Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Поиск антикоагулянтных среди сульфатированных полисахаридов-фукоиданов

? п:

МИНИСТЕРСТВО МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ СССР ЦЕНТР ПО ХИМИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ имени СЕРГО ОРДЖОНИКИДЗЕ

На правах рукописи

УДК 616—005Л—08:615.015

КАМЕНЕВА Наталья Семеновна

ПОИСК АНТИКОАГУЛЯНТОВ СРЕДИ СУЛЬФАТИРОВАННЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ - ФУКОИДАНОВ

14.00.25 — фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1990

Работа выполнена во 2 Московском ордена Ленина Государственном медицинском институте имени Н. И. Пирогова.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Ефимов В. С.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Шварц Г. Я.

доктор медицинских наук, профессор Макаров В. А.

Ведущая организация — Университет Дружбы народов имени П. Лумум1бы.

Защита состоится « » 1990 г. в час.

на заседании специализированного Ученого совета Д.098.05.01 Центра по химии лекарственных средств Всесоюзного научно-исследовательского химико-фармацевтического .института им. С. Орджоникидзе по адресу: 119815, Москва, ул. Зубовская, д. 7.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всесоюзного научно-исследовательского химико-фа.рмацевтического института им. С. Орджоникидзе.

Автореферат разослан « » 1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат медицинских наук

Р. Д. Сюбаев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА PABOTU

Актуальность темы. Расстройства гемостаза, характеризующиеся признаками гиперкоагуляции, являются главным звеном в развитии тром-богеморрагических осложнений различных заболеваний,главной причиной тромбозов и тромбоэмболия, приводящих к летальным исходам при пата-логиях сердечно - сосудистой системы (Баркаган З.С.,198Э;Чазов Е.И., Лакин К.М.,1979). Для быстрой коррекции таких нарушений свертываемости крови современная терапия использует природный антикоагулянт прямого действия - гепарин (Jaques,1979).

Обладая целым рядом положительных свойств, гепарин иногда вызывает аллергические реакции, тромбоцитопению, рикошетный эфйчкт, что нередко затрудняет, а иногда делает абсолютно невозможным его применение. Кроме того у значительной части населения планеты отсут-ствуеч или снижена чувствительность к этому препарату из-за врожденного дефицита кофактора' гепарина - AT-III. По данным ВОЗ на 5000 населения приходится I человек с наследственным дефицитом данного белка. Они составляют группу повышенного риска тромбообразования. Этот перечень добавляется сотнями тысяч пациентов с возникающей недостаточностью АТ—III в течении основного заболевания.

Все это и определяет необходимость поиска новых антикоагулянтов прямого действия как с подобным гепарину, так и отличным от него -без участия кофактора-- механизмом действия.

Поиск эффективных заменителей гепарина ведется среди его структурных аналогов - сульфатированных полисахаридов полусинтетического

и природного происхождения. По механизму антикоагулянтного действия эти соединения часто близки к гепарину. Так, сульфаты целлюлозы, декстрина, галактана и ксилана, подобно гепарину, реализуют свое действие, вовлекая в реакцию AT-III (Kindness et al.,1979). Их эффективность значительно снижается в крови пациентов с дефицитом ктого белка (Kindness et al.,1980).

В послоднее время появились сообщения об исследованиях аналогов гепарина - каррагинанов (Di Rosa, 1972), дерматансульфатов (Parvgrazsi.Glanese, 1987) .гонтозанполисульфата (Barrowoliífe et al., i?86>.Показано, ".то механизм их антикоагулянтного действия не определяемся ьзиаодейстьием с АТ-Ш,что открывает возможность эффективного использования судьфатированшх полисахардов у больных с вро-ьу.чн>»;м и приобретенном дефицитом этого кофактора гепарина. Однако

большинства из них весьма проблематично в связи с высокой Ж'^унигашостьи и гелеобразушей способностью.

Особое положение среди сульфатированнш полисахаридов природного ппоисхокденкя занимают фукоиданы, основной структурной единицей которых является фукоза, а полисахаридный скелет макромолекулы имеет рзз^етышшу» структуру (Donar ,Whistler,1973). В литературе веются единичные сообщения о проявлении этими соединениями антикоагулянтной жакьаости (Barnard!.Springer, 1962), без указания на возможный меха- • ш»?м действия. .

В на:лих исследованиях были использованы фукоидаяы, выделенные и охарактеризованные в Институте органической химии им. Н.Д.Зелинского АН СССР доктором химических наук, профессором А.И.Усовым.

Привести экспериментальное исследование антикоагулянтного и других наиболее выраженных фармакологических эффектов

препаратов фукоиданов, выделенных из бурых морских водорослей Японского моря.

Заз§чи_исслейования:

1.Установить изменение антикоагулянтной активности в зависимости от вариаций основных макромолекулярных характеристик фукоиданов.

2.Установить механизм действия соединений этого класса.

3.Определить наличие аналогичных гепарину сопутствующих фармакологических эффектов - активацию лшюпротеидлипазы(ЛПЛ) и возникновение тромбоцитопении.

4.Установить наличие антагонизма фукоиданов к поликатиону» нэ взаимодействия с четвертичной аммонийной солью олигомера-2& кона-дина с целью определения возможности быстрой отмены антикоагулянт-ного действия природных полианионов.

5.Показать возможность достижения гинокоагуляционного эф^мкта путем интратрахеального введения фукоиданов.

Научная .новизна: Впервые изучен ряд сульфатированных пЬлисахари-дов бурых морских водорослей,среди семи представителей которого были обнаружены соединения, обладающие сопоставимой с гепарином антикоагулянтной активностью..

В изученном ряду фукоиданов выявлены соединения, сочетающие высокую антикоагулянтную активность с низкой токсичностью.

Показано, что антикоагулянтное действие фукоиданов в отличие от гепарина реализуется главным образом через прямую инактивацию ■Факторов внутреннего пути свертывания, а не через взаимодействие с янти-тромбином-Ш.

Впервые исследована возможность нейтрализации антикоагул.чнтного действия фукоиданов четвертичной аммонийной солью олигомера 25 кон/.-

дана; установлено гипокоагуляционное действие фуковданов при интра-трахеалъном введении; выявлено и изучено липолизстимулирущее действие сульфатированных полисахаридов бурых морских водорослей.

Пдактаческая_уенность. Установлено,что фукоиданы,выделенные из бурых водорослей Японского моря, обладают антикоагулянтным действием, сопоставимым с гепарином. Это создает реальную перспективу получения новых антккоагулянтов на основе дешевого растительного сырья.

Наряду с влиянием на гемостаз,изученные фукоиданы обладают ли-полизстимулирующей активностью и могут быть основой для разработки препаратов, направленных на профилактику и лечение атеросклероза и его тромботических осложнений.

Показана возможность быстрой отмены антикоагулянтного действия фукоэданив синтетическим поличатионом - четвертичной аммонийной солью олигомера-25 конидина.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на совместной научной конференции лаборатории фармакологии гемостаза II ЮТ ш.Н.И.Пирогова.к&федры фармакологии ММСИ им.Н.А.Семашко,лаборатории фзрмзкокинетики НИИ Фармакологии АМН СССР(Москва,1989). . и на заседании расширенного коллоквиума лабораторий фармакологии и лекарственной токсикологии ВНИХФИ им.С.Орджоникидзе (Москва,1990). Основные положения работы были доложены на II Всесоюзной конференции по штерполимерныМ' комплексам (Рига,1989),на Всесоюзной конференции молодых ученых'Соврименные проблемы органического синтеза" (Иркутск, 1983).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 3 печатные работы.

Ст££ктп^_и_объем_1>аботы. Диссертация состоит из введения,обзора литературы,материалов и методов исследования, результатов ис-

следования и их обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы.

Диссертация излокена на страницих машинописного текста, содержит 18 рисунков,16 таблиц. Список цитируемой литературы включает 281 название, из них 30 отечественных и 251 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для скрининга гепариноподобной активности фукоиданов был использован метод определения метахроматической активности полисахаридов с водным раствором толуидинового синего (Macintosh,1941). Определение острой токсичности проводили на белых беспородных мышах массой 18-23 г. DL^0 определяли по формуле Кербера(Беленький М.Л., 1959).

Эксперименты in vivo проводены на 80 кроликах-самцах массой 3-4 кг. Фукоиданы вводили в краевую вену уха,образцы крови отбирали из краевой вены другого уха до введения соединения.через 15,30,60 мин и далее каждый час.В образцах крови определяли: тромбопластиновсе время по Квику (Quick,1972), время рекальцификации (Bergenhof, Rocka, 1954) и толерантное-^ крови к гепарину (Marbet.1954, в модификации Jürgens,1962), регистрировали тромбоэластограммы (Schneider et al., 1962), подсчитывали количество тромбоцитов и определяли их агре-гацнонную способность ( Born, 1962 ) и высвобождение АТФ, определяли концентрацию фибриногена (Goodwin,1965 в модификации Rampling, 1976), активность антитромбина III (Abildgaad.1970) и липоггротеид-липазы (Anderson, 1972)', активность факторов свертывания крови (с помощью стандартных реагентов 4ирмы Merz+ Dads).

Эксперименты по изучению интратрахеального введения фукоиданов

проведены на 240 крысах-самцах массой 200-250 г,которым вводили в трахею либо гепарин .либо фукоидан в дозе 50 мг/кг, либо физиологический раствор в объеме 0,5 мл.Образцы крови брали из сердца с помощью катетера через 2,5,24 и 48 часов после введения веществ, и исследовали их перечисленными выше коагулологическими методами,а так кз определяли концентрацию гепарина с помощью реагентов фирмы "Вое-Пп£ег Мат-Леш" (ФРГ).В перитонеальном смыве проводили морфометри-ческий анализ тучно-клеточной популяции (Линднер Д.П.,1980)

Характеристика изученных фукоиданов представленна в таблице I.

Таблица I. Характеристика сульфатированных полисахаридов из бурых морских водорослей

шифр сульфат Фукоза Галактоза Ксилоза Уроновые фракции ( %) {%) (%) (%) к-ты (в{6)

Laminaria Cichorioides

F2E 40,2 52.0 2.2 0.3 3.7

Р2а 24.5 47.0 1,7 0.3 4.1

г2б 44,0 43,8 2.6 0.3 3,0

Sphaerotrichia div^ricata

р32 27.9 60.3 3.1 следы 1.9

V 23.0 ' -- - - -

Р3Н 34.4 - -

Р31И. 16,1 - - - -

K3ÍVibTAíU ilCCJSiODAEÜ П EZ С£СГЦДЕгП2

На'лл было проведено сравнительное исследование антккоагулянтно-i'ü диЛствйя 7 сульфатированных полисахаридов бурых корских водорослей - Фукоиданов. У каздого полисахарида определяли ызтахроматичес-

кую активность и острую токсичность. Оказалось,что все фукоиданы вызывали изменение окраски раствора толуидинового синего.Наибольшей метахроматической активностью обладал фукоидан Р2> полученный из Laminarla cichorloides.ee величина превышала активность гепарина на 33%.В результате фракционирования были получены фракции этого соединения Р2а и ?2б, обладавшие меньшей метахроматической актиностью (рис.1),но вместе с тем их острая токсичность была значительно шшз, чем у суммарного препарата (рис.1). DL^0 фукоидана Р2б составила 167 t иг/кг, тогда как у F22 этот показатель был равен 83 мг/кг.

к

К п а S

о а х а н О 2

20-

IX 60 (мг/кг) 200

; .'.«fe

» \\W44\W s Л''№\№

- .'AWJWW

. i.MVV.

I. " •••

F2

метахромаэня а1 иаю

Рис.1 Метахооматическая активность и острая токсичность фукоидана Р2 и его фракций.

Наибольшей метахроматической активностью среди суммарного препарата фукоидана Рэ>полученного из Бр1гаего1,г1с1иа сЦуаг1с-\га, и его фракций обладал полисахарид Р^П (рис.2). Его метахромазия была на 34Ж выше активности суммарного полисахарида Р^ и на 7% выше мета-хромазии гепарина. Токсичность этого полисахарида и всех его фракли:Л

140

120-

100

ВО

00-

40 -

О

была достаточно низкая. Наименьшей токсичностью обладала фракция ?3ш (Ы>50=483 мг/кг). Однако имея такую низкую токсичность, 'этот фукоидан проявлял слабо выраженное гепариноподобное действие. А фракция Р^и сочетала высокую метахроматическую активность и низкую токсичность (рис.2).

Проведенные скрининговые исследования позволили перейти к изучению влияния фукоиданов в дозе 10 мг/кг на систему гемостаза после внутривенного введения кроликам. Эти исследования показали,что фуко-иданы обладают антикоагулянтным действием.Свертывание не фиксировалось всеми коагулологическими методами уже через 15 мин после введения в кровоток полисахаридов.

Л60 (мг/кг)

г 600

800

•100

метахромазия

Б31 Ва(о

Рис.2 Ыетахроматическая активность и острая токсичность фукоидана Р^ и его фракций

По продолжительности антикоагулянтного действия исследованные

полисахариды можно расположить в такой ряд сравнения:

Р311 = Р2Е > Р2б = Р2а > Р31> Р3Ш

Известно, что степень сульфатированности.макромолекулы играет важную роль в выраженности антикоагулянтного действия (Eckschlager, 1964;Jaques, 1979; Kindness,Long,1979,Nishino et al.,1989)-Для суль-фатированных макромолекул с большой молекулярной массой это положение не было подтверждено.Так содеряание сульфата в молекуле фукоида-иа ?2б примерно в два раза выше чем в Р?а (Табл.Ь,но величина и длительность их антикоагулянтного эффекта примерно одинакова. Содержание сульфагрупп у фукоидана РдП на 10% меньше чем Fgö (табл.1), однако продолжительность антикоагулянтного эффекта P^II по тесту тромбоэластографии (ТЭГ) - 120 мин, а ?2б - 60 мин. Эти данное согласуются с работами других авторов, получивши: сходные результаты при исследовании каррагинанов ' (Anderson,Duncan, 19.65;Bernard, Sprin-ger,1962;). Вероятно, содержание сульфата в молекуле полисахада имеет существенное значение в проявлении гепариноподобной активности для низкомолекулярных соединений, а при молекулярных массах,на порядок и более превышающих таковую гепарина, этот параметр решающей голи не играет.

Наиболее активный из исследованных наш фукоидэнов P^II обладал внтикоагулянтной активностью сопоставимой с эффектом гепарина по длительности и глубине, но иным механизм действия. Антитромбиновая активность плазмы крови после внутривенного введения фукоиданов изгонялась незначительно. Это свидетельствует о том,что эти полисахарида гораздо в меньшей степени чем гепарин способны взаимодействовать с антитромбином. Возможно они реализуют свое антикоагулннтчое действие подобно дерматансульфату через кофактор гепарина II (Рэпд-razzi.Glanese, 1987; Church et al., 1989).

Наблюдавшееся незначительное усиление антитромбиноюй активн'1-

сти можно связать с присутствием небольших количеств линейных фрагментов полисахаридов, обладающих большим сродством к AT-III, чем на-тнвная разветвленная молекула фукоидана.

Для выяснения возможного механизма антикоагулянтного действия полисахаридов было проведено исследование влияния фукоидана ?2б на активность факторов свертывания крови.Было установлено,что через 5 мин после внутривенного введения полисахарида происходит полная инактивацию VIII,IX,XI и XII факторов (рис.3).Это указывает на то,что антикоагулянтное действие этих соединений осуществляется через блокаду факторов -внутреннего - пути свертывания крови. Спустя 120 мин после введения фукоидана активность этих факторов начинает постепенно восстанавливаться. Именно столько времени продолжается антикоагу-

100

я о

а во о н х

та во о

л

0

1 20 H

гс о

Б во »0 (мин)

C3VUI. ОIX EU я ESxii Он СЗ» C3vi ' Юх факторы

Рис.3 Активность факторов свертывания крови чере 5, 60, 180 мин после введения в кровоток фукоидана ?2б в дозе 10 мг/кг.

лянтный эффект этого полисахарида. Последующая нормализация свертывания крови позволяет предположить, что восстановление активности

- 1j -

блокированных Факторов происходит в результате постепенной деструкции полисахарида в организме.

Незначительные изменения активности факторов протромбинового комплекса - II.Y.VII и X определяют слабо выраженные изменения

г

протромбинового индекса после внутривенного введения этого полисахарида . Аналогичные изменения активности факторов протромбинового комплекса наблюдал Sie и соавт.(1986)после введения пентозанполисуль-фата. Kindness et al.(1979) получил подобные результаты для каррэ-гинанов. В то se время введение гепарина вызывало снижение протромбинового индекса на 73,7х (Розкин М.Я. и соавт.,1988), а наибольшие изменения этого показателя под действием фукоиданов наблюдалось при введении фракции Р2б; оно составляло 48,5%.

Многие сульфатированные полисахариды способны вызывать преципитацию фибриногена (Anderson,Dunoon,1965).Мы также отметили тенденцию к снижению концентрации фибриногена в крови при однократном внутривенном введении фукоиданов. Однако это снижение было сопоставимо с уменьшением количества фибриногена от кровопотери «Лприча М.Н., 1987).Видимо изученные растительные полисахарида не оказывают влияния на этот белок,что согласуется с экспериментами Springer и соавт. (1957).

Помимо воздействия на белковые компоненты свертывающей системы, фукоиданы оказывают влияние на клеточное звено гемостаза. Все исследованные фукоиданы вызывали тромбоцитопению при внутривенном введении кроликам и агрегировали тромбоциты в исследованиях in vitro. Наиболее глубокую тромбоцитопению вызывали фукоиданы и рут. После внутривеного введения их в дозе 10 мг/кг в крови обнаруживались единичные тромбоциты на протяжении 120 мин, затем начиналось

постепенное увеличение их количества, но и через сутки оно оставалось сниженным. Механизм возкикащей тромбоцитопении не ясен. Полагают, что ее причиной является агрегация кровяных пластинок, вызываемая взаимодействием макромолекулярных полианионов с фибриногеном; (Kindness et al., 19SO).Аналогичный эффект наблюдается и при введении гепарина. Dunn et al.(1983) объясняют возникновение тромбоцитопе-нии при лечении гепарином тем,что последний вызывает связывание фибриногена с тромбоцитами; выраженность взаимодействия зависит от степени сульфатнрованности молекулы гепарина.

В наших исследованиях также отмечается связь между степенью сульфатнрованности полисахарида и глубиной тромбоцитопении.Например, фукоидан f26 содержал примерно в два раза больше сульфата,чем фукоидан Р2а (табл 1).При этом в экспериментах in vivo при введении в кровоток полисахарида ?2а через 30 минут в плазме регистрировались 74,8 Г/л кровяных пластинок,а через 60 мин уже 223,8 Г/л. При введении внутривенно той хсе дозы фукоидана Р2а на протяжении 60 мин в плазме регистрировались единичные клетки,а через 120 мин насчитывалось уке 230 Г/л тромбоцитов .Среди фракций фукоидана Р^ самая низкая сульфатированность молекулы была у. фукоидана F^111. Именно этот полисахарид вызывал транзиторную тромбоцнтопению при внутривенном введении кроликам,тогда как фракция с двукратным превышением сульфатнрованности (F^II) вызывала глубокую, и стойкую тромбоцитопению.

Кроме этого, тромбоцитопения иохет возникать вследствие изменения поверхностного заряда мембраны клеток (Grottim, 1969),либо иммунологических изменений (Green et al.,1989).lane н соавт.(1978) показала, что чем больше молекулярная масса полза;зра, тем чаще возникает это ослоэшенне. По данным liuzsarelli et al. (1994) высокомолекулярные

фракции карбсксизитозанов являлись эффективными антикоагулянтами, но при добавлении к крови вызывали гемолиз, агрегацию тромбоцитов, изменение формы эритроцитов. Однако деградированные ультразвуком и фракционированные карбоксихитозаны <смесь с М.м.39000 и 80000) не вызывали гемолиза,эритроциты не изменяли ни объем ни форму. Это указывает на то, что большая молекулярная масса полимера играет существенную роль в эффекте тромбоцитопении.

Кроме этого,проведешше исследования in vitro по изучению способности фукоиданов вызывать агрегацию тромбоцитов,показали непосредственное агрегирующее влияние этих соединений на клетки. При добавлении к плазме обогащенной тромбоцитами Есе изученные фукоиданы вызывали агрегацию клеток (рис.4).Внутривенное введете фуковдэни

Рис.4 Агрегация тромбоцитов и высвобождение АТФ при действии фукоиданов и АДФ.

P-jlI л сопровождалось глубокой тро^боцктопеЕг.ей.Пр:! вяедешш в

icpoBOTOic дозы 10 »г/кг ?311 только через 120 ir.m в плазге начинали

л

ч г

ЬО к

я

' : агрегация тромбоцитов £25 высвобождение ЛТФ

появляться кровяные пластинки - 62,7 Г/л,через 4 часа их количество увеличилось до 135 Г/л при исходной величине 900 Г/л.Вместе с тем и в экспериментах in vitro именно эти полисахариды индуцировали более сильную агрегацию тромбоцитов и вызывали освобождение агрегирующими тромбоцитами наибольшего количества АТФ (рис. 4).

Наряду с антикоагулянтным действием представляет большой практический интерес липолизстимулирущий эффект сульфатированных полисахаридов. Липопротеидлипаза - фермент превращающий липопротеиды богатые холестерином и триглицеридами в липопротеиды высокой плотности, которые участвуют в удалении из клеточных мембран излишков холестерина (Hamosh, Hanosh, 1983). Показано,что гепарин вызывает высвобождение ЛПЛ в кровоток, которая удерживается на интиме сосуда с помощью гепарансульфатных мостиков,тем самым активируя липолиз.

Аналогичный эффект кроме гепарина могут вызывать другие полисахариды: пентозанполисульфат (Fischer et al.,1982),дерматансульфат (Pangrazzi.Gláñese,1997). Не оказались исключением и исследованные нами фукоиданы.

В экспериментах in vivo все семь изученных фуконданов оказывали стимулирующий липолиз действие при внутривенном введении кроликам в дозе 10 мг/кг. Наиболее активным оказалось соединение P2S срис.5). Эффект наступал через 15 мин после его введения. Максимальная ак-' тивация липолиза под действием этого фукоадана наступала через 120 мин и к третьему часу эксперимента активность ЛПЛ оставалась все еще достаточно высокой (рис.5). Максимальное усиление липолиза под действием гепарина обнаружено уже через 15 мин после внутривенной инъекции. Причем, по данным Левиной Ы.Н.(1987), динамика активности ЛПЛ в.крови, индуцированная гепарином, коррелировала с глубиной ан-

тикоагулянтного воздействия,в частности.с угнетением активности факторов протромбинового комплекса.

ол-

ElFfj E3F» E3F9 I CZlFD II E3FO«I

Рис.5 Динамика активности ЙПЛ после внутривенного введения фукоиданов в дозе 10 мг/кг.

Для фукоидакоз такой связи не обнарукенно. Антикоагулянтвый эффект развивается сразу после их введения,з наибольшее увеличение ли-полиза наступает для всех исследуемых соединений, кроме Р^б, через 120 мин после внутривенного введения. Отсутствие корреляции между антикоагулянтным и стимулирующим липолпз эффектом,вероятно, указывает на то, что за реализацию их ответственны различные участки макромолекулы полисахарида или величина макромолекул похожих структур. Ко- следования ВагготтсНГХе и соавт. (1'98б) показали, л то антикоагулянт-ный эффект пентозанполисульфата (Неяюо1аг),был обусловловлен высвобождением печеночной ЛГЫ,которая воздействуя на богатые триглицери-дами липопротеиды приводила к снижению свертывающего потенциала крови за счет ингибирования образования тромбина и фактора Ха.

Применение антикоагулянтов прямого действия, как правило, требует

отмены кх эффекта. В настоящее врем в отечественной и зарубежной клинической практике для этой цели используются соли протаминов (Лакин К.М.,Ефимов B.C.,i970;Steven,iS87). Но их применение вызывает целый ряд токсических эффектов (Steven,1987;Hobbhahn et al.,1987; Casthely,198b). Наиболее опасное осложнение при использовании протаминов - феномен отдачи, проявляющийся в наступлении повторной гепа-ринемли после восстановления свертываемости крови нейтрализацией антикоагулянта протамином (Shanberge et al., 1987). Все это говорит о низкой селективности к гепарину препаратов протамина и определяет необходимость поиска новых,более эффективных соединений.

Особенно перспективным в этом плане является класс линейных поликатионов - ионенов синтетического (Ефимов B.C., 1981.Ефимов B.C. и соавт.,1983) и полусинтетического происхождения (Усманова,1980).

В напшх исследованиях было изучено интерполимерное взаимодействие антикоагулянта нового типа - фукоидана ?2б - с синтетическим поликатионом - четвертичной аммонийной соли олигомера-25 конидина (ЧАС 0-25. конидина), который обладает высоко селективной способностью связывания гепарина (Некрасов А.В. и соавт.1982).Важно было установить полиэлектролитное взаимодействие этого синтетического.линейного поликатиона с антикоагулянтом фукоиданом í^0 ~ полианионом разветвленной сруктуры.

В экспериментах in vitro было установлено весовое нейтрализующее соотношение фукоидана и ЧАС 0-25 конидина, которое было равно 1:1 (мг:мг) что линь немногим хуже, чем при взаимодействии этого поликатиона с гепарином (1:0,75) (Некрасов А.В.и соавт.,1982). Результаты, нейтрализации,'полученные in vitro хорошо воспроизводились в экспериментах in vivo. В крови зкивотных,несмотря на присутствие дру-

гих заряженных полимеров,быстро восстанавливалась свертываемость.Уже через 5 мин после введения антагониста на фоне антикоагулянтного действия фукоидана наступало восстановление гемокоагуляции по тестам тромбоэластографии и рекальцификации крови, значения которых достоверно не отличались от контроля на протяжении трех часов эксперимента. Ранее установленный факт необходимости множественного положительного заряда в макромолекуле полимера для его взаимодействия с гепарином (Щимов В.С.,1961) видимо, является определяющим и для образования полиэлектролитного комплекса с фукоиданом.

Новые возможности использования фармакологических эффектов гепарина открыл внутрилегочный путь введения этого препарата в виде аэрозоля. Среди множества преимуществ, подтвержденных клиническими наблюдениями, важнейший является развитие продолжительной и не глубокой гипокоагуляции (В1ок,1985). Она обусловлена феноменом длительного присутствия в кровотоке небольших количеств гепарина, поступающего в циркуляцию из клеточного пула (МаЬайоо е* а!.,1380), в котором особое место занимают тучные клетки.

Обладая сопоставимой с гепарином антикоагулянтной активностью (Розкин М.Я. и соавт.,1988) фукопданы отличаются механизмом действия, в котором влияние на свертывание крови не опосредуется через АТ-111 (Розкин М.Я.и соавт.,1989).

Для установления возможности пролонгирования- гипокоагуляцисн-ного эффекта фукоиданов была проведена серия сравнительных экспериментов на крысах, которым внутрптрахеально вводили гепарин или фукои-дая ?3П в дозе 50 мг/кг. Контрольной группе зивотных в трахею инсталлировали (физиологический раствор.

После однократного внутритрахеального введения гепарина разви-

вались характерные изменения в свертывающей•системе крови: антикоа-гулянтный эффект по данным тромбоэластографии наблюдался узке через 2 часа и сохранялся через 5 час после ввведения гепарина, в последующие сроки наблюдения вплоть до 48 час тромбо ол а стографиче ские показателе! сохраняли признаки вирагеиной гипокоагуляции. При этом влияние гепарина на систему свертывания крови коррелировало с его концентрацией в плазме (табл.2).

Увеличение концентрации гепарина в крови и его антикоагулянтное действие совпадает с возрастанием метахроматической окрашенности тучных клеток (табл.3) перитонеальной полости. По мере снижения кон-Таблица 2

Изменение показателей свертываемости крови при однократной инсталляции в трахею гепарина и фукоидана ?3П в дозе 50 мг/кг.

Бремя

после

введения (час)

Вводимое: вещество:.

Показатели свертывания крови

г + к " : Концентрация «сею : гепарина <ед/мл)

24

48

Физ.р-р Гепарин ?31*

Физ.р-р Гепарин р31!

Физ.р-р Гепарин Р31?

Физ.р-р Гепарин ? II

123 ±7.8 свертывания нет 285 ± 63»

204 ± 11,7 свертывания нет 192 ±10,8

157 ± 33 274 ± 57« . 174 ± 42

177 ± 16 210 ± 8,7* 148 ± 54

0,041 ± 0,002 1.8 г 0,08* 0.047 ± 0,005*

0,056 ±0,004 0,113 ± 0,007* 0,082 ± 0,005*

0,031 ± 0,002 0,038 ± 0,001* 0,038 ± 0,001*

« - различия относительно контроля достоверны при р < 0,05 центрации гепарина в крови на сроке 48 час. наблюдается на только постепенное восстановление свертываемости кровд, но в укэньпение

процента интенсивно окрашенных тучных клеток (табл.3). Такое совпадение эффектов даэт основание предполагать, что столь необычное то длительности действие коротко живущего в кровотоке гепарина во многом связано с секрецией тучными клеткам!, которые депонировали антикоагулянт на рашшх сроках после инстиляции.а в последствии его постепенно секретируют.Это совпадает с данными Орловой А.Г.и др. (1999)

Таблица 3. Изменение степени окрашенности тучных клеток крыс после однократного интратрахеального введения гепарина и фукоидана Р II в дозе. 50 иг/кг

Время после Тип Процент клеток К'ГГДОГО типа скрепя

введения

(час) геле ток фзз.раствор гепарин фукондэн

1-очень темные 42 63* 61*

2 2-темные 35 19» 25*

3-светлые 2Г 22 13

4-очень светлые 5 I 2

I 36 53* 54**

5 2 41 19* 25«

3 19 27 20

4 . 4 2 I

I 30 - 67» 65*

24 2 - 35 18 15*

3 29 18* 19х

4 I I I

I ' 23 46« 51*

48 2 39 28« 25*

3 38 26* 27*

4 I 0,5 0

а - различия относительно контроля достоверны при р < 0,05

Проведенные немл экспорт: :знта показали, что фукслдгд Р^И, как и гепарин, попадает в 1фовоток при внутритрахеальном введении. Несмотря на су^ествэннуа рззппцу талзкуляршх масс л структуры гепарина (<1ааиез,1979) п фукспдгпэ (Усоа Л.Л. и созвт., 1985), пх гипокоагуля-цпоыныЗ оффзкт начинался одцоврзганпо. Его продолжительность после

внутритрахеалыюго введения фукоидана P^II, была также увеличена по сранению с его внутривенным введением.Однако корреляции степени ги-покоагуляции с изменением концентрации гепарина в плазме обнаружить не удалось. Антитромбиновая активность плазмы в случае введения в трахею фукоидана F3II не возрастала .как в случае введения гепарина.

Это позволяет предположить, что фукоидан F^II и при интратрахе-альном способе введения реализует свой гшокоагуляционный эффект через взаимодействие с гепариновым кофактором II (Church,1989). либо путем прямого взаимодействия с факторами свертывающей системы крови (Розкин М.Я. и соавт.,1989).

ВЫВОДЫ

1.Исследование полисахарида бырых морских водорослей - фуко-иданы и их фракции обладают антикоагулянтной активностью.

2.Среди 7 исследованных фукоиданов наиболее вираженую антикоа-гулянтную активность и низкую токсичность проявляют соединения Р2б и P-jII.

3.Выраженность и длительность антикоагулянтного эффекта фукоиданов не зависит от степени сульфатированности макромолекул изученных структур.В отличив от гепарина основной механизм влияния на свертываемость крови оуществляется. без участия антитромбина ш.

4.Быстрая нейтрализация антикоагулянтного действия фукоиданов достигается внутрисосудистым введением синтетического поликатиона четвертичной аммонийной соли олигомера-25 конидина за счет интер-полиэлектролитного взаимодействия катионного и анионного полимеров.

5.Исследованные фукоиданы стимулируют липолиз, наибольшая вы-

рзженность которого наблюдается через 120-180 мин. после внутривенного введения. При этом антикоагулянтный эффект этих полисахаридов, возникает сразу после введения в кроЕоток.

6.Внутривенное введение фукоиданов сопровождается ьознжкоь--!^-ем транзиторной тромбоцитопении, глубина и длительность кот<х*:>;: коррелирует со степенью сульфатированности изученных полисахаридов.

7.Пролонгирование гипокоагуляционного эффекта Фукокданз Г-Н достигается его интратрахеальным введением.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1.Сульфатированные полисахариды бурых морских водорослей - фу-коиданы - могут быть использованы для создания прямых антикоэгулян-тов с отличным от гепарина механизмом действия.Наибольший интерес в этом плане предотавляют фукоиданы Р^П и Р2б.

2.Сочетание слабого антикоагулянтного и выраженного липолиз-стимулирующего действия у некоторых фукоиданов мокет привести к созданию нового фармакологического средства для профилактики и лечения атеросклероза.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Изучение механизма антикоагулянтного действия фукоиданов В сб.. Конференция молодых ученых, Иркутек,1988,С.202.

2.Изучение механизма антикоагулянтного действия фукоиданов. Фармакология И токсикология,1989,т.52,N 3,С.48-51,(в соавт.М.Я.Розклн, М.Н.ЛеЕина, А.И.Усов, В.С.Ефимов).

3.Отмена антикоагулянтного эффекта фукоидана- через интерполимерное взаимодействие с ЧАС 0-25 конидина.В кн.:Ингерполимерные комплексы. Тезисы докладов II Всесоюзной конференции.Рига,1989.с.361-365, .в еоавт.В.С.Ефимов.М.Я.Розкин ).