Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Исследование фармакологического влияния на свертываемость крови полиэлектролитов - производных винилазолов и фукоиданов (экспериментальное исследование)

lia ripamix рукописи

rABPJUïÛBA Елена Александровна

й)ис

ИССЛЕДОВАНИЕ MPí.íAKOJ!Oní4ECKOrO 1ШШШЫ НЛ СВЕРТЫВАЕМОСТЬ ККШН П олкаЛЕКТРОЛКГШ -ПРОИЗВОДНЫХ ЕШШАЗОЛОВ H ФУК0ИДЛ1ЮК (экспериментальное исследование)

14.GO.25 -. Фармакология

AIÍTCPGíEPAT

диссертации va соискание ученой степени .'ййндидатл биологических иаук

KiOCttßA - 1997

Работа выполнена в Российском Государственном медицинском

Университете

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор

B.C. Ефимов

доктор химических наук, профессор А.И. Смирнов

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

B.C. Утешев

доктор биологических наук Е.И. Асташкин

Ведущее учреждение: Московский медицинский стоматологический институт им. H.A. Семашко

Зашита диссертации состоится -/О ¿шАа^М4 997 г. в ас- часов на заседании дшЗсер?ационного Совета

К 084.14.05 в Российском Государственном медицинском университете по адресу: 117869, Москва, ул. Островитянова, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского Государственного медицинского университета (ул. . Островитянова, д.1).

Автореферат разослан " igg5 г_

. / '

Ученый секретарь диссертационного Совета

канд. медицинских наук Т.Н. Клушинг

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

_Актуальность темы.

Расстройства гемостаза, характеризующиеся признакам» гиперкоагуляции, являются главным звеном в развитии тромбогеморраги-ческих осложнений различных заболеваний, главной причиной тромбозов и тромбоэмболии, приводящих к летальным исходам при патологиях сердечно-сосудистой системы (Лакин К.М. и соавт., 1974, Макаров В.А., 1989). Для быстрой коррекции таких нарушений свертываемости крови современная терапия использует природный антикоагулянт прямого действия гепарин. (Jaques, 1975; Машков М.Д., 1995).

Безопасность применения гепарина может быть гарантирована только наличием и рациональным применением высокоактивных его антагонистов, которые способны быстро и необратимо, без побочных проявлений устранить антикоагулянтный эффект.

В настоящее время для этих целей применяют природные поли-катионьг белковой природы - протамины, многолетнее использование которых убедительно показало, что они не обладают необходимой избирательностью связывания гепарина в условиях кровотока; их использование сопровождается различными побочными эффектами даже при адекватной дозировке, но, особенно, при нередких передозировках. Кроме того, ограниченная доступность использования протами-нов в практической медицине зависит от объемов добычи ценных пород рыб, гонады которых являются сырьем для получения этого вида аптигепаринатов.

В результате активных поисков синтетических аналогов прота-мина появились сообщения, которые описывают структуру и биологические свойства в эксперименте новых перспективных катионных полимеров - антигепаринатов. Многие из них обладают более сильной, чем протамины, нейтрализующей активностью, однако, и они не лишены побочных эффектов (тромбоцитопения, частичная инактивация факторов свертывания), которые можно объяснить не только вариациями построения макромолекулы (плотность заряда, величина макромолекулы, степень кватернизации и др.), но и макроструктур-ными особенностями полимерных носителей кватернизованного атома азота (молекулярная масса, мономерный состав, конформационные характеристики, плотность заряда и др.). Используя современные возможности полимерной химии, в Иркутском госуниверситете получен ряд поликатионов на основе пинготазолов.

Известные производные азолов проявляют выраженную ан-тиагрегационную активность (Ferroni et al., 1988; Milani et al., 1988; Hisayama et al., 1989 и др.), что сильно повлияло на выбор этой структурной основы для создания новых поликатионов. Это свойство носителя заряда наиболее существенно, поскольку известно, что при адек-

ватной нейтрализации гепарина или передозировках всех известных антигепаринатов возникает выраженная тромбоцитопения, как результат склеивания этих клеток и длительной задержки клеточных агрегатов в капиллярном русле.

Кроме того, винилпроизводные азолов легко могут вступать в реакцию сополимеризащш, которая при условиях оптимального подбора количественного и пространственного соотношения сополимер-ных группировок со структурами - носителями заряда - может уменьшить токсичность антигепарината за счет уменьшения продолжительности его пребывания в организме.

Обладая целым рядом положительных свойств, гепарин может вызывать аллергические реакции. Его применение сопровождается тромбоцитопенией, нередко возникает рикошетный эффект, что сильно затрудняет, а иногда делает абсолютно невозможным его применение при затяжном течении ряда заболеваний. Кроме того, у значительной части населения планеты отсутствует или снижена чувствительность к этому препарату из-за врожденного дефицита кофактора гепарина - АТ III. По данным ВОЗ на 5000 населения приходится I человек с наследственным дефицитом данного белка. Они составляют группу повышенного риска тромбообразования. Этот перечень добавляется сотнями тысяч пациентов с возникающей недостаточностью АТ -III в течении основного зaбoлeвaшш.(Odegard, Abildgaard, 1978).

Поиск эффективных заменителей гепарина ведется среди его структурных аналогов - сульфатированных полисахаридов природного происхождения - фукоиданов. Основной структурной единицей этих полисахаридов является фукоза, а полисахаридный скелет макромолекулы имеет разветвленную структуру (Doner. WhinstLer, 1973; Усов А.И., 1992, 1993).

В наших исследованиях были использованы фукоиданы, выделенные и охарактеризованные в лаборатории Института органической химии им. Н. Д. Зелинского РАН под руководством доктора химических наук, профессора А. И. Усова.

_Цель исследования.

Целыо данной работы было выявление антигепариновых свойств в ряду сополимеров на основе винилазолов с различными вариациями их структурных элементов, исследование острой токсичности этих соединений и зависимости их специфической фармакологической активности от основных макромолекулярных характеристик.

Изучение механизма антикоагулянтной активности новых фракций фукоиданов и установление возможности нейтрализации анти-коагулянтного действия фукоиданов, выделенных из бурых морских водорослей Laminaria Saccharina Баренцева моря, сополимером на

основе винилимидазола, проявляющего наибольшую антигепариновую активность.

_Задачи исследования.

1. Установить наличие антигепариновых свойств и определить токсичность в ряду гомополимеров и сополимеров на основе винила-золов в исследованиях "in vitro";

2. Выявить зависимость антигепариновых свойств от основных характеристик заряженных макромолекул;

3. Установить изменение признаков антикоагулянтнон активности и острой токсичности в зависимости от способа выделения фу-коиданов из бурой морской водоросли Laminaria Saccharina;

4. Установить наличие антагонизма и нейтрализующих со отношений сополимером ВИМ-ДЭМК фукоиданов к сополимеру вшшлимидазола с диэтиловым эфиром малеиновой кислоты (ВИМ:ДЭМК) с целью определения возможности быстрой отмены антикоагулянт ного действия полианионов растительного происхождения.

_Научная новизна.

Впервые изучены антигепариновые свойства и определена острая токсичность сополимеров на основе винилимидазола с бисакри-ламидом.

Показана зависимость антигепариновых свойств поликатионов от макромолекулярных характеристик: строения мономерного звена сополимера, соотношения носителей заряда с сополимернымн группами в макромолекулах сопоставимых молекулярных масс.

Изучены антикоагулянтное действие и острая токсичность суль-фатированных полисахаридов - фукоиданов, выделенных из бурых морских водорослей Laminaria saccharina Баренцева моря с использованием различных способов очистки.

Впервые исследована возможность нейтрализации антикоагу-лянтного действия изученной группы фукоиданов сополимером винилимидазола с диэтиловым эфиром малеиновой кислоты (ВИМ:ДЭМК).

Практическая значимость работы.

Поликатионы на основе винилазолов, сочетающие в себе высокую антигепариловую активность и низкую токсичность, представляют новый класс перспективных антигепаринатов.

Установлено, что фукоиданы, выделенные из бурых водорослей Laminaria Saccharina Баренцева моря, обладают антакоагулянтным действием при достаточно низкой токсичности. Это создает реальную перспективу получения новых антикоагулянтов на основе дешевого растительного сырья.

Показана возможность быстрой отмены антикоагулянтного действия фукоиданов сополимером ВИМ:ДЭМК.

_Апробация материалов диссертации.

Материалы диссертационной работы обсуждены на совместном заседании лаборатории фармакологии гемостаза ЦНИЛ РГМУ, кафедры фармакологии РГМУ и лаборатории растительных полимеров ИОХ им. Н.Д. Зелинского (Москва, 1996).

Основные положения работы были обсуждены на II и III Российских национальных конгрессах "Человек и лекарство" (Москва, 1995, 1996)

_Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ в центральных журналах и сборниках.

_Объем и структура диссертация.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы.

Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста, содержит 24 таблицы и 12 рисунков. Список цитируемой литературы включает 186 наименований, из них 43 отечественных и 143 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

_Материалы и методы исследования.

В опытах "in vivo" использовано 90 кроликов - самцов весом 2,5 -3,0 кг; острую токсичность определяли на 750 белых беспородных мышах весом 15 - 20 г. Исследования проведены с использованием следующих методов: тромбоэластографии (Sohneider et al., 1962), тромбопластинового времени по Квику (Quick., 1972), времени ре-кальцификации (Bergenhof., 1954) и толерантности крови к гепарину (Marbet, в модификации Jürgens., 1962). Кроме того, подсчитывали количество тромбоцитов с помощью автоматического счетчика частиц, определяли их агрегационную способность (Born., 1962). Активность факторов свертывания крови определяли с помощью стандартных реагентов. Определение интенсивности метахромагической реакции основного красителя в водной среде при добавлении известных количеств гепарина проводили по методу Macintosh (1941).

Острую токсичность LD50 определяли по формуле Кербера (Беленький M.JL, 1959). Статистическая обработка результатов проведена по критерию Стьюдента с использованием компьютера М-240 "Olivetti".

В работе использованы поликатионы на основе N- и С-винилазолов синтезированные в лаборатории полимсризационных процессов Иркутского госуниверситета (табл. 1), а также фракции фу-коидаиа, выделенные и охарактеризованные п лаборатории Института органической химии имени Н.Д.Зелинского РАН под руководством доктора химических наук, профессора А.И.Усова.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Как известно, быстрая гинокоагуляция крови достигается введением в кровоток физиологического антикоагулянта прямого действия - гепарина, представляющего собой высокосульфированный полисахарид, обладающий множественным отрицательным зарядом. Длительность аптикоагулянтного эффекта гепарина пропорциональна введенному количеству, но, как правило, после окончания использования аппаратов искусственного кровообращения он еще остается в кровотоке и возникает необходимость нейтрализации его воздействия па кровь. Так как гепарин - сильная поликислота, то для ее надежной нейтрализации необходимы сильные полиоснования, потому что слабые полиоснования не дают устойчивого интерполиэлектролитного комплекса, что в условиях белковых конкурентов (антитромбины) делает нейтрализацию малоэффективной. Для этой цели показано применение антагонистов гепарина, представляющих собой полимерные катионы природного или синтетического происхождения (Лакин K.M. и соавт., 1970).

Известно, что четвертичные соли полимеров, полученных па основе 1-виш1лимидазола (1-ВИ) обладают высокой антигепариновой активностью. Однако эти соединения оказались достаточно токсичными. Введение в полимерную цепь поли-1-ВИ звеньев инертного сомономера такого, как диэтиловый эфир малеиновой кислоты (ДЭМК), позволило снизить токсичность синтезируемых поликатионов. (Афанасьева Г.В., 1992).

С целью дальнейшего улучшения фармакологических характеристик антигепаринатов на основе ВИ была изучена возможность синтеза биодеструктируемых поликатионов. Для этого нами был выбран путь синтеза имидазолсодержащих полимеров имеющих в своей структуре склонные к деструкции амидные связи.

Известно, что мономеры содержащие две реакционноспособные кратные связи при определенных условиях полимеризации могут давать растворимые продукты. Поэтому в качестве сомономера содер-

Таблица 1.

Структура исследованных поликатионов на основе N- и С-винилазолов

Структурная формула Шифр обрата Химическое название

сн сн2 i q. ^R xG I: R=CH3, X=l; Поли-1-бинил-З-алкилимидазолин галоге-нид

-CI N <s, xe II:X=I; III: Х=Г IV: X=0S03CH, Поли-1,3-диалкил- 5-вииилгетразолнй иодил (метилсульфат)

•X Н3С—N N 3

-CII — C'Hj— Qe V V: R=CII3, X=l, n:m - 86:14 моль%; VI: R=CIIi, X=l, n:m - 78:22 моль?»; VII: R=CHj. X=I,n:m- 70:30 моль0/о; VIII: R=CH3, X=I, n:m - 57:43 моль%; IX: R=C2Hj, X=Br, n:m - 86:14 моль%; X: R=CIh, X=C1. n:m-86:14 Сополимер 1-винил-З-алкилимидазолий галоге-иида с диэтиловым эфиром малеиновой кислоты

n 1 1 iisc,ooc coocjiij щ

— СН — СН2-i О. f n CHJ—CH idi ^c.-o HjC—CiT ш XI: n:m- 83:17: XII: n:rn-64:36; XIII: n:m - 52:48 Сополимер 1-випил-З-мстилимщмзолий иодида с Х.Ы'-мечилен-бис-акрилами-дом

'Степень кватернизации ~ 30%

жащего амидные связи нами был использован N,N'-mctiiji€ii-6hc-акриламид (МБАА).

В работе отражены результаты синтеза четвертичных солей сополимера 1-ВИ с МБАА и исследования их антигепариновой активности в опытах in vitro и в организме животных, а также их острой токсичности.

Исследования показали, что все сополимеры в той или иной степени обладают антигепариновой активностью, как в опытах in vitro с

основным красителем, гак и в опытах in vivo при введении поликатионов в кровоток животных.

Совпадение нейтрализующих соотношений в воде и в крови позволяет считать, что гепарин и поликатион связываются в эквивалентных количествах и образуют стехиометрический интернолиэлектро-литный комплекс, несмотря на присутствие белковых и клеточных элементов крови.

Среди изученных поликатионов, наиболее активным в исследованном ряду соединений является сополимер ВМИИ:МБАА (83:17 моль%). Оптимальное весовое нейтрализующее соотношение полика-тион:гепарин составило 0,6:1. Показатель острой токсичности LDso 123 мг/кг (рис. 1,2).

Рисунок 1.

Зависимость острой токсичности от содержания звеньев М.М'-метилен-бисакриламида в сополимере ВМИИ:МБАА

Содержание звеньев М5АА, моль %

Рисунок 2.

Зависимость антигепариновой активности от содержания звеньев Ы^'-метилен-бисакриламида в сополимере ВМИИ:МБАА

Содержание звеньев МБАА, моль %

Известно, что при практическом применении антагонистов гепарина нередко возникают передозировки. Несвязный гепарином поликатион может взаимодействовать с белковыми и клеточными компонентами крови, вызывая тем самым изменения в системе гемостаза,

а именно антикоагулянтный эффект, который без специального анализа можно воспринять за сохраняющийся эффект гепарина.

Для получения информации о признаках передозировки сополимера были проведены эксперименты, в которых имитировалось двукратное превышение нейтрализующей дозы. При этом было установлено, что данный поликатион (ВМИИ:МБАА, состава 83:17 моль%) практически не влияет на состояние свертывающей системы крови. Выраженные отклонения от нормальной коагуляции имели место лишь в случае превышения нейгралнзующей дозы антигепарината в четыре раза, при этом гипокоагуляционные изменения проявлялись сразу же после введения поликатиона, а затем повторялись, также на 120 минуте эксперимента. В дальнейшем восстановление гипокоагуляционных свойств было стабильным.

Исследование активности индивидуальных факторов, входящих в "протромбиновый комплекс", показало, что активность факторов II и X усиливается в течение часа, (II-145%, Х-120%) В последующие временные интервалы она снижается до 115-85%. Активность фактора IX на 5 и 15 мин. эксперимента превышает исходный уровень, а на 120 мин. падает до 76%. У фактора VII активность также снижается и достигает минимума на 120 мин. эксперимента - 65% (рис. 3).

Рисунок 3.

Изменение активности факторов протромбинозого комплекса после введения сополимера ВМИИ:МБАА состава 33:17 в дозе 6 мг/кг

— II —♦—VII IX

X

СО

I ■ i i i1' i > i ■ i ■ i ' i ' i ■ i ' /У-1-■-1

О 20 40 СО 80 100 120 140 160 180 1200 1400 1600

t, МИН

Исследование активности факторов V, VIII, XI и XII показало, что наибольшим изменениям подвергается активность фактора V. На 120 мин. эксперимента она падает до 55%. Активность факторов XII и XI повышена в начале эксперимента, а затем она плавно снижается до 86% и 83% соответственно. Активность фактора VIII на 120 мин. эксперимента составляет 75% от исходного уровня (рис. 4).

Таким образом, при значительном превышении дозы вводимого сополимера ВМИИ.МБАА (83:17 моль.%) - в 4 раза, существенные изменения претерпевает активность факторов как "внешнего", так и "внуфснпего" путей свертывания крови. В целом снижение свертываемости крови в первые 30 мин. после введения поликатиона, вероятно обусловлено развивающейся тромбоцитопенией, а также снижением активности факторов V и VIII свертывания крови, несмотря на

Рисунок 4.

Изменение активности факторов, не входяиух в протромбиновый комплекс, после введения сополимера ВМИИ.МБМсостава 83:17 в дозе

t, мин

то, что при этом повышена активность факторов II, IX и X. В более отдаленные сроки эксперимента (120 мин) снижается активность всех без исключения факторов свертывания крови, что выражается в гипо-коагуляционном сдвиге показателей тромбоэластограммы.

Двухфазность изменения активности плазменных факторов (сначала - повышение, а затем - снижение) характерна для поведения всех факторов, исключая V и VIII.

При снижении активности факторов II, V и X, на которых замыкаются как "внешний", так и "внутренний" механизмы, снижение свертывания крови наблюдается по всем коагуляционным тсстам.

Исследование антигепариновой активности имидазолсодержа-щих поликатионов с различными противоионами показало, что природа противоиона практически не влияет на способность сополимера связывать гепарин как в сложных, так и простых средах.

Нейтрализующая способность данного сополимера избранной структуры была изучена в условиях кровотока. Для этого нами был отобран образец поликатиона, отличающийся от представителей изучаемой структуры противоионом С1. Острая токсичность данного соединения составила 125 мг/кг.

Для подтверждения эффективности данного сополимера с гепарином в условиях организма были проведены опыты по нейтрализации гепарина в дозе 500 Ед/кг в оптимальном весовом соотношении 0,6:1. Результаты исследования свидетельствуют о восстановлении свертываемости крови, нарушенной гепарином уже через 5 мин. после введения сополимера. На это указывают основные показатели тром-боэластограммы, тромбопластиновое время по Квику, количество тромбоцитов и их агрегационная способность.

С целью изучения влияния сополимера ВИМ:ДЭМК (CI) на активность некоторых плазменных факторов системы гемостаза была проведена серия экспериментов. В частности, была исследована активность индивидуальных факторов свертывания II, V, VII и X, три из которых входят в протромбиновый комплекс (II, VII и X).

Было установлено, что в первые 60 минут эксперимента активность факторов X и VII не только не уменьшается, а напротив усиливается. Она превышает исходную 100% активность и составляет соответственно 175% и 115%. Активность фактора II через час после введения сополимера составила 80%. Через 24 часа после начала эксперимента активность факторов прогромбинового комплекса усиливается. У факторов X и VII она составила 200% и 190% и в последующие временные интервалы находилась в этих пределах. В меньшей степени усиливается активность протромбина, хотя также превышает исходный уровень. Через 48 часов она составила 115% .

Колебания результатов, полученные в динамике, находились в пределах биологической нормы, поэтому с полным основанием можно говорить о том, что отмена антикоагуляатного эффекта гепарина, наступающая уже на пятой минуте после введения этого сополимера, является полной и устойчивой.

Выполненные эксперименты показали, что степень проявления антигепаринового эффекта поликатионов тем больше, чем выше плотность заряда макромолекулы и практически не зависит от природы протнвоиона при четвертичном атоме азота звеньев ВИМ. Эта же закономерность прослеживается и в отношении взаимодействия с тромбоцитами - клетками, реагирующими на гидрофобность макромолекул или их комплексов. Наблюдавшаяся активация факторов вероятно, имеет сложную природу и может объясниться как нейтрализацией эндогенного гепарина (на ранних сроках наблюдения), так и стимуляцией их синтеза в печени (в отдаленные сроки), как это установлено для других катионных полимеров (Ефимов В.С. и др., 1995). Полученные результаты делают целесообразным дальнейшее изучение данного класса антигепаринатов.

Известно, что гепарин, обладая целым рядом положительных свойств может вызывать нежелательные эффекты (аллергические реакции, рикошетный эффект, тромбоцитопения и др.) (Ефимов В.С., Румянцева А.Г., 1994).

Основной поиск высокоэффективных заменителей гепарина ведется среди его структурных аналогов - сульфатированных полисахаридов полусинтетического и природного происхождения. По типу ан-тикоагулянтного действия эти соединения часто близки к гепарину.

Особое положение среди сульфатированных полисахаридов природного происхождения занимают фукоиданы, или фукансульфа-ты, основной структурной единицей которых является фукоза, а поли-сахаридный скелет имеет разветвленную структуру (Doner L., Whisller R„ 1973; Усов А.И. и др. 1994).

Показано, что механизм их антикоагулянтного действия не определяется взаимодействием с АТ-Ш, что открывает возможность их использования у больных с врожденным и приобретенным дефицитом этого кофактора гепарина.

В литературе имеются единичные сообщения о проявлении этими соединениями антикоагулянтной активности. (Bernardi, Springer, 1962, Pangrazzi, Glanese, 1987, Розкии М.Я. и соавт., 1988, Каменева Н.С. и соавт., 1990).

Нами было проведено сравнительное исследование метахрома-тической активности и острой токсичности сульфатированного полисахарида - фукоидана, фракции которого были выделены из бурых морских водорослей Laminaria saccharina Баренцева моря.

Проведенные исследования метахроматической активности сульфатированных полисахаридов - фукоиданов показали, что все изученные образцы обладают способностью взаимодействовать с основным красителем в опытах in vitro по аналогии с гепарином.

Известно, что степень сульфатированности макромолекулы играет важную роль в выраженности антикоагулянтного действия, а

также показателя острой токсичности (Jaques L.B.,1979; Nishino Т. et al., 1990).

Щелочная обработка фукоидана приводит к удалению балластных примесей, результатом чего является повышение сульфата в препарате FM, а также снижение острой токсичности. Так, у фукоидана F показатель острой токсичности составил 215 мг/кг, а у фукоиданов FM и FMC эта величина возросла и составила соответственно 285 и >300 мг/кг, (рис. 5, 6).

Подтверждением наличия антикоагулянтной активности у фукоиданов стали данные, полученные при введении фракций полисахарида в кровоток кроликов в дозе 20 мг/кг.

Доза 20 мг/кг. имеет устойчивый антикоагулянтный эффект "in vivo" и не превышает 1/10 LDjo, т.е. является терапевтической дозой.

Рисунок 5.

Относительная метахроматическая активность фукоиданов

VC71....." ~.............................:

100

90

80

* 70

Í 60

о X 50

а

40

а 30

20

10

0

Гепарин

F FM

Вещество

Рисунок 6.

Острая токсичность фукоиданов

3000 ' 2500

Гепарин

F FM

Вещество

В опытах in vivo все изученные фукоиданы обладали антикоагу-

лянтной активностью. Большей глубиной и продолжительностью ан-тикоагулянтного действия обладал фукоидан FMC. Его введение в кровоток сопровождалось гипокоагуляционными изменениями в течение суток. Это связано, прежде всего, с падением активности факторов "внутреннего пути" активации коагуляционного каскада за счет угнетения факторов XII и XI, а также антигемофильных факторов VIII и IX, как это было установлено для других фракций фукоидана ранее (Каменева U.C., 1990).

В наших исследованиях также отмечается связь между степенью сульфатиропанности полисахарида и глубиной тромбоцитопепии. Так, фукоидан FMC содержит наибольшее количество сульфата. При введении его в кровоток уже через 30 минут наблюдается снижение количества тромбоцитов и в течение всего эксперимента эта величина имеет достоверно сниженные характеристики.

Механизм возникающей тромбоцитопепии не ясен. Ее причиной может быть агрегация тромбоцитов, вызываемая их взаимодействием с фибриногеном (Marley T.F., 1987). Кроме того, тромбоцигопения может возникать вследствие изменения поверхностного заряда мембраны клеток (Grottum К.А., 1969), либо иммунологических изменений (Green D. et al.,1990). Lane D.A. и соавт. (1978) показали, что чем выше молекулярная масса полимера, тем чаще возникает это осложнение.

Антитромбиновая активность плазмы крови после внутривенного введения фукоиданов изменялась незначительно. Это свидетельствует о том, что эти полисахариды в гораздо меньшей мере, чем гепарин, способны образовывать биологически активный комплекс с антитромбином. Возможно они реализуют свое антикоагулянгнос действие подобно дерматансульфату через гепариновый кофактор II (Jamagishi R. et al., 1984; Church F.S. et al, 1989, Pangrazzi J. et al., 1987).

Применение антикоагулянтов, как правило, требует отмены их действия. В отечественной и зарубежной клинической практике для этой цели применяются соли протаминов (Лакин K.M., Ефимов B.C., 1970,). Но их применение вызывает целый ряд токсических эффектов. (Konstadt S., 1987; Hobbhahn J. et al., 1990). Наиболее опасное осложнение при использовании протаминов - феномен отдачи, проявляющийся в наступлении повторной гепаринемии после восстановления свертываемости крови нейтрализацией антикоагулянта протамином. (Shanberg J.N. et al., 1987). Все это говорит о низкой селективности к гепарину препаратов протамина и определяет необходимость поиска новых, более аффинных антигепаринатов.

В наших исследованиях мы изучали интерполимерное взаимодействие антикоагулянта нового типа - фукоидана с синтетическим поликатионом ВИМ:ДЭМК. Природа их взаимодействия, по-видимому, аналогична реакции гепарина и его антагониста, т.к. фуко-

иданы содержат значительное количество (до 40% массы) сульфатных группировок, и, следовательно, представляют собой полимерную кислоту.

В экспериментах "in vitro" было установлено весовое нейтрализующее соотношение фукоидана FMC и сополимера ВИМ:ДЭМК. Оно составило 0,6:1.

Результаты полученные "in vitro" были подтверждены в экспериментах "in vivo". В крови животных, полиэлектролитный комплекс фу-коидан - сополимер образовывался в том же соотношении с быстрой отменой основного биологического действия антикоагулянта. Свертывание крови наступало уже через 5 минут после введения антагониста на фоне антикоагулянтного действия фукоидана (табл. 2).

Таблица 2.

Динамика показателей свертывания крови кроликов после однократного внутривенного введения FMC в дозе 20 мг/кг и нейтрализации его действия сополимером ВИМ:ДЭМК (86:14 моль%) в дозе 3 мг/кг

Время взятия крови, мин Тромбоэластограмма Время рекаль-цифика-ции, с Время толерантности, с Количество тромбоцитов, г/л Прот-ромби-новый индекс, % ЧАТВ, с Активность АТ-Ш, %

"г", с "к", с Am, мм

фон 220,0 ±24,2 100,0 ±11,1 74,0 ±1.3 98,7 ±18,3 115,3 ±10,0 382,2 ±52,1 100 32,3 ±5,2 134,2 ±15,0

FMC фон - - - >720* >720* 110,8* ±40,0 28* >900* 139,1 ±11,2

5 300,0 ±32,8 156,3 ±20,0 71,2 ±1,8 108,2 ±12,3 124,3 ±14,7 154,4* ±28,1 82 39,1 ±9,4 122,4 ±17,8

15 480,0 ±54,8 225,0 ±36,2 68,4 ±3,0 130,0 ±28,5 160,4 ±19,3 102,0* ±38,5 80 54,3 ±11,3 114,1 ±8,0

30 375,2 ±43,2 180,0 ±10,0 71,3 ±1,8 127,8 ±14,2 141,2 ±17,1 142,8* ±44,8 84 47,2 ±12,4 120,0 ±13,3

60 330,0 ±22,4 163,4 ±12,4 69,7 ±2,5 114,3 ±20,8 144,8 ±15,4 184,6 ±53,3 88 39,1 ±4,3 128,7 ±18,1

120 285,0 ±30,0 140,0 ±19,3 70,0 ±2,0 90,0 ±22,0 136,2 ±11,3 245,7 ±32,3 98 36,2 ±7,7 122,2 ±14,2

180 274,6 ±41,4 114,2 ±27,4 72,1 ±1,9 88,2 ±17,1 130,0 ±12,7 215,3 ±42,6 100 33,1 ±8,3 129,6 ±10,5

24 час. 245,0 ±35,1 110,0 ±14,1 72,8 ±2,0 104,2 ±19,2 21,7 ±18,1 293,3 ±38,9 99 35,1 ±6,4 125,5 ±17,7

примечание: * - достоверно по от ношению к исходному состоянию (р<0,05); п=6

Нейтрализация была сгойкой на протяжении всего эксперимента. Ранее установленный факт необходимости множественного положительного заряда в макромолекуле полимера для его взаимодействия с ге-

парином (Ефимов В.С., 1981) видимо, является определяющим и для полиэлектролитного комплекса с фукоиданом.

Проведенные эксперименты показали, что существуют пути улучшения показателей специфической активности и безопасности фукоиданов, что огкрывает перспективу их применения с целью предупреждения развития тромбоза у лиц с отсутствием или сниженной активностью AT-III.

Кроме того, появилось основание считать не обязательной разработку специальных антагонистов фукондана, поскольку синтетические антигепаринаты, в частности ВИМ:ДЭМК, могут быть успешно использованы для этих целей. Этот факт должен благоприятно повлиять на ускорение появления препарата фукоидана в практике неотложной фармакологической регуляции кропи.

ВЫВОДЫ

1). Антигепариновая активность, пропорциональная степени заряженное™ всей макромолекулы, содержащей полностью кзатернизо-ванные азольные фрагменты снижается при увеличении содержания звеньев ДЭМК в сополимере и не зависит от противоиона при четвертичном атоме азота.

2). Введение в полимерную цепь звеньев "инертного" сомономера позволяет снизить острую токсичность поликатионов на основе вини-лимидазольных структур. Сополимер винилимидазола с метилен-бис-акриламидом, имеющий в своем составе наибольшее количество заряженных групп (состава 83:17 моль%) проявляет наибольшую антигепариновую активность (весовое нейтрализующее соотношение 0,6:1). Острая токсичность этого соединения 123 мг/кг.

3). Антигепариновая активность и острая токсичность изученных поликатионов практически не зависит от природы противоиона. Ранее не исследованный сополимер ВИМ:ДЭМК (86:14 моль%), с противо-ионом С1, обладает высокой антигепариновой активностью и низкой токсичностью.

4). Препараты полисахарида - фукоидана из бурой морской водоросли Laminaria saccharina Баренцева моря и его фракции обладают антикоагулянтной активностью. Их высокая антикоагулянтная активность сохраняется при депротеинизации, приводящей к снижению острой токсичности.

5). Быстрая и необратимая нейтрализация антикоагулянтного действия фукоидана достигается путем связывания его катионным сополимером ВИМ:ДЭМК, проявляющим антигепариновую активность.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1) Сравнительная оценка антигепариновой активности в ряду поликатионов винилазолов.-В кн.: Природные ресурсы, экология и социальная Среда Прибайкалья.Том 1. Иркутск, 1995, С. 209 - Гаври-лова Е.А., Баженов Д.Н., Афанасьева Г.В., Антонович A.A., Ефимов

B.C., Смирнов А.И.

2) Синтез и антигепариновая активность поликатионов на основе сополимеров 1-винилимидазола с К,1Ч-.мегилен-бис-акриламидом //Хим.-фарм.журнал.-1995.-Т.29, N10.-C. 20-21 .-Смирнов А.И., Баженов Д.Н., Антонович A.A., Гаврилова Е.А., Ефимов B.C.

3) Фармакологическое исследование новых антикоагулянтов прямого типа действия из бурых водорослей //Сб. тезисов докл. II Российского национального Конгресса "Человек и лекарство". -М. -1995. -

C.209. -Гаврилова Е.А., Усов А.И., Смирнов А.И., Ефимов B.C.

4) Сополимер ВИМ-ДЭМК - эффективный антагонист антикоагулянтов полисахаридной природы //Сб. тезисов докл. III Российского национального конгресса "Человек и лекарство".-М.-1996.-С.21,-Ефимов B.C., Гаврилова Е.А., Барбанова И.И., Смирнов А.И., Усов А.И.

5) Влияние природы противоиона и состава сополимера на антигепариновую активность имидазолсодержащих поликатионов //Хим,-фарм. журн.-1996.-Т.30, №12.-С. 33-34.- Гаврилова Е.А., Бирюкова Е.И., Ефимов B.C., Смирнов А.И.