112 ЕД/мг) и сульфатом протамина (ПСТ). С увеличением аХа активности высота пиков преципитации возрастает (г = 0,75 - 0,92, рис. 11),

27

тесная отрицательная корреляция существует между высотой (h) и площадью (S) пиков преципитации, с одной стороны, и количеством серы (гб.ъдм—О.ОД; р<0,05) и alla активностью (гапад,5оо=-0,8б; р<0,05), с другой. Умеренная отрицательная связь от г -0,41 до -0,74 (р<0,05) отмечена между ММ и размерами пиков преципитации.

Замечено, что контуры пиков преципитации у СХ с ММ 10 кДа наиболее четкие и выраженные, а сами пики более светлые, в отличие от более темно окрашенных с менее выраженными границами пиков преципитации СХ с большими ММ. Подобное может свидетельствовать о меньшей подвижности комплексов СП с СХ с ММ больше 20 кД.

Комплексообразование СХ с ММ 9-40 кДа с хитозанами [ММ 6-21 кДа, степень дез-ацетилирования (СД) 61-93%] также показано при биоспецифичном электрофорезе в геле ага-розы. Все образцы хигозанов демонстрируют наличие пиков преципитации с сульфатами хитозана. Сравнимый с ПСТ эффект показали образцы хитозана с ММ не ниже 6 кДа и СД 60-85%.

13

S

à 12

s i 11

X з- 10

ï. С m !»

¥ >

?

Я ;

о

i t

s

О О,S 1 1,5 2 2,5 _lg (аХа. ЕД/мг)_

Рис 11. Высота пиков преципитации между СХ с аХа активностью 2-112 ЕД/мг (ММ 9-40 кДа, количество серы 12,0-16,8%, alla активность 13-58 ЕД/мг) и сульфатом протамина_

0,J

$ o>

i 0.5

ï 0,4

• 0,J

:r

£ Of

t 0.1

0

ОЭкДаСХ агЭкДаСХ 130КД1СХ В40цДаСХ

1

24,6 16

J6.S

« -0.1

X X

I "°'г I -е.»

| -0,4 «

§ -О.!

к ?

-0.7 •OÎ

14,6 1*

□ 9«Д»СХ «29*Д«СХ ■ ЗОкДаСХ В<0«Д>СХ

количество серы шСХ.*

Рис. 12 Коэффициенты корреляции (р<0,05) между молекулярной массой хитозанов и высотой пиков преципитации с сульфатами хитозана (СХ)_

Рис. 13. Коэффициенты корреляции (р<0,05) между степенью дезацетилирования хитозанов и высотой пиков преципитации с СХ

0НФГ15кДа »НМГЧТхДа "СХ9кД> 0J С 'M i fi ¿i Ш I К ПСТ -VMM:I ХДбкДа, кДа.СД- СД-9Н» 61«* C.2S Ju 0 f№ 0 ... . ОНФГ 15кДа ■ХШГ4.?кД1 «ОС9кДа ■ Jm К ПСТ Х.ММП Х,16кД>, к&.СД- СД-М!» «•а

А. Влияние поликатионов (конечная концентрация 0,03 мкг/мл) на ингибирование антикоагулянтами (К; 0,03 мкг/мл) амидолитической активности тромбина Б. Влияние поликатионов (конечная концентрация 0,03 мкг/мл) на ингибирования антикоагулянтами (К; 0,03 мкг/мл) амидолитической активности фактора Ха

Рис. 14. Нейтрализация хитозанами (X) с ММ 16 кДа и 21 кДа и сульфатом протамина (ПСТ) ингибирования антикоагулянтами амидолитической активности тромбина и фактора Ха (без антикоагулянтов А 405/мин=150±0,03 для рис. 14 А и 0,200±0,028 для рис. 14 Б); * - (р<0.05) достоверность различий с показаниями К.

В диапазоне количества серы в СХ ¡4,6 - 16,8 % коэффициенты корреляции между высотой пиков преципитации и ММ поликатионов-хитозанов возрастают до 0,47-0,58 (рис.12). С увеличением степени дезацетилирования поликатионов-хитозанов высота пиков преципитации для СХ с ММ 9-30 кДа снижается [г = (-0,59) - (-0,77] (рис. 13).

Ингибирование амидолитической активности Т посредством СХ с ММ 9 кДа нейтрализовали с помощью ПСТ и хитозана с ММ 16 и СД 91%. В меньшей степени нейтрализует alla активность хитозан с ММ 21 кДа и СД 61% (рис. 14 А). ПСТ полностью снимает ингибирование амидолитической активности фактора Ха у СХ и только на 17% у НФГ и НМГ (рис. 14 Б).

Влияние сульфатированных полисахаридов из бурых морских водорослей, травянистых и древовидных высших растений на свертывание крови человека и экспериментальных животных in vitro и in vivo.

Учитывая случаи появления заболеваний обусловленных прионами, которые могут сопровождать лекарственный материал из тканей млекопитающих [Díaz-Nido J. и др.,

2002], внимание исследователей привлекают полисахариды из водорослей, травянистых и древовидных растений [Farias W.R.L. и др., 2002; Matsubara К, 2004; Ciancia М.и др., 2007].

1. Аитикоагулянтная активность фукоиданов и сульфатированной альгиновой кислоты из бурых морских водорослей in vitro и in vivo.

В последнее время возрос интерес к нанообъектам различной природы. Это связано с тем, что многие физические, химические и биологические свойства наночастиц значительно отличаются от аналогичных свойств у макроскопических объектов. Аититромби-повая активность сульфатированной альгиновой кислоты из бурой водоросли Macrocystis pyrifera (MM 48-186 кДа) составляет 76 ЕД/мг (у альгиновой кислоты АК активнотси нет). Анплромбиновая активность сульфатированной альгиновой кислоты в наноструктурах (70-100 нм) достоверно увеличивается в 1,3 раза (рис. 15), аХа - в 2 раза при использовании™ качестве осадителя СаСЬ (рис. 16).

120 -|

100 -11

iiй-

II-

ш I»

20 -О -

12 3

Рис. 15. Анплромбиновая активность сульфата альгиновой кислоты в растворе (1) и в виде наночастиц [2- осадитель СаСЬ, 3- осадитель Ва(МОз)2], измеренная в тесте АЧТВ

9 к'

8 а

7 £

е

5 §

4 i

3 \

¿ *

1 *

о

12 3

Рис. 16. Анти-факгор Ха активность сульфата альгиновой кислоты в растворе (1) и в виде наночастиц [2- осадитель СаС12, 3- осадитель Ва(Шз)2], измеренная в тесте РеаКлот

□alta, ЕД/мг 2АЧТВ,мкг/м|л

г 2,5

tí

th

2 §

а

£

ÍJ

wf

0.51

Мо *■

30 b 25

х 15 а

1 ю н «

* 5

О

OiXa,ЕД/мг В2РезКлот,мкг *

í *

-f

i

i

b

В отличие от альгиновой кислоты из бурых водорослей нативные фукоиданы суль-фапгированы. Фукоиданы, выделенные из водорослей Fucus evanescens, Undariapinnatifida, Laminaria gurjanovae, Laminaria japónica, Laminaria cichorioides. Costaría Costata, Laminaria saccharina с ММ 20 - 80 кДа влияют на внешний и общий пути свертывания крови уд-линияя время появления фибринового сгустка в тестах тромбинового и протромбинового

30

времени; ингибируют активность тромбина (alla активность достигает 1,9 - 53,2 ЕД/мг) и фактора Ха (аХа активность - 6,1 - 31,4 ЕД/мг) свертывающей системы крови. Различия в ингибировании сериновых протеаз связаны с тем, что моносахаридный состав исследованных фукоиданоз, количество серы и ММ различаются, а также присутствием разных типов гликозидных связей в молекулах полисахаридов. Так, АК активность возрастает с увеличением количества серы, снижением количества ксилозы и увеличением количесвта фукозы. Почти у всех фукоиданов, за некоторым исключением, в амидолигических определениях (в "чистой системе" с антитромбином и тромбином) снижается на один - два порядка активность в сравнении с коагулологическими определениями, это свидетельствует о том, что свою активность фукоиданы осуществляют, в основном, посредством не антитромбина, а других серпинов.

Дезацегилирование фукоидана из водоросли Fucus evanescens приводит к изменению способности фукоидана ингибировать активность тромбина и фактора Ха (по всей вероятности, ацетаные группы необходимы дня проявления АК активности), тогда как после очистки его от белка и полифенолов АК активность снижается. Гидролиз фукоиданов из бурых водорослей F. evanescens и L. cichorioides иммобилизованным целлюлоли-тическим ФК целповиридин привел к получению фракций с большим отношением активностей aXa/alIa (до 2,3) и меньшей АК активностью, которая коррелирует с величиной пиков преципитации с ПСТ при биоспецифичном электрофорезе. С целью деполимеризации фукоидана из бурых водорослей F. evanescens использовали гепариназу и получили фракции с ММ 8-18 кДа, у которых способность ингибировать амидолитическую активность Т посредством AT исчезает. При сохранении ингибирования фибриногенсвергы-вающей активности тромбина это может свидетельствовать о вероятности участия в коагуляции кофактора гепарина II или о разрушении сайта молекулы полисахарида, ответственного за связь с антитромбином.

Фукоидан из водоросли F. evanescens в конечных концентрациях 0,01-5,00 мг/мл не способстует агрегации тромбоцитов человека; в конечных концентрациях 0,1-0,5 мг/мл достоверно снижает в 1,5-1,8 раз АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека.

Ферментативная деполимеризация фукоидана из водорослей Laminaria saccharina (аХа = 9,6±0,9 ЕД/мг) при обработке экстрактом из гепатопанкреаса камчатского краба приводит к получению образа с достоверно большей в 1,7 раз ингибиторной активностью по отношению к фактору Ха, антитромбиновая активность не увеличивается. Анализ

за

двойных эффективных концентраций в коагулологических и амидолитических тестах показал, что для осуществления alla активности необходим AT. Для осуществления аХа активность требуются другие серпины. Значительную роль в проявлении АК активности фукоидана из водорослей L. saccharina играют остатки фукозы и сульфат, что определено в результате анионообменной хроматографии. В зависимости от состава исследованных фракций фукоиданов для проявления alla активности необходимы либо только AT (для фукоидана с наибольшим количеством серы и фукозных остатков), либо еще и другие серпины. Снижение аХа активности в 5-10 раз при определениях в тестах с AT ("чистая система") свидетельствует о необходимости других серпинов.

□ ПСТ 0 миг/мл ■ ПСТ 0,67 мкг/мл т

Lamlnaria cichorioidcs, мкг/мл

Рис. 17. Нейтрализация антитромбиновой активности фукоиданов сульфатом протамина в тесте АЧТВ; * - (р<0.05) достоверность различий с данными ПСТ 0 мкг/мл при снижении антитромбиновой активности__

Показана электрофоретическая подвижность комплексов исследованных фукоиданов (нативных; дезацетилированных; фракций с меньшей ММ, полученных ферментативным гидролизм нативных) в агарозном геле с сульфатом протамина. Фукоиданы со специфическими АК активностями менее 5 ЕД/мг не образуют комплексы с ПСТ. Величина пиков преципитации сильно положительно коррелирует с антитромбиновой и аХа активностями и слабо - с количеством фукозы. С увеличением ксилозы размеры пиков преципитации уменьшаются. Чем больше концентрация фукоидана, тем больше размеры пиков преципитации. Зоны преципитации гидролизованного образца фукоидана имеют характерные для низкомолекулярных сульфатированных полисахаридов размытые контуры.

Сульфат протамина нейтрализует alla активность фукоиданов из Fucus evanescens (рис. 17 А) и L. cichorioides (рис. 17 Б) в тесте АЧТВ. Гравиметрическое отношение анти-

дот/антикоагулянт для фукоидана из F. evanescens составляет 1, для фукоидана из L. ci-chorioides находится в диапазоне 0,67-1,35 (сравнение с НФГ: 0,75-1,49). Известно, что 1 мг ПСТ нейтрализует 100 ЕД (0,53-0,83 мг) НФГ fFourtounas С, 2008]. Учитывая большую в 5-6 раз alla активность НФГ, можно утверждать, что механизм нейтрализации АК активности исследованных фукоиданов сульфатом протамина отличается от такого же механизма у НФГ.

1 . пформафомба, балл

■ 11Т Внес тромба, мг

Il Ifc" • ■ ft¿

0 мг/кг 2,5 5 мг/кг 7 «г/кг 10 мг/кг «г/кг

1

мг/мг

17 мг/кг

НФГ

Рис. 18. Антитромботический эффект фукоидана из F. evanescens; * - (р<0,05) достоверность различий с показаниями в контроле (0 мг/кг)_

Рис. 19. Геморрагический эффект фукоидана из К evanescens: * - (р<0,05) достоверность различий с показаниями для НФГ

Внутривенное введение фукоиданов из водорослей F. evanescens (крысам в дозах 1,3 и 5 мг/кг; кроликам в дозах 5 и 10 мг/кг) и L. cichorioides (крысам в дозах 1,3 и 5 мг/кг) приводит к возрастанию АК активности и длительности действия с увеличением дозы. Наблюдали достаточную для терапевтического эффекта alla активность плазмы крыс до 2,5 и 3.0 ЕД/мл. Анти-фактор Ха активность плазмы крыс при введении фукоидана из L. cichorioides достигает 1 ЕД/мл. Несмотря на большее соотношение активностей аХа/а11а плазмы крыс для фукоидана из F. evanescens, сила и длительность АК эффекта фукоидана из L. cichorioides больше. Это можно объяснить различием в специфических alla активностях образцов (у фукоидана из L. cichorioides alla активность в два раза выше, чем у фукоидана из F. evanescens), при практически одинаковых ингибиторных активностях по отношению к фактору Ха.

По весу влажного тромба, полное ингибирование роста тромба на модели венозного стаза у крыс наблюдали при дозах фукоидана из F. evanescens 7 и 10 мг/кг (рис. 18). Ге-

моррагический эффект фукоидана из F. evanescens выражен в меньшей степени, чем у НФГ (рис. 19).

Наиболее перспективными для углубленного фармакологического исследования являются образцы F. evanescens, U. pinnatiflda, L. gurjanovae.

2. Антикоагулянтная активность сульфатированных галактоманнанов и ара-биногаластана in vitro и in vivo.

Одним из доступных видов растительных полисахаридов считается арабиногалак-тан, который содержится в древесине лиственницы сибирской в количестве до 20 % массы. Антитромбиновая активность равная 2 ЕД/мг появляется при сульфатировании араби-ногалакгана из древесины лиственницы до степени сульфатирования 4 %. Известно, что АК активность сульфатированных полисахаридов увеличивается с возрастанием количества серы [Li В. и др., 2009; Costa L.S. и др., 2009].

Специфические АК активности сульфатированных галактоманнанов (СГМ) из семян бобового травянистого растения Cyamópsis tetragonólobus с ММ от 54,2 до 245,6 кДа достигают 76 - 87 alla ЕД/мг и 6,8 - 12,6 аХа ЕД/м и не зависят or ММ (рис. 20).

При в/в введении СГМ с ММ 127 кДа (alla активность - 35,8 ± 1,8 ЕД/мг; аХа - 6,6 ± 0,5 ЕД/мг) время свертывания плазмы крыс в тесте АЧТВ удлиняется с увеличением дозы от I до 3 мг/кг. Активность плазмы против тромбина в результате введения СГМ возрастает с увеличением дозы. Продолжительность эффекта достигает 180 - 300 мин. То есть, СГМ с ММ 127 кДа и степенью сульфатирования 1,46 при невысокой специфической alla и совсем незначительной аХа активностях вызывает высокую АК активность плазмы при внутривенном введении крысам. Противотромботическую активность в 100% наблюдали при дозе 3 мг/кг. Для достижения одинакового АТБ эффекта СГМ потребуется в 1,8 раза больше, чем НФГ (рис. 21).

¿00,00 J 90,00 080,00 ? 70,00

азХа,ЕД/мг «alla,ЕД/мг

12,60 54,2 81,9 132,3 200,1 245,6 молекулярная масса, кДа

Рис. 20. Антикоагулянтная активность сульфатированных фракций галактоманнана гуар из Cyamópsis tetragonoloba (L.) Taub.

При проведении биоспецифичного электрофореза наблюдали перемещение комплексов между исследуемыми образцами СГМ и ПСТ. Характер комплексов преципитации ПСТ/СГМ и ПСТ/НФГ несколько отличается в силу структурных различий полианионов. Высота и площадь пиков преципитации возрастает с увеличением концентрации как НФГ, так и СГМ.

4,5 § 4 » 3,5

ё з I W

Ê 2

g"1'?

S 1

I 0,5 0

п

□ форма тромба, балл ■ вес тромба, мг

U3

0 ■ оМ

1 2 3 1 1,7

TM-HS03Na НФГ

доза, мг/кг

я ю

5

в

6

а

Рис. 21. Атшромботическая активность СГМ (ГМ-ШОзЫа) с ММ 127 кДа на модели венозного тромбоза у крыс; достоверность различий с показаниями в конгроле (доза 0 мг/кг) при введении 1мл физиологического раствора: * - р< 0,05- р< 0,001; п=10.

Агрегация тромбоцитов человека, вызванная добавлением АДФ достоверно снижается в 1,9 - 6,8 раз при инкубации с СГМ (ММ 127 кДа) в концентрациях 0,1 - 0,5 мкг/мл (в сравнении с контролем 67,1±4,1 %).

Антикоагулянтная активность образцов СГМ из травянистых и древовидных растений семейства бобовых [Гуар из Cyamópsis tetragonólobus (L.) Taub. - однолетнее травянистое растение из семейства бобовых; Галега Galega orientalis Lam - Козлятник восточный - многолетнее травянистое растение из семейства бобовых; софора из семян софоры японской (Styphnolobium japonicum - листопадное дерево семейства бобовых и ГМ Локуст бин (Locust Bean) из - смолы рожкового дерева (Ceratoniae fructus)} возрастает с увеличением отношения Man:Gal. AK активность значительно снижается (в 1,34 раза по alla активности и в 90 раз по аХа активности) после ферментативного гидролиза СГМ Гуар из

однолетнего травянистого растения семейства бобовых Cyamôpsis tetragonôlobus (L.) Taub. целлюлолитическим ферментным комплексом.

Сульфатирование ГМ и карбоксиметилированных ГМ приводит к увеличению alla активности в 50 раз и появлению незначительной аХа активности (22 ЕД/мг) в коагулоло-гических исследованиях. При анализе ингибирования амидолитических активностей Т и фактора Ха в присутствии AT сульфатированный карбоксиметилированный ГМ показывает увеличение alla активности в 370 раз, а СГМ - в 76 раз. Различия показаний alla активностей, измеренных по ингибированию способности гидролизовать фибриноген или хромогенный субстрат, для одних и тех же образцов можно объяснить несколько отличающимся механизмом действия НФГ и сульфатированных ГМ. Так как, для активных образцов наблюдали достоверность различий по эффективным концентрациям в тесте АЧТВ. Кроме того, различие в alla активности (в амидолигическом тесте) почти в 5 раз, может свидетельствовать о том, что для сульфатированного КМГМ достаточно AT, а для СГМ может быть необходимы другой серпин.

Для использования per os ряд авторов получили коньюгат НФГ с натрий N-[8(2-гидроксибензоил)амино] каприлагом, микрокапсулы на основе НМГ тинзапарина и комплекс на основе НМГ эноксапарина и дендримеров полиамидоамина [Jiao Y. и др., 2002; Lamprecht А. и др., 2007; Bai S. и др., 2007]. Полисахаридные ионные комплексы (ПИК), содержащие галактшилированный хитозан, СГМ и сукцинил-хитозан в разных весовых пропорциях демонстрируют in vitro AK активность, В ПИК, содержащих СГМ со степенью сульфатирования 1,46 с увеличением доли ГМ от 50 до 67% alla активность возрастает в 1,6 раз, в сравнении с СГМ. Добавление к СГМ галактозилированного хитозана и сукцинил-хитозана не изменяет активности против фактора Ха. Отсутствие в ПИК сукци-нил - хитозана приводит к возрастанию двойных эффективных концентраций и снижению аПа и аХа активностей. Использование в ионных комплексах СГМ с меньшей степенью сульфатирования - 0,60 приводит к увеличению двойных эффективных концентраций в коагулологических тестах и к снижению специфической АК активности.

На основе СГМ получены наночастицы с АК активностью. Ангитромбиновая активность наночастиц на основе СГМ возрастает с увеличением ММ. Анти-факгор Иа активность наночастиц достоверно возрастает в 1,4-2,1 раза (в сравнении с исходным), ан-ти-фактор Ха активность наночастиц с ММ 177 кДа достоверно увеличивается, в сравнении с исходным образцом в 2,9 раза. Отношение активностей aXa/alla наночастиц возрастает до 0,34; отношение активностей aXa/alla сульфатированного ГМ составило 0,23.

3. Антикоагулянтная активность in vitro химически модифицированной целлюлозы, сульфатов крахмала, сульфатов пектина и цианидинов.

С уменьшением ММ до 10-30 кДа антитромбиновая активность сульфатов целлюлозы хлопка (СЦ: ММ 100 кДа СС 1,7 и ММ 10 - 50 кДа СС 1,00 - 2,50) возрастает достигая величины 144 ЕД/мг (аХа- 30 ЕД/мг). Сульфаты карбоксиметил целлюлозы (СКМЦ: ММ 30 - 50 кДа и СС 3.0), амидоэтил целлюлозы (СКЭЦ: ММ, кДа/ СС/СЗ по амидным группам: 120/1,37/0,3 и 150/0,8/0,3) и альдегидцеллюлозы (СДАЦ: ММ, кДа/ СС/СЗ по альдегидным группам: 100/0,3/0,075 и 150/0,6/0,5) демонстрируют антшромбиновую активность 4-30 ЕД/мг (аХа = 0,14 - 27,00 ЕД/мг). Столь незначительные показатели АК активности могут быть связаны со слабым зарядом карбоксиметильных / амидоэтильных групп и пространственным фактором. Альдегидные группы сильно искажают конформацию целлюлозной цепи. Антитромбиновая активность сульфатов шкофосфатов целлюлозы (СФЦ: ММ, кДа/ СС/СЗ по монофосфатным 1руппам: 40/1,21/0,75;40/1,06/1,73; 75/1,2/1,02; 75/1,34/1,22) достигает 38 - 80 ЕД/мг (аХа 10-30 ЕД/мг). С увеличением СС и снижением ММ alla и аХа активности сульфатов целлюлозы и карбоксиметил целлюлозы возрастают. При анализе амидолитической активности Т и фактор Ха соединениями группы СЦ, СКМЦ, СКЭЦ и СДАЦ отмечаем, что у подавляющей части соединений alla активность по гепарину в сравнении с коагулологическим методом снижается в 3-20 раз (вероятно, кроме AT необходим другой серпин); в двух случаях не меняется (достаточно только антитромбина). Таким образом, у соединений внутри групп СЦ, СКМЦ, СКЭЦ и СДАЦ можно наблюдать разный механизм ингибирования активности Т. Способность ин-гибировзть амидолкгическую активность фактора Ха соединениями модифицированной целлюлозы (групп СЦ, СКМЦ, СКЭЦ и СДАЦ) значительно возрастает только для трех образцов; вероятно, плазменные факторы влияют на механизм активации этими полисахаридами активности ангитромбина. При анализе амидолитической активности Т и фактор Ха группой СФЦ отмечаем для всех случаев падение alla активности в 5-50 раз, аХа - в 340 раз. Кроме четкой закономерности в ряду этих веществ, можно заметить, что для осуществления АК активности в плазме этой группе необходим/мы кроме AT другой/гие сер-пин/ы.

Образцы целлюлозы из древесины осины и соломы пшеницы не влияют на внешний путь свертывания крови человека, о чем свидетельствует отсутствие удлинения времен свертывания плазмы в тесте ПВ. Сульфаггированная метилцеллюлоза из древесины осины демонстрирует крайне незначительную alla активность (0,064±0,021 ЕД/мг). Антитромбиновая активность микрокристаллической целлюлозы из древесины осины сосгав-

37

ляет 51,0±5,2 ЕД/мг, аХа активность в 3,6 раза меньше. Антитромбиновая активность наиболее активных образцов микрокристаллической сульфатированной целлюлозы из соломы пшеницы (количеством серы 6%) и древесины осины (количество серы 3,6%) достигает 119 и 134 ЕД/мг (аХа активность = 30-40 ЕД/мг). С увеличением количества серы АК активность образцов возрастает. Вещества с такой alla активностью могут претендовать на статус АК средства для лечения и профилактики тромбозов после токсикологических и клинических испытаний.

Сульфаты пектина из бадана толстолистного (Bergeniacrassifolia (L.) Fritsch), сабельника болотного (Comarum palustre L.), ряски малой (Lemna minor L.), рдеста плавающего (Patamogeton natans), пижмы обыкновенной (Tanacetum vulgare L.) удлиняют время свертывания плазмы в тесте ТВ с увеличение концентрации, влияя на конечный этап свертывания крови; наибольшей alla активностью 32,7±4,б ЕД/мг обладает сульфат пектина из ряски малой. Влияние на внешний путь свертывания показали только сульфат пектина из ряски малой и сабельника болотного. В тестах АЧТВ и РеаКлот сульфат пектина из ряски малой продемонстрировал alla активность 53,1±9,89 ЕД/мг и аХа - 3,4±0,55 ЕД/мг, АК активность остальных образцов в 30-75 раз меньшие. Снижение аХа активности, определенной амидолигическим методом в 10 раз, в сравнении с определенной в коагулоло-гическом методе, свидетельствует о том, что для проявления анти-Ха активности образцу сульфата пектина из ряски малой, кроме AT, необходим другой серпин. С увеличением степени сульфатирования некоторых пектинов появляется аХа активность, а аПа активность возрастает в 100 - 250 раз.

С увеличением степени замещения по сульфатным группам (СЗ) образцов крахмала то Solánum tuberosum (CK) от 0,37 до 2,50 alla активность возрастает. Наибольшую alla активность (70±7 ЕД/мг) демонстрирует образец с СЗ 1,67 (рис. 22). При степени замещения 1,90 время свертывания плазмы человека в тесте ПВ (при концентрации образцов CK 0,059 мг/мл) - наибольшее. Активность против фактора Ха возрастает с увеличением степени сульфатирования. Судя по коэффициентам корреляции между количеством серы в образцах CK и показателями АК активности, alla и аХа активности необходимо определять по двойным эффективным концентрациям, так как чувствительность используемых методов определений для стандарта НФГ и CK различна. Исследованные CK ингибируют скорость гидролиза тромбином хромогенного субстрата. Ни один из исследованных образцов в диапазоне концентраций 0,048 - 480,000 мкг/мл не снижает амидолитческую активность Т в отсутствии AT. Образец с С3=1 в концентрации 5 мкг/мл наоборот увеличивает амидолитическую активность Т в 10 раз. В диапазоне концентраций 0,2 - 4,0

38

мкг/мл исследованные образны снижают скорость гидролиза Т хромогенного субстрата в присутствии AT. Образец с С3=1 в меньшей степени, в сравнении с другими образцами, снижает амидолитическую активность Т в присутствии AT.

Препарат пикногенол (Рус-nogenol) с антиоксидантными и ан-тиагрегантными свойствами получает экстрагированием горячей водой коры сосны приморской (Pi-nus maritima). Пикногенол состоит из процианидиков разной длины -от димеров до гептамеров [Packer D. и др., 1999]. Цианидины, выделенные из коры сосны, ели, лиственницы и берёзы имеют незначительную АК активность; антитром-биновая активность достигает 0,02 - 4,40 ЕД/мг, аХа активность есть только у цианидинов из коры ели, кедра, березы и составляет всего 0,11 - 0,52 ЕД/мг. Для такого рода препаратов большей АК активности и не требуется.

Антикоагулянтная активность синтетических олигосахаридов и пептидов.

Определена связь между молекулярной массой, степенью сульфатирования и АК активностью синтетических тетра-, гекса- и октасахаридов, полученных в результате направленного синтеза крупных фрагментов фукоиданов заданного строения. Анализировали alla и аХа активности олигосахаридов, полученных двумя разными способами.

В одном случае окгасахариды с ММ 2044 Да и 2148 Да имели соотношение Fuc:SOjNa = 1:1, alla активность составила 0,08 - 0,19 Ед/мг, активности против фактора Ха не наблюдали. Анткгромбиновая активность полученных другим способом, полностью сульфатированных олигосахаридов с ММ: тстрасахарид - 1563 Да (Fuc:SÛ3Na = 1,0:2,1); гексасахарид - 2264 Да (Fuc:S03Na = 1.00:2,17); октасахарид - 2964 Да (Fuc:S03Na = 1,00:2,13) составила 9,8 - 29,4 Ед/мг, анти-фактор Ха активность - в диапазоне 0,34 - 5,3 ЕД/мг.

То есть, увеличение степени сульфатирования синтетических тетра-, гекса- и октасахаридов приводит к возрастанию alla активности, появлению аХа активности и увели-

1 90

se

s 70

s «0

1 so

н О! 40

« jjj Ï30

1 20

t 10

s 0

в

□аП»,ЕД/мг «аХа,ЕД/мг

ж

35 34 36

I* й h.

0,37 1 1,67 1,9 г 2,S

степень замещения го сульфатным группам

Рис. 22. Влияние степени замещения по сульфатным группам образцов крахмала из Solatium tuberosum на антикоагулянтную активность.

чению способности удлинять время свертывания плазмы по внешнему пути. Антикоагу-лянтная живность увеличивается с увеличением молекулярной массы (Рис. 23).

С увеличением концентрации синтетических производных пептидов [1. ZAla-Ala-Arg-Лр* TFA (ММ 632 Да); 2. Z-A¡a-Aía-Arg-Mf*HBr (ММ 601 Да); 3. Ac-Trp-Arg-Mf*HCl (ММ 508 Да); 4. Fta-GIy-Arg-Pip* TFA (ММ 560 Да); 5. (Ac-Trp-Arg-Pip* TFA (ММ 584 Да)] в тестах АЧТВ и ТВ время свертывания плазмы крови человека возрастает, амидолитическая активность Т снижается, что свидетельствует о наличии у исследованных пептидов АК активности, связанной с ингибирование активности Т. Наибольшей ингибиторной активностью по отношетнию к Т обладает образец 4 (1С 5о = 281±15цМ). При в/в введении самого активного синтетического производного пептида самцам крыс линии Wistar время свертывания плазмы крови животных в тестах АЧТВ и ТВ удлиняется с увеличением дозы. Минимальная эффективная доза, при которой время свертывания плазмы крыс удлиняется в два раза в сравнении с контролем в тестах АЧТВ и ТВ составляет 3 мг/кг.

Антитромботическая активность экспериментального концентрата антитромбина человека и пара-аминобеизойной кислоты (ПАБК).

Определены оптимальные сочетания экспериментальных препаратов концентрата AT человека и НФГ [НФГ (Bauer) 40 ЕД/кг и AT в растворе 56 ЕД/кг, НФГ (Bauer) 30 ЕД/кг и AT высушенный лиофильно 100 ЕД/кг, НФГ (ООО "Белмедпрепарат") 50 или 60 ЕД/кг и AT высушенный лиофильно 100 или 55 ЕД/кг (рис. 24)], которые позволяют достигнуть 100% предотвращения роста тромба при в/в введении крысам с моделированным венозным тромбозом.

Анализ АК активности показал, что пара-аминобензойная кислота (ПАБК, ММ 137 Да) обладает alla и аХа активностями (7,00 ± 0,32 ЕД/мг и 16,70 ±0,12 ЕД/мг, соответственно). Такой важный параметр, определяющий антитромботаческий (АТБ) потенциал препаратов, как отношение активности аХа к alla, у ПАБК равен 2,4. ПАБК, обладая

40

Рис. 23. Ангикоагулянтная активность полностью сульфатированных синтетических олиго-сахаридов фукоиданового типа

свойствами АК прямого действия в системе m vitro и, демонстрируя не только alla активность, но и ингибируя активированный фактор X, при в/в введении крысам в дозе 1,5 мг/кг, проявляет АТБ эффект через 1,5 часа после введения, с пиком активности на третьем часу и окончанием действия на пятом часу (рис. 25).

□фврмктром€а,б»пл 1 мстром&а, да

50 55

ВДиг ВД/кг

н«г н»г

ОЕД/wAT

и 55 ОЕДГю 50

ВД«г » Н*Г FA/КГ

н»г H»r н»г

55 75 tOO Вдет AT

ЕДГкг ЕД/кг

AT AT

120 ISO 240 500 яр«M* ПОСЛ* fMfleHH«, ммн

Рис. 24. Влияние совместного внутривенного введения лиофильно высушенного концентрата АТ человека и НФГ ОАО "Белмедпре-парат" на развитие моделированного венозного тромбоза у крыс самцов \Vistar, через 15 мин экспозиции антикоагулянтов._

Рис. 25. Антитромботаческая активность ПАБК при внутривенном введении крысам

Необходимо отметить одинаковую АТБ активность плазмы крыс после введения широко используемого НМГ фраксипарина в дозе 40 аХа ЕД/кг и ПАБК в дозе 25 аХа ЕД/кг (1,5 мг/кг). То есть, ПАБК несмотря на низкую удельную аХа активность, оказывает равный, но отдаленный во времени, в сравнении с фраксипарином, АТБ эффект. Какого-либо воздействия ПАБК в концентрации 1,5 мг/кг на число тромбоцитов и их агрегационную активность индуцированну АДФ или адреналином не обнаружено. При введении ПАБК per os крысам наблюдается увеличение alla активности плазмы при увеличении дозы (6-18 мг/кг). Продолжительность эффекта составляет 5-7 час. Способность ПАБК при введении per os крысам увеличивать alla активности плазмы может явиться дополнительным аргументом для применения этого вещества в качестве профилактического АТБ средства при гомоцистеинемии, так как синтез последнего зависит от фолиевой кислоты, а фолаты синтезируются de novo из птерипов и ПАБК.

Таким образом, экспериментально обоснована возможность конструирования новых лекарственных препаратов на основе низкомолекулярных гепринов, фукоиданов из бурых водорослей Охотского моря, сульфатированных производных хитозана, целлюлозы, пектина, крахмала, галактоманнанов для профилактики и лечения тромбозов. Исследованные СП животного и растительного происхождения, натуральные или химически модифицированные имеют АК активность, которая осуществляется в основном посредством AT. Анализ связи между структурой (степень сульфагирования, наличие разных функциональных групп, молекулярная масса) и alla / аХа активностями, установление механизма АК действия СП имеет фундаментальное значение для проектирования новых лекарственных средств на основе СП разного происхождения. При анализе АК активности in vitro и in vivo СП разного происхождения выделили образцы со специфическими alla и аХа активностями более 70 ЕД/мг (за исключением фукоидана), что необходимо для противотромботического лекарственного средства. Для парентерального введения выбраны: низкомолекулярный гепарин с ММ 6,8 кДа; низкомолекулярный гепарин с ММ 5,4 кДа ; механическая смесь сульфата хитозана (ММ 75 кДа; СС 1,26) и нефракционирован-ного гепарина (в весовом соотношении 1:1); фукоидан (ММ 20-40 кДа) из водоросли Fucus evanescens; сульфатированный галактоманнан (ММ 127 кДа;СС 1.46). Для введения per os выбрана пара-аминобензойная кислота.

Для окончательной оценки возможности выбора оптимального для клинического применения аншкоагулянга необходимо изучить острую и хроническую токсичность указанных соединений, их побочные эффекты, связанные с влиянием на различные органы и системы и экономическую целесообразность производства. Эти данные совместно с результатами наших исследований могут лечь в основу создания новых отечественных антикоагулянтов прямого действия.

ВЫВОДЫ

1. Для получения низкомолекулярных гепаринов с высоким противотромботическим потенциалом требуется использовать ферментные комплексы из культуры Streptomycess kurssanovii и препарата протеаза С, либо протеолитический фермент - лизоцим при гидролизе нефракционировашшх гепаринов. С уменьшением средней молекулярной массы гепаринов до 1,6 - 9,3 кДа антитромбиновая активность снижается в 2-10 раз. Фармакоди-намические параметры наиболее перспективных низкомолекулярных гепаринов и фрак-сипарина при подкожном введении экспериментальным животным совпадают.

2. Ингибирование активности тромбина сульфатами хитозана (ММ 20-123 кДа) осуществляется с участием плазменного ингибитора сериновых протеаз - антитромбина, в больших концентрациях - с участием кофактора гепарина II. Анплромбиновая активность сульфатов хитозана возрастает с увеличением степени сульфатирования в диапазоне молекулярных масс от 56 до 82 кДа. Для создания эффективного актитромботического средства с меньшей, чем у нефракционированного гепарина, геморрагической активностью необходимо комбинировать сульфат хитозана (ММ 75 кДа, степень сульфатирования 1,25) с нефракционированным гепарином в весовом соотношении 1:1. Для получения сульфатов хитозана с высокой ингибиторной активностью по отношению к активированному фактору десять (аХа активность) следует использовать кислотный гидролиз высокомолекулярных сульфатов хитозана.

3. Исследованные фукоиданы из бурых водорослей в большей степени ингибируют активность тромбина преимущественно антатромбином. Фармакодинамические параметры наиболее перспективных фукоиданов и нефракционированного гепарина при внутривенном введении экспериментальным животным сравнимы. 100% антагромботический эффект появляется при внутривенном введении крысам фукоидана из F. evanescens в дозе 7 мг/кг, геморрагический эффект этого фукоидана выражен в меньшей степени, чем у неф-ракциоинрованного гепарина. Для получения фракций фукоиданов из водорослей F. evanescens и L. saccharina с меньшей молекулярной массой и большей антикоагулянтной активностью необходимо использовать фукоиданазу или экстракт из гепагопанкреаса камчатского краба.

4. Антикоагулянтная активность исследованных полисахаридных ионных комплексов и сульфатов галакгоманнана уменьшается со снижением степени сульфатирования последнего. Фармакодинамические параметры при внутривенном введении крысам сульфата галакгоманнана с молекулярной массой 127 кДа и нефракционированного гепарина - сопоставимы. Определена доза сульфата галакгоманнана для достижения 100% антитромбо-тической активности.

5. Для нейтрализации антикоагулянтной активности исследованных сульфатов полисахаридов растительного и животного происхождения in vitro можно использовать сульфат протамина и хитины с молекулярной массой 16 и 21 кДа.

6. Механизм антикоагулянтного действия сульфатов целлюлозы из древесных и травянистых растений и сульфатов монофосфатов-, карбоксимегил-, диальдегид-, амидоэтилцел-люлозы связан с ингибированием активности тромбина и фактора Ха преимущественно

антитромбином. С уменьшением молекулярной массы до 10-30 кДа и увеличением степени сульфатирования целлюлозы до 2,5 антикоагулянтная активность возрастает.

7. Исследованные сульфаты пектина и крахмала ингибируют активность тромбина и фактора Ха посредством антитромбина и других плазменных ингибиторов сериновых протеаз свертывающей системы крови, но сульфаты крахмала ингибируют амидолитическую активность тромбина только в присутствии антитромбина. Антикоагулянтная активность сульфатов пектинов увеличивается с возрастанием степени сульфатирования и зависит от вида растения и моносахаридного состава. Зависимость антикоагулянтной активности сульфатов крахмала от степени сульфатирования - колоколообразна, с пиком при степени сульфатирования 1,67.

8. Антикоагулянтная активность исследованных синтетических фрагментов олигосахари-дов фукоиданового типа увеличивается с увеличением молекулярной массы и степени сульфатирования. Синтетические производные пептидов ZAIa-Ala-Arg-Pip* TFA; Z-Ala-Ala-Arg-Mf*HBr; Ac-Trp-Arg-MPHCl; Fta-Oly-Arg-Pip* TFA; Ac-Trp-Arg-Pip* TFA ингибируют амидолитическую активность тромбина и задерживают появление фибринового сгустка плазмы человека в тестах при оценке состояния внутреннего и конечного этапов свертывания плазмы. При внутривенном введении экспериментальным животным наиболее активного производного пептида Fta-Gly-Arg-Pip-TFA антикоагулянтная активность плазмы увеличивается с возрастанием дозы.

9. Определены оптимальные сочетания экспериментальных препаратов концентрата антитромбина человека (55-100 БД/кг) с нефракционированным гепарином (40-60 ЕД/кг) и доза пара-аминобензойной кислоты при которых достигается 100% предотвращение роста тромба при внутривенном введении крысам с моделированным венозным тромбозом.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Шер, А.И. О стандартизации протамина [Текст] / А.И. Шер, М.Ю. Мазов, В.А. Макаров, H.H. Дрозд // Хим. Фарм. Ж,- 1988.-№ 4,- С. 486-490.

2. Дрозд, H.H. Механизм антикоагулянтного действия эфира сульфата хитозана [Текст] / H.H. Дрозд, Г.В. Башков, ВЛ. Макаров, А.Б. Хейломский, И.Н. Горбачева// Вопр. Мед. Хим.-1992.- Т.38, № 5,- С. 12-14.

3. Дрозд, H.H. Взаимодействие между аитикоагулянтными эффектами и образцами полисульфатов хитозана [Текст] / H.H. Дрозд, А.И. Шер, В.А. Макаров, J1.C. Гальбрайх, Г.А. Вихорева, И.Н. Горбачева //Эксп. Клин. Фарм,-1994.- Т. 57, № 4,- С. 42-45.

4. Дрозд, H.H. Влияние совместного введения гепарина и сернокислого эфира хитозана на функцию гемостаза [Текст] / H.H. Дрозд, В.А. Макаров, Г.В. Башков, JI.C. Гальбрайх, ГЛ. Вихорева, И.Н. Горбачева//Эксп. Клин. Фарм,-1996.-Т. 59, № 1.-С. 30-33.

5. Пат. 2076712 С1 Российская Федерация, МПК7 А 61 К 31/725,31/73. Средство, обладающее антикоагулянтной и антитромботческой активностью [Текст] / H.H. Дрозд, В.А.

44

Макаров, А.И. Шер, Г.В. Башков, Л.С. Гальбрайх, ГА. Вихорева, И.Н. Горбачева; Москва, Гематологический научный цешр—№ 93053060; заявл. 23.11.1993; опубл. 10.14.1997.-Бюлл. 10.- с. 11. (С. 1-15.)

6. Дрозд H.H. Лабораторный кошроль за противотромботической терапией II Исследование системы крови в клинической практике [Текст] / под ред. Г.И. Козинец, В.А. Макарова,- М.; [Триада-Х], 1997.- глава4.- С. 41-43.

7. Дрозд, H.H. Парааминобензойная кислота как противотромботический агент [Текст] / H.H.Дрозд, В.А. Макаров, Н.Т. Мифтахова, С.А. Калугин, О.Г. Строева, С.И. Акберова// Онтогенез,- 2000,- Т. 31, № 4,- С. 265-266.

8. Строева, О.Г. Антитромботическая активность пара-аминобензойной кислоты при экспериментальном тромбозе [Текст] / О.Г. Строева, С.И. Акберова, H.H. Дрозд, В.А. Макаров, Н.Т. Мифтахова, С.А. Калугин // Извест. Акад. Наук Сер. Биол.-1999,- Т. 26, №3.- С. 265-271.

9. Пат. 2146138 С1 Российская Федерация, МПК7 А 61 К 31/245. Антикоагулянтное средство {Текст] I НА Дрозд, В.А. Макаров, Н.Т. Мифтахова, С.А. Калугин, О.Г. Строева, С.И. Акберова; Москва, Гематологический научный центр — № 96113786; заявл. 08.07.1996; опубл. 10.03.2000, С. 1-12.

10. Пат. 2195673 С2 Российская Федерация, МПК7 G01N 33/68. Способ определения активности антитромбина III [Текст] / Т.Л. Воюшина, O.E. Неведрова, В.А. Макаров, H.H. Дрозд, А.П. Момот; Барнаул, ООО Фирма "Технология-Стандарт"—№2000130498/15; заявл. 06.12.2000; опубл. 27.12.2002, С. 1-15.

11. Макаров, В.А. Методические указания по изучению фармакологических веществ, влияющих на гемостаз [Текст] /ВА Макаров, Г.Н. Петрухина, H.H. Дрозд, Г.Г. Белозерская, O.E. Неведрова // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / под ред. В.П.Фисенко. — М.: [Ремедиум], 2000.—С. 250-256.

12. Дрозд, НЛ. Антитромботическая активность пара-аминобензойной кислоты [Текст] / H.H. Дрозд, В.А. Макаров, Н.Т. Мифтахова, С.А. Калугин, О.Г. Строева, С.И. Акберова// Эксп. Клин. Фарм,- 2000,- Т. 63, №3,- С.40-44.

13. Потетинова, Ж.В. Фармакологическое ингибирование активности тромбина и плазми-на [Текст] / Ж.В. Потетинова, Т.Л. Воюшина, H.H. Дрозд, В.А. Макаров И Эксп. Клин. Фарм,- 2001.- Т. 64, №5,- С.72-78.

14. Drozd, N.N. Comparison of antithrombin activity of the polysulphate chitosn derivatives in in vitro and in vivo system [Text] / N.N. Drozd, A.I. Sher, V.A Makarov, GA. Vichoreva, L.S, Galbraikh, I.N. Gorbachiova //Thromb Res.- 2001.- V. 102, N 5,- P. 445-455.

15. Дрозд, H.H. Влияние сульфата хитозана на взаимодействие между тромбином и антитромбином [Текст] / Н.Н.Дрозд, В.А. Макаров, Л.С.Гапьбрайх, Г.АВихорева, И.Н.Горбачева // Молекулярная биология, химия и физика гетерогенных систем; материалы 6-ой Международной конф.—Плес: Юнона, 2002. — С. 52-56.

16. Дрозд, H.H. Антикоагулянтная активность сульфатированных производных хитозана [Текст] / Н.Н.Дрозд, В.А.Макаров /У Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение / под ред. К.Г.Скрябина, Г.АВихоревой, В.П.Варламова.- М.: [Наука], 2002,-С. 302-314.

17. Дрозд, НЛ. Исследование антикоагулянтной активности низкомолекулярных образцов сульфата хитозана [Текст] / Н.Н.Дрозд, В.АМакаров, В.П.Варламов, Г.Е.Банникова, Л.С.Гапьбрайх, Г.А.Вихорева, П.П.Столбушкина // Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана: материалы Седьмой Международной конф. — Санкт-Петербург ВНИРО, 2003. — С. 169-171.

18. Дрозд, H.H. Антикоагулянтная активность низкомолекулярных образцов сульфата хитозана и гепарина [Текст] / Н.Н.Дрозд, В.АМакаров, Г.Е.Банникова, В.П. Варламов,

П.П.Столбушкина, Г.А.Вихорева // Молекулярная биология, химия и физика гетерогенных систем: материалы 7-ой Международной конф. — Плес: Юнона, 2003. — С. 33-36.

19. Макаров, В.А. Современные препараты крови для коррекции патологии гемостаза [Текст] / В.А. Макаров, H.H. Дрозд, Г.Г. Белозерская // Проблемы гематологии и переливания крови,- 2004.- N3,- С. 32-35.

20. Макаров, В А Препараты крови, регулирующие функцию гемостаза [Текст] / В.А. Макаров, H.H. Дрозд, Г.Г. Белозерская // Новое в трансфузиологии.- 2004.- выпуск 37,- С, 512.

21. Drozd, N.N. The inhibition of the sulphate chitosan thrombin activity [Text] / N.N. Drozd, V.A. Makarov, G. Vikhoreva // Eur I Bioch. - 2004,- V. 270, suppl. 1.- PS4-29.

22. Малыхина, Л.С. Некоторые показатели тератогенного и эмбриотоксического действия нового антикоагулянта хиторина [Текст] / Л.С. Малыхина, H.H. Дрозд, В.А. Макаров // Токсикологический вестник,- 2001,- N1.- С. 23-28.

23. Пат. 2221578 С1 Российская Федерация, МПК7 А61К 35/36, С07К 14/745. Способ получения очищенного активированного фактора X свертывания крови [Текст] / А. Л. Бер-ковский, Е.В. Сергеева, В.А. Макаров, H.H. Дрозд, A.A. Козлов, Ю.А. Градова, A.B. Суворов; Москва, Межрегиональная благотворительная общественная организация инвалидов "Общество больных гемофилией"—№ 2002128481/15; заявл. 24.10.2002; опубл.

20.01.2004, Бюл. 2. — 5 с. (C.1-I9).

24. Столбушкина, П.П. Получение и антикоагуляшная активность образцов низкомолекулярных гепаринов [Текст] / П.П. Столбушкина, Г.Е. Банникова, H.H. Дрозд, В.А. Макаров, В Л. Варламов, Г.Е. Влхорева // Хим. Фарм. Ж. - 2004,- Т.З 8Д» 2.- С. 82-85.

25. Банникова, Г.Е. Гидролиз гепарина иммобилизованным ферментным комплексом из Streptomyces kurssanovii [Текст] / Г.Е.Банникова, П.П.Столбушкина, Н.Н.Дрозд, Г.А.Вихорева, В.П. Варламов, В.А.Макаров // Прикл. Биох. Микробиол.- 2004,- Т.40, № 4,-С.365-369.

26. Пат. 2248801 С2 Российская Федерация, МПК7 А61К 31/727. Способ получения низ-комолскулярных гепаринов [Текст] / В.П. Варламов, Г.Е. Банникова, В.А. Макаров, H.H. Дрозд, Н.Т. Мифтахова, Г.А. Вихорсва, Л.С. Гальбрайх, П.П. Столбушкина; Москва, Гематологический научный центр РАМН— № 2003111205/15; заявл. 21.04.2003; опубл.

27.03.2005, Бюл. 9. — 7 с. (С. 1-10).

27. Vikhoreva, G. Anticoagulant activity of low-molecular-weight sulfated chitosan [Text] / G. Vikhoreva, P. StoJbushkina, G. Bannikova, A. Panov, N. Drozd, V. Makarov, V.Varlamov // Carbohydr Polym.- 2005.- V. 62, N4,- P. 327-332.

28. Дрозд, H.H. Ашитромботческая активность российского низкомолекулярного гепарина [Текст] / H.H. Дрозд, В.А. Макаров, Н.Т. Мифтахова, Г.Е. Банникова, В.П. Варламов, П.П. Столбушкина, Г.А. Вихорева//Омский научный вестник.- 2005.- №1(30).- С. 125128.

29. Drozd, N.N. Mobility of the sulphate Protamin/ low molecular weight heparin complexes in an electrical field [Text] / N.N. Drozd, I. Migal, M. Kiutína, V.A. Makarov, G.E. Bannikova, V.P. Varlamov // FEBS J.- 2005.-V.272, suppl. 1,- B3-016P.

30. Кузнецова, Т. А. Сравнительное исследование биологической активности фукоиданов, выделенных из бурых водорослей [Текст] / Т.А. Кузнецова, H.H. Беседнова, А.М. Урван-цева, И.У. Бакунина, Т.Н. Звягинцева, H.H. Дрозд, В.А. Макаров И Вестник ДВО РАН,-2006.-Х» 6,-С. 105-110.

31. Дрозд, ILII. Фармакодинамические параметры акгикоагулянгов на основе сульфати-рованных полисахаридов из морских водорослей [Текст] / Н.Н Дрозд, A.C. Толстенков, В.А Макаров, Т.А. Кузнецова, Н.Н Беседнова, Н.М.Шевченко, Т.Н.Звягинцева// Бюлл. Эксп. Биол. Мед- 2006,- Т.- 142, № 11.- С. 537-540.

32. Дрозд, H.H. Антикоагулянтная активность сульфатировакных полисахаридов [Текст] / H.H. Дрозд, Г.Е. Банникова, В.А. Макаров, В.П. Варламов // Эксп. Клин. Фарм,- 2006,- Т. 69, №6,-С. 51-60.

33. Макаров, В.А. Характеристика лекарственных средств для коррекции системы гемостаза [Текст] /ВА Макаров, H.H. Дрозд, Г.Г. Белозерская, Г.Н. Петрухииа //Очерки по производственной и клинической трансфузиологии / под. ред. АИ.Воробьева— М.: [Ньюдиамед], 2006.—С. 374-3 82.

34. Толсгенков, A.C. Биоспецифичный электрофорез комплексов между низкомолекулярными гепаринами и хигозанами [Текст] / А.С.Толстенков, H.H. Дрозд, В.А.Макаров, Г.Е.Банникова II Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана: материалы Восьмой Международной конф. —Казань: ВНИРО, 2006. — С. 253-256.

35. Дрозд, H.H. Антитромботическая активность отечественного препарата "Ангитромби-на III" на модели индуцированного венозного тромбоза [Текст] / H.H.Дрозд, В.А.Макаров, НТ.Мифтахова, Т.Л. Дереза, М.А.Ажигирова//Бюлл. Эксп. Биол. Мед.- 2006,- Т.-142, № 7,- С. 75-78.

36. Дрозд, H.H. Определение активности низкомолекулярных гепаринов против активированного фактора Ха с помощью диагностических наборов "Реахром-Гепарин" (НПА "Ренам") [Текст] / H.H. Дрозд, В.А. Макаров, Н.Т. Мифтахова, AJI. Берковский, Е.В. Сергеева, Г.Е. Банникова, В.П. Варламов // Пат. Физ. Эксп. Тер.- 2006.- N 2,- С.16-18.

37. Дрозд, H.H. Антикоагулянтная активность низкомолекулярных гепаринов, полученных с помощью комплекса гидрслаз [Текст] / H.H. Дрозд, A.C. Толсгенков, Г.Е Банникова, Н.Т. Мифтахова, Е.С Лапикова, В.А. Макаров, В.П. Варламов // Эксп. Клин. Фарм.-2007.-Т.70,Х°6.-С. 19-24.

38. Местечкина, Н.М. Антикоагулянтная активность низкомолекулярных сульфатирован-ных производных галактоманнана семян Cyamopsis tetragonoloba (L.) Taub. [Текст] / Н.М. Местечкина, В.Д. Щербухин, Г.Е. Банникова, В.П. Варламов, Н.Н.Дрозд, A.C. Толсгенков, В.А. Макаров, В.Е. Тихонов // Прикл. Биох. Микроб.- 2007,- Т. 43, № 6,- С. 732-737.

39. Дрозд, H.H. Влияние низкомолекулярного гепарина, полученного с помощью хитино-литического комплекса, на антикоагулянтную активность плазмы кроликов и крыс {Текст] / H.H. Дрозд, A.C. Толсгенков, В.А. Макаров, Н.Т. Мифтахова, Г.Е. Банникова, П.П. Суханова, В.П. Варламов, Г.Е. Вихорева // Эксп. Клин. Фарм,- 2007.- Т. 70, №2,- С. 40-44.

40. Пат. 2295538 С2 Российская Федерация, МПК7 С08В 37/10, А61К 31/727. Способ получения гепаринов с низкой молекулярной массой [Текст] / H.H. Дрозд, Г.Е. Банникова, В А. Макаров, В.П. Варламов, В.Е. Тихонов, К.Г. Скрябин; Москва, Гематологический научный ценгр РАМН и Центр "Биоинженерия" РАН— № 2005105423/15; заявл. 01.03.2005; опубл. 20.03.2007, Бюл. 8. — 5 с. (С. 1-12).

41. Davydova, A.I. Anticoagulant properties of the cellulose derivatives with various substitu-ents [Text] / A.I. Davydova, N.N. Drozd, V.A. Makarov, MA. Torlopov // FEBS J.- 2008,-V.275, suppl. 1.-PP8A-2.

42. Дрозд, H.H. Гликозаминогликан-зависимая регуляция каскада свертывания крови [Текст] / H.H. Дрозд, В А Макаров // Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана: материалы Девятой Международной конф.—Ставрополь : ВНИРО, 2008. — С. 165-168.

43. Дрозд, Н.Н.Влияние внутривенного введения сульфатированного галактоманнана на антикоагулянтную активность плазмы крыс [Текст] / H.H. Дрозд В.А. Макаров, A.C. Толсгенков, Лапикова Е.С., Мифтахова Н.Т., Местечкина Н.М., В.Д. Щербухин, Ильина A.B., В.П.Варламов//Пат. Физ. Эксп. Тер,- 2008.- № 3,- С. 20-23.

44. Дрозд, H.H. Антикоагулянтная активность оригинальных синтетических производных пептидов [Текст] / Н.Н Дрозд, A.C. Толсгенков, В.А Макаров, Н.Т.Мифтахова, ТЛВоюшина, М.Е.Сергеев// Бюлл. Эксп. Биол. Мед.- 2008.- Т. 145, № 1,- С. 57 - 60.

45. Дрозд, Н.Н. Ангакоагулянгная активность in vitro сульфатированного арабиногалак-тана и экстракта коры кедра [Текст]/ Н.Н. Дрозд, С.А. Кузнецова, Е.С. Лапикова, А.И. Давыдова, В.А. Макаров, Б.Н. Кузнецов, А.И. Бутьикина, Н.Ю. Васильева, Г.П. Скворцова// Эксп. Клин. Фарм,- 2008.- Т. 71, № 4,- С. 30-34.

46. Дрозд, НЛ. Антикоагуляигная активность ионных комплексов полисахаридов, содержащих хитозан, сукцинилхигозан и сульфатированпый галакгоманнан [Текст] / Н.Н. Дрозд, А.В.Ильина, Н.М.Месгсчкина, А.С. Толсгенков, Е.С. Лапикова, В.А. Макаров,

В .П.Варламов, В. ДЩербухин // Вопр. Биол. Мед. Фарм. Хим.- 2008,- № 4,- С. 28-32.

47. Лапикова, Е.С. Ингибирование тромбина и фактора Ха фукоиданом из Fucus evanes-cens и его модифицированными аналогами [Текст] / Е.С. Лапикова, Н.Н. Дрозд, А.С. Толсгенков, В.А. Макаров, Т.Н. Звягинцева, Н.М. Шевченко, И.Ю. Бакунина, Н.Н. Беседнова, Т.А. Кузнецова II Бюлл. Эксп. Биол. Мед.- 2008- Т. 146, №3,- С.328-333.

48. Il'ina, А. V. The production of nanoparticles based on sulfated polysaccharides and a study of their anticoagulation activity [Text]/A. V. H'ina, A. N. Levov, N. M. Mestechkina, N. N. Drozd, V. N. Orlov, V. A. Makarov, V. D. Shchcrbukhin, V. P. Varlamov, K. G. Skryabin// Na-notechnologies in Russia- 2009.- V.4, Nos. 3-4,-P. 244-252.

Подписано в печать:

26.11.2009

Заказ № 3228 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Актуальность проблемы

Тромбоэмболия вен является результатом дисбаланса прокоагулянт-ных, антикоагулянтных и фибринолитических процессов в системе свертывания крови, отражающего сложное взаимодействие между генетическими или приобретенными факторами риска [177,487,711,745]. Тромбоэмболиче-ские осложнения - распространенная медицинская проблема, связанная со значительной заболеваемостью и смертностью, особенно у послеоперационных пациентов [176,254].

Антикоагулянты (АК) - основные лекарственные средства для предотвращения и лечения тромбоэмболических нарушений [226, 313, 316, 384, 460,478, 549,646,768]. Сульфатированный полисахарид (СП) животного происхождения (получают из легких крупного рогатого скота или слизистой оболочки кишечника свиней) гликозаминогликан (ГАГ) нефракционирован-ный гепарин (НФГ) используют в качестве АК и антитромботического (АТБ) средства на протяжении 80-ти лет [137,313,316,478,490]. Гетерогенность и полианионность НФГ объясняют строением макромолекулы - линейный сополимер глюкозамина и остатков уроновых кислот с большим количеством сульфатных групп [281,392,434,581].

Функционирование каскадов свертывающей и фибринолитической систем крови регулируется плазменными ингибиторами сериновых протеаз (серпинами и кунинами): ингибитор пути тканевого фактора (ТБРІ), антитромбин, кофактор гепарина И, протеин 2-зависимый ингибитор, протеаза нексин І, протеаза нексин 2, ингибитор активатора плазминогена I, а-2 анти-плазмин, а-2 макроглобулин, а-1 ингибитор протеаз, тромбин-активированный ингибитор фибринолиза (ТАИ), ингибитор протеина С [95,141,198,213,237,249,250, 338,360,462,519,524,527,584,598,666,709, 725]. АК активность НФГ связана с увеличением скорости ингибирования сериновых протеаз свертывающей системы крови - тромбина (Па), факторов Ха, ІХа, ХІа, ХИа, при этом активируется плазменный ингибитор - антитромбин

AT) [349,526,531]; при активации другого плазменного серпина, кофактора II гепарина, происходит ингибирование только тромбина [141,248, 584,638,709]. Механизмы ингибирования фактора Ха и тромбина (На) активированным НФГ антитромбином различаются [213,575, 681,743]

Однако НФГ со средним молекулярно-массовым распределением 15 кДа неспецифически связывается с макрофагами, эндотелиальными клетками и плазменными белками, в результате чего имеет сложную фармакокинетику и мало предсказуемый АК эффект [197,390,429,715,738]; действует непродолжительно и требует частых повторных инъекций. Для исключения риска кровотечения, терапевтические дозы НФГ должны контролироваться с использованием теста активированного частичного тромбопластинового времени, так как возможны существенные индивидуальные различия чувствительности к препарату [130,195,490,703]. Неспецифическое связывание НФГ с белками плазмы - одна из главных причин " устойчивости к гепарину "[316,743]. Индуцированная НФГ тромбоцитопения встречается у 1 %-3 % пациентов и вызвана способностью связываться с фактором 4 тромбоцитов, который стимулирует формирование антител к комплексу НФГ - фактор 4 тромбоцитов [570,622,627]. НФГ не ингибирует тромбин/фактор Ха связанные со сгустком [313-315] и вызывает остеопению, связываясь с остеобластами, в результате чего происходит активация остеокластов и ломкость костей увеличивается [314,575]. Главными причинами побочных эффектов НФГ считают высокие молекулярную массу (ММ) и плотность отрицательного заряда.

Вышеперечисленные недостатки НФГ стимулировали разработку новых АК средств. Современные АК, находящиеся на стадии клинических испытаний, составляют следующие группы: 1. ингибиторы пути фактор Vila /тканевой фактор; 2. ингибиторы фактора 1Ха; 3. прямые и непрямые ингибиторы фактора Ха; 4. активированный протеин С и растворимый тромбомо-дулин; 5. прямые ингибиторы тромбина [313-315,742-744,746]. Низкомолекулярные гепарины (НМГ) принадлежат к числу непрямых ингибиторов фактоpa Xa; получают химическим или ферментативным гидролизом НФГ [50,121, 314,434,716, 721, 783].

Коммерческие НМГ фраксипарин (надропарин, Sanofi-Winthrop, Франция), цертопарин ( тропарин Biochemie GmbH, Австрия), фрагмин (dalteparin sodium, Pharmacia & Upjohn, США), клексан (enoxaparin sodium, Aventis /Rhone-Poulenc Rorer ), тинзопарин (innohep, Pharmacia&Upjohn, Дания), pe-випарин (кливарин, Abbot Laboratories) со средней MM 3,6-7,0 кДа используют для профилактики и лечения венозных тромбоэмболий, инфаркта миокарда, тромботического инсульта, порока сердца, тяжелых заболеваний легких, при лечении пациентов со злокачественными опухолями [226,306, 313, 323,325,327, 328, 384,460,478,501,549,577,646,768]. Среди пациентов, перенесших хирургическое вмешательство при переломе бедра или избирательную замену бедра/ коленной чашечки, использование НМГ снижает риск венозного тромбоза до 50 % по сравнению с плацебо [325,327]. НМГ все больше используют для профилактики и лечения тромбозов у беременных женщин с искусственными клапанами сердца [384,460,478].

Основное преимущество НМГ над НФГ - способность в меньшей степени связываться с белками плазмы и тромбоцитами [137,258,431,665], что приводит к более длинному периоду полувыведения, высокой биодоступности, низкому риску тромбоцитопении и остеопороза. Предсказуемость АК реакции, позволяющая вводить лекарство один или два раза в день подкожно, предполагает уход от потребности в регулировании дозы или лабораторном контроле у большинства пациентов, как считают некоторые авторы [104,106,135,313-316]. Однако НМГ демонстрируют в десять раз меньшую антитромбиновую активность в сравнении с НФГ; их АК активность не полно нейтрализуется сульфатом протамина.

АК синтетический пентасахарид - фондапаринукс (fondaparinux, коммерческое название Arixtra) - высоко специфичный AT - зависимый ингибитор фактора Ха (фХа) [195,316,328,553,556,698]. Молекулы фондапаринукса одинаковой длинны и состоят из пяти сахаридных остатков, повторяющих

AT - связывающую последовательность НФГ и связывается с AT с высокой аффинностью. Связывание фондапаринукса с AT вызывает конформацион-ное изменение, которое ускоряет ингибирование фХа в 300 раз [195,323,553]. Длина молекул фондапаринукса не позволяет ускорять ингибирование тромбина антитромбином [213,681,743]. На моделях тромбоза у животных и в клинических условиях показана АТБ активность фондапаринукса [453,436,630,679]. Препарат рекомендован для предотвращения венозного тромбоза у больных после ортопедических операций [109,700,741]. Однако, стоимость синтетических олигосахаридов высока, они не имеют специфического антидота и не ингибируют связанные со сгустком тромбин и фактор Ха [252,650].

В клетках здоровых животных присутствует нормальный прионовый с белок (РгР ), первичная структура которого полностью идентична инфекци

Sc онному приону (РгР ). Однако эти белки различаются конформацией [217].

Sc

Высокая стабильность РгР позволяет преодолеть все барьеры на пути от пищеварительного тракта до клеток мозга, и возникающие высокомолекулярные агрегаты вызывают губчатую энцефалопатию. Идентификация трансмиссивных спонгиоформных (похожих на губку) энцефалопатий [болезнь Крейцфельдта-Якоба - Creutzfeldt-Jakob desease (nvCJD), фатальная семейная бессоница - fatal family insomnia (FFI), и синдром Герстмана-Штраусслера-Шейнкера - Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrom (GSS)], связанных с прионовыми белками [789,790], которые обнаруживают и в тканях крупного и мелкого рогатого скота, предположение о возможном заражении людей прионами, содержащимися в препаратах полученных из тканей больных животных и сокращение сырьевой базы НФГ (выявление одного случая коровьего бешенства приводит к уничтожению всего стада) предполагают поиск альтернативных источников веществ с АК и антитромботическими свойствами.

Из лишайников, грибов, низших и высших растений, морских беспозвоночных, членистоногих выделяют вещества (сульфатированные полисахариды, флавоноиды, иридоиды и так далее), которые влияют на клеточный и плазменный гемостаз [160,165,202,240,296,339,472,550,786]. Для увеличения АК активности веществ молекулы деполимеризуют, в них встраивают разные функциональные группы, объединяют [коньюгируют] с молекулами других полисахаридов, пептидов, пептидомиметиков или белков [236,248,256,343, 375,430,440, 442,552, 663,696,697,723].

Кроме этого, осуществляют поиск АК средств на основе синтетических олигосахаридов гепаринового/фукоиданового и других типов [44,45], пептидов [88,133,167,273,284,421,480,609,639], не исключая выделение из плазмы человека или использование рекомбинантных технологий для получения плазменных ингибиторов сериновых протеаз [193,228,557].

Предполагают, что идеальное АК средство, к разработке которого стремятся исследователи, должно иметь: быстрое начало действия, предсказуемую фармакокинетику, предсказуемый АК ответ, наличие безопасного антидота, отсутствие влияния вне цели, например гепатотоксичность, разумная стоимость, применение per os. Результатом таких характеристик может быть: упрощенный режим дозирования, отсутствие потребности в АК мониторинге, снижение риска геморрагических осложнений, возможность широкого применения [104,106].

Актуальность выбранной темы связана с тем, что:

1. Используемые в настоящее время АК прямого действия не удовлетворяют полностью потребности практической медицины; при несомненной эффективности у НФГ, НМГ, синтетических олигосахаридов есть недостатки (зависимость от AT и невозможность ингибировать активность Т связанного со сгустком) [316, 745]; прямые ингибиторы тромбина и фактора Ха действуют непродолжительно и не имеют антидотов [108,480,504].

2. В Российской Федерации отсутствует собственное производство для наработки субстанций нефракционированных гепаринов.

3. В Российской Федерации есть существенная сырьевая база сульфатиро-ванных полисахаридов растительного и животного происхождения для получения новых соединений с антикоагулянтной активностью.

Цель работы - анализ структуры и антикоагулянтной (АК) активности натуральных и химически модифицированных полисахаридов растительного/животного происхождения и синтетических фукозилированных олигоса-харидов, выявление потенциальных антикоагулянтов прямого действия.

Задачи исследования:

• Выявление связи между антикоагулянтной активностью и молекулярной массой, степенью сульфатирования, степенью замещения, моноса-харидного состава 290 нативных и полусинтетических сульфатов полисахаридов и 5 синтетических фукозилированных олигосахаридов.

• Определение механизма антикоагулянтного действия сульфатирован-ных хитозанов с молекулярной массой 65 - 123 кДа и количеством серы 11,1-15,4%.

• Сравнение способов определений антитромбиновой активности суль-фатированных хитозанов с молекулярной массой 20 - 123 кДа (количество серы 8,8 - 16,9%) в системах in vit.ro и ex. vivo.

• Выбор в результате анализа связи между АК активностью и молекулярной массой оптимальных способов деполимеризации НФГ или сульфатов хитозана для получения образцов с отношением активностей аХа /alla в диапазоне 1,5 - 3,0.

• Сравнение специфических антикоагулянтных активностей (alla и аХа) натуральных и химически модифицированных сульфатированных полисахаридов (СП) растительного происхождения (фукоиданы, сульфаты галактоманнана, целлюлозы, пектина, крахмала).

• Определение фармакодинамических параметров наиболее перспективных образцов НМГ, сульфатов хитозана, фукоиданов, сульфата галак-томаннана при введениях экспериментальным животным.

• Сравнение антитромботической и геморрагической активностей наиболее перспективных образцов НМГ, фукоиданов, сульфатов хитозана и галактоманнана, с используемыми в клинической практике нефракцио-нированными и низкомолекулярными гепаринами.

• Разработка метода выбора поликатионов для нейтрализации антикоагу-лянтной активности и количественного определения сульфатированных полисахаридов в биологических жидкостях.

• Выявление наиболее активного прямого ингибитора тромбина среди синтетических производных пептидов (7-А1а-А1а-А1^-Ргр* ТГА; г-А1а-А^-Ащ-МР'НВг; Ас-Тгр-Ащ-Мгаа; ¥1а-С\у-Аг%-Р[р* ТГА; Ас-Тгр-Агв-Р1р* ТГА).

• Оценка возможности применения комбинации экспериментального концентрата антитромбина человека с нефракционированным гепарином и пара-аминобензойной кислоты в качестве антитромботических средств на модели венозного стаза у крыс.

Научная новизна и теоретическая значимость работы

Проведены широкомасштабные сравнительные исследования специфической антикоагуляной активности 290 нативных и модифицированных сульфатов полисахаридов, выделенных из растительного материала или тканей млекопитающих и членистоногих. Получены новые сведения о зависимости структура - антикаогулянтное действие для низкомолекулярных гепари-нов, фукоиданов из бурых водорослей, сульфатов хитозана, целлюлозы, га-лактоманнанов, крахмала и пектинов.

Осуществлен комплексный анализ с целью выявления низкомолекулярных гепаринов с антитромботической активностью посредством целенаправленных изменений молекул нефракционированных гепаринов, с помощью хитинолитических, целлюлолитических, протеолитических ферментных комплексов, а также лизоцима, папаина, и химотрипсина, никогда ранее для этой цели не использовавшихся.

Установлены особенности как механизма реализации ингибирования активности тромбина и фактора Ха, так и образования комплексов между поликатионами и сульфатированными полисахаридами с последующим выбором антидота для нейтрализации антикоагулянтной активности.

Разработаны и апробированы методологические аспекты детализации молекулярных механизмов антикоагулянтного действия фукоиданов из бурых водорослей, сульфатов целлюлозы и галактоманнанов из травянистых и древовидных растений, сульфата картофельного крахмала, сульфатов пектинов из травянистых растений, синтетических олигосахаридов фукоиданового типа и синтетических производных пептидов с выявлением наиболее активных образцов и анализом фармакодинамических параметров, антитромботи-ческой и геморрагической активностей, в сравнении с используемыми в клинической практике антикоагулянтами прямого действия. Таким образом, экспериментально обоснована возможность конструирования новых лекарственных препаратов для профилактики и лечения тромбозов на основе исследованных соединений.

Разработан алгоритм для адекватной оценки специфической антитром-биновой активности сульфатированных хитозанов. В результате анализа связи между молекулярной массой и антикоагулянтной активностью, с помощью направленных модификаций получены низкомолекулярные сульфаты хитозана с высокой антикоагулянтной активностью.

Создана композиция, состоящая из нефракционированного гепарина и экспериментального концентрата антитромбина человека. Эта композиция и пара-аминобензойная кислота демонстрируют антитромботическую активность на модели венозного стаза у крыс.

Практическая значимость работы

Разработаны методические указания по изучению антикоагулянтной активности фармакологических веществ и включены в Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (Москва, 2000).

Ресурсная обеспеченность и патентная защищенность (6 патентов, 4 положительных решения по заявкам) являются предпосылками для получения антитромботических лекарственных средств на основе нативных и полусинтетических сульфатированных полисахаридов растительного и животного происхождения, синтетических фукозилированных олигосахаридов и производных пептидов, а также композиции экспериментального концентрата антитромбина человека и нефракционированного гепарина и пара-аминобензойной кислоты.

Материалы диссертации были использованы при подготовке:

1. Патента РФ № 2076712 "Средство, обладающее антикоагулянтной и антитромботической активностью", авторы: Дрозд H.H., Макаров В.А., Шер

A.И., Башков Г.В., Гальбрайх JI.C., Вихорева Г.А., Горбачева H.H. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений 10 апреля 1997 г.

2. Патента РФ на изобретение № 2146138 "Антикоагулянтное средство ", авторы: Дрозд H.H., Макаров В.А., Мифтахова Н.Т., Калугин С.А., Строева О.Г., Акберова С.И. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений 10 марта 2000 г.

3. Патента РФ на изобретение № 2195673 "Способ определения активности антитромбина ИГ', авторы: Воюшина Т.Л., Неведрова О.Г., Макаров

B.А., Дрозд H.H., Момот А.П. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений 27 декабря 2002 г.

4. Патента РФ на изобретение № 2221578 "Способ получения очищенного активированного фактора X свертывания крови", авторы: Берковский A.JI., Сергеева Г.В., Макаров В.А., Дрозд H.H., Козлов A.A., Градова Ю.А.,

Суворов A.B. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений 20 января 2004 г.

5. Патента РФ на изобретение № 224880 Г'Способ получения низкомолекулярных гепаринов" авторы: Варламов В.П., Банникова Г.Е., Макаров В.А., Дрозд H.H., Мифтахова Н.Т., Вихорева Г.А., Гальбрайх Л.С., Столбуш-кина П.П. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений 27 марта 2005 г.

6. Патента РФ на изобретение № 2295538 " Способ получения гепаринов с низкой молекулярной массой", авторы: Банникова Г.Г., Варламов В.П., Дрозд H.H., Макаров В.А., Тихонов В.Е., Скрябин К.Г. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений 20 октября 2009 г.

Основные положения, выносимые на защиту:

• Исследованные СП растительного, животного и синтетического происхождения ингибируют фибриногенсвертывающую и амидолитическую активности тромбина и фактора Ха при участии плазменного ингибитора сериновых протеаз - антитромбина.

• АК активность исследованных СП растительного, животного и синтетического происхождения зависит от молекулярной массы, степени сульфатирования, введения монофосфатных, ацетатных, карбоксиме-тильных, амидоэтильных групп.

• Сульфат протамина нейтрализует амидолитическую и фибриногенсвертывающую антитромбиновую (alla) и анти-фактор Ха (аХа) активности НМГ с молеклярной массой (ММ) 4,7 и 7,0 кДа, СХ с ММ 9,0 кДа, фукоиданов из F. evanescens и L. cichorioides в гравиметрических отношениях антидот/антикоагулянт от 0,5 до 1,5. Хитозаны с ММ 16 кДа (степень дезацетилирования - СД 91%) и 21 кДа (СД 61%) нейтрализуют антитромбиновую активность НФГ 15 кДа, НМГ с ММ 4,7 кДа и сульфата хитозана (СХ) с ММ 9,0 кДа.

Фармакодинамические (ФД) параметры НМГ с ММ 4,7; 5,4 и 7,0 кДа при подкожном введении кроликам сопоставимы с ФД параметрами фраксипарина. Внутривенное введение крысам и кроликам смеси СХ (ММ 75 кДа, степень сульфатирования - СС 1,25) и НФГ в весовом соотношении 1:1, фукоиданов из водорослей Е. ЕуапеБсет и Ь. Ыскопо1с1е8, сульфатированного галактоманнана (ГМ., ММ 127 кДа, СС - 1,46) приводит к возрастанию АК активности плазмы и длительности действия с увеличением дозы.

НМГ с ММ 4,7 и 5,4 кДа в одинаковой степени и также эффективно, как и фраксипарин, препятствуют развитию экспериментального тромбоза у крыс; геморрагическая активность НМГ с ММ 4,7; 5,4 кДа и фраксипарина одинакова. Антитромботическое действие СХ с ММ 75 кДа (СС 1,25) и фукоидана из Е. Еуапеясет сопоставимо с действием НФГ при в/в введении крысам, но геморрагический эффект ниже. Сульфатированный ГМ имеет противотромботическую активность в 100% при дозе 3 мг/кг.

Экспериментальный концентрат АТ человека (56 - 100 ЕД/кг) в сочетании с НФГ (30-50 ЕД/кг) и пара-аминобензойная кислота (0,5; 1,5 и 3,0 мг/кг) предотваращает развитие тромбоза на модели венозного стаза у крыс при внутривенном введении.

Синтетические пептиды Х-АЫ-А\ъ-А\^-Р1р* ТГА; 7-А1а-А1а-А^-МРНВг; Ас-Тгр-А^-М^НО; Па-С1у-А^-Р1р* Т¥А; Ас-Тгр-А1^-Р1р* ТГА ингибируют активность тромбина; при внутривенном введении Г1а-С1у-Аг§-Р1р* ТГА крысам антикоагулянтная активность плазмы возрастает с увеличением дозы.

С помощью биоспецифичного электрофореза в геле агарозы можно фиксировать комплексы между СП растительного, животного, синтетического происхождения и поликатионами (сульфат протамина и хи-тозаны с ММ 6-21 кДа и СД - 61-93%).); размеры пиков преципитации зависят от ММ, степени сульфатирования и АК активности сульфатов полисахаридов.

Апробация материалов диссертации

Основные результаты и положения предлагаемой работы были представлены на Всесоюзных, Всероссийских и Международных съездах, конгрессах, симпозиумах, конференциях. 1 Международная конференция Европейского хитинового общества, Брест (Франция), 1995; XV, XVI, XVII, XVIII Конгрессы Международного общества по Тромбозам и Гемостазу: Иерусалим (1995), Флоренция (1997), Болонья (2002), Любляна (2004); Первая Международная конференция по инженерии полисахаридов, Трондхейм (Норвегия),1995; 13,14 Международные конгрессы по тромбозам: Монпелье (1996), Любляна (1998); 10 встреча Средиземноморского клуба крови, Салоники, 1997; XIII Международный конгресс по фибринолизу и тромболизису, Барселона, 1996; 15 международный конгресс по тромбозам Средиземноморной лиги против тромбоэмболических заболеваний, Анталия 1998; 29, 30, 33 Конгрессы Федерации Европейских биохимических обществ: Варшава (2004), Будапешт (2005), Афины (2008); Вторая Европейская школа по биореологии, Варна (Болгария), 2006; 14 Конференция Европейского общества по клинической гемореологии и микроциркуляции, Дрезден, 2007; Вторая Всесоюзная конференция по фармакокинетике "Фармакокинетические исследования при создании и применении лекарственных средств", Каунас, 1987; III Всесоюзная научно-техническая конференция "Актуальные проблемы производства кровезаменителей, консервантов крови, гормональных и органотерапевтиче-ских препаратов", Москва, 1987; Всесоюзный симпозиум "Гериатрические средства: экспериментальный поиск и клиническое использование", Киев, 1990; I съезд Российского научного общества фармаколога, Волгоград, 1995; Съезд всероссийской ассоциации по изучению тромбозов, геморрагий и патологии сосудов им.А.А.Шмидта-Б.А.Кудряшова "Противотромботическая терапия в клинической практике", Москва 1995, 1997; Научно-практическая конференция "Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии", Санкт-Петербург, 2000; 6,7,8 и 9 Международные конференции "Новые достижения в исследовании хитина и хитозана", Щелково 2001, Санкт-Петербург 200, Казань 2006, Ставрополь 2008; 6-ая, 7-ая Международные научные конференции "Молекулярная биология, химия и физика неравновесных систем", Иваново-Плес, 2002, 2003; Первая Всероссийска научная конференция "Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии", Москва, 2003; 2-ой съезд Российского научного общества фармакологов "Фундаментальные проблемы фармакологии", Москва, 2003; Международный конгресс: Тромбоз, гемостаз, патология сосудов, Санкт-Петербург, 2004; 1-Украинская конференция с международным участием "Тромбозы в клинической практике: профилактика, диагностика, лечение", Киев, 2004; II, X, XI Национальные конгрессы "Человек и лекарство", 1995, 2003, 2004, Москва; II Всероссийская конференция по клинической гемостазиологии и гемореоло-гии в сердечно-сосудистой хирургии, 2005, Москва; Первая международная научно-практическая конференция «Биологические и медицинские технологии: от научных результатов - к инновационным разработкам» 2005, Москва; Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины, 2005, Киров; Международная конференция "Гемореология в макро- и микроциркуляции", Ярославль, 2005; II Всероссийская конференция Всероссийской Ассоциации по изучению тромбозов, геморрагий и патологии сосудов им. А.А.Шмидта-Б.А.Кудряшова, Ярославль 2005; Вторая Международная научно - практическая конференция «Перспективы развития биотехнологий в России», Пущино (Московская область), 2005; Третья Международная Научно-практическая Конференция МЕДБИОТЕК «Актуальные вопросы инновационной деятельности в биологии и медицине», Москва 2006; III съезд фармакологов России Фармакология -практическому здравоохранению, Санкт-Петербург, 2007; 3 Всероссийская конференция "Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии", 2007, Москва; III съезд фармакологов России Фармакология -практическому здравоохранению, Санкт-Петербург, 2007; V Всероссийская конференция-школа «Химия и технология растительных веществ», Уфа 2008; "IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов" Новосибирск 2008; Всероссийская конференция с международным участием "Тромбозы, кровоточивость, ДВС-синдром: современные подходы к диагностике и лечению" Москва 2008; IX Международная конференция "Современные тенденции в исследованиях и использовании хитина и хитозана" Ставрополь 2008; IV Всероссийской конференции по клинической гемостазиологии и гемореологии в сердечно-сосудистой хирургии (с международным участием), Москва 2009; XII научно-практическая конференция "Химия - XXI век: новые технологии, новые продукты", Кемерово, 2009; Научная конференция "Химическая биология - Фундаментальные проблемы бионанотехнологии", Новосибирск, 2009.

Личный вклад соискателя. Автор самостоятельно определяла направление исследований, осуществляла поиск перспективных, с точки зрения антикоагулянтной активности, органических соединений разной структуры и осуществляла контакты с предполагаемыми соавторами - химиками. А также, планировала ход экспериментов, самостоятельно получала результаты ко всем главам диссертации, анализировала результаты и формулировала выводы.

Публикации. Основные положения и результаты отражены в 48 публикациях; из 40 статей 2 опубликованы в зарубежных журналах, 4 представлены главами в книгах, 16 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации основных научных результатов докторских диссертаций. По теме диссертации получено 6 патентов

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, глав обзора литературы, материалов и методов исследования, а также 7 глав собственных результатов, заключения, выводов, рекомендаций, списка литературы и приложения (445 страниц); число рисунков 123, таблиц 121. Список

346 ВЫВОДЫ

1. Для получения низкомолекулярных гепаринов с высоким противо-тромботическим потенциалом требуется использовать ферментные комплексы из культуры 81гер(отусез8 кипястоуп и препарата протеаза С, либо проте-олитический фермент - лизоцим при гидролизе нефракционированных гепаринов. С уменьшением молекулярной массы гепаринов до 1,6- 9,3 кДа анти-тромбиновая активность снижается в 2-10 раз. Фармакодинамические параметры наиболее перспективных низкомолекулярных гепаринов и фраксипа-рина при подкожном введении экспериментальным животным совпадают.

2. Ингибирование активности тромбина сульфатами хитозана (ММ 20123 кДа) осуществляется с участием плазменного ингибитора сериновых протеаз - антитромбина, в больших концентрациях - с участием кофактора гепарина II. Антитромбиновая активность сульфатов хитозана возрастает с увеличением степени сульфатирования в диапазоне молекулярных масс от 56 до 82 кДа. Для создания эффективного антитромботического средства с меньшей, чем у нефракционированного гепарина, геморрагической активностью необходимо комбинировать сульфат хитозана (ММ 75 кДа, степень сульфатирования 1,25) с нефракционированным гепарином в весовом соотношении 1:1. Для получения сульфатов хитозана с высокой ингибиторной активностью по отношению к активированному фактору десять (аХа активность) следует использовать кислотный гидролиз высокомолекулярных сульфатов хитозана.

3. Исследованные фукоиданы из бурых водорослей в большей степени ингибируют активность тромбина преимущественно антитромбином. Фармакодинамические параметры наиболее перспективных фукоиданов и нефракционированного гепарина при внутривенном введении экспериментальным животным сравнимы. 100% антитромботический эффект появляется при внутривенном введении крысам фукоидана из Г. емапезсет в дозе 7 мг/кг, геморрагический эффект этого фукоидана выражен в меньшей степени, чем у нефракциоинрованного гепарина. Для получения фракций фукоиданов из водорослей F. evanescens и L. saccharina с меньшей молекулярной массой и большей антикоагулянтной активностью необходимо использовать фукоида-назу или экстракт из гепатопанкреаса камчатского краба.

4. Антикоагулянтная активность исследованных полисахаридных ионных комплексов и сульфатов галактоманнана уменьшается со снижением степени сульфатирования последнего. Фармакодинамические параметры при внутривенном введении крысам сульфата галактоманнана с молекулярной массой 127 кДа и нефракционированного гепарина - сопоставимы. Определена доза сульфата галактоманнана для достижения 100% антитромботиче-ской активности.

5. Для нейтрализации антикоагулянтной активности исследованных сульфатов полисахаридов растительного и животного происхождения in vitro можно использовать сульфат протамина и хитозны с молекулярной массой 16 и 21 кДа.

6. Механизм антикоагулянтного действия сульфатов целлюлозы из древесных и травянистых растений и сульфатов монофосфатов-, карбоксиме-тил-, диальдегид-, амидоэтилцеллюлозы связан с ингибированием активности тромбина и фактора Ха преимущественно антитромбином. С уменьшением молекулярной массы до 10-30 кДа и увеличением степени сульфатирования целлюлозы до 2,5 антикоагулянтная активность возрастает.

7. Исследованные сульфаты пектина и крахмала ингибируют активность тромбина и фактора Ха посредством антитромбина и других плазменных ингибиторов сериновых протеаз свертывающей системы крови, но сульфаты крахмала ингибируют амидолитическую активность тромбина только в присутствии антитромбина. Антикоагулянтная активность сульфатов пектинов увеличивается с возрастанием степени сульфатирования и зависит от вида растения и моносахаридного состава. Зависимость антикоагулянтной активности сульфатов крахмала от степени сульфатирования - колоколообраз-на, с пиком при степени сульфатирования 1,67.

348

8. Антикоагулянтная активность исследованных синтетических фрагментов олигосахаридов фукоиданового типа увеличивается с увеличением молекулярной массы и степени сульфатирования. Синтетические производные пептидов 2А1а-А1а-А^-Р/р* Т¥А; г-Ак-Ак-Ащ-МРНВг; Ас-Тгр-А1^-МР*НС1; Р1а-01у-Ащ-Р1р* ТБА; Ас-Тгр-А^-Р1р* ТБА ингибируют амидоли-тическую активность тромбина и задерживают появление фибринового сгустка плазмы человека в тестах при оценке состояния внутреннего и конечного этапов свертывания плазмы. При внутривенном введении экспериментальным животным наиболее активного производного пептида Р1а-С1у-Аг§-Р1р-ТЕА антикоагулянтная активность плазмы увеличивается с возрастанием дозы.

9. Определены оптимальные сочетания экспериментальных препаратов концентрата антитромбина человека (55-100 ЕД/кг) с нефракционированным гепарином (40-60 ЕД/кг) и доза пара-аминобензойной кислоты при которых достигается 100% предотвращения роста тромба при внутривенном введении крысам с моделированным венозным тромбозом.

Рекомендации для внедрения результатов исследования:

- в науку

При разработке новых антикоагулянтов на основе сульфатированных полисахаридов растительного или животного происхождения следует учитывать результаты экспериментального исследования по оценке действия нативных, полусинтетических или синтетических сульфатов полисахаридов на систему гемостаза in vitro и in vivo.

Для выбора новых поликатионов-антидотов АК активности сульфатов полисахаридов рекомендуется использовать биоспецифичный электорфорез в геле агарозы.

- в медицинскую практику

Ресурсная обеспеченность и патентная защищенность являются основой для разработки антитромботических лекарственных средств на основе нативных и полусинтетических полисахаридов растительного и животного происхождения.

Рекомендуются для токсикологических испытаний -для парентерального введения: низкомолекулярный гепарин с ММ 7.0 кДа ; низкомолекулярный гепарин с ММ 5.4 кДа ; механическая смесь сульфата хитозана (ММ 75 кДа;СС 1,26) и нефракционированного гепарина (в весовом соотношении 1:1); фукоидан (ММ 20-40 кДа) из водоросли Fucus evanescens ; сульфатированный галактоманнан (ММ 127 кДа;СС 1.46) ; для введения per os :пара-аминобензойная кислота.

- в учебный процесс

Рекомендуется использовать при подготовке аспирантов по специальностям фармакология, биохимия, биотехнология новые данные о механизмах антикоагулянтного действия нативных и полусинтетических производных карбогидратов растительного и животного происхождения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ЮЛ. Влияние аминополисахаридов - низкомолекулярных гепари-нов и сульфатированных хитозанов на свертывающую систему крови.

Ограниченность сырьевых ресурсов, рост потребления и наличие побочных эффектов НФГ предполагают поиск заменителей этого АК средства среди СП натурального (с использованием тканей растений или животных), полусинтетического или синтетического происхождения [36,50,162,166,195, 198,242, 283,325,356,359,434,435,455,456,459, 461,559,631, 634,652,692,698, 716,726,729, 732,783].

10.1.1. Антикоагулянтная активность низкомолекулярных гепари-нов, полученных с помощью ферментативного гидролиза нефракциони-рованных гепаринов.

Препараты НМГ имеют ряд преимуществ перед НФГ: снижение активности против Т (alla активность), высокая биодоступность и быстрое всасывание при п/к введении; продолжительность действия 18-28 ч при п/к введении; предсказуемый АК эффект; терапевтический эффект проявляется при приеме 1 раз в сутки; в некоторых случаях отсутствие необходимости в регулярном лабораторном контроле; низкая частота выработки антител к НМГ и тромбо-цитопений; не проникают через плаценту; не влияют на сосудистую проницаемость; незначительная активация остеобластов и низкая частота развития остеопороза [325,743]. На фармакологические свойства НМГ влияет источник НФГ (тип ткани и вид животного) [73,121,278,293]. Препараты НФГ являются гетерогенной смесью сульфатированных ГАГ с разными ММ [316]. В полимере НФГ основная повторяющаяся дисахаридная единица представлена следующей формулой: (1—>4)-2-дезокси-2-сульфамино-а-Б-глюко-пираноза-6-сульфат-(1-^4)-а-Ь-идопиранозил-уроно-вая кислота-2-сульфат (1—>4) [434]. Препаратам НФГ присуща тканевая специфичность. Повторяющаяся единица составляет в НФГ из легких крупного рогатого скота (КРС) свыше 90%

327], а в НФГ из слизистой оболочки тонкого кишечника (мукозы) свиней около 75 %, по данным Овсепяна A.M. [327], или 88 % по данным Linhard R.I. [434]. В макромолекуле НФГ из мукозы, кроме указанных дисахарид-ных фрагментов, есть остатки 2-ацетамидо-2-дезокси-а-0-глюкопиранозы и [3-D-глюкуроновой кислоты [327]. Обычно НФГ из мукозы содержат больше N-ацетильных групп и показывают более высокую АК активность, чем НФГ из легких. Тромбоцитопения чаще проявляется в виде побочного эффекта при введении НФГ из легких (26-30% пациентов), чем при введении НФГ из мукозы (2-5 % пациентов) [433]. Также имеет значение разновидность соли препарата НФГ. НФГ из мукозы в форме натриевой соли превосходит НФГ в форме кальциевой соли по силе АК эффекта при в/в введении кроликам, но при подкожном введении Са++- НФГ действует более стабильно и длительно, чем №+-НФГ [433,434]. К факторам, влияющим на АК активность НФГ, относят степень сульфатирования, количество и расположение О-сульфатных групп, присутствие свободных карбоксильных групп, содержание гексоза-мина и уроновых кислот [281,392,581].

В настоящей работе для выбора наиболее оптимального НМГ исследовали АК активность образцов, полученных деполимеризацией НФГ разных фирм производителей, из тканей КРС или свиней, с использованием разных ферментных комплексов (ФК) и ферментов. Критериями отбора перспективных образцов НМГ служили активность против фактора Ха (аХа активность) -не менее 70 ЕД/мг по Европейской фармакопейной статье [723] и отношение активностей aXa/alla не ниже 1,5.

Анализ АК активности НМГ, полученных деполимеризацией НФГ из легких КРС или слизистой оболочки кишечника свиней с помощью ФК Strep-tomycess kurssanovii (иммобилизованный или в растворе) (табл. 10.1.1.1., табл. 4.1.1.2. - 4.1.5.2.) показал, что с уменьшением ММ alla активность снижается (коэффициенты корреляции достигали 0,75-0,97; р<0,05). Величина аХа активности полученных НМГ возрастает с увеличением ММ при гидролизе НФГ из мукозы свиней (г=0,88) и в значительно меньшей степени подобная связь наблюдается для НМГ, полученных гидролизом НФГ из легких КРС (г=0,35). Максимальное отношение активностей aXa/alIa у НМГ, полученных деполимеризацией НФГ их легких КРС в 1,5 раза больше, чем у образцов, полученных деполимеризацией НФГ и мукозы свиней (табл. 10.1.1.1.). То есть, в случае гидролиза ФК Streptomycess kurssanovii на AK активность НМГ влияет тип ткани НФГ.

Гидролизаты полученные из НФГ легких КРС обладают высокими аХа активностями до 179± 17 ЕД/мг (НМГ с ММ 4,7 кДа; гидролиз иммобилизованным ФК), полученные из НФГ слизистой оболочки тонкого кишечника свиней до 189±28 ЕД/мг (НМГ с ММ 5,4 кДа; гидролиз ФК в растворе). Количество и состояние (иммобилизованный или в растворе) ФК, а также время действия и температурный режим играют роль при получении АК с высокой активностью. При уменьшении ММ НМГ, полученных гидролизом НФГ впервые использованным с этой целью хитинолитическим ФК из Streptomycess kurssanovii, отмечается снижение аПф активности и максимальное увеличение отношения активностей aXa/alla до 4-6.

Состояние ФК карбогидраз - протеаза С (иммобилизованный или в растворе) влияет на величину аХа активности НМГ полученных гидролизом НФГ из легких КРС. Например, образцы, полученные деполимеризацией НФГ ФК Протеаза С в растворе, показали высокие аХа и alla активности, но отношение aXa/alla активностей составило 0,86 (alla - 155±7 ЕД/мг, аХа - 133±15 ЕД/мг). Использование иммобилизованного ФК позволило получить НМГ с меньшей ММ, отношение активностей aXa/alla достигало 1,23 (alla - 92±6 ЕД/мг, аХа 112±8 - ЕД/мг). По сравнению с исходным НФГ аХа активность возрасла и увеличилось отношение aXa/alla у образцов с ММ 5,4; 4,0; 3,4 кДа. То есть, произошло существенное снижение длинны цепи и, по всей вероятности, при деполимеризации не нарушилась структура специфического пентасахарида [325,554,743].

Отношение активностей aXa/alla НМГ полученных гидролизом НФГ из легких КРС или мукозы свиней папаином (Sigma или ЗАО "Биопрогресс"), целловиридином, химотрипсином и лизоцимом достигает 0,3-2,5. Состояние фермента (иммобилизованный или в растворе) большого значения для увеличения АК активности не имеет. При деполимеризации растворами ферментов папаин и целловиридин максимальная alla активность составляет 184±25 ЕД/мг, максимальная аХа активность - 183±47 ЕД/мг. Но в отличие от деполимеризации НФГ ФК протеаза С, гидролизаты, полученные с помощью иммобилизованных ферментов папаин (Sigma) и целловиридин, несмотря на высокие аХа и alla активности показали отношение активностей aXa/alla близкое к 1. Использование иммобилизованных ферментов имеют ряд производственных преимуществ, но в нашем случае полученные таким способом НМГ не всегда имеют лучшие специфические активности. То есть на передний план выходят другие параметры гидролиза, такие как соотношение фермент : субстрат, температура и время гидролиза.

НМГ с ММ 6,8 и 9,3 кДа (получены гидролизом НФГ из легких КРС, ОАО "Белмедпрепарат") с помощью иммобилизованного лизоцима или в растворе продемонстрировали отношения активностей aXa/alla 1,28 и 1,33, соответственно. В работах последних лет некоторые авторы рассматривают преимущества НМГ с оптимальными ММ в диапазоне 9-12 кДа, так называемые гепарины со средней ММ (СМГ). Геморрагическая активность СМГ чуть выше, чем у НМГ, но их АК активность успешнее нейтрализуется фактором тромбоцитов 4 (PF 4) [197,327,328,390,715,738]. Молекулы с высокой ММ и низкой аффинностью к AT (с меньшей alla активностью) нарушают нормальное функционирование тромбоцитов, что способствует кровотечениям [715,738]. Отсутствие молекул с ММ более 15 кДа в СМГ и высокое содержание высоко-аффинных к AT молекул - два условия, при которых безопасность АК средства улучшается.

Отношение активностей aXa/alla НМГ, полученных гидролизом НФГ лизоцимом (НМГ с ММ 7,0 кДа) и ФК протеаза С (НМГ с ММ 9,0 кДа) в одинаковых условиях составило 1,23 и 1,36, соответственно. Однако образец с ММ 9,0 кДа можно отнести к СМГ.