Возрастные особенности регенераторных процессов в печени больных хроническим активным гепатитом

Крохина, Наталья Борисовна

Диссертации по медицине → Патологическая физиология

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Возрастные особенности регенераторных процессов в печени больных хроническим активным гепатитом

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Крохина, Наталья Борисовна Екатеринбург 2004 г.

Ученая степень: кандидата медицинских наук

ВАК РФ: 14.00.16

Автореферат диссертации по медицине на тему Возрастные особенности регенераторных процессов в печени больных хроническим активным гепатитом

На правахрукописи

Крохина Наталья Борисовна

ВОЗРАСТНЫЕ ОСОБЕННОСТИ РЕГЕНЕРАТОРНЫХ ПРОЦЕССОВ В ПЕЧЕНИ БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ АКТИВНЫМ ГЕПАТИТОМ

14.00.16 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Екатеринбург - 2004

Работа выполнена в Уральской государственной медицинской академии

Научный руководитель:

Заслуженный деятель науки РФ, член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор А.П.Ястребов Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор С.В.Сазонов Официальные оппоненты:

Заслуженный деятель науки Республики Башкортостан, доктор медицинских наук, профессор Д.А.Еникеев

доктор медицинских наук, профессор А.В.Осипенко Ведущее учреждение:

Челябинская государственная медицинская академия, 454092, г.Челябинск, ул.Воровского, д.64

Защита состоится «_» мая 2004г. в_часов на заседании

Диссертациионного Совета К 208.102.02. при Уральской государственной медицинской академии по адресу: 620219, г.Екатеринбург, ул.Репина, д.З.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО УГМА (г.Екатеринбург, ул.Ключевская,д. 17).

Автореферат разослан 2004 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор медицинских наук, профессор

В. В. Базарный

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В современной гепатологии проблеме хронических гепатитов уделяется все более пристальное внимание в связи с неуклонным ростом заболеваемости (Лобзин Ю. В., 1999; Шляхтенко Л. И. и др., 2000), тенденцией к прогрессирующему течению (Zarski J. P. et al., 1998), нередко с формированием в исходе цирроза и первичного рака печени (Подымова С. Д. и др., 1996; Benvegnu L. et al., 1994).

Повреждение клеток печени при хроническом гепатите (ХГ) индуцирует развитие репаративной регенерации. В той или иной мере активируются характерные для гепатоцитов процессы клеточной (митоз, эндомитоз) и внутриклеточной регенерации (клеточная гипертрофия) (Кудрявцев Б. Н. и др., 1982,1993; Эсауленко Е. В., Погромская М. Н., 1990; Цвиренко С. В., 1993; Димов П. Г., 1990; Werling К. et al., 2000; Vielhaer V. et al., 2001; Hai N.I. et al.,2002; Song Z. et al., 2004), коррелирующие с некрозо-воспалительной активностью ХГ (Серов Н.А.идр., 1995; Jin Y.M.etaL, 2001).

В настоящее время актуальным является изучение изменений реактивности организма и его регулирующих систем при старении (Кишов М. Г., Грабовский B.C., 1995; Титов С. А., Крутько В. Н., 1996; Донцов В. И., 1998; Ястребов А. П., Сазонов С. В., 1997, 1998, 1999; Сазонов С. В., 1999; Мещанинов В. Н., 1999; Спектр СИ., Ястребов А.П. и др., 2003). Несмотря на активное изучение регенераторных процессов в печени при старении, опубликованные данные нередко противоречивы. Большинство современных работ свидетельствуют о снижении синтеза ДНК и митотической активности гепатоцитов при старении (Mendenhall С. L. et al., 1993; Tsukamoto I. et al., 1993; Орли-ченко Л. С. и др., 1994; Мозжухина Т. Г. и др., 1994; Taguchi Т., Ohashi М., 1996; Higami Y. et al., 1997). Другие исследователи с увеличением возраста выявили активацию пролиферативных процессов в печени (Кудрявцев Б.Н. и др., 1991), нарастание полиплоидизации гепатоцитов (Северин М. В., 1993; Урываева И. В., Делоне Г. В., 1995; Кодолова Г. И., 1997; Костромина О. В. и др., 1999; Солтыс Т.В., 2002; Basso A. etal., 1996).

В литературе не освещены вопросы участия гепатоцитов разных классов плоидности в репаративной регенерации при ХГ в различные возрастные периоды. В настоящее время нет единого мнения в вопросе о соотношении основных способов регенерации гепатоцитов при ХГ в условиях возрастной инволюции организма. Недостаточно определена роль отдельных р е г у ¿g,¿^течении о -

лиферативных процессов в печени в *гих vWifoftHQIEKA I

Все выше изложенное послужило основанием для определения цели и основных задач настоящего исследования.

Цель: Исследовать возрастные особенности регенераторных процессов в печени больных хроническим активным гепатитом.

Задачи:

1. Оценить состояние пролиферативных процессов процессов в печени больных хроническим активным гепатитом в возрастном периоде развития.

2. Изучить состояние процессов клеточной и внутриклеточной регенерации гепатоцитов у больных хроническим активным гепатитом в периоде зрелости.

3. Оценить состояние процессов клеточной и внутриклеточной регенерации гепатоцитов у больных хроническим активным гепатитом в периоде старения.

4. Изучить возрастные особенности некоторых механизмов регуляции пролиферативных процессов в печени больных хроническим активным гепатитом.

Научная новизна.

В работе проведена качественная и количественная оценка состояния регенераторных процессов в печени больных ХГ умеренной активности в различные возрастные периоды. Дана сравнительная характеристика процессов клеточного деления, полиплоидизации и клеточной гипертрофии у больных ХГ в периоде развития, зрелости, старения. Определена доля участия одноядерных и двуядерных гепатоци-тов разных классов плоидности в репаративной реакции на повреждение при ХГ умеренной активности в условиях возрастной инволюции организма.

Установлены возрастные особенности представительства лим-фоидных клеток в печени больных ХГ умеренной активности, их значение в развитии репаративных процессов при старении.

Получены новые данные о значительном увеличении численности и стимуляции функциональной активности тучных клеток в печени больных ХГ на фоне снижения пролиферативных процессов и усилении полиплоидизации гепатоцитов.

Теоретическая и практическая значимость работы.

мерности представительства тучных и лимфоидных клеток в печени больных ХГ умеренной активности, определено их участие в репара-тивной регенерации гепатоцитов в условиях возрастной инволюции. Проведенные исследования дают теоретическое обоснование возможностей направленной коррекции возрастных изменений регенераторных процессов при ХГ через изменение морфо-функционального состояния тучных и лимфоидных клеток.

Положения, выносимые на защиту:

¡.Состояние процессов клеточной и внутриклеточной регенерации гепатоцитов при хроническом активном гепатите имеет возрастные особенности.

2.Доля участия одноядерных и двуядерных гепатоцитов разных классов плоидности в репаративной реакции на повреждение при хроническом активном гепатите изменяется в разный возрастной период.

3.Снижение пролиферативных процессов в печени больных хроническим активным гепатитом при старении сопровождается изменениями морфо-функционального состояния тучных и лимфоидных клеток в портальных трактах.

Внедрение результатов исследования.

Результаты исследования используются при обучении студентов. в курсах «Патологическая физиология» и «Гистология человека» на соответствующих кафедрах Уральской государственной медицинской академии (ректор — Заслуженный деятель науки РФ, член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор А. П. Ястребов). Отработанные в процессе выполнения диссертации морфо-метрические методы исследования используются в научных работах морфологического отдела ЦНИЛ УГМА (зав. ЦНИЛ — д. м. н., профессор Г. Я. Липатов). Результаты проведенного исследования успешно внедрены в комплексное обследование больных с хроническими диффузными заболеваниями печени в Городском гастроэнтерологическом центре ГБ № 40 (зав. центром — к.м.н. И. Б. Хлынов), в Областном гепатологическом центре ОКБ № 1 (зав.центром — к.м.н. Е. Н. Бессонова), в общественно-медицинском центре «Профессор» (зав. центром — д.м.н., проф. Т. Н. Постникова). По результатам этих работ сделано 6 публикаций.

Апробация работы и публикации.

По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на 5З научной конференции молодых ученых и студентов УГМА «Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения» (Екатеринбург, 1998), на научно - практической конференции ЦНИЛ

УГМА (Екатеринбург, 1999, 2000, 2003), на Межобластной научно-практической конференции «Геронтология. Гериатрия. Медицинская помощь ветеранам войн» (Екатеринбург, 2001).

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, трех глав собственных исследований, общего заключения, выводов и списка литературы, включающего 137 отечественных и 62 иностранных источников. Работа изложена на 135 страницах, иллюстрирована 21 таблицей, 8 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Для исследования была выбрана группа больных хроническим активным гепатитом различной этиологии, проходивших обследование с проведением пункционной биопсии печени в Городском гастроэнтерологическом центре ГБ № 40 г. Екатеринбурга (зав. центром — к.м.н. Хлынов И. Б., врач к.м.н. Серов Н. А). Обследованы 86 пациентов в возрасте от 16 до 70 лет.

Гистологическое исследование гепатобиоптатов проводилось на базе морфологического отдела ЦНИЛ УГМА с.н.с. к.м.н. Бродской И. К., м.н.с. Крохиной Н. Б.

Выбор пациентов для включения в группу исследования основывался на наличии у них умеренной степени активности гепатита, определенной при морфологическом анализе гепатобиоптата. Для оценки степени гистологической активности ХГ использовали полуколичественный анализ определения индекса гистологической активности (ИГА), включающий три первых критерия «индекса Knodell» (Knodell R. et all., 1981). ИГА у обследованных пациентов находился в интервале от 9 до 12 баллов, характерном для умеренной степени активности (Sherlock S., Dooley I., 1997; Серов В. В., 1998). Для определения стадии ХГ полуколичественно оценивали гистологический индекс склероза (ГИС) (Desmet J. V. et all., 1994).

Больные были распределены на три возрастные группы: первая — период развития — до 20 лет (n = 28), вторая — период зрелости — от 20 до 50 лет (n = 29), третья группа — период старения — старше 50 лет (n = 29) (Канунго М., 1982; Кудрявцев Б. Н. и др., 1991). Исследуемые возрастные группы пациентов однородны с учетом гистологической и биохимической активности и стадии ХГ.

Проводили морфометрическое исследование гепатобиоптатов с использованием окуляр-микрометра МОВ-1-х. Определяли размеры печеночных клеток и их ядер, рассчитывали средние площади цито-

плазмы и ядер гепатоцитов. С использованием окулярной сетки Г. Г. Автандилова (1990) подсчитывали количество гепатоцитов разной степени плоидности, число одноядерных и двуядерных гепатоцитов в десяти полях зрения. Анализировали 600 клеток в биоптате каждого больного. Рассчитывали процентное соотношение одноядерных и двуядерных гепатоцитов, распределение гепатоцитов по степени плоид-ности их ядер.

С целью оценки морфо-функционального состояния лимфоцитов в ткани печени исследовали гепатобиоптаты 15 больных ХГ умеренной активности вирусной этиологии в возрасте от 18 до 70 лет. Больные распределены на соответствующие возрастные группы. Проводили морфометрическое исследование гепатобиоптатов с использованием 100-точечной сетки Г. Г. Автандилова (1990). Определяли объемные доли лимфоидных клеток в паренхиме печени и в портальных трактах, выражая результаты в процентах. Определяли удельное количество лимфоцитов в портальных трактах на определенной площади с последующим пересчетом показателя на 1 мм2. Анализировали десять портальных трактов в биоптате каждого больного.

Морфо-функциональное состояние тучных клеток в печени больных оценивали с помощью селективной окраски основным коричневым (Шубич М. Г. и др., 1979). Подсчитывали число клеток, приходящихся на определенную площадь с последующим пересчетом их содержания в 1мм2, измеряли клеточные размеры. Количественное исследование кислых гликозаминогликанов в тучных клетках проводили с использованием цитофлуориметрического метода (Зеленин А. В., 1967; Гордон Д. С, 1990).

Для иммуногистохимических исследований (Райхлин Н. Т., Петров С. В., 1997) применяли моноклональные антитела (CD45+, CD45RO+, CD45RA+, CD3+, CD20+, CD68+) и визуализационную систему для проведения пероксидазно-антипероксидазной (ПАП) методики (Shandon, USA), выполняемой на автомате (Shandon, USA).

Результаты исследования обработаны методами вариационной статистики с вычислением средней величины (М), стандартной ошибки средней величины (т), коэффициента вариации. Достоверность отличий показателей между группами оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Достоверными считались различия при уровне значимости р<0,05. Использовался однофакторный дисперсионный анализ и непараметрический метод Хи-квадрат с применением стандартного пакета прикладных программ «Statistica 5.0, StatSoft, Inc». В работе также использовался пакет статистических программ Microsoft Excel 7.0.

Результаты и их обсуждение

Изучение состояния регенераторных процессов в зависимости от возраста возможно только в пределах одной группы, сформированной по степени активности патологического процесса в печени больных. Для исследований была выбрана группа больных ХГ умеренной степени активности, являющейся прогностически неблагоприятной в плане прогрессирующего течения и формирования цирроза печени.

Оценка морфо-функциональных показателей гепатоцитов у больных ХГ умеренной активности позволила определить возрастные особенности регенераторных процессов в печени.

У больных ХГ в печени с увеличением возраста снижается суммарная доля одноядерных гепатоцитов: Наблюдается перераспределение клеток по степени плоидности их ядер, что является следствием изменения активности регенераторных процессов, происходящих в печени в ответ на повреждение.

Анализ морфометрических данных позволил выявить распределение одноядерных гепатоцитов разных классов плоидности в печени больных ХГ различных возрастных групп (табл. 1).

В печени больных ХГ умеренной активности в возрастном периоде развития (I группа) стимулируются процессы клеточной регенерации, за счет чего поддерживается популяция одноядерных диплоидных гепатоцитов и появляются клетки с тетраплоидным и гиперпло-идным ядром.

Таблица 1

Распределение одноядерных гепатоцитов по плоидности в печени больных ХГ разных возрастных групп, % (М ±ш)

Группы Относительное количество гепатоцитов

больных диплоидные теграплоидные гиперплоидные

87,210,57 4,910,27 0,410,09

I Pi<0,001 Pi<0,001 Pi<0,001

Р2<0,001 Р2<0,001 Р2<0,001

79,3±0,91 8,4Ю,48 1,3610,17

и Pi<0,001 Pi<0,001 Pi<0,001

Р3<0,05 Рз<0,05 Рз<0,001

69,5±1,2 11,510,48 5,911,0

III Р2<0,001 Р2<0,001 Р2<0,001

Р3<0,05 Р3<0,05 Рз<0,001

Примечание: здесь и далее в таблицах - Pi при сравнении показателей I и II групп, Р2 -1 и III групп, Р3 - II и III групп.

По нашим данным, относительное количество диплоидных гепа-тоцитов составляет 87,2 %, а полиплоидных клеток в сумме — 5,3 %, что сопоставимо с уровнем плоидности гепатоцитов в условиях физиологической регенерации. Так, по данным Б.Н. Кудрявцева с со-авт.(1991), доля диплоидных клеток в паренхиме печени здорового человека в конце периода развития составляет 90 %, полиплоидных гепатоцитов не превышает 5,5 %.

У больных ХГ в периоде зрелости (II группа) обнаружено снижение доли диплоидных гепатоцитов на 9,1 % и увеличение количества тетраплоидных гепатоцитов на 71,4 %, клеток с гиперплоидным ядром на 240 % по сравнению с молодыми пациентами (табл.1). Это связано с ослаблением процессов клеточного деления и усилением явлений эндомитоза в регенераторной реакции печени на повреждение. При этом степень повышения доли гиперплоидных гепатоцитов в 3,4 раза выше, чем тетраплоидных, что свидетельствует о более активном участии этих клеток в репаративной регенерации печени у больных в этот возрастной период.

Наблюдается достоверное увеличение средней площади цитоплазмы гепатоцитов всех классов плоидности по сравнению с такими же клетками в печени молодых больных, что свидетельствует о стимуляции процессов внутриклеточной регенерации (табл. 2). Площадь цитоплазмы диплоидных гепатоцитов увеличивается на 7,7 %, тетрапло-идных — на 5,5 %, гиперплоидных — на 9,8 %, следовательно, явления клеточной гипертрофии в большей степени свойственны гиперп-лоидным и диплоидным гепатоцитам.

Таблица 2

Средняя площадь цитоплазмы одноядерных гепатоцитов у больных ХГ разных возрастных групп, мкм2 (М ±ш)

Группы Классы плоидности

больных диплоидные тетрашюидные пшерплоидные

194,6 ±2,3 232,9±2,9 267,4±5,4

I Р!<0,001 Р1<0,01 Р,<0,01

Р2<0,001 Р2<0,001 Р2<0,001

209,6±2,4 246,0±3,0 293,8±5,9

II Р,<0,001 Р,<0,01 Р1<0,01

Р3<0,05 Рэ<0,05 Р3<0,05

232,б±3,7 267,8±5,1 317,0±4,45

III Р2<0,001 Р2<0,001 Р2<0,001

Р3<0,05 Рз<0,05 Р3<0,05

В периоде старения организма развитие ХГ сопровождается активацией регенераторных процессов, которые характеризуются ослаблением митотической активности гепатоцитов и значительным усилением эндомитоза, в результате чего в печени увеличивается количество полиплоидных клеток. По нашим данным, у больных в периоде старения (III группа) уменьшается число диплоидных гепатоцитов на 20,3 %, возрастает доля тетраплоидных клеток в 2,3 раза и гиперпло-идных гепатоцитов в 14,7 раз по сравнению с молодыми пациентами (табл. 1).

В печени больных ХГ Ш группы стимулируются процессы внутриклеточной регенерации, приводящие к компенсаторной гипертрофии одноядерных гепатоцитов (табл.2). Наблюдается увеличение средней площади цитоплазмы гепатоцитов всех классов плоидности, в том числе диплоидных клеток на 19,5 %, тетраплоидных — на 15 %, гиперплоидных — на 18,5 % по сравнению с показателями I возрастной группы

При сравнении средних размеров гепатоцитов у больных старшей и средней возрастной группы площадь цитоплазмы диплоидных клеток увеличивается на 11 %, тетраплоидных — на 9 %, гиперплоидных — на 8 %. Таким образом, при старении организма у больных ХГ в печени явления клеточной гипертрофии более характерны для гепатоцитов с диплоидным ядром.

Анализ регенераторных процессов у больных ХГ в различные возрастные периоды позволил определить особенности реакции одноядерных гепатоцитов разных классов плоидности на повреждение. Так, диплоидные гепатоциты участвуют в репаративной регенерации у больных в периоде развития, их доля в популяции одноядерных клеток соответствует физиологическому уровню. При старении организма в результате снижения митотической активности в паренхиме печени уменьшается относительное количество этих клеток, в них стимулируются процессы внутриклеточной регенерации.

Тетраплоидные гепатоцты присутствовали в печени больных

всех возрастных групп. Однако такие клетки принимают наиболее активное участие в регенерации у пациентов в периоды зрелости и старения, так как их доля возрастает по сравнению с молодыми больными на 71,4 % и в 2,3 раза, соответственно. При этом тетраплоидным гепа-тоцитам свойственны явления клеточной гипертрофии в большей степени у больных старшей возрастной группы.

Гиперплоидные гепатоциты. выявляемые у 50% больных I группы, обнаруживаются у 93,1 % больных II группы и у всех пациентов III возрастной группы. Степень повышения количества таких клеток в паренхиме печени у больных ХГ в периоды зрелости и старения выше, чем тетраплоидных, что указывает на их более активное их участие в регенерации.

У больных ХГ умеренной активности с увеличением возраста в печени повышается доля двуядерных гепатоцнтов. Анализ морфо-метрических данных позволил определить распределение двуядерных гепатоцитов по классам плоидности у больных ХГ в разные возрастные периоды (табл.3).

В печени больных I возрастной группы стимулируются процессы клеточной регенерации: за счет выхода части гепатоцитов в эндо-митоз поддерживается популяция двуядерных клеток. Суммарная доля двуядерных гепатоцитов у больных I группы составляет, по нашим данным, 7,5 %, что соответствует количеству таких клеток в паренхиме печени у здорового человека в этот возрастной период. По данным Б. Н. Кудрявцева с соавт. (1991), в возрастной группе 16-20 лет доля двуядерных диплоидных гепатоцитов составляет 7,1 %, тетраплоид-ных — 0,1 %. Однако у молодых пациентов нами выявлено перераспределение двуядерных клеток печени по степени плоидностн ядер: доля гепатоцитов с диплоидными ядрами — 6,2 %, тетраплоидными — 1,27 %, выявляются двуядерные гиперплоидные гепатоциты, относительное количество которых составляет 0,03 %.

У больных ХГ II группы обнаружено увеличение количества двуядерных диплоидных гепатоцитов на 35,5 %, тетраплоидных — на 89 %, гиперплоидных — в 4,7 раза (табл. 3). Это связано с усилением явлений эндомитоза в регенераторной реакции печени на повреждение, что приводит к активации процесса полиплоидизации и преимущественному накоплению двуядерных клеток более высоких классов плоидности.

Таблица 3

Распределение двуядерных гепатоцитов по плоидности в печени больных ХГ разных возрастных групп, % (М ±т)

Группы Относительное количество гепатоцитов

больных диплоидные тетраплоидные пшерллоидныс

6,2±0,42 1,27±0,16 0,03±0,02

I р1<0,05 Р1 <0,001 Р!<0,001

Рг>0,05 Р2<0,001 Р2<0,001

8,4±0,8 2,4±0,19 0,14±0,04

п Р!<0,05 Рх<0,001 Р!<0,001

Р3Х),05 Р3<0,001 Р3<0,001

7,3±0,69 5,0±0,53 0,8±0,18

III Р2Х),05 Р2<0,001 Р2<0,001

Р3>0,05 Р3<0,001 Р3<0,001

Средняя площадь цитоплазмы двуядерных гспатоцитов всех классов плоидности по сравнению с такими же клетками в печени молодых больных существенно не отличалась (табл.4). Следовательно, в двуядерных гепатоцитах у больных ХГ в этот возрастной период не происходит стимуляции процессов внутриклеточной регенерации.

Таблица 4

Средняя площадь цитоплазмы двуядерных гепатоцитов у больных ХГ разных возрастных групп, мкм2 (М ±т)

Группы Классы плоидности

больных диплоидные тетраплоидные гиперплондные

240,812,8 268,315,3 308,7±17,8

I Р1>0,05 Рх>0,05 Рх>0,05

Р2<0,001 Р2<0,001 Р2<0,05

248,0±3,2 277,3±3,7 343,2±8,9

II Р!>0,05 Р,>0,05 Р1>0,05

Р3<0,05 Р3<0,05 Р3>0,05

272,4±3,7 301,8±4,8 359,0±10,0

III Р2<0,001 Р2<0,001 Р2<0,05

Р3<0,05 Рз<0,05 Рз>0,05

В периоде старения организма развитие ХГ сопровождается активацией регенераторных процессов, которые характеризуются стимуляцией полиплоидизации гепатоцитов. По нашим данным, у больных III возрастной группы существенно не изменяется количество

двуядерных диплоидных гепатоцитов, при этом наблюдается значительное увеличение количества двуядерных гепатоцитов с полиплоидными ядрами, в том числе тетраплоидных — в 3,9 раза, гиперплоид-ных — в 26,7 раз по сравнению с молодыми пациентами (табл. 3). При этом степень повышения количества гиперплоидных гепатоцитов в паренхиме в 6,8 раз выше, чем тетраплоидных, что указывает на их более активное участие в репаративной регенерации печени у больных пожилого возраста. Выявлено достоверное различие данных показателей у больных Ш группы при сравнении с больными II группы. Так, доля тетраплоидных гепатоцитов возрастает в 2,1 раза, гиперплоидных — в 5,7 раза.

В печени больных ХГ в периоде старения стимулируются процессы внутриклеточной регенерации, приводящие к компенсаторной гипертрофии двуядерных гепатоцитов. Так, средняя площадь цитоплазмы двуядерных диплоидных гепатоцитов увеличивается на 13,1%, тетраплоидных — на 12,5 %, гиперплоидных — на 16,3 % по сравнению с такими же клетками у больных I группы (табл. 4).

У пациентов старшей возрастной группы выявляется достоверное увеличение данного показателя для гепатоцитов с диплоидными и тетраплоидными ядрами — на 10 % и 9 %, соответственно, по сравнению с больными II группы. Таким образом, в периоде старения у больных ХГ процессы клеточной гипертрофии более характерны для двуядерных диплоидных и тетраплоидных гепатоцитов.

Анализ регенераторных процессов у больных ХГ умеренной активности в различные возрастные периоды позволил определить особенности реакции двуядерных гепатоцитов разных классов пло-идности на повреждение ткани печени. Так, диплоидные гепатоциты наиболее активно участвуют в репаративной регенерации у больных в периоде зрелости, их доля в популяции двуядерных клеток наиболее высока в этот возрастной период и достоверно больше таковой у молодых пациентов. При этом процессы внутриклеточной регенерации в двуядерных диплоидных гепатоцитах остаются на прежнем уровне у больных средней возрастной группы и преобладают в период старения организма.

Двуядерные тетраплоидные гепатоциты присутствуют в печени 92,8 % больных I группы и у всех пациентов П и Ш в групп. Эти клетки принимают наиболее активное участие в регенерации у пациентов в периоды зрелости и старения, так как их доля повышается по сравнению с молодыми больными на 89 % и в 3,9 раза, соответственно. При этом явления компенсаторной гипертрофии двуядерных тетраплоид-ных гепатоцнтов более выражены в печени больных ХГ в период ста-

рения.

Двуядерные гиперплоидные гспатоциты выявляются у 7,1 % больных I группы, 34,5 % — II группы, 75,9 % — Ш группы. Степень повышения количества таких клеток в паренхиме печени у больных ХГ в периоды зрелости и старения выше, чем тетраплоидных, что указывает на активацию полиплоидизации преимущественно за счет ги-перплоидных гепатоцитов и их активное участие в репаративной регенерации печени.

Таким образом, в печени больных ХГ с увеличением возраста наблюдается снижение процессов клеточного деления, усиление по-липлоидизации и внутриклеточной регенерации гепатоцитов.

Основными механизмами снижения пролиферативных потенций тканей при старении считают накопление клеток в пресинтетическом и премитотическом периодах, удлинение митотического цикла, снижение активности клеточного деления и усиление полиплоидизации (Донцов В. И., 1998, Сазонов С. В., 1999). Изменения врегиенных параметров клеточного цикла могут быть связаны с изменением концентрации регуляторных веществ в межклеточном матриксе. Чувствительность гепатоцитов к рострегулирующим факторам в значительной мере зависит от состояния внеклеточного окружения - клеток соединительной ткани, компонентов основного вещества (Епифанова О. И. и др., 1988; Маянский Д. Н., 1980, 1981; Lowes K.N. et al.,2003). В этой связи представлял интерес поиск механизмов регуляции обнаруженных изменений параметров регенерации гепатоцитов у больных ХГ в условиях возрастной инволюции организма, осуществляемых на уровне клетки и ее микроокружения.

Ведущая роль местного биологического регулятора в системе микроокружения принадлежит тучным клеткам благодаря их способности синтезировать гликозаминогликаны (ГАГ) и гистамин и наличию функциональных связей с другими клетками соединительной ткани (Ястребов А. П. и др., 1988,1997; Юшков Б. Г. и др., 1994; Процен-ко В. А. и др., 1987). Определена зависимость между количеством тучных клеток и активностью пролиферативных процессов в тканях с различной интенсивностью процессов клеточного деления (Сазонов С. В., 1999). Наличие связи ГАГ с регенераторными процессами в печени обнаружено у крыс после ЧГЭ (Цвиренко С. В., 1993), у больных хроническими диффузными заболеваниями печени (Косых А. А., 1992, Сазонов С. В., 1999).

В этой связи представлялось актуальным исследование возрастных особенностей морфо-функцнонального состояния тучных клеток в печени и их значения в репаративной регенерации гепатоци-

тов у больных хроническим активным гепатитом.

При морфологическом исследовании гепатобиоптатов больных всех возрастных групп тучные клетки выявлялись исключительно в соединительной ткани портальных трактов, в непосредственной близости от наиболее активной в плане пролиферативных процессов зоны классической печеночной дольки. Тканевые базофилы, как правило, небольших размеров, количество протеогликанов в них невелико. Однако встречались и достаточно крупные клетки, которые содержали значительное количество кислых ГАГ. Тучные клетки не выходили за пределы портальных трактов и не встречались между клетками печеночных балок. В печени больных ХГ умеренной активности с увеличением возраста наблюдались количественные и качественные изменения в популяции тучных клеток (рис. 1).

В старшей возрастной группе количество тучных клеток в портальных трактах увеличивалось в 4,4 раза (р<0,001) по сравнению с I группой, в 5,5 раза (р<0,001) по сравнению с больными II группы. При этом с клетках снижается содержание кГАГ, увеличивается число более мелких форм лаброцитов.

I группа

II группа

III группа

■Содержание клеток в 1 кв.мм ткани ■Содержание кГАГ в клетке, усл.ед.

усл. ед.

Рис. 1 Морфо-функциональные показатели тучных клеток печени больных разных возрастных групп

Выявленные нами существенные различия регенераторных процессов в печени больных ХГ умеренной активности при старении сопровождались значительной динамикой представительства тучных

клеток в портальных трактах. Результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о значительном увеличении количества тканевых базофилов, повышении их функциональной активности на фоне снижения интенсивности процессов клеточного деления в тканях при индуцированной регенерации и в условиях возрастной инволюции.ор-ганизма (Цвиренко С. В. и др.,1995, Ястребов А. П. и др.,1997, Сазонов С. В., 1999). Полученные нами данные соответствуют представлениям о способности тучных клеток оказывать влияние на интенсивность процессов регенерации клеток через изменение концентрации биологически активных веществ в межклеточном веществе ткани.

Таким образом, одним из важных факторов снижения пролифе-ративной активности в печени больных хроническим активным гепатитом при старении может являться накопление в портальной строме тучных клеток, повышение их функциональной активности.

В настоящее время среди механизмов регуляции процессов регенерации важное значение отводится системе иммуногенеза (Бабаева А. Г., 1990; Труфакин В. А., Шмаков А. К, 1991; Донцов В. И., 1990, 1996; Черешнев В.А. и др., 2002; Koniaris L.G. et al.,2001; Zhang C.P. et al.,2004). Пострезекционное восстановление органов сопровождается увеличением численности лимфоцитов в ткани, усилением морфогене-тической активности лимфоидных клеток (Бабаева А. Г., 1985). При восстановительном процессе в печени реализация указанной активности осуществляется при лимфоцитарно-эпителиальном взаимодействии (Бабаева А. Г. и др., 1998). Осуществление морфогенетической функции связывают с Т-популяцией иммунокомпетентных клеток (Бабаева А. Г., Гиммельфарб Е. И., 1997; Бляхер М. С. и др., 1996).

Известно, что при старении организма в нем снижается общее число Т-лимфоцитов (Phelourat M. А. е.а.,1996, Донцов В. И., 1998), изменяются их свойства (Flaherty D. e.a..,1997, ReaJ.M. e.a..,1996, Engwerda C.R. е.а.,1996, Haynes L. e.a.,1997, Zhou Т. е.а.,1995). Однако нет комплексных работ по изучению морфо-функционального состояния лимфоидных клеток в печени больных хроническим активным гепатитом в разных возрастных группах.

При морфологическом исследовании гепатобиоптатов больных ХГ умеренной активности во всех возрастных группах выявлялась лимфоцитарно-макрофагальная инфильтрация портальной стромы, в части портальных трактов наблюдалось формирование лимфоидных фолликулов, определялось скопление лимфоцитов на месте перипор-тальных и очаговых внутридольковых некрозов гепатоцитов. Лимфо-идные клетки в паренхиме печени также располагались диффузно по

ходу синусоидных капилляров в виде единичных клеток и очаговых скоплений. Скопления лимфоидных клеток определялись и вблизи ге-патоцитов с признаками регенерации: двуядерных и полиплоидных.

При морфометрическом исследовании гепатобиоптатов нами установлены возрастные различия представительства лимфоидных клеток в ткани печени (рис. 2). У больных ХГ умеренной активности при старении выявлено снижение средней объемной доли лимфоидных клеток клеточного инфильтрата портальных трактов у пациентов II и III группы по сравнению с молодыми: на 26,8%(р<0,05) и на 31,6%(р<0,05), соответственно.

Удельное количество лимфоидных клеток в портальной строме уменьшается у больных ХГ П группы на 13,3 % (р>0,05), в III группе на 35,1 % (р<0,05) по сравнению с молодыми пациентами.

При иммуногистохимическом исследовании гепатобиоптатов больных всех возрастных групп большинство лимфоидных клеток, участвующих в образовании инфильтратов в портальных трактах, экс-прессируют СБ45+, СБ45ЯО+, СБ3+, что позволяет идентифицировать их как Т-клетки.

Включение в группу исследования пациентов только с умеренной активностью ХГ создает относительную однородность по степени повреждения ткани и проявлению цитопатических эффектов лимфоцитов в печени больных. Полученные нами данные свидетельствуют об уменьшении инфильтрации печени лимфоидными клетками, относящимися к субпопуляции Т-лимфоцитов, у больных ХГ при старении.

Центральным механизмом возрастного снижения пролифера-тивных потенций тканей человека считают уменьшение пула специализированных Т-лимфоцитов-регуляторов при старении организма (Донцов В. И., 1998). Определено участие лимфоцитов в регуляции репаративной регенерации гепатоцитов, в том числе в условиях возрастной инволюции организма (Бережков Н. В., 1989; Бабаева А. Г. и др., 1998). Установленные нами существенные различия регенераторных процессов в печени больных ХГ при старении и данные об участии лимфоцитов в обеспечении регуляции регенерации указывают на взаимосвязь низкого уровня пролиферативных процессов в печени и уменьшения лимфоидной инфильтрации портальных трактов.

Таким образом, у больных хроническим активным гепатитом в условиях возрастной инволюции организма снижение пролифератив-ной активности гепатоцитов сопровождается накоплением в портальной строме тучных клеток и повышением их функциональной активности. При этом в печени больных при старении наблюдается уменьшением числа лимфоцитов, относящихся к популяции Т-лимфоцитов.

Результаты собственных исследований и анализ литературных данных позволили нам предложить схему, иллюстрирующую возрастные особенности состояния регенераторных процессов в печени больных хроническим активным гепатитом (рис. 3).

Рис. 3. Состояние регенеративных процессов в печени больных хроническим активным гепатитом разных возрастных групп

выводы

1. Процессы репаративной регенерации в печени больных хроническим активным гепатитом имеют возрастные особенности. В печени пациентов всех возрастных групп наблюдаются характерные для гепатоцитов процессы клеточного деления, полиплоидизации, внутриклеточной регенерации. Однако с возрастом существенно изменяется соотношение различных способов репаративной регенерации.

2. В печени больных хроническим активным гепатитом в возрастном периоде развития основную роль в репаративной регенерации печени играют процессы клеточного деления диплоидных гепатоци-тов, что обеспечивает сохранение популяции одноядерных гепатоци-тов разных классов плоидности. Одновременно повреждение вызывает стимуляцию эндомитоза двуядерных гепатоцитов, что сопровождается увеличением числа полиплоидных клеток.

3. У больных хроническим активным гепатитом в периоде зрелости на фоне ослабления процессов клеточного деления обнаружена стимуляция эндомитоза в печени, что приводит к полиплоидизации одноядерных и двуядерных гепатоцитов. В репаративной регенерации активное участие принимают полиплоидные клетки, при этом в большей степени гиперплоидные, чем тетраплоидные. В одноядерных ге-патоцитах стимулируются процессы внутриклеточной регенерации, что сопровождается их компенсаторной гипертрофией.

4. У больных хроническим активным гепатитом в периоде старения организма репаративная регенерация в печени характеризуется снижением активности процессов клеточного деления и значительным усилением эндомитоза. Увеличивается число одноядерных и двуядер-ных полиплоидных гепатоцитов. При этом активация полиплоидиза-ции осуществляется преимущественно за счет гиперплоидных клеток. В одноядерных гепатоцитах стимулируются процессы внутриклеточной регенерации, при этом их интенсивность выше в клетках с диплоидным ядром. В двуядерных гепатоцитах признаки компенсаторной гипертрофии более выражены в клетках с диплоидными и тетраплоид-ными ядрами.

5. В печени больных хроническим активным гепатитом при старении снижение активности процессов клеточного деления гепатоци-

тов сопровождается уменьшением инфильтрации лимфоидными клетками, имеющими иммунофенотип субпопуляции Т-лимфоцитов.

6. На фоне снижения активности процессов клеточного деления-и усиления полиплоидизации гепатоцитов у больных хроническим активным гепатитом при возрастной инволюции определяется значительное увеличение численности тучных клеток в печени и повышение их функциональной активности.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Состояние регенераторных процессов в печени больных хроническим активным гепатитом // В сб.: Прикладные аспекты морфогенеза и регенерации в онтогенезе и эксперименте. — Екатеринбург: Изд-во УрГМА, 1996. — С. 86-90. Соавторы: Н. А. Серов, О. В. Ряв-кина, С. В. Сазонов, А. П. Ястребов.

2. Регенераторные процессы в печени больных хроническим активным гепатитом в период старения организма // В сб.: Актуальные проблемы геронтологии и гериатрии / Под ред. акад. А. П. Ястребова, проф. В. С. Мякотных. — Екатеринбург: Изд-во УрГМА, 1997. — С. 120-122. Соавторы: Н. А. Серов, С. В. Сазонов.

3. Влияние противовирусной терапии на морфо-функциональное состояние печени у больных хроническим активным гепатитом // Вестник Уральской государственной медицинской академии. — Екатеринбург: Изд-во УГМА, 1997. — Вып.5. — С. 131-133. Соавторы: Н. А. Серов, Т. Н. Постникова, С. В. Сазонов.

4. Возрастные особенности регенераторных процессов в печени больных хроническим активным гепатитом (ХАГ) // В сб.: Проблемы и гипотезы (Дайджест) / Под ред. акад. А. П. Ястребова, проф. А. А. Баталова. — Екатеринбург: Изд-во УрГМА, 1998. — №1. С. 39-40.

5. Морфометричсское исследование гепатобиоптатов при хроническом активном гепатите у больных разных возрастных групп // Тез. докл. научн.конф. Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения. - Екатеринбург: Изд-во УГМА, 1998. — С.85. Соавторы: С. В. Сазонов, А. П. Ястребов.

6. Значение полиплоидизации гепатоцитов при хроническом вирусном гепатите у лиц пожилого возраста // Тез. докл. научн. конф. Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения. — Екатеринбург: Изд-во УрГМА, 1999. — С.316—317. Соавтор:

О. А. Шишмарева.

7. Оценка показателей регенераторной активности у больных хроническим вирусным гепатитом (ХГ) при старении // Тез. докл. на-учн.конф. Актуальные вопросы медицины и экологии. — Екатеринбург: Изд-во УГМА, 1999. — С.53. Соавторы: С. В. Сазонов, А. П. Ястребов, Н. А. Серов.

8. Состояние процессов полиплоидизации при хроническом активном гепатите у больных из разных возрастных групп // В сб.: Геронтология и гериатрия (Материалы межобл.научн.-практ.конф.) / Под ред. акад. А. П. Ястребова, проф. В. С. Мякотных. — Екатеринбург: Изд-во УГМА, 1999. — С.47-48. Соавторы: Сазонов СВ., Серов Н. А., Ястребов А. П., Шишмарева О. А.

9. Возрастные изменения лимфоидного компонента воспалительного инфильтрата в печени больных хроническим гепатитом умеренной активности (морфометрическое исследование) // В сб.: Геронтология. Гериатрия. Медицинская помощь ветеранам войн (Материалы межобл. научн.-практ. конф.) / Под ред. акад. А. П. Ястребова, проф. В. С. Мякотных. - Екатеринбург: Изд-во УГМА, 2001. - с.82-83.

10. Исследование морфо-функционального состояния тучных и лимфоидных клеток в печени хроническим гепатитом (ХГ) умеренной активности в условиях возрастной инволюции организма // В сб.: Вопросы медицинской и социальной помощи участникам войн, вооруженных конфликтов, лицам пожилого и старческого возраста (Материалы Всероссийского совещания по вопросам реабилитации участников вооруженных конфликтов, контртеррористических операций) / Под ред. Засл. Врача РФ СИ. Спектра. - Екатеринбург: Изд-во УГМА, 2003. - с.237-239. Соавторы: Ястребов АЛ., Сазонов СВ.

Крохина Наталья Борисовна

ВОЗРАСТНЫЕ ОСОБЕННОСТИ РЕГЕНЕРАТОРНЫХ ПРОЦЕССОВ В ПЕЧЕНИ БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ АКТИВНЫМ ГЕПАТИТОМ

14.00.16 - патологическая физиология АВТОРЕФЕРАТ

ЛР №020452 от 04.03.1997г.

Подписано в печать 26.03.2004г. Формат60х84 1/16 Усл. печ. л. 1.4. Тираж 100 экз. Заказ №_20_. Отпечатано в типографииУГМА, ул. Репина, 3. Тел/факс 231-42-64

4-7761

Оглавление диссертации Крохина, Наталья Борисовна :: 2004 :: Екатеринбург

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. Обзор литературы.

1.1. Современное представление о физиологической и репаративной регенерации тканей.

1.2. Регенерация печени и её регуляция.

1.3. Морфо-функциональное состояние печени при хроническом гепатите.

1.4. Морфо-функциональное состояние печени при старении.

Введение диссертации по теме "Патологическая физиология", Крохина, Наталья Борисовна, автореферат

Актуальность проблемы

В современной гепатологии проблеме хронических вирусных гепатитов уделяется все более пристальное внимание в связи с неуклонным ростом заболеваемости у лиц активного репродуктивного возраста [Лобзин Ю.В., 1999; Шляхтенко Л.И. и соавт., 2000], тенденцией к прогрессирующему течению [Zarski J.P. et al.,1998], нередко с формированием в исходе цирроза и первичного рака печени [Подымова С.Д. и соавт., 1996; Benvegnu L. et al.,1994].

Повреждение клеток печени при хроническом гепатите (ХГ) индуцирует развитие регенераторных процессов в ткани этого органа. Огромный фактический материал, посвященный проблеме репаративной регенерации печени в условиях экстремальных воздействий на организм и при хроническом гепатите, свидетельствует о наличии в ткани печени трех способов регенерации. В той или иной мере активируются процессы клеточной (митоз, эндомитоз) и внутриклеточной регенерации (клеточная гипертрофия) [Кудрявцев Б.Н. и соавт., 1982; Гейвандова Н.И.,1988; Эсауленко Е.В., Погромская М.Н.,1990; Цвиренко С.В.,1993; Димов П.Г.,1990; Werling К. et al.,2000; Vielhaer V. et al.,2001; Hai N.I. et al., 2002; Song Z. et al., 2004], коррелирующие с некрозо-воспалительной активностью ХГ [Серов Н.А. и соавт., 1995; Jin Y.M. et al.,2001].

В то же время глобальное явление XX века - увеличение продолжительности жизни человека породило значительный интерес к изучению изменения реактивности организма и его регулирующих систем при старении [Ванюшин Б.Ф.,Бердышев Г.Д.,1977; Кишов М.Г.,Грабовский B.C., 1995; Титов С.А.,Крутько В.Н.,1996; Донцов В.И.,1998; Ястребов А.П.,Сазонов С.В.,1997,1998,1999; Сазонов С.В.,1999; Мещанинов В.Н.,1999; Спектр С.И., Ястребов А.П. и др., 2003). В частности, перспективной с точки зрения клинической патофизиологии явилась проблема репаративной регенерации печени при хроническом гепатите в условиях возрастной инволюции организма.

Несмотря на активное изучение регенераторных процессов в печени при старении, опубликованные данные нередко противоречивы. Большинство современных работ свидетельствуют о снижении синтеза ДНК и митотической активности гепатоцитов при старении [Mendenhall C.L. et al.,1993; Tsukamoto I. et al.,1993; Орличенко JT.С. и соавт.,1994; Мозжухина Т.Г. и соавт.,1994; Taguchi T.,Ohashi М.,1996; Higami Y. et al.,1997]. Другие исследователи с увеличением возраста выявили активацию пролиферативных процессов в печени [Кудрявцев Б.Н. и соавт.,1991], стимуляцию активности эндомитоза и нарастание полиплоидизации печеночных клеток [Саркисов Д.С. и соавт.,1990; Северин М.В.,1993; Урываева И.В.,Делоне Г.В.,1995; Кодолова Г.И.,1997; Костромина О.В.с соавт.,1999; Солтыс Т.В., 2002; Basso A. et а1.,1996]. Показано повышение роли полиплоидизации гепатоцитов в репаративной регенерации печени при ХГ у пациентов с увеличением возраста [Кудрявцев Б.Н. и соавт.,1993].

В литературе не освещены вопросы участия гепатоцитов разных классов плоидности в восстановительном росте печени при ХГ в различные возрастные периоды. В настоящее время нет единого мнения в вопросе о соотношении основных способов регенерации в репаративной реакции печени на повреждение при ее хронических диффузных заболеваниях в различные возрастные периоды. Недостаточно определена роль отдельных регуляторных механизмов в обеспечении пролиферативных процессов в печени в этих условиях.

Все выше изложенное послужило основанием для определения цели и основных задач настоящего исследования.

Цель: Изучить возрастные особенности регенераторных процессов в печени больных хроническим активным гепатитом.

Задачи:

1. Оценить состояние пролиферативных процессов в печени больных хроническим активным гепатитом в возрастном периоде развития.

Научная новизна.

В работе впервые дана качественная и количественная оценка состояния регенераторных процессов в печени больных хроническим гепатитом (ХГ) умеренной активности в различные возрастные периоды. Выполнена сравнительная характеристика процессов клеточного деления, полиплоидизации и клеточной гипертрофии у больных хроническим активным гепатитом в периоде развития, зрелости, старения.

Определена доля участия одноядерных и двуядерных гепатоцитов разных классов плоидности в репаративной реакции на повреждение при ХГ умеренной активности в условиях возрастной инволюции организма.

Установлены возрастные особенности представительства лимфоидных клеток в печени больных ХГ умеренной активности, их значение в развитии репаративных процессов при старении.

Получены новые данные о значительном увеличении численности и стимуляции функциональной активности тучных клеток в печени больных хроническим активным гепатитом на фоне снижения пролиферативных процессов и усилении полиплоидизации гепатоцитов.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Проведена комплексная оценка процессов клеточного деления, полиплоидизации и внутриклеточной регенерации в печени больных хроническим активным гепатитом в разные возрастные периоды. Полученные данные расширяют возможности оценки состояния регенераторных процессов в печени при гистологической диагностике ХГ у пациентов различных возрастных групп. Установлены новые закономерности представительства тучных и лимфоидных клеток в печени больных ХГ умеренной активности, определено их участие в репаративной регенерации гепатоцитов в условиях возрастной инволюции. Проведенные исследования дают теоретическое обоснование возможностей направленной коррекции возрастных изменений регенераторных процессов при ХГ через изменение морфо-функционального состояния тучных и лимфоидных клеток.

Внедрение результатов исследования.

Результаты исследования используются при обучении студентов в курсах "Патологическая физиология" и "Гистология человека" на соответствующих кафедрах Уральской государственной медицинской академии (ректор -Заслуженный деятель науки РФ, член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор А.П.Ястребов).

Отработанные в процессе выполнения диссертации морфометрические методы исследования используются в научных работах морфологического отдела ЦНИЛ УрГМА (зав. ЦНИЛ - д.м.н.,профессор Г.Я.Липатов). Результаты проведенного исследования успешно внедрены в комплексное обследование больных с хроническими диффузными заболеваниями печени в Городском гастроэнтерологическом центре ГБ№40 (зав.центром - к.м.н. И.Б.Хлынов), в Областном гепатологическом центре ОКБ№1 (зав.центром - к.м.н. Е.Н.Бессонова), в общественно-медицинском центре "Профессор" (зав. центром - д.м.н.,проф. Т.Н.Постникова). По результатам этих работ сделано 6 публикаций.

Апробация работы и публикации.

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на 53 научной конференции молодых ученых и студентов УрГМА "Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения" (Екатеринбург, 1998), на научно-практической конференции ЦНИЛ УрГМА (Екатеринбург, 1999,2000, 2003), на Межобластной научно-практической конференции "Геронтология. Гериатрия. Медицинская помощь ветеранам войн" (Екатеринбург, 2001).

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, двух глав собственных исследований, общего заключения, выводов и списка литературы, включающего 137 отечественных и 62 иностранных источников. Работа изложена на 135 страницах, иллюстрирована 22 таблицами, 8 рисунками.

Заключение диссертационного исследования на тему "Возрастные особенности регенераторных процессов в печени больных хроническим активным гепатитом"

ВЫВОДЫ

2. В печени больных хроническим активным гепатитом в возрастном периоде развития основную роль в репаративной регенерации печени играют процессы клеточного деления диплоидных гепатоцитов, что обеспечивает сохранение популяции одноядерных гепатоцитов разных классов плоидности. Одновременно повреждение вызывает стимуляцию эндомитоза двуядерных гепатоцитов, что сопровождается увеличением числа полиплоидных клеток.

3. У больных хроническим активным гепатитом в периоде зрелости на фоне ослабления процессов клеточного деления обнаружена стимуляция эндомитоза в паренхиме печени, что приводит к полиплоидизации одноядерных и двуядерных гепатоцитов. В репаративной регенерации активное участие принимают полиплоидные клетки, при этом в большей степени гиперплоидные, чем тетраплоидные. В одноядерных гепатоцитах стимулируются процессы внутриклеточной регенерации, что сопровождается их компенсаторной гипертрофией.

4. У больных хроническим активным гепатитом в периоде старения организма репаративная регенерация в печени характеризуется снижением активности процессов клеточного деления и усилением эндомитоза. Увеличивается число одноядерных и двуядерных полиплоидных гепатоцитов. При этом активация полиплоидизации осуществляется преимущественно за счет гиперплоидных клеток. В одноядерных гепатоцитах стимулируются процессы внутриклеточной регенерации, их интенсивность выше в клетках с диплоидным ядром. В двуядерных гепатоцитах признаки компенсаторной гипертрофии более выражены в клетках с диплоидными и тетраплоидными ядрами.

5. В печени больных хроническим активным гепатитом при старении снижение активности процессов клеточного деления гепатоцитов сопровождается уменьшением инфильтрации портальных трактов лимфоидными клетками, имеющими иммунофенотип популяции Т-лимфоцитов.

6. На фоне снижения активности процессов клеточного деления и усиления полиплоидизации гепатоцитов у больных хроническим активным гепатитом при возрастной инволюции определяется значительное увеличение численности тучных клеток в печени и повышение их функциональной активности.

Считаю своим приятным долгом выразить глубокую благодарность моему научному руководителю - ректору УГМА, члену-корреспонденту РАМН, доктору медицинских наук, профессору

ЯСТРЕБОВУ АНАТОЛИЮ ПЕТРОВИЧУ за оказанное доверие и постоянное внимание к моей работе.

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Развитие патологического процесса в печени при ХГ приводит к повреждению и гибели клеток паренхимы. Активность ХГ определяет объем и выраженность повреждения ткани органа. В ответ на повреждение в печени индуцируются процессы репаративной регенерации, интенсивность которых коррелирует со степенью деструктивных изменений ткани (степенью активности ХГ) [Серов Н.А., Сазонов С.В.,1995; Song Z. et а1.,2004]. При этом развитие патологического процесса при ХГ зависит не только от степени его активности, но и в значительной мере от возраста больного. Сложностью оценки регенераторных процессов в печени является значительная гетерогенность гепатоцитов, связанная с различным уровнем плоидности их ядер, с наличием одноядерных и двуядерных клеток. При этом известно, что участие гепатоцитов в регенераторном ответе на повреждение при экстремальных воздействиях на организм в значительной мере зависит от класса плоидности [Цвиренко С.В., 1993]. Оценка морфо-функциональных показателей гепатоцитов у больных ХГ умеренной активности позволила определить возрастные особенности регенераторных процессов в печени.

У больных ХГ умеренной активности в печени с увеличением возраста снижается суммарная доля одноядерных гепатоцитов. Наблюдается перераспределение клеток по степени плоидности их ядер, что является следствием изменения активности регенераторных процессов, происходящих в ответ на повреждение в ткани этого органа.

Анализ морфометрических данных позволил выявить распределение одноядерных гепатоцитов разных классов плоидности в паренхиме печени у больных ХГ умеренной активности в различные возрастные периоды. В печени больных периоде развития стимулируются процессы клеточной регенерации, за счет чего поддерживается популяция одноядерных диплоидных гепатоцитов и появляются клетки с тетраплоидным и гиперплоидным ядром.

По нашим данным, относительное количество диплоидных гепатоцитов составляет 87,2%, а полиплоидных клеток в сумме - 5,3%, что сопоставимо с уровнем плоидности гепатоцитов в условиях физиологической регенерации. Так, по данным Б.Н. Кудрявцева с соавт.(1991), доля диплоидных клеток в паренхиме печени здорового человека в конце периода развития составляет 90%, полиплоидных гепатоцитов не превышает 5,5%.

У пациентов в периоде зрелости обнаружено снижение доли диплоидных гепатоцитов на 9,1% и увеличение количества тетраплоидных гепатоцитов на 71,4%, клеток с гиперплоидным ядром на 240% по сравнению с молодыми пациентами.

Это связано с ослаблением процессов клеточного деления и с усилением явлений эндомитоза, что приводит к накоплению в паренхиме печени полиплоидных клеток. При этом степень повышения доли гиперплоидных гепатоцитов в 3,4 раза выше, чем тетраплоидных, что свидетельствует о более активном участии этих клеток в репаративной регенерации печени у больных в этот возрастной период.

Наблюдается достоверное увеличение средней площади цитоплазмы гепатоцитов всех классов плоидности по сравнению с такими же клетками в печени молодых больных, что свидетельствует о стимуляции процессов внутриклеточной регенерации. Площадь цитоплазмы диплоидных гепатоцитов увеличивается на 7,7%, тетраплоидных - на 5,5%, гиперплоидных - на 9,8%, следовательно, явления клеточной гипертрофии в большей степени свойственны гиперплоидным и диплоидным гепатоцитам.

В периоде старения организма развитие хронического активного гепатита сопровождается активацией регенераторных процессов, которые характеризуются ослаблением митотической активности гепатоцитов и значительным усилением эндомитоза, в результате чего в печени увеличивается количество полиплоидных клеток. По нашим данным, у больных пожилого возраста уменьшается число диплоидных гепатоцитов на 20,3%, возрастает доля тетраплоидных клеток в 2,3 раза и гиперплоидных гепатоцитов в 14,7 раз по сравнению с молодыми пациентами

Степень повышения доли гиперплоидных клеток в 6,4 раза выше, чем тетраплоидных, что указывает на их более активное участие в восстановлении ткани печени у больных ХГ в этот возрастной период. Кроме того, выявлено достоверное различие данных показателей у пожилых пациентов при сравнении с больными средневозрастной группы. Так, доля диплоидных гепатоцитов снижается на 12,6%, увеличивается количество тетраплоидных клеток на 36,9%, гиперплоидных гепатоцитов в 4,3 раза. Степень прироста количества последних в 8,9 раз выше, чем тетраплоидных, что свидетельствует об активациии процесса полиплоидизации преимущественно за счет гиперплоидных клеток и, в меньшей мере, тетраплоидных гепатоцитов у больных в периоде старения организма.

В печени больных III группы стимулируются процессы внутриклеточной регенерации, приводящие к компенсаторной гипертрофии одноядерных гепатоцитов. Наблюдается увеличение средней площади цитоплазмы гепатоцитов всех классов плоидности, в том числе диплоидных клеток на 19,5%, тетраплоидных - на 15%, гиперплоидных - на 18,5% по сравнению с показателями первой возрастной группы . При сравнении средних размеров гепатоцитов у больных пожилого и зрелого возраста площадь цитоплазмы диплоидных клеток увеличивается на 11%, тетраплоидных - на 9%, гиперплоидных - на 8%. Таким образом, при старении организма у больных ХГ умеренной активности в печени явления клеточной гипертрофии более характерны для гепатоцитов с диплоидным ядром.

Анализ регенераторных процессов у больных ХГ в различные возрастные периоды позволил определить особенности реакции одноядерных гепатоцитов разных классов плопдпости на повреждение. Так, диплоидные гепатоциты участвуют в репаративной регенерации у больных в периоде развития, их доля в популяции одноядерных клеток соответствует физиологическому уровню. При старении организма в результате снижения митотической активности в паренхиме печени уменьшается относительное количество этих клеток, в них стимулируются процессы внутриклеточной регенерации. Диплоидные гепатоциты подвергаются клеточной гипертрофии наиболее активно по сравнению с полиплоидными клетками у больных старших возрастных групп. По данным Н.И.Гейвандовой (1988), при ХГ активируются процессы внутриклеточной регенерации, причем увеличение среднего объема гепатоцитов коррелирует с повышением степени активности гепатита. Явления компенсаторной гипертрофии гепатоцитов обнаружены также при репаративной регенерации печени у лабораторных животных при старении [Бережков Н.В.,1989].

Тетраплоидные гепатоциты присутствовали в печени больных всех возрастных групп. Однако такие клетки принимают наиболее активное участие в регенерации у пациентов средней и старшей возрастных групп, так как их доля возрастает по сравнению с молодыми больными на 71,4% и в 2,3 раза, соответственно. При этом тетраплоидным гепатоцитам свойственны явления клеточной гипертрофии, однако у больных III группы степень увеличения средних размеров таких клеток в 2,7 раза больше, чем у пациентов II группы. Чередование гипертрофии гепатоцитов и их структур с пролиферацией отмечают при экспериментальном хроническом гепатите [Иванова H.JL, Жданова Т.Ф.,1990] и у больных ХГ и циррозом [Ягода А.В., Гейвандова Н.И.,1990; Hai N.I. et al.,2002],

Гиперплоидные гепатоциты, выявляемые у 50% больных молодого возраста, обнаруживаются у 93,1% больных II группы и у всех пациентов III возрастной группы. Степень повышения количества таких клеток в паренхиме печени у больных ХГ умеренной активности в зрелом и пожилом возрасте выше, чем тетраплоидных, что указывает на активацию полиплоидизации преимущественно за счет гиперплоидных гепатоцитов и активное их участие в восстановлении печеночной ткани. При ХГ, по мнению ряда авторов, имеется существенное повышение доли полиплоидных гепатоцитов по сравнению с нормой [Altmann H.-W. et al.,1966; Гейвандова Н.И, 1988], однако отмечаются значительные колебания числа одноядерных тетраплоидных и октаплоидных гепатоцитов у отдельных пациентов [Кудрявцев Б.Н. с соавт., 1982].

У больных ХГ умеренной активности с увеличением возраста в печени повышается доля двуядерных гепатоцитов. Наблюдается перераспределение клеток по степени плоидности их ядер, что является следствием изменения активности регенераторных процессов, происходящих в ответ на повреждение.

Анализ морфометрических данных позволил определить распределение двуядерных гепатоцитов по классам плоидности у больных ХГ в разные возрастные периоды. В печени больных в периоде развития стимулируются процессы клеточной регенерации: за счет выхода части гепатоцитов в эндомитоз поддерживается популяция двуядерных клеток. Суммарная доля двуядерных гепатоцитов у больных I группы составляет, по нашим данным, 7,5%, что соответствует количеству таких клеток в паренхиме печени у здорового человека в этот возрастной период. По данным Б.Н.Кудрявцева с соавт.(1991), в возрастной группе 16-20 лет доля двуядерных диплоидных гепатоцитов составляет 7,1%, тетраплоидных - 0,1%. Однако у молодых пациентов нами выявлено перераспределение двуядерных клеток печени по степени плоидности ядер: доля гепатоцитов с диплоидными ядрами - 6,2%, тетраплоидными - 1,27%, выявляются двуядерные гиперплоидные гепатоциты, относительное количество которых составляет 0,03%.

У больных ХГ в периоде зрелости обнаружено увеличение количества двуядерных диплоидных гепатоцитов на 35,5%, тетраплоидных - на 89%, гиперплоидных - в 4,7 раза.

Это связано с усилением явлений эндомитоза, что приводит к активации процесса полиплоидизации и преимущественному накоплению двуядерных клеток более высоких классов плоидности.

Средняя площадь цитоплазмы двуядерных гепатоцитов всех классов плоидности по сравнению с такими же клетками в печени молодых больных существенно не отличается. Следовательно, в двуядерных гепатоцитах у больных ХГ в этот возрастной период не происходит стимуляции процессов внутриклеточной регенерации.

В периоде старения организма развитие ХГ сопровождается активацией регенераторных процессов, которые характеризуются стимуляцией клеточной регенерациии гепатоцитов преимущественно по пути выхода клеток в эндомитоз, в результате чего в печени больных увеличивается количество полиплоидных клеток. По нашим данным, у больных III группы существенно не изменяется количество двуядерных диплоидных гепатоцитов, при этом наблюдается значительное увеличение количества двуядерных гепатоцитов с полиплоидными ядрами, в том числе тетраплоидных - в 3,9 раза, гиперплоидных - в 26,7 раз по сравнению с молодыми пациентами. При этом степень повышения количества гиперплоидных гепатоцитов в паренхиме в 6,7 раз выше, чем тетраплоидных, что указывает на их более активное участие в репаративной регенерации печени у больных старшей возрастной группы.

Кроме того, выявлено достоверное различие данных показателей у пациентов II группы при сравнении с больными II группы. Так, доля тетраплоидных гепатоцитов возрастает в 2,1 раза, гиперплоидных - в 5,7 раза.

В печени больных ХГ в пожилом возрасте стимулируются процессы внутриклеточной регенерации, приводящие к компенсаторной гипертрофии двуядерных гепатоцитов. Так, средняя площадь цитоплазмы двуядерных диплоидных гепатоцитов увеличивается на 13,1%, тетраплоидных - на 12,5%, гиперплоидных - на 16,3% по сравнению с такими же клетками у больных молодого возраста.

У пожилых пациентов выявляется достоверное увеличение данного показателя для гепатоцитов с диплоидными и тетраплоидными ядрами - на 10% и 9%, соответственно, по сравнению с больными средней возрастной группы. Таким образом, в период старения у больных ХГ процессы клеточной гипертрофии более характерны для двуядерных диплоидных и тетраплоидных гепатоцитов.

Анализ регенераторных процессов у больных ХГ в различные возрастные периоды позволил определить особенности реакции двуядерных гепатоцитов разных классов плоидности на повреждение. Так, диплоидные гепатоциты наиболее активно участвуют в репаративной регенерации у больных в периоде зрелости, их доля в популяции двуядерных клеток наиболее высока в этот возрастной период и достоверно больше таковой у молодых пациентов. При этом процессы внутриклеточной регенерации в двуядерных диплоидных гепатоцитах остаются на прежнем уровне, так как средние размеры таких клеток существенно не отличаются у больных I и II групп. В период старения организма в диплоидных гепатоцитах преобладают процессы клеточной гипертрофии, так как у больных III группы степень увеличения площади цитоплазмы в 4 раза выше, чем у больных II группы. Это свидетельствует о значительной роли процессов внутриклеточной регенерации в восстановлении ткани печени при ХГ в периоде старения. По данным Б.Н.Кудрявцева с соавт.(1982), двуядерные диплоидные гепатоциты наиболее активно участвуют в репаративной регенерации при ХГ: в печени больных их доля возрастает по мере усиления тяжести заболевания, достигая 40% в клеточной популяции. Однако установлено, что динамика двуядерных клеток в популяции гепатоцитов в условиях экстремальных воздействий на организм в значительной мере зависит от возраста. Так, доля двуядерных гепатоцитов после кровопотери возрастает у зрелых лабораторных животных и снижается у старых [Бережков Н.В.,1989].

Двуядерные тетраплоидные гепатоциты присутствуют в печени 92,8% больных I группы и у всех пациентов II и III возрастных групп. Эти клетки принимают наиболее активное участие в регенерации у пациентов в периоде зрелости и старения, так как их доля повышается по сравнению с молодыми больными на 89% и в 3,9 раза, соответственно. При этом явления компенсаторной гипертрофии двуядерных тетраплоидных гепатоцитов несущественны в зрелом возрасте и значительно выражены в печени больных ХГ в период старения. Так, у пожилых пациентов степень увеличения площади цитоплазмы таких клеток в 3,8 раза больше, чем у больных средней возрастной группы. При ХГ увеличение доли двуядерных клеток расценивается большинством авторов как показатель стимуляции регенераторных процессов [Блюгер А.Ф., Карташова О.Я.,1977; Безродных А.А. с соавт., 1987; Шиленок И.Г. с соавт., 1999]. Однако, по мнению Б.Н.Кудрявцева с соавт.(1982), число двуядерных гепатоцитов с тетраплоидными ядрами у больных гепатитом увеличивается незначительно по сравнению с нормой и не отражает тяжести заболевания. При этом установлено, что значительная стимуляция полиплоидизации в печени человека при старении приводит к накоплению двуядерных гепатоцитов с тетраплоидными ядрами [Кудрявцев Б.Н. с соавт., 1991]. Именно эти клетки, по нашим данным, активно участвуют в восстановлении ткани печени у больных ХГ в условиях возрастной инволюции организма.

Двуядерные гиперплоидные гепатоциты выявляются у 7,1% больных I группы, 34,5% - II группы, 75,9% - III группы. Степень повышения количества таких клеток в паренхиме печени у больных ХГ в зрелом и пожилом возрасте выше, чем тетраплоидных, что указывает на активацию полиплоидизации преимущественно за счет гиперплоидных гепатоцитов и их активное участие в репаративной регенерации печени. Двуядерные клетки с гиперплоидными ядрами подвергаются компенсаторной гипертрофии у больных старшей возрастной группы, что указывает на активацию процессов внутриклеточной регенерации в гепатоцитах такого класса плоидности в периоде старения организма.

Установлено, что в печени человека после 50 лет полиплоидия играет заметную роль в физиологической регенерации ткани этого органа. Максимальная плоидность двуядерных гепатоцитов старых людей достигает уровня 8сх2 [Кудрявцев Б.Н. с соавт., 1991]. По нашим данным, двуядерные клетки с гиперплоидными ядрами выявляются преимущественно у больных пожилого возраста и играют ведущую роль в репаративной регенерации печени при ХГ в условиях возрастной инволюции.

Таким образом, проведенные исследования позволили выявить существенные различия репаративной регенерации печени у больных хроническим активным гепатитом при старении. Достоверное уменьшение доли диплоидных клеток в паренхиме печени свидетельствует о снижении активности процессов клеточного деления. Стимуляция клеточной регенерации характеризуется активацией эндомитоза, что проявляется увеличением количества полиплоидных гепатоцитов. При этом степень прироста количества одноядерных и двуядерных гепатоцитов с гиперплоидным ядром выше, чем с тетраплоидным. Следовательно, в печени больных ХГ при старении активация процессов полиплоидизации осуществляется преимущественно за счет клеток с гиперплоидными ядрами и, в меньшей степени, тетраплоидных гепатоцитов.

У больных ХГ при старении выявлено увеличение средних размеров цитоплазмы печеночных клеток, характерное для гепатоцитов всех классов плоидности, свидетельствующее о стимуляции процессов внутриклеточной регенерации. При этом в популяции одноядерных и двуядерных гепатоцитов явления компенсаторной гипертрофии более характерны для клеток с диплоидным ядром и тетраплоидным ядром.

Анализ возрастных особенностей репаративной регенерации печени на клинической модели ХГ должен учитывать однородность групп больных по ряду клинических признаков. Сравниваемые нами группы однородны по степени биохимической и гистологической активности ХГ. У большинства пациентов до проведения пункционной биопсии не проводилась патогенетическая терапия. Однако пациенты имели различную давность заболевания на момент исследования. Для подтверждения возрастных изменений параметров регенерации гепатоцитов дополнительно проведен сравнительный анализ распределения клеток печени по степени плоидности в группах больных (п = 8) с одинаковой длительностью ХГ (в среднем 4,5 года).

Однофакторный дисперсионный анализ показал достоверность отличий относительного количества гепатоцитов всех классов плоидности (кроме 2п2п) в сравниваемых группах. Сравнение частот распределения гепатоцитов по классам плоидности непараметрическим методом Хи-квадрат выявило статистически значимое различие между I и III, а также II и III группами больных. Следовательно, в использованной нами клинической модели различная давность течения ХГ у ряда пациентов не оказывает существенного влияния на различия регенераторных процессов в исследованных группах. Эти различия, по нашему мнению, имеют возрастные особенности. Снижение процессов клеточного деления, усиление полиплоидизации и внутриклеточной регенерации гепатоцитов наиболее выражены у больных ХГ в условиях возрастной инволюции организма.

Известно, что при старении организма инволютивные изменения в печени характеризуются уменьшением числа клеток в результате повышенной их элиминации, в частности, по механизму апоптоза [Бережков Н.В.,1989;

Мозжухина Т.Г. с соавт.,1994; Higami Y. et al., 1997], снижением пролиферативной активности в ткани [Kropacova K.,Misurova Е.,1992], уменьшением массы и объема органа, нарастанием явлений атрофии. Следовательно, развитие патологического процесса в печени больных хроническим активным гепатитом при старении происходит на фоне уже имеющихся изменений морфо-функционального состояния ткани и требует индукции компенсаторных процессов особой интенсивности.

В условиях возрастной инволюции большинство авторов отмечает снижение митотической активности гепатоцитов при индуцированной регенерации [Mendenliall C.L. с соавт.,1993; Liu Y. с соавт.,1996], часть исследователей указывают на возрастное снижение синтеза ДНК в клетках печени [Орличенко J1.C. с соавт.,1994; Isliigami А. с соавт.,1994]. Замедление с возрастом скорости восстановления веса печени у лабораторных животных после ЧГЭ связывают не только с уменьшением пролиферативного пула, но и с постоянным удлинением состояния покоя между двумя последовательными митотическими циклами [Урываева И.В.,1979], со снижением числа гепатоцитов в первой волне пролиферации и с увеличением продолжительности пререпликативного периода клеточного цикла гепатоцитов [Полищук A.M., 1983].

При изучении возрастных особенностей пролиферативных процессов в печени старых лабораторных животных методом ДНК-цитометрии не обнаружено достоверного снижения числа ДНК-синтезирующих гепатоцитов, получено увеличение доли полиплоидных клеток, приводящее к увеличению пролиферативного клеточного пула. Показано изменение соотношения между различными способами регенерации в печени у старых животных [Сазонов С.В.,1999].

Основным механизмом полиплоидизации гепатоцитов является эндомитоз, характеризующийся накоплением клеток в премитотическом периоде клеточного цикла. Известно, что накопление клеток в пресинтетическом и премитотическом периодах, удлинение митотического цикла, снижение активности клеточного деления и усиление полиплоидизации обусловлено торможением прохождения клеток через регуляторные периоды митотического цикла [Сазонов С.В.,1999]. Изменения временных параметров митотического цикла могут быть связаны с изменением концентрации регуляторных веществ в межклеточном матриксе. Чувствительность гепатоцитов к рострегулирующим факторам в значительной мере зависит от состояния внеклеточного окружения - клеток соединительной ткани, компонентов основного вещества и т.п. [Епифанова О.И. с соавт., 1988; Маянский Д.Н., 1980,1981; Lowes K.N. et а1.,2003]. В этой связи представлял интерес поиск механизмов регуляции обнаруженных изменений параметров регенерации ткани печени больных ХГ в условиях возрастной инволюции организма, осуществляемых на уровне клетки и ее микроокружения.

Наиболее изученной является роль микроокружения в регуляции пролиферативных процессов при экстремальных воздействиях на организм в красном костном мозгу. Определена роль гликопротеиновых конъюгатов в формировании гемопоэзиндуцирующего микроокружения, а также их место в перестройке кроветворения в условиях действия экстремальных факторов [Ястребов А.П. с соавт., 1988; Юшков Б.Г. с соавт.,1994]. Рассматривая протеогликаны как регуляторный фактор, считается, что изменение их концентрации в костном мозге связано прежде всего с популяцией тучных клеток, содержащих протеогликаны в своих гранулах [Проценко В.А. и соавт., 1987; Ястребов А.П. с соавт., 1997].

В печени обнаружена способность липоцитов (клеток Ито) синтезировать сульфатированные ГАГи, идентичные протеогликанам внеклеточного матрикса [Schafer S. et al., 1987]. Гликозаминогликаны выявлены также в секреторных гранулах синусоидальных pit-клеток, относящихся к APUD-системе организма

Мироджов Г.К., Павлов В.Л.,1991]. При этом изменение концентрации кислых ГАГ в основном веществе ткани связывают с морфо-функциональным состоянием популяции тучных клеток, которые выявляются в рыхлой соединительной ткани портальных трактов [Ястребов А.П., Сазонов С.В.,1995].

Обнаружено, что тучные клетки с помощью биологически активных веществ, содержащихся в их гранулах, принимают участие в регуляции регенераторных процессов в тканях с различной интенсивностью физиологической регенерации. При этом скорость клеточного обновления пропорциональна числу тучных клеток в органе, а последние, как правило, обнаруживаются около генеративных зон, где происходит наиболее активное клеточное размножение. В цитоплазме тучных клеток цитохимическим методом обнаружены вещества, идентифицированные как кислые ГАГ [Сазонов С.В.,1999].

В портальной строме печени больных с ее хроническими диффузными заболеваниями на фоне угнетения процессов клеточного деления гепатоцитов обнаружено увеличение числа тучных клеток, пропорциональное степени тяжести повреждения паренхимы. При этом возрастает число дегранулированных клеток, что приводит к снижению содержания кГАГ в цитоплазме таких клеток [Сазонов С.В.,1999].

В этой связи представляло значительный интерес исследование морфо-функцнонального состояния тучных клеток в печени и их значения в репаративной регенерации гепатоцитов у больных ХГ умеренной активности в разные возрастные периоды.

При морфологическом исследовании гепатобиоптатов больных всех возрастных групп тучные клетки выявлялись исключительно в соединительной ткани портальных трактов, в непосредственной близости от наиболее активной в плане пролиферативных процессов зоны классической печеночной дольки. Тканевые базофилы, как правило, небольших размеров, количество протеогликанов в них невелико. Однако встречались и достаточно крупные клетки, которые содержали значительное количество кГАГ. Тучные клетки не выходили за пределы портальных трактов и не встречались между клетками печеночных балок. В печени больных с увеличением возраста наблюдались количественные и качественные изменения в популяции тучных клеток. В старшей возрастной группе количество тучных клеток в портальных трактах увеличивалось в 4,4 раза (р<0,001) по сравнению с I группой, в 5,5 раза (р<0,001) по сравлению с больными II группы. При этом в клетках снижается содержание кГАГ, увеличивается число более мелких форм лаброцитов.

Таким образом, в печени больных ХГ умеренной активности из старшей возрастной группы отмечается стимуляция полиплоидизации гепатоцитов, активируются процессы внутриклеточной регенерации, приводящие к компенсаторной гипертрофии печеночных клеток, а процессы клеточного деления тормозятся. Одновременно в соединительной ткани портальных трактов нарастает число тучных клеток и увеличивается их функциональная активность.

Ранее установлена роль тучных клеток в торможении пролиферативных процессов в миелоидной ткани в ответ на кровопотерю, при торможении репаративной регенерации эпителия тонкой кишки при действии холода на организм, в динамике развития индуцированного регенераторного ответа на ЧГЭ в печени крыс [Ястребов А.П. с соавт., 1997;Сазонов С.В., 1999]. Наличие связи ГАГ с процессами адаптивного роста в печени были обнаружены у крыс после удаления 2/3 массы органа [Цвиренко С.В.,1993]. По данным А.А.Косых (1992), обязательным условием репаративной регенерации печени при хроническом гепатите является увеличение количества и функциональной активности тучных клеток.

В условиях возрастной инволюции организма выявлено изменение морфо-функционального состояния тучных клеток в миелоидной ткани, тимусе, в печени у лабораторных животных на фоне снижения активности процессов клеточного деления [Сазонов С.В.,1999].

Выявленные нами существенные различия регенераторных процессов в печени больных ХГ при старении сопровождались значительной динамикой представительства тучных клеток в ткани этого органа. Результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о значительном увеличении количества тканевых базофилов, повышении их функциональной активности на фоне снижения интенсивности процессов клеточного деления в тканях при индуцированной регенерации и в условиях возрастной инволюции организма. Полученные нами данные соответствуют представлениям о способности тучных клеток оказывать влияние на интенсивность процессов регенерации клеток через изменение концентрации биологически активных веществ в межклеточном веществе ткани. Таким образом, одним из наиболее важных факторов снижения пролиферативной активности в печени больных хроническим активным гепатитом при старении может являться накопление в портальной строме тучных клеток, повышение их функциональной активности.

В настоящее время среди механизмов регуляции процессов регенерации важное значение отводится системе иммуногенеза [Бабаева А.Г., 1990; Труфакин В.А., Шмаков А.Н., 1991; Донцов В.И.,1990,1996; Gremion С. et al.,2004; Zhang С.Р. et al.,2004]. Пострезекционное восстановление органов сопровождается усилением морфогенетической активности лимфоцитов, которая, как считают, играет ключевую роль в обеспечении пролиферативной фазы восстановительного роста оперированных органов [Бабаева А.Г.,1985]. Реализация указанной активности при восстановительном процессе в печени осуществляется, предположительно, при лимфоцитарно-эпителиальном взаимодействии, морфологическим эквивалентом которого являются тесные септированные контакты и увеличение общего числа лимфоцитов в этом органе

Бабаева А.Г. с еоавт.,1998]. Осуществление морфогенетической функции связывают с Т-популяцией иммунокомпетентных клеток [Бабаева А.Г., Гиммельфарб Е.И., 1997], в частности, эта способность определена у Т-хелперов [Бляхер М.С. с соавт., 1996].

При морфологическом исследовании в печени больных ХГ выявляется лимфоцитарно-макрофагальная инфильтрация портальных трактов и паренхимы на месте некротизированных гепатоцитов. Скопления лимфоидных клеток определяются и вблизи гепатоцитов с признаками регенерации: двуядерных и полиплоидных. Нужно отметить, что интенсивность лимфоцитарной инфильтрации не одинакова в разных отделах печеночной дольки - в зонах различной регенераторной активности. Максимальная инфильтрация наблюдалась в портальных трактах и I (перипортальной) зоне ацинуса и была наименее выражена в III (перивенулярной) зоне. Известно, что при ХГ вирусной этиологии поражаются гепатоциты преимущественно перипортальной зоны печеночного ацинуса [Султанова Л.И.,1990]. При этом наиболее выраженная пролиферативная активность наблюдается в гепатоцитах, окружающих зоны некроза [Аруин Л.И.,1990; Vielhauer V. et al.,2001; Jin Y.M. et al., 2001]. В гепатоцитах III зоны печеночного ацинуса отмечают низкий уровень синтетической и митотической активности. Имеются данные о том, что 5-7% гепатоцитов, расположенных в этой зоне, не реагируют на пролиферативный стимул даже при самой интенсивной пролиферации [Wright N., Alson М.,1984].

Известно, что при старении организма в нем снижается общее число Т-лимфоцитов [Phelourat М.А. et al.,1996] и клеток, относящихся к субпопуляции Т-хелперов [Flaherty D et al.,1997; Rea J.M. et al.,1996], изменяются их свойства [Engwerda C.R. et al.,1996; Haynes L. et al.,1997; Zhou T. et al.,1995]. Согласно положениям новой лимфоидной теории старения, ведущим механизмом возрастной инволюции соматических тканей является снижение их клеточного самообновления в результате изменений в системе лимфоидной регуляции их пролиферации. Сущностью изменений клеток-регуляторов пролиферации в старости является увеличение доли ингибиторов и абсолютное уменьшение общего числа клеток-регуляторов, что приводит к снижению скорости продвижения соматических клеток из фазы G1 в S, формируя G1/S блок в тканях старых животных [Донцов В.И.,1998].

У больных ХГ В в пожилом возрасте наблюдается неспецифическая задержка лимфоцитов в печени, что расценивается как фактор возрастной иммунодепрессии [Постовит В.А., 1988].

В этой связи представляет интерес исследование морфо-функцнонального состояния лпмфондных клеток в печени больных хроническим активным гепатитом в разных возрастных группах.

При морфологическом исследовании гепатобиоптатов больных ХГ умеренной активности во всех возрастных группах выявлялась лимфоцитарно-макрофагальная инфильтрация портальной стромы, в части портальных трактов наблюдалось формирование лимфоидных фолликулов, определялось скопление лимфоцитов на месте перипортальных и очаговых внутридольковых некрозов гепатоцитов. Лимфоидные клетки в паренхиме печени также располагались диффузно по ходу синусоидных капилляров в виде единичных клеток, так называемых "цепочек" и очаговых скоплений.

При морфометрическом исследовании гепатобиоптатов нами установлены возрастные различия представительства лимфоидных клеток в печени больных. Выявлено снижение средней объемной доли лимфоидных клеток клеточного инфильтрата портальных трактов у пациентов средней и старшей возрастной групп по сравнению с молодыми: на 26,8%(р<0,05) и 31,6%(р<0,05), соответственно.

Удельное количество лимфоидных клеток в портальной строме уменьшается у пациентов II группы на 13,3%(р>0,05), в III группе на

35,1%(р<0,05) по сравнению с молодыми пациентами.

Присутствие лимфоцитов в ткани печени и данные о наличии лимфоцитарно-эпителиальных контактов имеют многостороннюю оценку. Основным патогенетическим механизмом вирусного поражения печени является имунный цитолиз гепатоцитов, который осуществляется лимфоидными клетками, составляющими наибольшую долю в составе воспалительного инфильтрата при умеренной активности ХГ [Серов В.В., Лапши К.,1989]. Проникновение в цитоплазму гепатоцитов путем периполеза и эмпериполеза больших гранулосодержащих лимфоцитов, обладающих естественной киллерной активностью, обнаружено при старении у 24-месячных интактных крыс и особенно у крыс через 10 часов после кровопотери [Бережков Н.В.,1989].

В то же время и восстановительные процессы в печени после ее резекции также сопровождаются увеличением в ее паренхиме числа лимфоцитов в период подготовки гепатоцитов к делению и во время деления. Лимфоциты в эти сроки вступают в тесное соприкосновение с гепатоцитами, образуя септированные контакты с микротонеллями [Бабаева А.Г. с соавт.,1998].

Включение в группу исследования пациентов только с умеренной степенью активности ХГ создало относительную однородность по степени повреждения ткани и проявлению цитопатических эффектов лимфоцитов в печени больных. Полученные нами данные свидетельствуют об уменьшении представительства лимфоцитов в клеточном инфильтрате портальных трактов у пациентов в периодах зрелости и старения. Лимфоидные клетки экспрессируют CD45+, CD45RO+, CD3+, что позволяет отнести их к субпопуляции Т-лимфоцитов.

Установленные нами существенные возрастные различия регенераторных процессов в печени больных ХГ умеренной активности при старении организма, а также данные об участии лимфоцитов в регуляции регенерации тканей указывают на взаимосвязь низкого уровня пролиферативных процессов в печени и уменьшения лимфоидной инфильтрации стромы портальных трактов.

Необходимо отметить, что снижение уровня митотической активности гепатоцитов связанно именно с уменьшением численности лимфоидных клеток в ткани печени, так как морфогенетические свойства лимфоцитов не изменяются при старении организма [Сазонов С.В.,1999].

Таким образом, у больных хроническим активным гепатитом в условиях возрастной инволюции организма снижение пролиферативной активности гепатоцитов сопровождается накоплением в портальной строме тучных клеток и повышением их функциональной активности. При этом в печени больных хроническим активным гепатитом при старении наблюдается уменьшение числа лимфоидных клеток, относящихся к субпопуляции Т-лимфоцитов.

Результаты собственных исследований и анализ литературных данных позволил нам предложть схему, демонстрирующую возрастные особенности регенераторных процессов в печени больных хроническим активным гепатитом (рис. 8).

Паренхима печени больных в возрастном периоде развития

Паренхима печени больных в периоде зрелости

Паренхима печени больных в периоде старения

Усиление эндомитоза

Активация внутриклеточной регенерации

Увеличение плоидности одноядерных гепатоцитов за счет ТГ и ГГ

Увеличение размеров одноядерных гепатоцитов

Стимуляция клеточного деления Сохранение популяции одноядерных гепатоцитов

Увеличение плоидности двуядерных гепатоцитов

Стимуляция эндомитоза

Повышение морфо-функциональной активности тучных клеток в печени

-О

Уменыпение относительного количества ДГ

Торможение клеточного деления о

Увеличение плоидности одноядерных и двуядерных гепатоцигов (преимущественно за счет ГГ)

Усиление эндомитоза

•

Активация внутриклеточной регенерации Увеличение размеров одноядерных и двуядерных гепатоцитов 1

Снижение интенсивности пролиферативиых процессов в печени больных I

Снижение численности Т-лимфоцитов в печени

Условные обозначения: ДГ — диплоидные гепатоциты ТГ — тетраплоидные гепатоциты ГГ — гпперплоидные гепатоциты

8. Состояние регенеративных процессов в печени больных хроническим активным гепатитом разных возрастных гр>пп

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2004 года, Крохина, Наталья Борисовна

1. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия / Рук-во. - М.: Медицина, 1990.-384 с.

2. Агеносова А.П. Особенности суточного ритма ядерно-цитоплазматических отношений и объема ядер гепатоцитов некоторых млекопитающих при различной физической нагрузке // Бюл. эксперим. биол. и медицины. 1974. - Т.77, №.2. - С.80-84.

3. Аруин Л.И. Морфологическая классификация хронического гепатита // Арх. патологии. 1995. - №3. - С.3-5.

4. Аруин Л.И., Капуллер Л.Л., Исаков В.Л. Морфологическая диагностика болезней желудка и кишечника. М.: «Триада-Х», 1998. - 496 с.

5. Бабаева А.Г. О полноте восстановления внутренних органов у позвоночных после резекции // Онтогенез. 1970.- № 2. - С.139-146.

6. Бабаева А.Г. Регенерация и система иммуногенеза. М.: Медицина, 1985. -255с.

7. Бабаева А.Г. Клеточные и гуморальные факторы иммунитета как регуляторы восстановительного морфогенеза // Онтогенез. 1989. - Т.20. -№5. - С.450-453.

8. Бабаева А.Г. Лимфоциты как регуляторы пролиферации и дифференцировки клеток нелимфоидных органов // Вестник РАМН. -1990.- Вып.2. С.43-46.

9. Бабаева А.Г., Зотикова Е.А. Иммунология процессов адаптивного роста. -М.: Наука, 1987. -208 с.

10. Бабаева А.Г., Гиммельфарб Е.И. Цитогенетические свойства лимфоидных клеток селезенки мышей в ранние сроки после двухсторонней нефрэктомии // Бюлл. эксперим. биол. и медицины. 1997. - Т.123, №1. -С. 109-111.

11. Бабаева А.Г., Шахламов В.А., Алтухова В.И., Гиммельфарб Е.И.

12. Морфологические эквиваленты лимфоцитарно-эпителиального взаимодействия при восстановительных процессах в почке и печени // Арх. патологии. 1998, №5. - С.58-61.

13. Бакаев В.В. Влияние кофеина на клеточную пролиферацию в регенерирующей печени крыс при облучении быстрыми нейтронами // Радиобиология. 1980. - Т.20, вып.2. - С.256-259.

14. Балаж А., Блажек И. Эндогенные ингибиторы клеточной пролиферации: Пер. с англ. М.:Мир,1982. - 302с.

15. Бекетова Т.П., Секамова С.М. Синусоидальные клетки печени и их роль в патологических процессах// Арх. патологии. 1983. - № 10. - С.83-88.

16. Беляева И.Д., ИвлеваТ.С. Двуядерные клетки печени крыс при репаративной регенерации // Бюл. экспер. биологии. 1979. - № 4. -С.347-349.

17. Бережков Н.В. Структурные основы старения клеток печени и возрастные особенности их реактивности // Арх. патологии. 1989. - Т.51, №11. -С.40-47.

18. Блок Ю.Е. Результаты культивирования in vitro пункционных биопсий печени // В кн.: Актуальные вопросы гастроэнтерологии. М., 1972. -Вып. 5,- С.314-320.

19. Блюгер А.Ф., Карташова О .Я. Репаративные процессы при некоторых заболеваниях печени//Успехи гепатологии. 1977.-Т.6,- С.120-132.

20. Бляхер М.С., Гуторова Н.М., Федорова И.М. и др. Численность субпопуляций лимфоцитов в селезенке и уровень пролиферации кроветворной ткани у мышей при оперативных вмешательствах // Бюлл. эксперим. биол. и медицины. 1996. - Т.121, №3. - С. 301-304.

21. Бродский В.Я. Полиплоидия в миокарде. Компенсаторный резерв сердца // Бюлл. эксперим. биол. и медицины. 1995. - Т.119, № 5. - С. 454-460.

22. Бродский В.Я., Урываева И.В. Клеточная полиплоидия. Пролиферация и дифференцировка. М.: Наука, 1981. - 259с.

23. Бычков С.М. Кузьмина С.А. Протеогликаны и клетки // Бюлл. эксперим. биол. и медицины. 1996. - Т.121, № 2. - С.124-128.

24. Ванюшин Б.Ф., Бердышев Г.Д. Молекулярно-генетические механизмы старения. М.: Медицина, 1977. - 296 с.

25. Гейвандова Н.И. Клиническое значение показателей регенерационной способности печени и обмена коллагена при хронических гепатитах и циррозах: Автореф.дис.канд. мед. наук. М.,1988. - 22 с. - (ЦНИЛ Четвертого гл. Упр. при МЗ СССР).

26. Дамянов Б.Д. Активное агрессивное коллагенообразование в печени и его роль в процессе хронизации болезней печени // В кн.: Успехи гепатологии. Рига, 1982. - Вып.Ю. - С.128-141.

27. Донцов В.И. Влияние Т-лимфоцитов на пролиферацию клеток слюнных желез крыс и мышей под действием изопротеренолом // Бюл. эксперим. биол. и медицины. 1985. - N24. - С.82-87.

28. Донцов В.И. Регуляция лимфоцитами клеточной пролиферации -альтернатива теории «противоопухолевого надзора»? // Иммунология. -1989.-№.5.-С.94-96.

29. Донцов В.И. Иммунология постнаталыюго развития. М.: Наука, 1990. -152 с.

30. Донцов В.И. Регуляция лимфоцитами клеточного роста соматическихтканей и новая иммунная теория старения // Профилактика старения. -1998. Вып.1. - С.1-14.

31. Донцов В.И., Крутько В.Н., Подколзин А.А. Старение: механизмы и пути преодоления. М., 1997.

32. Дрозд Т.Н., Бекетова Т.Н., Узянова B.JI. Клинико-морфологическая характеристика заболеваний печени, протекающих с синдромом неконъюгированной гипербилирубинемии // Арх. патологии. 1984. -Вып. 2. - С.36-43.

33. Епифанова О.И., Терских В.В., Полуновский В.А. Покоящиеся клетки. Свойства и функции в организме. М.: Наука, 1983. - 180 с.

34. Епифанова О.И., Полуновский В.А., Терских В.В. Регуляция размножения клеток в процессе специализации, старения и неопластической трансформации. М.:ВИНИТИ, 1988. - 100 с. - (Итоги науки и техники. Сер. Общие проблемы физико-химической биологии; Т.11).

35. Завадская Е.Э. Цитологические механизмы репаративного роста печени в условиях ее хронического повреждения и частичной гепатэктомии: Автореф. дис.канд.биол.наук. Ленинград, 1989. - 22 с. - (Ин-т цитологии АН СССР).

36. Зуфаров К.А. Клеточные механизмы старения внутренних органов // В кн.: Клеточные механизмы приспособительных процессов. Ташкент, 1984.- С.3-7.

37. Иванова Н.А., Жданова Т.Ф. Кинетика процесса регенерации при экспериментальном хроническом гепатите // Регенерация, адаптация, гомеостаз: Сб. научн.тр. / Горьк. мед. ин-т им. С.М.Кирова; Под ред. Б.П.Солопаева. Горький, 1990. - С.37-43.

38. Канунго М. Биохимия старения. М.: Мир, 1982. - 296 с.

39. Карташова О.Я. Регенерация гепатоцитов при заболеваниях человека // В сб.: Сравнительные аспекты изучения регенерации и клеточной пролиферации. М., 1985. - 4.1. - С.119-121.

40. Касымов И.Ю., Закирходжаев Ш.Я., Ташпулатов Х.А., Нурмухамедова Р.А. Лазерно-проточная цитометрия в диагностике хронических гепатитов различной этиологии // Тер. архив. 1992. - Т.64, №2. - С.22-24.

41. Кириллов О.И. Процессы клеточного обновления и роста в условиях стресса. М.: Наука, 1977. - 117 с.

42. Кишов М.Г.,Грабовский B.C. Функциональная характеристика лейкоцитов при старении человека // Иммунология. 1996. - N4. - С.4-10.

43. Кодолова Г.И., Костромина О.В., Кабонина О.И. Влияние экстремальных факторов на течение репаративных процессов в печени // В кн.: Вопросы экспер. физиологии. Екатеринбург: УрО РАН, 1997. - С. 187-190.

44. Комплексное изучение биоаминов/ Под ред. Д.С.Гордон. Информационный бюллетень. Вып.1. - Чебоксары, 1990. - 16 с.

45. Котовский Е.Ф. Морфо-функциональные закономерности действия перегрузок и гипоксических газовых сред на организм: Автореф. дис.докт. мед .наук. М., 1972. - 38 с.

46. Косых А.А. Соединительная ткань печеии в норме, при хроническом гепатите и циррозе в условиях регенерации (морфофункц. исслед.): Автореф. дис.докт. мед. наук. Москва, 1992. - 32 с. - (Рос.ун-т дружбынародов).

47. Кудрявцев Б.Н., Кудрявцева М.В., Завадская Е.Э. и др. Полиплоидия в печени человека в норме и при заболевании гепатитом // Цитология. -1982. Т.24, N4. - С.436-443.

48. Кудрявцев Б.Н., Кудрявцева М.В., Сакута Г.А. и др. Кинетика клеточной популяции паренхимы печени человека в разные периоды его жизни // Цитология. 1991. - Т.ЗЗ, №8. - С.96-109.

49. Кудрявцев Б.Н., Кудрявцева М.В., Сакута Г.А. и др. Исследование полиплоидизации гепатоцитов при некоторых хронических заболеваниях печени у человека // Цитология. 1993. - Т.35, №5. - С.70-83.

50. Ли С.Е. Пролиферативная активность гепатоцитов в разное время суток в условиях продолжительной гипокинезии // Бюл. эксперим. биол. и медицины. 1988. - Т.54, №11. - С.610-611.

51. Лиознер Л.Д., Бабаева А.Г., Маркелова И.В. Регенерационные процессы и их изучение в СССР. М.: Изд-во МГУ, 1990. - 106с.

52. Лобзин Ю.В. Вирусные гепатиты. Спб.: ИКФ «Фоллиант», 1999. - 104 с.

53. Логинов А.С., Аруин Л.И. Клиническая морфология печени. М.: Медицина, 1985. -240 с.

54. Макеев О.Г. Роль гуморальных факторов в регуляции кроветворения при экстремальных воздействиях на организм // В кн.: Очерки экспериментальной патофизиологии / Под ред. А.П.Ястребова. -Екатеринбург: Изд-во УрГМА, 1999. С.48-67.

55. Маленков А.Г. Регуляция деления клеток, межклеточное взаимодействие, кейлоны //Кейлоны. М., 1982. - С.6-9.

56. Маянская Н.Н., Щербаков В.И., Панин JI.E. Изменение лизосомалыюго аппарата клеток печени в процессе репаративной регенерации после частичной гепатэктомии // Цитология. 1977. - Т.19, № 10. - С. 1189-1193.

57. МаянскийД.Н. Роль клеток соединительной ткани в процессах регенерации // Современные проблемы регенерации. Йошкар-Ола: Марийск. гос. ун-т, 1980. - С. 114-123.

58. Маянский Д.И. Клетка Купфера и система мононуклеарных фагоцитов. -Новосибирск: Наука, 1981. 169с.

59. Маянский Д.Н. Роль макрофагов в репаративных процессах // Механизмы патологических реакций / Под ред. Е.Д.Гольдберга. Томск, 1981. - С.56-62.

60. Мироджов Г.К., Павлов B.JI. Синусоидальные клетки печени: природа, функциональная характеристика и кооперативная взаимосвязь // Арх. патологии. 1991. - № 4. - С. 72-76.

61. Неустроев Г.В. Кейлоны (анализ основных положений кейлоновой гипотезы) // Успехи современной биологии. 1985. - Т.99, вып.З. - С.350-357.

62. Общая патология человека: Рук-во для врачей / Под ред. А.И.Струкова, В.В.Серова, Д.С.Саркисова. В 2т. Т.2. - 2-е изд. - М.: Медицина, 1990. -416с.

63. Павлов А.В. Характеристика клеточного состава печени крыс и кроликов в ходе реперативной регенерации после некоторых экстремальных воздействий // Регуляция и функционирование биологич. систем. М.,1980. С.92-94.

64. Пышкин С.А., Коваленко B.J1., Димов П.Г. Морфологичекие варианты хронического активного гепатита с различным эффектом хирургической стимуляции регенерации печени // Врачебное дело. 1990. - №12. - С.58-61.

65. Подымова С.Д. Болезни печени. 2-е изд. - М.: Медицина, 1993.- 544 с.

66. Подымова С.Д., Буеверов О.А. Гепатит С: современные подходы к диагностике и лечению // Русс. мед. журнал. 1996. - Т.З, №1. - С.4-8.

67. Полищук A.M. Особенности пролиферации гепатоцитов в растущей и регенерирующей печени // Успехи совр. биол. 1983. - Т.З, №6. - С.451-456.

68. Постовит В.А. Возрастные особенности клиники вирусного гепатита В // В сб.: Вирусный гепатит В /Ленингр. сан-гигиен, мед. ин-т; Под ред. А.Ф.Подлевского. Л., 1988. - С.84-87.

69. Проценко В.А., Шпак С.И., Доценко С.М. Тканевые базофилы и базофильные гранулоциты крови. М.: Медицина, 1987. - 128 с.

70. Райхлин Н.Т., Петров С.В. Основные этапы иммуногистохимической диагностики опухолей человека // Арх. патологии. 1997. - №4. - С. 14-19.

71. Родионов В.М., Кузмичева Н.А., Поспелова А.В. Химические факторы, регулирующие деление клеток в организме // Вопр. мед. химии. 1981. -Т.27, №3. - С.290-300.

72. Романова Л.К. Регуляция восстановительных процессов. М.: Изд-во МГУ, 1984.- 175 с.

73. Романов Ю.А., Кетлинский С.А., Антохин А.И., Окулов В.Б. Кейлоны и регуляция деления клеток. М.: Медицина, 1984. - 207с.

74. Романчиков Ю.М. Факторы роста, вторичные мессенджеры и онкогены // Успехи соврем, биол. 1991. - T.l 11, №1. - С. 19-33.

75. Рябинина З.А., Бенюш В.А. Полиплоидная гипертрофия клеток впроцессах роста и восстановления. М.: Медицина, 1973. - 207с.

76. Сазонов С.В. Состояние регенераторных процессов в почке при воздействии холода на организм: Автореф. дис.канд. мед. наук. -Челябинск, 1990. 20 с. -(Свердловскиий мед.ин-т).

77. Сазонов С.В. Особенности развития клеточной регенерации в печени // Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения: Тез. докл. научн. конф. Екатеринбург: Изд-во УрГМА, 1995.-С.241.

78. Сазонов С.В. Особенности состояния пролиферативных процессов в условиях возрастной инволюции организма: Автореф. дисс.докт. мед. наук. Челябинск, 1999. - с.ЗЗ. - (УрГМА).

79. Саркисов Д.С. Регенерация и ее клиническое значение. М.: Медицина, 1970. - 168с.

80. Саркисов Д.С. Очерки по структурным основам гомеостаза. М.: Медицина, 1977. - 351 с.

81. Саркисов Д.С., Аруин Л.И., Туманов В.П. Морфология компенсаторно-приспособительных процессов; Под ред. В.В.Серова. (Итоги науки и техники. Сер. патологическая анатомия; Т. 4). - М.: ВИНИТИ, 1983.-135с.

82. Северин М.В.,Юшков Б.Г., Ястребов А.П. Регенерация тканей при экстремальных воздействиях на организм. Екатеринбург: Изд-во УрГМА, 1993.- 186 с.

83. Серов В.В. Морфологическая верификация хронических вирусных и алкогольного гепатитов // Росс. журн. гастроэнтерол.,гепатол. и колопроктологии. 1998. - №5. - С.26-29.

84. Серов В.В., Лапиш К. Морфологическая диагностика заболеваний печени. М.: Медицина, 1989, - 336 с.

85. Серов Н.А., Сазонов С.В., Максимова Э.А. и др. Морфо-функциональные критерии дифференциальной диагностики хронических гепатитов и компенсированных циррозов печени // Вестник УГМА. Екатеринбург: Изд-во УрГМА. - 1995, вып.1. - С. 183-185.

86. Сидорова В.Ф. Постнатальный рост и восстановление внутренних органов у позвоночных. М.: Наука, 1969. - 188с.

87. Сидорова В.Ф. Возраст и восстановительная способность органов у млекопитающих. М.: Медицина, 1976. - 198с.

88. Солтыс Т.В. Компенсаторно-приспособительные эндоэкологические реакции паренхимы печени в процессе формирования хозяино-паразитарных отношений при описторхозе на различных этапах онтогенеза: Автореф. дис. канд. биол. Наук. Сургут, 2002. - с.22.

89. Состояние временной организации системы репродукции клеток в некоторых тканях крыс в условиях гипокинезии / Ю.А.Романов,Е.А. Коваленко, С.С Филлипова и др.//Космич.биология и авиакосмич. медицина. 1978. - Т. 12, №1. - С.52-57.

90. Струков А.И., Серов В.В. Патологическая анатомия: учебник 4-е изд., стереотип. - М.: Медицина, 1995. - 688с.

91. Ступина А.С. Структурные изменения клеток и тканей в процессе старения организма // Рук-во по геронтологии. М.: Медицина, 1978. -С. 143-163.

92. Ступина А.С., Литошенко А.Я., Межиборская Н.А. и др. Изменения митохондрий при старении // Вестник АМН СССР. 1984. - №3. - С.36-40.

93. Ступина А.С.,Межиборская Н.А., Квитницкая-Рыжова Т.Ю. и др. Ультраструктурные проявления адаптации при старении // Вестник АМН СССР. 1986. - №10. - С.25-30.

94. Султанова Л.И. Морфологические показатели печени при хроническом токсическом гепатите и его медикаментозной коррекции: Автореф.дис. канд. биол. наук. Ташкент, 1990. - 16 с.- (Ташк. гос. мед. ин-т).

95. Титов С.А., Крутько В.Н. Современные представления о механизмах старения//Физиология человека. 1996. - Т. 22, №2. - С. 118-123.

96. Тодрия Т.В. Возрастные особенности формирования кроветворного микроокружения стромальными предшественниками из костного мозга тимэктомированных мышей // Бюлл.эксперим. биол. и медицины. 1998. -Т. 125, №4. - С.457-460.

97. Труфакин В.А., Шмаков А.Н. Иммунная система и ее регуляторная рольв процессах пролиферации и дифференцировки в организме // Вестник АМН СССР. 1991. - Вып.12. - С.23-28.

98. УрываеваИ.В. Рост и дифференцировка в системе структурно-функциональной единицы печени // Цитологические механизмы гистогенеза. -М., 1979.

99. Фактор В.М., УрываеваИ.В. Полиплоидизация гепатоцитов мышей при многократных воздействиях СС14 // Бюл. экспер. биологии. 1980. - №11. С. 614-616.

100. Фролькис В.В. Старение, нейрогуморальные механизмы. Киев: Наукова думка, 1981.

101. Фролькис В.В. Старение и увеличение продолжительности жизни. JI.: Наука, 1988.-239 с.

102. Хансон К.П. Исследования действия ионизирующей радиации на биосинтез ДНК в изолированных митохондриях интактной и регенерирующей печени крысы //Радиобиология. 1974. - Т. 14, вып.З. -С.395-398.

103. Хмельницкий O.K., Ступина А.С. Функциональная морфология эндокринной системы при атеросклерозе и старении. JL: Медицина, 1989.-248 с.

104. Хохлов А.Н. Пролиферация и старение. Общие проблемы физико-химической биологии (Итоги науки и техники ВИНИТИ АН СССР). М., 1988. - 174 с.

105. ЦвиренкоС.В. О связи пластических и энергетических процессов при повышенной регенерации ткани: Автореф. дис.канд. мед. наук. -Челябинск, 1979. 26 с. - (Свердловский мед. ин-т).

106. ЦвиренкоС.В. Состояние регенераторных процессов тканей в условиях воздействия на организм экстремальных факторов: Дис.д-ра мед. наук. -Челябинск, 1993. 435 с.

107. Черешнев В. А., Юшков Б.Г., Климин В.Г., Лебедева Е.В. Иммунофизиология. Екатеринбург: УрОРАН, 2002. - с.257.

108. ИГаравара А.А. Особенности гемопоэза в условиях действия низкой температуры на организм: Автореф. дис.канд. мед. наук. Челябинск, 1990. - 19 с. - (Свердловский мед.ин-т).

109. Шехтер А.Б., Серов В.В. Воспаление, адаптивная регенерация и дисре генерация (анализ межклеточных взаимодействий) // Архив патологии. 1991. - Т.53, №7. - С.7-14.

110. ШиленокИ.Г. с соавт. Способ стимуляции регенерации печеночной ткани. Патент РФ №97107229. -1997.

111. Шляхтенко Л.И., Мукомолов СЛ., Левакова И.А. и соавт. Вирусные гепатиты сочетанной этиологии, новаые задачи по контролю за этими инфекциями // Рос. жур. гастроэнтерол., гепатол. и колопроктологии. -2000.-№3.-С.28-31.

112. Шубич М.Г. Метод элективной окраски кислых сульфатированных мукополисахаридов основным коричневым / Бюлл. экспер. биологии. -1961. Т.51, №2.-С. 116-119.

113. Шубич М.Г., Могильная Г.М. Гликопротеины и протеогликаны. Принципы их гистохимического анализа // Арх. анатомии. 1979. - Т.77,вып.8. С. 92-99.

114. Юшков Б.Г., Попов Г.К., Северин М.В., Ястребов А.П. Гликопротеиды и гемопоэз. Екатеринбург: Изд. УрГМА, 1994. 127 с.

115. Ягода А.В. Молекулярно-клеточные аспекты патогенеза, клиники и лечения хронического гепатита и цирроза печени: Автореф. дис. д-ра мед. наук. М., 1994. 50 с. - (Моск. мед. акад. им И.М.Сеченова).

116. Ястребов А.П. Некоторые вопросы регуляции гемопоэза в экстремальных условиях // В кн.: Патология дыхания, крови и регулирующих систем организма и принципы коррекции нарушений. Ижевск, 1989. - С. 125-126.

117. Ястребов А.П., Юшков Б.Г., Большаков В.Н. Регуляция гемопоэза при воздействии на организм экстремальных факторов. Свердловск: УрО АН СССР, 1988. -152 с.

118. Ястребов А.П., Сазонов С.В. Роль тучных клеток в регуляции процессов физиологической клеточной регенерации // Вестник Уральскойгосударственной медицинской академии. Екатеринбург: Изд-во УрГМА.- 1995. Вып. 1.-С. 42-47.

119. Ястребов А.П., Сазонов С.В. Возрастные особенности состояния пролиферативных процессов в миелоидной ткани // В сб.: Вопросы экспериментальной физиологии. Екатеринбург: Изд-во УрО РАН, 1997.- С.158-163.

120. Ястребов А.П., Цвиренко С.В., Сазонов С.В. Тучные клетки, протеогликаны и индуцированный гемопоэз // Вестник Уральской государственной медицинской академии. Екатеринбург:Изд-во УрГМА,1997. - Вып.5. - С.28-33.

121. Ястребов А.П., Сазонов С.В.Возрастные особенности морфогенетической функции лимфоцитов // Вестник Уральской государственной медицинской академии. Екатеринбург: Изд-во УрГМА , 1998. - Вып.7. -С.115-117.

122. Altmann H.-W., Loeschke К., Schenk К. Uber das Karyogramm der inenschlichen Leber unter normalen und pathologischen Bedingungen // Virchows Arch. pathol.Anat. 1966. - Bd 341. - S.85-101.

123. Baker A.L. Hepatotrophic factors. Basic concepts and clinical implications // Acta med. scand. -1985. Vol.218, Supl. № 703. - P.201-208.

124. Basso A., Rossolini G., Piantanelli L. Determination of the optimal conditions to study DNA syntesis in cultures of mouse hepatocytes// Boll. Soc. Ital. Biol. Sper. 1996. - Vol.72, №3-4. - P.71-77.

125. Benvegnu L., Fattovich G., Noventa F. et al. Concurrent hepatitis В and С virus infection and risk of hepatocellular carcinoma in cirrosis // Cancer. -1994. Vol.74, №9. - P.2442-2448.

126. Bianchi L. Necroinflaminatory liver disease // Seminars in liver disease. -1986. Vol.6. -№3. - P. 185-198.

127. Chamuleau R.A., Bosman D.K. Liver regeneration // Hepatogastroenterology. -1988. Vol.36, №6. - P.309-312.

128. Chedid A., Sung C.C., Lepe M.R. et al. Expression of novel protein by regenerating hepatocytes and peripheral blood lymphocytes. // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2001, Nov. - Vol. 8, №6. - P.1292-1294.

129. Chung Y.H., Kim J.A., Song B.C. et al. Expression of transforming growth factor-alpha inRNA in livers of patients with chronic viral hepatitis and hepatocellular carcinoma // Cancer. 2000, Sep. - Vol.89, №5. - P.977-82.

130. Cotran R.S., Kumar V., Collins T. Robbins Pathologic Basis of Disease:6-th ed.- 1999.-P.854.

131. Cross S.A., Ewen S.W., Rost F.W. A study of methods available for cytochemical localization of histamine by fluorescence induced with ophthalaldehyde or acetaldehyde // Histochem. J. 1971. - Vol.3, №6. -P.l 136-1141.

132. Dalu A., Cronin G.M., Lyn-Cook B.D. et al. Age-related differences in TGF-alpha and protooncogenes expression in rat liver after a low dose of carbon tetrachloride // J.Biochem.Toxicol. 1995, Oct. - Vol.10, №5. - P.259-264.

133. Dalu A., Warbritton A., Bucci T.J. et al. Age-related susceptibility to chlordecone-potentiated carbon tetrachloride hepatotoxicity and lethality is due to hepatic quiescence // Pediatries. 1995, Aug. - Vol.38, №2. - P.140-148.

134. Desmet V.J., GerberM., Hoofnagle J.H. et al.Classification of chronichepatitis: Diagnosis, grading and staging // Hepatology. 1994. - №19. -P.1513-1520.

135. Desser-Wiest L. Autosynchronisation of rat liver cells with endogenous corticosterone after partial hepatectomy // Cell and Tissue Kinet. 1975. - Vol. 8, №1. - P. 1-9.

136. Engwerda C.R., FoxB.S., Handwerger B.S. Cytokine production by T lymphocytes from young and aged mice // J.Immunol. 1996. - Vol. 156(10).-P.3621-3630.

137. Fausto N., Mead J. Regulation of liver growth: protooncogenes and transforming growth factors // Lab. Invest. 1989. - Vol.60, N1. - P.4-13.

138. Flaherty D., Wagner C., Gross C. Aging and lymphocyte subsets in the spleen and peripheral blood of the Sprague-Dawley rat // Immunopharmacol. -1997. -Vol. 19, №2.-P. 185-195.

139. Fleig W.E. Liver specific growth factors // Scand. J.Gastroenterol.Supp. -1988. Vol.151. -P.31-36.

140. Fujimoto J. Gene therapy for liver cirrosis. // J.Gastroenterol. Hepatol.-2000,Mar. Suppl 15. - P.d33-6.

141. Gremion C., Crabscheid В., Wolk B. et al. Cytotoxic T lymphocyte derived from patients with cronic hepatitis С virus infection kill by stander cells via Fas-Fash interaction // J. Viral. 2004, Feb. - Vol.78, № 4. - P. 2152-7.

142. Hai N.I., Lee Y.S., Choi H. et al. PCNA expression and electron microscopic study of acinus-forming hepatocytes in chronic hepatitis В // Korean J. Intern. Med. -2002, Jun. Vol. 17, №2.-P. 100-106.

143. Haynes L., Lipton P.J., Swain S.L. Age-related changes in CD4 cells receptor transgenic mice // Mech. Ageing Dev. 1997. - Vol.93, №1-3. - P.95-105.

144. Higami Y., Shimokawa I., Okimoto T. et al. Effect of aging and dietaly restriction on hepatocyte proliferation and death in male F344 rats // Cell Tissue Res. 1997. - Vol.288, №1. - P.69-77.

145. Holmes G.E., Bernstein C., Bernstein H. Oxidative and other DNA damaged asthe basis of aging / A review // Mutation Res. 1992. - Vol.275, №3-6. -P.305.

146. Isliigami A., Roth G.S. Age-related changes in DNA syntesis stimulated by epinephrine and isoproterenol in primary cultured rat hepatocytes // J. Cell Physiol. 1994, Feb. - Vol.158, №2. - P.231-236.

147. Jin Y.M., Yun C., Park C. et al. Expression of hepatitis В virus X protein is closely correlated with the high periportal inflammatory activity of liver diseases // J. Viral. Hepat. 2001, Sep. - Vol.8, №5. - P.322-30.

148. KitamuraO., HidakaT., AshiharaT. et al. Age-related changes in ploidy classes of liver cells in human and rats as studied by the Feulgen-DNA cytofluorometry // Jap. J. Gastroenterol. 1979. - Vol.76. - P.223-230.

149. Kitani K. Aging of the liver. Facts and theories // Arch. Gerontol. Geriatrics. -1991.-Vol.12, №2-3.-P.133.

150. Kitano S., Venable S., Smith J.R. et al. Effect of aging on regulation of sdi-1 in rat hepatocytes // Biochem. Biophys. Res.Commun. 1996,Aug 5. - Vol.225, №1. - P.122-127.

151. Knodell R.G., Ishak K.G., Black W.C. et al. Formulation and application of a numerical scoring system for assessing histological activity in asymptomatic chronic active hepatitis // Hepatology. 1981, №1. - P.431-435.

152. Koniaris L.G., Zimmers- Koniaris Т.,Hsiao E.C. et al. Cytokine-responsive gene-2/IFN- inducible models of liver and bileduct injury suggests a role in tassue regeneration // J.Immunol. 2001/ - Vol.67,№1. - P.399-406.

153. Kozurkova M., Misurova K., Kropacova K. Aging and radiation induced alterations of histones in regenerating rat liver // Mecli. Ageing Dev. 1993. -Vol.72, №l.-P.37-48.

154. Kropacova K., Misurova E. Influence of age and gamma irradiation on the proliferative activity in regenerating rat liver // Physiol. Res. 1992. - Vol. 41, №2. - P. 135-140.

155. Liu Y., Guyton K.Z., Gorospe M. et al. Age-related decline in mitogen-activated protein kinase activity in epidermal growth factor-stimulated rat hepatocytes// J. Biol. Chem. 1996, Feb 16. - Vol.271, №7. - P.3604-3607.

156. Lowes K.N., Groager E.J., Abraham L.J. et al. Upregulation of lymphotoxin beta expression in liver progenitor (oval) cells in chronic hepatitis С // Gut. -2003,Sep. Vol.52, № 9. - P. 1327-32.

157. Mendenhal C.L., Rouster S.D., Rosselle G.A. et al. Impact of chronic alcogolism on the aging rat: changes in nutrion, liver composition, and mortality // Alcohol. Clin. Exp. Res. 1993, Aug. - Vol.17, №4. - P.847-853.

158. Mozzliukhina T.G., Orlichenko L.S., Litoshenko A.Ia. The presence of mtDNA-like sequences in the DNA of liver chromatin fractions from rats of different ages // Izv. Akad. Nauk. Ser. Biol. 1994, Sep-Okt 5. - P. 751-760.

159. Orlichenko L.S., Beregovskaia N.N., Litoshenko A.Ia. Synthesis of mtDNA and proteins coded by mtDNA in liver mitochondrial fractions of rats of varying age// Ukr. Biokhim. Zn. -1994, May-Iun. Vol.66, №3. -P. 33-39.

160. Pacifici R.E., Davies K.Y.A. Protein. Lipid and DNA-repair systems in oxidative stress / The free radical theory of aging revisited // Cerontology. -1991.-Vol.37, №1-3.-P.166.

161. Phelouzat M.A., Arbogast A., Laforge T. et al. Excessive apoptosis of mature T lymphocytes is a characteristic feature of human immune senescence // Mech. Ageing. Dev. 1996, Jul 5. - Vol.88, №1-2. - P.25-38.

162. Ranek L., KeidingN., Jensen S.T. A morphometric study of normal human liver cell nuclei // Acta Pathol. Microbiol. Scand. Sect. A.- 1975. Vol.83. - P. 467- 476.

163. Rea I.M., Stewart M., Campbell P. et al. Changes in lymphacyte subsets, interleukin 2, and soluble interleukin 2 receptor in old and very old age //

164. Gerontology. 1996. - Vol.42, №2. - P.69-78.

165. Regeneration of liver after partial hepatectomy in X-ray irradiated rats / E.Misurova, M.Krivanova, K.Kropacova, F.Fabianova // Radiobiol. Radiother. 1987. - Vol.28, №1. - P.59-68.

166. Rigamonti C., Andorno S., Madulli S. et al. Iron, hepatic stellate cells and fibrosis in chronic hepatitis С // Eur. J. Clin. Invest. 2000, Mar. - Vol.32, Suppl 1. - P.28-35.

167. Roth G.S., Hess G.D. Changes in the mechanisms of hormone and neurotransmitter action during aging: current status of the role of receptor and post-receptor alterations // Mech. Ageing and Develop. -1982. Vol.20. - №3.

168. Rozga J., Jeppsson В., Bengmark S. Hepatotrophic factors in liver growth and atrophy // Brit. J. Exp. Path. 1985. - Vol.66. - P.669-678.

169. Sakakibara K., Igarashi S., Hatahara T. Localisation of type III procollagen aminopeptide antigenity in hepatocites from cirrhotic human liver // Virch. Arch. Abt. A. 1985. - Vol.408. - P.219-228.

170. Sgro J.C. Site of origin of hepatotrophic portal blood factor involved in liver regeneration // Surg. Form. 1973. - Vol.24. - P.377-379.

171. Sherlock S., DooleyJ. Diseases of the Liver and Biliary System: 10-th ed. -1997.-714 p.

172. Song Z., Joshi-Barve S., Barve C.J. et al. Advances in alcoholic liver disease // Curr. Gastroenterol. Rep. 2004, Feb. - Vol.6, №1. - p. 71-76.

173. Taguchi Т., Ohashi M. Age-associated changes in template-reading fidelity of DNA polymerase alpha from regenerating rat liver // Mech. Ageing Dev. -1996.- Vol.92, №2-3. -P. 143-157.

174. Tsukamoto I., Nakata R., Kojo S. Effect of ageing on rat liver regeneration after partial hepatectomy // Biochem. Mol. Biol. Int. 1993. - Vol 30, №4. -P.773-778.

175. Ueki Т., Kaneda Y., Tsutsui H. et al. Hepatocyte growth factor gene therapy of liver cirrhosis in rats //Nat. Med. 1999, Feb. - Vol. 5, №2. - P.226-230.

176. Weintraub L.R., Goral A., Grasso J. Pathogenesis of hepatic fibrosis in experimental jron overload // Brit. Haemat. 1985. - Vol.59. - P.321.

177. Werling K., Szepesi A., Szentirmay Z. et al. Effect of hepatitis С virus on hepatocyte proliferation and DNA ploidy in patients with chronic hepatitis C// Z. Gastroenterol. 2000, Jun. - Vol.38, №7. - P. 553-4, 556-8.

178. Yamoto Т., Ohashi Y., Teranishi M. et al. Age-related changes in the susceptibility to clofibric acid, a hypolipidemic agent, of male rat liver // Toxicol. Lett. 1995, Jul. - Vol.78, №2. - P. 141-145.

179. Yen T.C., King K.L., Lee H.C. et al. Age-dependent increases of mitochondrial DNA deletions together with lipid peroxidase and superoxide desmutase in human liver mitochondria // Free Radical Biol. Med. 1994. - Vol.16, №.2. -P.207.

180. Zarski J.P., Bolin В., Bastie A. et al. Characteristics of patients with dual infection by hepatitis В and С viruses // J. Hepatol. 1998. - Vol.28. - P.27-33.

181. Zhang C.P., Tian Z.B., Liu X.S. et al. Effects of Zhaoyangwan on chronic hepatitis В and posthepatitic cirrosis // Word J.Gastroenterol. 2004, Jan 15. -Vol.10, №2.-P. 295-8.

182. Zhou Т., Edwards C.K.-3td, Moutz J.D. Prevention of age-related T cell apoptosis defect in CD2-fas-transgenic mice see coments. // J. Exp. Med. -1995, Jul 1. Vol 182, №1. - P.129-137.