Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Фармакологические свойства антикоагулянта прямого действия из травы нонея темная

Р Г 5 ОД

2 7 ЯНЗ 1ЯР7

На правах рукописи

ГУБАЕВ Андрей Геннадьевич

Фармакологические свойства

антикоагулянта прямого действия из травы нонея темная

14.00.25 - Фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск - 1996

Работа выполнена на кафедре клинической фармакологии Тюменской государственной медицинской академии

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

ЭЛ. Ортенберг

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

О.Б.Кузьмин доктор медицинских наук, профессор Л.П.Ларионов

Ведущая организация: Институт фармакологии РАМН, Москва

Защита состоится "_"_ 1996 г. в_ч на заседании Диссертационного Совета Д.08404.02 при Челябинской государственной медицинской академии (454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Челябинской государственной медицинской академии.

Автореферат разослан "_"_ 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук,

профессор А.В.Зурочка

Актуальность проблемы. Система гемостаза выполняет в организме ряд жизненно важных функций - поддерживает кровь в жидком состоянии, препятствует тромбообразованию и блокаде микроциркуляции в органах, предотвращает кровоточивость и обеспечивает купирование уже развившихся геморрагии, несет ограничительную и защитную функцию, препятствуя распространению из очагов поражения микрофлоры, а также гетеро- и аутотоксинов (Кузник Б.И., Скипетров В.П., 1974; Гаврилов O.K., 1982; Мачабели М.С., 1983, Баркаган З.С., 1987). Нарушения в этой системе предопределяют развитие геморрагии, тромбогеморрагий, ишемических изменений в органах, создают предрасположенность к тромбозам. Все эти нарушения, как известно, являются промежуточным звеном патогенеза многих заболеваний, характеризующихся повреждением внутренней выстилки сосудов, нарушением взаимодействия эндотелия с клетками крови и плазменными ферментными системами, сдвигами реологии крови.

Независимо от этиопатогенеза тромбоэмболических осложнений одним из средств их предупреждения и коррекции являются антикоагулянты, введением которых достигается либо угнетение синтеза прокоагулян-тов (антибиотики, цитостатики), либо ограничение пострибосомального формирования прокоагулянтов (антивитамины К). Эти группы антикоагулянтов (антикоагулянты непрямого действия) используются для создания медленно развивающейся стабильной гипокоагулемии. Однако, практическая медицина нуждается, как правило, в быстром эффекте, который обеспечивается антикоагулянтами прямого действия. Среди них чаще других применяется гепарин, отличающийся сильным, но кратковременным эффектом (Кудряшов Б.А., 1984). Хотя гепарин и является средством выбора, он отличается рядом недостатков. К важнейшим из них можно отнести способность вызывать агрегацию тромбоцитов (Bertele V. et al, 1983; Cimo P.I.. et al., 1979) и тромбоцитопению (Ansell J., Deykin D., 1980; Borg J.L., 1986). Известны данные и о существовании гепарино-резистентности (Баркаган З.С. и соавт., 1982, 1988). Нередко отмечают-

ся тромбоэмболические осложнения после отмены гепарина, связанные с так называемым "эффектом бумеранга" (Nordon et al., 1981).

Исследования в области поиска естественных или создания новых синтетических средств направленного воздействия на гемостаз не прекращаются уже много лет. В этом плане активно изучаются ингибиторы тромбина (Markwardt, 1974), активаторы фибринолиза и фибринолитики (Терешин И.М., Гринберг Г.Е., 1981; Андреенко Г.В., 1981), исследуются иммобилизированные ферменты и комплексные препараты (Мамедов Я.Д. и соавт., 1981). Не остались в стороне и растения, как источники веществ, модифицирующих гемостаз, среди которых найдены как активаторы (Турова А.Д., Сапожникрва Э.Н., 1983), так и ингибиторы свертывания крови (Колхир В.К., Соколов С.Я., 1982, Wong et al., 1984). Вместе с тем большинство проведенных исследований посвящены поиску средств фармакологической коррекции гемостаза, влияние которых реализуется через ограничение тромбиногенеза либо дезагрегацию тромбоцитов.

В последние годы показано, что регулирующим воздействиям может подвергаться взаимодействие сформировавшегося тромбина с фибриногеном и , что особенно важно, неферментативный процесс самосборки фибрина, т.е. этап, не имеющий альтернативного пути, с помощью воздействия на который можно предотвратить образование тромба на конечной стадии этого процесса (Чирятьев Е.А., 1990; Бышевский А.Ш., 1991).

Показано, что, в известной мере, таким действием обладают корот-коцепочечные пептиды, в частности, выделенные из плазминового гидро-лизата фибриногена или фибрина (Takasi, Suzuki, 1979), из тканей человека и животных (Бышевский А.Ш. и соавт., 1990) или синтезированные в лабораторных условиях (Vincente et al, 1984), но все они оказались либо недостаточно эффективными, либо высокотоксичными.

Работы, выполненные в лаборатории кафедры биохимии Тюменского медицинского института, свидетельствует о том, что некоторые растения,

в частности, медуница мягчайшая, могут явиться источником фармакологически активных средств, ограничивающих коагуляционные превращения фибриногена (Герберт И.Я., 1990; Дементьева И.А., 1991). Однако, остается актуальным изучение более широкого ассортимента растений, содержащих подобные вещества, на базе которых возможно создание принципиально новых средств коррекции гемостаза. В предварительных экспериментах растение нонея темная представилась перспективным объектом для таких исследований.

Цель работы. Экспериментальное изучение возможностей получения и основных фармакологических свойств экстракта из нонеи темной, обладающего, по предварительным данным, антикоагулянтной активностью.

Задачи исследования. 1). Выделение антикоагулянта в виде однородного вещества и изучение его химической природы 2). Изучение проти-восвертывающей активности экстракта при однократном и длительном введении лабораторным животным; 3). Изучение токсичности экстракта в острых и субхронических опытах.

Научная новизна. Впервые из травы нонеи темной выделен антикоагулянт прямого действия в виде однородного вещества, установлена его химическая природа, основные параметры и фармакологические свойства.

Практическая значимость. 1). Получен прямой антикоагулянт длительного действия с известным механизмом действия, который можно использовать как инструмент в практике работы гематологических лабораторий; 2). Получены данные, которые обосновывают целесообразность и необходимость дальнейшего исследования полученного антикоагулянта из травы нонеи темной по схеме, предусмотренной Фармакологическим Комитетом для доклинических испытаний антикоагулянтов прямого действия.

Апробация и публикации. Основные положения диссертации доложены на проблемной комиссии "Фармация" Тюменской медицинской академии, 1-м съезде Российского научного общества фармакологов, меж-

дународной выставке "Здоровье - 96", опубликованы в материалах названных конференций и конференции "Актуальные вопросы теоретической и клинической медицины" (Тюмень, 1994).

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Объем и структура работы. Материалы работы, включая указатель литературы, изложены на 135 страницах машинописного текста. В тексте работы содержится 8 рисунков и 34 таблицы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследований, главы (содержащей 7 разделов), в которой изложены результаты собственных исследований, заключения и выводов. Указатель литературы представлен 146 отечественными и 128 иностранными авторами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Растительное сырье для исследований (трава Нонея темно-бурая) заготавливали в фазу цветения на протяжении 1990 и 1991 годов в окрестностях г. Тюмени, высушивали на открытом воздухе, защищая от прямого воздействия солнца. Выделение и очистка антикоагулянта проводилась по способу, описанному в работах И.Я.Герберт (1990), И.А.Дементьевой (1991) и О.А.Русаковой (1993).

Получение сухого экстракта из травы нонеи темной проводили следующим образом: экстракцию осуществляли 0,01 М раствором аммиака (в соотношении 1:10) на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 1 ч, отделяли экстракт и проводили повторную экстракцию тем же объемом экстрагента, объединенный экстракт подвергали ультрафильтрации против дистиллированной воды на мембране гидрат-целлюлозной для гемодиализа (целлофан Т-100, смена воды каждые 24 ч), концентрировали недиализующиеся фракции экстракта на ротационном испарителе, обрабатывали их абсолютным спиртом и отделяли осадок центрифугированием при 1500 об/мин.

Гомогенные носители антикоагулянтной активности получали путем гель-фильтрации недиализующихся фракций экстракта на Сефадексе G-50 Fain (колонка 20x500 мм, элюент - 0,01 M аммонийно-ацетатный буфер, рН 7,6). Степень гомогенности препарата оценивали хромотогра-фией водных растворов на бумаге FN-11 (Filtrak) в системе растворителей бутанолгуксусная кислота:вода в соотношении 4:1:1 и 4:1:5, на пластинках Silufol ("Kavalier", Чехословакия) в тех же системах растворителей и на пластинках Fixion 50x80 ("Chinoin"), используя для разделения аминокислот смесь, включающую лимонную кислоту (24,6 г), едкий натр (14,0 г), соляную кислоту с удельной массой 1,19 (6,5 г) на 1л дистиллированной воды.

Для более строгой оценки гомогенности антикоагулянта (перед определением аминокислотного состава) чистоту препарата контролировали на жидкостном хроматографе высокого давления "Миллихром-1 " по количеству пиков оптической плотности (256 нм) после обработки индивидуальных ингибиторов фенипзотиоцианатом. Полученные фенилкарбама-ил-производные, количество которых зависит от наличия концевых аминогрупп, подвергали хроматографии на колонке Сепарон С-18 (алюент-метанол:вода в соотношении 1:1).

Для определения аминокислотного состава носителя антикоагулянтной активности фракции, содержащие антикоагулянт, гидролизовали 6М хлористоводородной кислотой в среде аргона при 110°С в течение 24 ч в присутствии 0,01% фенола и Р-меркаптоэтанола. Гидролизаты подвергали аминокислотному анализу на автоматическом аминокислотном анализаторе КВ-4101 (Швеция) по одноколоночному методу в трехбуферной натриевой системе на колонке 6x500 мм с ионообменной смолой Durrum DC (D. Chemical Corporation). Колонку калибровали стандартной смесью 18 аминокислот ("Serva", Чехословакия). Аминокислотный анализатор ра-эотал по следующей программе: буфер А (рН 3,25) - 55 мин, буфер В 'рН 4,25) - 58 мин, буфер С (рН 6,45) - 85 мин. Скорость подачи буфе-эа и нингидрина 0,75 мл/мин. Колонка термостатирована при 55°С.

Антикоагулянтную активность экстракта оценивали in vivo и in vitro по его влиянию на неактивированное время рекальцификации, тромбино-вое и лротромбиновое время плазмы крови крыс, стабилизированной 3,8% раствором натрия цитрата в соотношении 9:1 (В.В.Меньшиков и со-авт., 1987). Результаты выражали либо в секундах, либо в значениях эффективности торможения по формуле ¡=1-Vo/Vk, где i - эффективность торможения, Vo и Vk - скорость реакции в присутствии антикоагулянта и без него. Умножая эффективность торможения на 100, получали степень торможения в процентах.

В опытах с провокацией внутрисосудистого свертывания определяли кроме того содержание продуктов деградации фибрина /ПДФ/ (С.3.Га-битов и соавт., 1982; В.М.Шафер, 1989).

Для количественной оценки уровня тканевого тромбопластина мы использовали метод, разработанный И.А.Дементьевой, основанный на предварительном насыщении субстратной плазмы эритрофосфатидом (И.А.Дементьева, 1991).

Эксперименты проводили на беспородных белых крысах. В опытах было использовано 430 крыс обоего пола, массой от 180 до 240 г. Все исследования на животных проводились под легким эфирным наркозом, исключение составила лишь регистрации ЭКГ, где в качестве наркотического агента использовали оксибутират натрия (интраперитонеально, в дозе 200 мг/кг).

Приготовленные растворы антикоагулянта вводили в яремную вену (контрольным животным - соответствующие объемы 0,85% раствора хлорида натрия), кровь отбирали из противоположной яремной вены, стабилизируя 3,8% раствором цитрата натрия /1:9/, согласно правилам, принятым в коагулологических лабораториях (В.П.Балуда и соавт., 1980; Е.П.Иванов, 1983).

Функциональные исследования проводили с использованием следующих методик:

1. Острую токсичность оценивали при внутривенном, внутримышечном и внутрибрюшинном путях введения экстракта. Ориентировочную DL50 определяли, используя Range Finding test (прием Deichman и Le Blanc) - введение животным нескольких доз и принятия за DL50 минимальной дозы, вызывающей летальный исход (И.В.Саноцкий, 1970); формулу Г.Н.Першина DL50 = [(а+Ь) (m-n)]/200; а также метод Кербера, при котором определение LD-50 производят по формуле:

DLSO = DL100- (zd)/n.

2. Состояние функции печени оценивали используя следующие показатели: а). Активность ферментов АсАт, АлАт (Bessey O.A. et al, 1946); б). Активность щелочной фосфатазы и содержание общего билирубина (Reitman S., Fraenkel S., 1957). Активность этих ферментов - маркеров синдромов цитолиза, печеночноклеточных некрозов и холестаза, определяли спектрофотометрически в сыворотке крови, с помощью стандартных наборов Био-Тест "Lahema" ЧССР ;

3. Для оценки степени сохранности функции почек использовали интегральные показатели уровня эндогенного креатинина и мочевины сыворотки крови. Уровень эндогенного креатинина определяли колориметрическим методом по F. Loken, с использованием стандартных наборов "Lahema" Чехословакия (F.Loken, 1957). Уровень мочевины сыворотки крови определяли уреазным методом по K.Lorentz, с использованием стандартных наборов "Lahema" Чехословакия (Комаров Ф.И. и соавт., 1981). Уровень белка в моче определяли по методу Геллера, в основе которого лежит способность 30% азотной кислоты осаждать белок (Трахтенберг И.М. и соавт., 1978).

4. Биоэлектрическую активность миокарда регистрировали на многоканальном электрокардиографе 6-НЭК (Германия). Широко принятым и достаточным для экспериментальной практики считается получение ЭКГ во II стандартном отведении (И.А.Дементьева, 1991; Н.Э.Нохрина, 1993). Для получения более информативной электрокардиографической картины мы проводили регистрацию ЭКГ в трех стандартных, трех усиленных от

конечностей и трех грудных отведениях. Игольчатые электроды вводили подкожно: четыре конечности и район грудной клетки на уровне верхушечного толчка в 3-х позициях: по средней линии грудины и отступив 1 см влево от среднего электрода, что приблизительно соответствует стандартным позициям грудных электродов У1( У3 и У5. ЭКГ регистрировали при скорости 100 мм/с и чувствительности каналов 20 мм/мВ;

5. Состояние периферической крови оценивали с помощью общепринятых в клинико-диагностических лабораториях методикам (количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, содержание гемоглобина, уровень СОЭ и лейкоцитарная формула) (В.Е.Предтеченский, 1960).

Результаты исследований подвергали математической обработке методом вариационной статистики для малых рядов наблюдений. Достоверность различия между средними величинами определялась с использованием критерия Х2, критерия Стьюдента, различия принимали за достоверные при значениях вероятности (р) меньше 0,05 (М.Л.Беленький, 1963; И.Г.Лаврова, 1980).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Способ очистки антикоагулянта из экстракта нонеи темной. С целью выбора способа очистки антикоагулянта, обеспечения контроля гомогенности, мы провели определение основных групп биологически активных веществ, содержащихся в экстракте, с помощью качественных реакций (Н.И.Гринкевич, 1983). Изучаемый экстракт содержит набор веществ растительного происхождения - полисахариды, флавоноиды, гидролизуе-мые дубильные вещества, фенолокислоты и нингидринположительные соединения, в связи с чем мы попытались провести дополнительную их очистку с помощью фитохимических методов, включающих экстракцию органическими растворителями, хроматографию на бумаге и в тонком слое, колоночную абсорбционную хроматографию. Это не привело к желаемому результату: очистки либо не происходило, либо она сопровождалась значительной потерей антикоагулянтной активности. Неудачной

оказалось и попытка освободиться от балластных веществ с помощью ионообменной хроматографии на гелях ОЕАЕ ТоуореаН, ОЕАЕ БерЬас1ех А 25 и СМ БерЬас^ех А 25. Более результативным оказалось применение для очистки антикоагулянтов гель-фильтрации на БерЬас1ех с различной степенью исключения: 6-15, С-25, С-50 и &-75 (колонка 20x500 мм, элюент - 0,05М аммонийно-ацетатный буфер, рН 7,6. Элюат собирали фракциями по 2 мл и регистрировали оптическую плотность при длине волны 280 нм. Установили, что при использовании 5ерЬас1ех Э-50 выход антикоагулянта составляет до 96% от внесенного в колонку, а в активных фракциях полностью отсутствуют примеси в виде вышеупомянутых соединений, за исключением следовых количеств флавоноидов.

Ранее полученные данные (Е.А.Чирятьев, 1990) позволили предположить, что носителями антикоагулянтной активности могут явиться соединения пептидной природы. Для определения аминокислотного состава антикоагулянтов мы использовали экстракт, очищенный трехкратной гель-фильтрацией на 5ерЬас1ех 0-50.

Таким образом, противосвертывающая активность экстракта обусловлена пептидом Мг - 1738 Да, который содержит следующие аминокислоты (табл. 1).

Таблица 1.

Аминокислотный состав антикоагулянта, выделенного из травы нонеи темной

АБр (2 остатка) А1а (2 остатка)

Бег Уа1

ТЬг (2 остатка) Не

Фи (2 остатка) 1_еи

Рго буз

Э1у (2 остатка) Ьуз

Механизм ограничения свертывания крови антикоагулянтом растительного происхождения. Для расшифровки механизма ограничения свертывающей активности плазмы крови антикоагулянтом необходимо было выяснить этап, на котором оказывается преимущественное влияние.

С этой целью цитратную плазму доноров дефибринировали двумя различными способами (нагреванием и высаливанием), фибриноген удаляли центрифугированием, надосадок подвергали диализу против большого объема физиологического раствора. Обработанная таким образом плазма не теряла способность генерировать тромбин, что при добавлении фибриногена в присутствии кальция (Са) или тромбопластинкальцие-вой смеси (ТКС) вызывает свертывание.

В дальнейшем к полученной плазме добавляли фибриноген и антикоагулянт одновременно с Са (или ТКС) или через определенное время после их введения (достаточным для образования тромбина).

Оказалось, что антикоагупянт в различных дозах добавленный после образования тромбина блокирует свертывание почти в той же степени, что и при добавлении на более ранних этапах, т.е. действие антикоагулянта направлено преимущественно на конечную фазу свертывания - образование фибрина (вне зависимости от того, инициируется ли тромбиноге-нез Са или ТКС), (табл. 2)

Таблица 2.

Эффективность торможения свертывания фибриногена при внесении антикоагулянта из травы нонеи темной в тромбингенерирующую систему (дефибринированную нагреванием плазму) до и после образования тромбина

Антикоагулянт в концентрации мг/мл Антикоагулянт внесен

Одномоментно с инициацией тромбиногенеза По завершению тромбиногенеза

Тромбиногенез инициирован

Са++ ТКС Са++ ТКС

1,0 0,68±0,02' 0,51+0,02* 0,51±0,01* 0,39+0,01*

2,0 0,72±0,01* 0,56±0,00* 0,54±0,00* 0,43±0,01*

3,0 0,76+0,01* 0,67±0,03* 0,64±0,02* 0,59±0,03*

Примечание: здесь и далее знаком "'" помечены достоверно различаю-

щиеся между собой значения (р<0,05).

Сходные данные получены при проведении эксперимента с плазмой крови, дефибринированной высаливанием (табл. 3).

Таблица 3.

Эффективность торможения свертывания фибриногена при внесении антикоагулянта из травы нонеи темной в тромбингенерирующую систему (дефибринированную высаливанием плазму) до и после образования тромбина

Антикоагулянт Антикоагулянт внесен

в концентрации Одномоментно с инициа- По завершению

мг/мл цией тромбиногенеза тромбиногенеза

Тромбиногенез инициирован

Са++ ТКС Са++ ТКС

1,0 0,70+0,03* 0,54±0,02* 0,56±0,02 0,40+0,01*

2,0 0,73±0,04 0,56±0,03 0,53±0,01 * 0,44+0,01*

3,0 0,78+0,04' 0,65±0,02* 0,65±0,01 * 0,58±0,01*

Они еще раз подтверждают, что антикоагулянт из нонеи темной оказывает влияние как на этапы, предшествующие тромбинообразова-нию, так и на заключительный этап свертывания крови, восприимчивость которого к антикоагулянту составила от 74% до 89% общей антикоагу-лянтной активности экстракта.

Противосвертывающее действие экстракта в опытах на животных. Настоящую часть работы начали с уточнения эффективной, но не вызывающей кровоточивости дозы экстракта.

Результаты влияния экстракта на показатели гемокоагуляции представлены в таблице 4. Из данных таблицы видно, что с увеличением дозы гипокоагулемический эффект растет интенсивно: эффективность торможения изменяется с 10% до 284% - по тесту "время рекальцификации"; с 3% до 230% - по тесту "протромбиновое время"; с 15% до 164,2% - по тесту "тромбиновое время". Значительна и продолжительность противо-свертывающего действия экстракта: от 6 до 9 ч после инъекции гипокоа-гулемия стабильна, затем постепенно ослабляется, сохраняясь до 24-36 ч в зависимости от дозы (табл. 4).

Затем мы изучали состояние гемокоагуляции в течение 14 дней при ежедневном однократном введении экстракта (доза 50 мг/кг) и отбора проб крови. Данные представлены в таблице 5 .

Таблица 4.

Влияние экстракта нонеи темной на базисные показатели гемокоагуляции

Время рекальцификации, с

Контроль 5 мг/кг 10 мг/кг 30 мг/кг 50 мг/кг

30 мин 70,4±1,8 78,8±3,6* 89,112,2* 139,211,6*^ 256,112,7*

1 час 68,2±1,5 78,2±3,4" 96,7±2,2* 147,3±1,6* 261,8±1,2*

3 часа 71,5±2,1 72,4+2,4 97,3+2,1* 150,1+2,1* 262,4±2,8*

6 часов 69,5±1,2 68,4±4,1 94,5±2,8* 106,2±2,6* 204,2±2,7*

9 часов 68,2±2,1 70,1 ±2,4 85,713,3* 94,2±1,5* 181,3±2,6*

12 часов 71,6±1,2 - 74,8±2,6 77,7+2,1' 107,7±3,4*

24 часа 68,6±2,6 - 72,6±2,8 74,2±2,3 85,3+1,6'

36 часов 69,5±1,2 - 71,2±4,1 I 69,4±2,3 71,3±1,4

Тромбиновое время, с

30 мин 30,4±1,9 35,1+2,6' 35,9+2,7' 52,7±2,9* 77,0±1,7'

1 час 30,4±1,4 36,0±1,8' 38,5±2,6' 53,2±2, Г 80,3±1,6*

3 часа 31,7±2,7 30,4±2,4 38,4±1,2* 54,9±2,8* 82,4±1,3*

6 часов 29,2±2,4 29,4±1,8 32,8±2,9 36,2±2,6" 64,3±2,2*

9 часов 30,2±2,9 29,6±2,4 33,2±1,4 34,5±1,2 41,7+2,7*

12 часов 31,2±2,2 - 31,8±2,6 32,4±2,8 34,0±2,2

24 часа 29,2±1,6 - 30,2±2,2 30,6±1,1 31,2±1,8

36 часов 29,8±2,4 - 30,1±1,4 30,2±2,3 29,6±1,2

Протромбиновое время, с

30 мин 16,2±1,8 16,8±3,5 19,7±2,6* 33,0+3,7* 50,8±5,2*

1 час 15,6+1,6 16,512,4 20,3±2,8* 33,2±2,4* 51,612,8*

3 часа 15,1 ±2,2 15,8+2,7 20,5±2,3* 32,7±4,Г 51,1+4,2*

6 часов 16,3+1,6 15,1±1,2 18,9±1,6 21,4±1,6* 42,3±1,5*

9 часов 15,2±2,7 15,0±2,2 15,7±1,6 18,5±1,4* 29,2±3,7*

12 часов 16,3±1,9 - 15,9+2,2 17,2±2,8 18,4±2,6

24 часа 16,2+1,4 - 16,1±1,1 16,2±2,8 17,412,7

36 часов 14,6±1,7 - 14,2+1,8 14,6±2,2 15,411,2

Результаты опыта показывают, что при ежедневном однократном

введении экстракта гемокоагуляционные сдвиги достигают максимума к 4-6 дню (время рекальцификации увеличивается по сравнению с контролем в 3,3 раза, тромбиновое - в 2,1 раз). В последующие дни введения экстракта гипокоагулемический эффект сохраняется и остается равным по интенсивности гипокоагулемии, вызванной первой инъекцией.

Таблица 5.

Оценка кумулятивного влияния экстракта нонеи темной на показатели гемокоагуляции, (М±т)

Число инъекций Время рекальцификации, с Тромбиновое время, с

Контроль Опыт Контроль Опыт

1 77,4±2,8 208,0±2,5* 30,2±2,4 61,6±1,7*

2 68,2 ±2,5 207,8±6,0* 34,0±2,6 64,6±2,6*

3 71,5+1,1 204,6±2,4" 29,2+1,4 62,4+1,3*

4 74,3±2,4 209,6±1,2" 31,4±1,2 64,2± 2,2*

5 68,7+2,\ 227,0±2,7* 30,2±2,7 64,2±2,2*

6 63,8±2,2 214,1±2,Г 34,4±2,1 66,4±2,2"

7 67,8±2,4 201,8±2,0* 29,2±1,6 60,8±2,2*

8 74,3±2,5 217,7±1,7* 32,4±1,1 63,4±3,2"

9 76,6±2,9 210,5±2,8* 29,6±1,6 64,4±3,2*

10 75,8 ±2,7 209,2±2,2* 29,2±1,6 63,2±2,2*

11 67,8±2,6 206,4+1,4" 33,2±1,4 64,5±1,6*

12 71,4+1,2 204,4±1,4* 30,0±2,7 64,2±2,1"

13 69,0±2,4 209,0±2,6* 29,2±1,6 63,1 ±2,7*

14 71,7+2,4 202,6±2,8* 29,1+2,7 62,2±1,4*

В следующей серии опытов мы сравнили динамику изменений свер-

тывающей активности после первой и 14-й инъекции антикоагулянта в дозе 50 мг/кг массы. Как видно из приведенных в табл. 6 данных, динамика гипокоагулемии примерно одинакова после первой единичной инъекции и после инъекции, выполненной в 14-й раз.

Таблица 6.

Изменение свертывающей активности после однократного и четырнадцатикратного введения экстракта

Пробы Время рекальцификации, с Тромбиновое время, с

взяты Контроль после 1-й после 14-й Контроль после 1-й после 14-й

через инъекции инъекции инъекции инъекции

1 ч 68,2+1,5 259,6±4,8" 261,1+2,8* 30,4±1,4 80,3+2,2" 79,6+3,0"

6 ч 69,5+1,2 207,8±2,7" 209,0+3,4* 29,2±2,4 66,4±2,2* 64,4+3,2*

12 ч 71,6±2,1 104,7±3,6* 110,2+2,8" 31,2+2,2 34,2+3,4 33,2±2,8

24 ч 68,6±2,6 83,4±2,Г 84,2+3,4' 29,2±1,6 31,2+1,8 32,4±2,0

Защитное действие экстракта из травы нонеи темной при экспериментальной тромбопластинемии . Экзогенную тромбопластинемию использовали как модель, позволяющую оценить эффективность экстракта на уровне организма (Б.А.Кудряшов, 1975; А.Ш.Бышевский, В.Н.Кожевников, 1986). Препарат тканевого тромбопластина (активность 22,8 с, 40 мг/кг массы тела) вводили в вену через 30 минут после предварительного введения растворителя (контроль) или экстракта в дозах 10 мг/кг, 50 мг/кг (опыт). В контроле погибло 63,3% крыс (19 из 30), на фоне экстракта в дозе 10 мг/кг - 30% (9 из 30), в дозе 50 мг/кг - 13,3% (4 из 30), т.е. экстракт снизил частоту гибели в 2,1 раза и 4,8 раза соответственно (р<0,05).

Инъецируя тромбопластин в дозе 30 мг/кг, не вызывающей гибели животных, мы изучили защитное действие экстракта, оценивая содержание ПДФ, как показателя интенсивности внутрисосудистого свертывания (З.С.Баркаган, 1988). В контроле через 30 минут после инъекции тромбопластина содержание ПДФ составило 0,14±0,007 г/л, на фоне экстракта в дозе 50 мг/кг - 0,05+0,002 г/л (ограничение прироста содержания ПДФ практически в 3 раза). Приведенные данные указавают, что защитное действие экстракта при тромбообразовании обусловлено его способностью замедлять коагуляционные превращения фибриногена.

Сопоставление характера противосвертвающего эффекта экстракта из травы нонеи темной с эффектом гепарина. In vitro мы установили, что 1 мг экстракта соответствует по противосвертывающему эффекту 0,02 мг гепарина (1 мг гепарина равен 130 ЕА гепарина). Это позволило сопоставить в организме эффект антикоагулянтов в дозах, одинаковых по активности. Эффективной принято считать дозу гепарина, удлиняющую в три раза время рекальцификации при внутривенном введении (Е.И.Чазов, 1966). Такие дозы гепарина и экстракта вводили животным, сопоставляя в динамике эффекты обоих антикоагулянтов. Результаты откладывали в координатах: абсцисса - время от момента инъекции, ордината - значения времени рекальцификации. Площади, описываемые кривыми (над ли-

нией контроля), пропорциональны эффективности сравниваемых препаратов (В.Н.Соловьев и соавт., 1980). На рис. 1 видно, что площадь, очерченная графиком, характеризующим эффект экстракта (1) на 34% больше площади, отражающей эффект гепарина (2). Если учитывать, что эффект экстракта сохраняется до 24 ч, то в действительности разница еще значительнее.

сек

350 300 250 200

50 ■

0 -,-,-,-,---,-,-,-----1

01 23456789 10 11 12 часы

Рисунок 1. Время рекальцификации после введения животным гепарина или экстракта (ордината) в разное время после инъекции (абсцисса); непрерывная линия — после введения гепарина, прерывистая — после введения экстракта.

токсикологичекая характеристика сухого экстракта недиапизующейся фракции нонеи темной. В первую очередь оценили исходы в зависимости от дозы при внутривенном введении. Гибель наблюдали (табл. 7) начиная с дозы 150 мг/кг. С увеличением дозы экстракта нарастала частота гибели; причина - кровотечение из места прокола вены, остановить которое оказалось невозможным. У погибших животных обнаружены массивные кровоизлияния. При вскрытии в сосудистом русле выявили не-свернувшуюся кровь в сочетании с рыхлыми сгустками, кровоизлияния в легкие, сгустки крови в просвете тонкого кишечника.

150

100

Таблица 7.

Результаты наблюдения над животными, получившими внутривенно различные дозы экстракта

Доза экстракта, Кол-во Погибло Время Частота гибели,

мг/кг животных гибели %

Контроль 10 0 не гибли 0,0

50 10 0 не гибли 0,0

100 8 0 не гибли 0,0

150 13 7 за 20 ч 53,8

200 13 10 за 14 ч 76,9

250 8 8 за 8 ч 100

300 8 8 за 5 ч 100

При расчете согласно Range finding test ориентировочная DL50 при внутривенном введении составила 150 мг/кг. При вычислении DL5Q по формуле Г.Н.Першина получен следующий результат: DL50 равно 159,62 мг/кг; по методу Кербера - DL.5o=162,5±15,7 мг/кг. Отметим, что DL50, расчитанные тремя различными методами приблизительно равны. Средняя арифметическое DL50=157,37 мг/кг массы тела.

Внутрибрюшинное и внутримышечное введение экстракта крысам (200, 300 и 400 мг/кг) не вызывало гипокоагулемии, гибели животных и не изменяло их поведения. Это еще раз свидетельствует о том, что гибель животных при внутривенном введении больших доз вызвана крово-потерями, тем более, что кровотечения и кровоизлияния во внутренние органы вообще характерны для передозировки антикоагулянтов (Е.И.Чазов, К.М.Лакин, 1977). При ежедневном введении экстракта (50 мг/кг внутривенно и 300 мг/кг внутрибрюшинно один раз в день, 20 дней) прибавка массы тела в контроле и в опыте была одинаковой (1,4 и 1,2 г в сутки). На 10, 21 дни введения экстракта количество эритроцитов, тромбоцитов, лейкоцитов и гемоглобина не отличалось от контрольных цифр. Не отразилось 20-ти дневное введение экстракта и на функциональной способности почек и печени (табл. 8-13). Достаточная чувствительность и специфичность использованных тестов (содержание белка, креатинина,

мочевины, АЛТ, ACT, щелочная фосфатаза, общий билирубин) позволила нам отказаться от более детального исследования в этом направлении. Биоэлектрическую активность миокарда регистрировали в 3-х стандартных, трех усиленных и в 3-х грудных отведениях. Все показатели ЭКГ (амплитуда ЭКГ-зубцов, длительность ЭКГ-интервалов) у животных контрольной и подопытных групп достоверно не отличались ни в начале эксперимента, ни на 21-й день введения экстракта нонеи темной; не отличались они и от средних показателей ЭКГ, полученных в других лабораториях (И.В.Саноцкий, 1970; М.К.Чабанов, 1983).

Таблица 8.

Влияние экстракта нонеи темной на диурез и содержание белка в моче после водно-солевой нагрузки (по 10 крыс в каждой группе; доза экстракта — 300 мг/кг внутрибрюшинно)

Показатели Контроль Опыт Р

1 сутки 21 сутки 1 сутки 21 сутки

V мочи, выделившейся за 3 ч, мл 3,7+0,8 3,8±0,5 3,4±0,6 3,1+0,8 >0,05

Белок, г/л 0,051+0,01 0,051+0,04 0,049±0,06 0,048+0,04 >0,05

Таблица 9.

Влияние экстракта нонеи темной на диурез и содержание белка в моче после водно-солевой нагрузки (по 10 крыс в каждой группе; доза экстракта - 50 мг/кг внутривенно)

Показатели Контроль Опыт Р

1 сутки 21 сутки 1 сутки 21 сутки

V мочи, выделив- 3,7+0,8 3,8±0,5 3,8+0,7 4,0±0,5 >0,05

шейся за 3 ч, мл

Белок, г/л 0,051+0,01 0,051+0,04 0,053±0,04 0,052±0,09 >0,05

Таблица 10.

Влияние экстракта нонеи темной на уровень креатинина и мочевины в сыворотке крови крыс (по 10 крыс в каждой группе; доза экстракта — 300 мг/кг внутрибрюшинно)

Показатели Конт роль Опыт Р

1 сутки 21 сутки 1 сутки 21 сутки

Креатинин, мкмоль/п 140,2+13,1 139,7+15,1 140,8+12,2 140,5±13,4 >0,05

Мочевина, ммоль/л 11,9±1,38 12,2±2,4 13,0+1,92 12,9±1,70 >0,05

Таблица 11

Влияние экстракта нонеи темной на уровень креатинина и мочевины в сыворотке крови крыс (по 10 крыс в каждой группе; доза экстракта — 50 мг/кг внутривенно)

Показатели Конт роль Опыт Р

1 сутки 21 сутки 1 сутки 21 сутки

Креатинин, мкмоль/л 140,2+13,1 139,7+15,1 138,9±16,2 139,6±14,7 >0,05

Мочевина, ммоль / л 11,9+1,38 12,2±2,4 12,0+1,80 12,6+2,1 >0,05

Таблица 12.

Влияние экстракта нонеи темной на активность ферментов печени (12 крыс в каждой группе; доза экстракта — 300 мг/кг внутрибрюшинно)

Показатели 1 сутки Р 21 сутки Р

Контроль Опыт Контроль Опыт

АлАТ, ЕД/л 16,4±0,48 15,8±2,03 >0,05 15,8±1,14 16,0+1,40 >0,05

АсАТ, ЕД/л 34,2+1,26 33,1±1,68 >0,05 33,6±2,41 33,4±0,82 >0,05

Щелочная фос-фатаза, ЕД/л 38,6±2,44 37,6±1,44 >0,05 34,6+1,82 37,0+1,24 >0,05

О. билирубин, мг/100 мл 0,30±0,02 0,28±0,03 >0,05 0,29±0,08 0,28+0,06 >0,05

Таблица 13

Влияние экстракта нонеи темной на активность ферментов печени (12 крыс в каждой группе; доза экстракта — 50 мг/кг внутривенно)

Показатели 1 сутки Р 21 сутки Р

Контроль Опыт Контроль Опыт

АлАТ, ЕД/л 16,4+0,48 16,1±0,82 >0,05 15,8+1,14 15,9±0,98 >0,05

АсАТ, ЕД/л 34,2+1,26 33,9+1,84 >0,05 33,6+2,41 33,8+2,12 >0,05

Щелочная фос-фатаза, ЕД/л 38,6±2,44 39,1 ±2,14 >0,05 34,6+1,82 39,2+1,78 >0,05

О. билирубин, мг/100 мл 0,30+0,02 0,29+0,05 >0,05 0,29±0,08 0,29±0,07 >0,05

Представленные данные свидетельствуют об отсутствии или о низкой токсичности экстракта, тем более, что применявшиеся дозы были значи-

тельно выше эффективной по показателям гемокоагуляции.

В ЗАКЛЮЧЕНИЕ отметим следующее. В недиализующейся фракции водно-аммиачного экстракта травы нонеи темной содержится антикоагулянт прямого действия, эффект которого реализуется на уровне заклю-

чительной фазы свертывания. Можно с достаточной степенью уверенности, основанной на результатах экспериментальных наблюдений и на сопоставлении эффектов исследуемого экстракта и ранее изученных ингибиторов самосборки пептидной природы, связывать действие экстракта с присутствием в пептидах остатков аминокислот, несущих радикалы, которые способны к ионизации в физиологических условиях. Это обеспечивает пептиду возможность взаимодействовать с фибринмономерами за счет электростатических связей, т.е. конкурировать за мономер в реакции аутополимеризации.

Недиализующаяся фракция экстракта нонеи темной нетоксична или мало токсична, что позволяет использовать ее как противосвертывающее средство. Противосвертывающая активность экстракта выгодно отличается от гепарина продолжительностью вызываемой гипокоагулемии. Экстракт обладает так же выраженной способностью снижать частоту гибели животных при внезапно усиливающемся громбинообразовании, вызванном тромбопластинемией.

Все это свидетельствует о целесообразности дальнейшего изучения нонеи темной как источника антикоагулянтов прямого действия и может служить обоснованием необходимости детального изучения недиализую-щейся фракции экстракта из травы нонеи темной согласно рекомендациям Фармакологического Комитета для антикоагулянтов прямого действия.

выводы

1. Из травы нонеи темной с помощью относительно несложных методов возможно получить в значительном количестве экстракт, обладающий свойствами прямого антикоагулянта и содержащий остатки аспа-рагиновой и глутаминовой кислот, глицина, треонина, аланина (по2), се-рина, пролина, валина, лизина, лейцина, изолейцина (по1).

2. Противосвертывающий эффект экстракта реализуется на стадии коагуляционных превращений фибриногена, является дозозависимым и продолжительным.

3. Эффективная доза антикоагулянта при внутривенном введении меньше токсичной в 15 раз. При повторных введениях ингибитор проявляет минимальные кумулятивные свойства.

4. Полученный антикоагулянт обладает низким токсическим потенциалом: его длительное внутривенное и внутрибрюшинное введение в дозах, превышающих эффективную в 3-20 раз не отражается на приросте массы тела, на клеточном составе крови, функциональной способности почек, печени, биоэлектрической активности миокарда, а так же на активности тканевого тромбопластина внутренних органов.

5. Сочетание высокой противосвертывающей активности с малой токсичностью свидетельствует о целесообразности детального изучения экстракта по схеме, предусмотренной Фармакологическим Комитетом для антикоагулянтов прямого действия.

список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Губаев А.Г. "Фармакологические свойства антикоагулянта прямого действия из травы Нонея темная". Сборник "Актуальные вопросы теоретической и клинической медицины" (материалы докладов молодых ученых и студентов), Тюмень, 1994, с. 18-19.

2. Ортенберг Э.А., Вешкурцева И.М., Губаев А.Г., Чабанов М.К., Близнякова Е.В., Черкасова С.П. "Некоторые методы фармакологической коррекции нарушений функции печени, почек и системы гемостаза".//Фундаментальные исследования как основа создания лекарственных средств. Сборник тезисов 1-го съезда Российского научного общества фармакологов, 9-13 октября 1995 г., Волгоград, Москва, С.311.

3. Чабанов М.К., Ортенберг Э.А., Дружинина О.И., Русакова O.A., Губаев А.Г., Кайб И.Д. "Биологическая активность экстрактов некоторых растений Западной Сибири". // Фундаментальные исследования как основа создания лекарственных средств. Сборник тезисов 1-го съезда Российского научного общества фармакологов, 9-13 октября 1995 г., Волгоград, Москва, С.475.

4. Дементьева И.А., Губаев А.Г. "Современные лекарственные средства из растительного сырья". Сборник "Актуальные вопросы клинической медицины (материалы докладов международной выставки "Ярмарка - 96").

5. Губаев А. Г., Ортенберг Э.А., Русакова O.A., Чирятьев Е.А. "Фармакологические свойства антикоагулянта прямого действия из травы Нонея темная". //Экспериментальная и клиническая фармакология, №1, 1996, с. 40-44.