Автореферат и диссертация по медицине (14.01.08) на тему:Возрастные особенности развития, течения и прогноза гломерулярных заболеваний

На правах рукописи

Вознесенская Татьяна Сергеевна

Возрастные особенности развития, течения и прогноза гломерулярных заболеваний

14.01.08 - Педиатрия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

П з ДПР 2014

Москва, 2013 005546746

005546746

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научный центр здоровья детей» Российской академии медицинских наук

Научный консультант:

Доктор медицинских наук, профессор

Тамара Васильевна Сергеева

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой педиатрии лечебного факультета ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И.Пирогова» Светлана Стояновна Паунова

доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН, директор Института детской эндокринологии ФГБУ «Эндокринологический научный центр» Минздрава РФ

Валентина Александровна Петеркова

доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой педиатрии ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Минздрава РФ

Ирина Николаевна Захарова Ведущая организация:

ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова Минздрава РФ

Защита диссертации состоится «22» апреля 2014 года в 13:00 часов на заседании диссертационного совета Д 001.023.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научный центр здоровья детей» РАМН по адресу: 119296, г.Москва, Ломоносовский проспект, 2, стр.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научный центр здоровья детей» РАМН (119296, г.Москва, Ломоносовский проспект, 2, стр.1.)

Автореферат разослан « » _2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

И.В.Винярская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Гломерулярные заболевания являются одной из основных причин развития хронической болезни почек (ХБП). Распространенность ее растет во многих странах, в связи с чем крайне необходимым становится изучение клинических, биологических, генетических факторов, влияющих на развитие, течение и прогноз почечных заболеваний. В некоторых работах среди факторов прогрессировать ХБП указывался возраст (Ardissino G., 2012), однако большинство исследований выполнено у взрослых, в основном они посвящены нефросклерозу, связанному со старением (Борисов И.А., Петров Ю.Л., 2000; Martin J.E., Sheaff М.Т., 2007; Pannarale G., et al., 2010).

В современной нефрологии возрастные особенности гломерулярных заболеваний рассматриваются в двух направлениях: изучаются различия между детьми и взрослыми, а также особенности у детей и взрослых в зависимости от их возраста к началу болезни.

В настоящее время есть устоявшиеся представления об отличиях в частоте встречаемости отдельных форм первичных гломерулярных заболеваний (Рябов С.И., и др., 1986), и их клинических проявлениях у детей и взрослых (Korbet S.M., 1998; Джаналиев Б.Р. и др., 2002).

В то же время, мало исследований посвящено гистологическим различиям при одной и той же морфологической форме гломерулярного заболевания, а также различиям в ответе на терапию и в прогнозе отдельных морфологических форм гломерулярных заболеваний в зависимости от возраста. Имеется две категории детей (до года и старше 12 лет), течение гломерулярных заболеваний у которых отличается и от детей других возрастов, и от взрослых, однако эти особенности недостаточно изучены из-за малочисленности групп (Habib R., 1993; Baqi N., et al., 1998). Существуют также этнические особенности клинических проявлений и прогрессирования гломерулярных заболеваний (Andreoli S P., 2004).

Кроме того, по данным эпидемиологических исследований, структура гломерулярных заболеваний может изменяться. Так, в 90-х годах появились данные об увеличении встречаемости ФСГС в отдельных странах, как у взрослых, так и у детей (Haas M., 1995; Bonilla-Felix M., 1999).

Предполагается, что почечное заболевание может быть реализовано при помощи нескольких биологических механизмов: активизации Т-клеток, выделения еще неидентифицированного фактора иммунной природы, воздействующего на

гломерулярную проницаемость, нарушений в молекулярном строении

диафрагм или гломерулярной базальной мембраны, изменения клеточного строения подоцитов с расплавлением их ножек, отложения иммунных комплексов в мезангиуме или базальной мембране. Возрастные особенности механизмов развития гломерулярных заболеваний изучены недостаточно.

Развитие нефротического синдрома связано с повышением проницаемости гломерулярного фильтрационного барьера для макромолекул. Патобиохимия этого состояния при различных гломерулярных заболеваниях интенсивно изучается. Появились работы о возможном участии интерлейкина-18 и кластерина в развитии гломерулопатий, однако, одни из них экспериментальные, другие посвящены отдельным морфологическим формам гломерулярных заболеваний (Yamada К., et al., 2001; Rosenberg ME., et al., 2002; PrintzaN., et al., 2008).

Согласно современным представлениям, часть считавшихся идиопатическими спорадических гломерулярных заболеваний обусловлена мутациями в генах, кодирующих гломерулярные белки (Caridi G., et al., 2003), проявляться же мутантные гены могут в разном возрасте (Schultheiss M., et al., 2004). Кроме того, частота обнаружения мутаций варьирует в разных популяциях (Boute N., 2000; Maruyama К., et al., 2003).

Известно, что гломерулярные заболевания могут приводить к снижению почечных функций. Длительное время нарушение функции почек может протекать латентно. Выявление ХБП в начальной стадии важно для повышения эффективности профилактических и лечебных мероприятий, направленных на замедление прогрессирования заболевания. Для оценки почечной функции в настоящее время чаще всего определяют креатинин сыворотки крови и рассчитывают скорость клубочков он фильтрации. Однако креатинин не является точным маркером, так как он может зависеть от мышечной массы, недостаточного питания, задержки жидкости, применяемых препаратов (Moran S.M., Myers B.D.,1985; Bonventre J.V., Weinberg J.M., 2003). Кроме того, он довольно долго может оставаться нормальным даже при наличии морфологических признаков прогрессирования. Хорошо известно, что тубуло-интерстициальные изменения играют ведущую роль в прогрессировании первичных гломерулярных заболеваний (Eddy А.А., Neilson E.G., 2006). На сегодняшний день интенсивно изучаются новые биомаркеры раннего повреждения канальцев, в том числе липокалин-2, также называемый NGAL (нейтрофильный желатиназассоциированный липокалин), кластерин, интерлейкин-18. В почках они индуцируются только после повреждающего воздействия (Rabb H., 2003; Trof R.J., et al., 2006). Несмотря на то, что недавние исследования показали, что липокалин-2, кластерин и интерлейкин-18 могут

являться чувствительными биомаркерами острого повреждения почек, их роль при хронических почечных заболеваниях изучена недостаточно.

Все вышеперечисленное сделало актуальным проведение настоящего исследования. Цель исследовании:

установить закономерности формирования, течения и прогрессирования первичных гломерулярных заболеваний в зависимости от возраста их дебюта для выбора оптимальной тактики ведения пациентов. Задачи исследования:

1. провести анализ структуры первичных гломерулярных заболеваний у детей и ее изменений в разные временные периоды с учетом возраста начала заболевания;

2. выявить особенности клинических проявлений первичных гломерулярных заболеваний у детей разных возрастных групп;

3. выявить различия в прогрессировании первичных гломерулярных заболеваний в зависимости от возраста;

4. исследовать особенности патогенеза первичных гломерулярных заболеваний в разных возрастных группах;

5. выявить новые биомаркеры прогрессирования гломерулярных заболеваний;

6. оценить эффективность терапии у детей с гломерулярными заболеваниями при разных морфологических формах.

Научная новизна. Впервые проведено лонгитудинальное исследование с ретроспективным анализом анамнестических данных, включившее период с 1975 по 2009 гг., для оценки долгосрочного прогноза гломерулярных заболеваний у детей. Выявлены изменения структуры первичных гломерулярных заболеваний у детей с увеличением частоты фокально-сегментарного гломерулосклероза и уменьшением частоты мембранопролиферативного гломерулонефрита.

Впервые установлен долгосрочный прогноз гломерулярных заболеваний и влияющие на него факторы при различных морфологических формах первичных гломерулярных заболеваний у детей, в том числе при редких морфологических вариантах: мезангиопролиферативном гломерулонефрите с отложением ^М, мезангиальном гломерулонефрите, фокальном ме.мбранопролиферативном гломерулонефрите.

Выявлены возрастные особенности патогенеза и прогноза гломерулярных заболеваний. Впервые в отечественной нефрологии установлено, что у детей, заболевших в возрасте от 3 месяцев до года, нефротический синдром в 2/3 случаев связан с мутациями в гене ЫРН$2. При врожденном нефротическом синдроме заболевание связано в

большинстве случаев с NPHS1 мутациями. Обнаружены новые мутации генов, кодирующих подоцитарные белки, ответственные за развитие нефротического синдрома. Установлено, что морфологические изменения почечной ткани при Л73//.Ь'2 мутациях неспецифичны.

Впервые определено диагностическое значение специфических маркеров острого повреждения почек 1Ь-18, кластерина и липокалина-2 для хронической болезни почек, развившейся в результате первичных гломерулярных заболеваний. Показано, что 1Ь-18 может иметь патогенетическое значение как при стероидчувствительном, так и при стероидрезистентном нефротическом синдроме, как при ФСГС и НСМИ, так и при пролиферативных формах гломерулярных заболеваний. Установлено, что выраженное снижение уровня кластерина отрицательно влияет на течение заболевания. Выявлено, что липокалин-2 в крови является чувствительным показателем снижения скорости клубочковой фильтрации при нефротическом синдроме.

Предложены референтные значения 1Ь-18, кластерина, липокалина-2 в крови и

моче.

Доказан наилучший эффект микофенолата мофетила (Селлсепта) по сравнению с другими иммуносупрессивными препаратами при мембранопролиферативном гломерулонефрите 1 типа у детей.

Практическая значимость. Установлено, что молекулярно-генетическое исследование на мутации в гене А'РНЬ^ до начала терапии кортикостероидами и до нефробиопсии у детей с нефротическим синдромом, заболевших в возрасте от 3 месяцев до года, позволяет избежать назначения иммуносупрессивной терапии детям с этой патологией в связи с ее неэффективностью. Определена эффективность микофенолата мофетила (Селлсепта) при мембранопролиферативном гломерулонефрите 1 типа, что позволяет рекомендовать его к применению при этом заболевании. Показано, что уровень липокалина-2 в крови отражает степень снижения СКФ у детей с нефротическим синдромом, его повышение в крови является более ранним, чем повышение сывороточного креатинина, признаком нарушения почечных функций. Доказано, что выраженное снижение уровня кластерина в моче у детей со стероидчувствительным нефротическим синдромом свидетельствует о зависимости от высоких доз преднизолона, а у детей со стероидрезистентным нефротическим синдромом - о резистентности ко многим видам иммуносупрессивной терапии. Выявленные различия референтных значений содержания ГЬ-18 в крови в зависимости от возраста определяют необходимость учета возрастных норм при оценке результатов обследования.

Апробация материалов диссертации. Результаты исследования и основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на XIII и XV конгрессах Международной ассоциации педиатров-нефрологов (Аделаида, Австралия, 2004, Нью-Йорк, США, 2010), 33 и 40 конгрессах Европейского общества педиатров-нефрологов (Прага, Чехословакия, 1999, Палермо, Италия, 2006), конгрессе Европейской нефрологической ассоциации и Европейского общества диализа и трансплантации (XLVII ERA-EDTA congress) (Мюнхен, Германия, 2010), V Российском конгрессе детских нефрологов (Воронеж, 2006), II съезде нефрологов России (Москва, 1999), II съезде педиатров-нефрологов (Москва, 2000), IX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2002), II Российском конгрессе «Современные методы диагностики и лечения в детской нефрологии и урологии» (Москва, 2002), Международной конференции «Прогресс в неонатальной интенсивной терапии и в детской нефрологии» (Катовицы, Польша, 2002), I Российском Конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2002), Международной нефрологической конференции «Белые ночи» (Санкт-Петербург, 2003), IX, X, XV Конгрессах педиатров России (Москва, 2004, Москва, 2006, Москва, 2011), VI Международном семинаре «Неделя нефрологии в Москве» (Москва, 2006), VI Съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 45 работ в отечественной и зарубежной печати, в т. ч. 20 статей в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК, главы в 2 руководствах, 1 методические рекомендации для врачей.

Внедрение результатов исследования в практику. Результаты исследования внедрены в клиническую практику нефрологического отделения НИИ педиатрии ФГБУ «НЦЗД» РАМН, консультативно-диагностического центра НИИ профилактической педиатрии и восстановительного лечения ФГБУ «НЦЗД» РАМН и отделений ФГБУЗ «Центральная детская клиническая больница ФМБА».

Результаты исследования используются в лекционных курсах кафедры ФППО педиатров ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И М. Сеченова и кафедры педиатрии ФГБОУ ДПО «ИПК ФМБА» России. Структура и объем диссертации. Работа изложена на 261 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объема исследования и методов, 4-х глав собственных исследований, заключения, выводов и практических рекомендаций. Диссертация иллюстрирована 12 таблицами и 81 рисунком. Указатель литературы содержит 431 работу, включая 17 отечественных и 414 иностранных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объем и методы исследования

Работа выполнена в нефрологическом отделении НИИ педиатрии (заведующий -д.м.н., профессор АН. Цыган) ФГБУ «НЦЗД» РАМН (директор - академик РАН и РАМН, профессор A.A. Баранов).

Дизайн исследования.

Для выполнения поставленных задач проведено лонгитюдное исследование с ретроспективным анализом анамнестических данных 523 детей с первичными гломерулярными заболеваниями, обследовавшихся в нефрологическом отделении ФГБУ «НЦЗД» РАМН в период с 1975 по 2009 годы. Возраст детей составил от 1 мес до 17 лет.

Выполненная работа включает 4 части:

L Клиннко-лабораторные исследования и анализ историй болезни детей с первичными гломерулярными заболеваниями

(п=523)

II Изучение

морфологических форм гломерулярных заболевании, их сзруктуры. особенностей течения и факторов прогрессирования (п=471)

IIL

Молекулярно-генегические исследования NFHS2 (п=35) XPHS1 (п=й)

IV. Исследование новых биомаркеров повреждения почечной ткани IL1 S(n-96) Кластерин (п=90) Липокалин-2 (п=93)

Моментом включения в исследование был дебют заболевания, изучаемым исходом была умеренная (СКФ=30-59 мл/мин/1,73м2 в течение 3-х и более месяцев) и терминальная стадии ХБП.

Общая характеристика больных.

С идиопатическим нефротическнм синдромом было 313 детей, с хроническим гломерулонефритом - 181 ребенок. С врожденным нефротическим синдромом было 12 детей, с инфантильным нефротическим синдромом - 17 детей.

Нефротический синдром был основным симптомом заболевания - у 342 человек, нефритический синдром - у 6, нефротически-нефритический синдром - у 61, бессимптомные изменения мочи - у 79, макрогематурия - у 35.

Основные морфологические формы выделены в соответствии с классификацией ВОЗ (1995 г), модифицированной БсИепаР.Р. в 1997 г. ^сЬепа Р.Р., 1997).

При морфологическом исследовании почечной ткани нефротический синдром с минимальными изменениями был выявлен у 107, не-^Л мезангиопролиферативный ГН -у 98, 1§А- нефропатия - у 68, мембранопролиферативный ГН - у 72, ФСГС - у 73, мембранозная нефропатия - у 22, фибропластический (склерозирующий) ГН - у 21,

изменения, соответствующие врожденному нефротическому синдрому финского типа - у 6, диффузный мезангиальный склероз - у 4.

Диагностические методы исследования.

У всех пациентов определялись общие биохимические параметры крови, включая концентрации креатинина (метод Яффе), мочевины, белка и белковых фракций, холестерина, электролитов (калия, натрия, хлора, кальция, фосфора, железа), мочевой кислоты, билирубина, аланин-аминотрансферазы (АЛТ), аспартат-аминотрансферазы (ACT), С-реактивного белка, фибриногена, исследовался также общий анализ крови, общий анализ мочи. Для исключения аномалии развития мочевой системы всем детям проводилось УЗИ или экскреторная урография. В моче исследовалась суточная экскреция белка. Небольшой считалась протеинурия от 100 мг до 1 г/сут, умеренной - от 1 до 3,0 г/сут, выраженной - более 3,0 г/сут. Нефротический синдром устанавливался при гипоальбуминемии<25 г/л и протеинурии более 3,0 г/сут (>50 мг/кг/24ч или >40 мг/час/м2). Стероидрезистентным считался нефротический синдром при сохранении выраженной протеинурии после б недель терапии преднизолоном в дозе 2 мг/кг/24ч (максимум 60 мг/24ч) (ISKDC, 1981).

Нефритический синдром включал олигурию, гематурию, протеинурию, артериальную гипертензию.

Бессимптомные изменения мочи включали протеинурию и/или гематурию, выявляемые при лабораторном обследовании, без каких-либо клинических признаков.

Гематурия в зависимости от выраженности делилась на 3 степени: 1) небольшая (от 5 до 20 эритроцитов в п/зр, 2) умеренная (от 20 до 50 эритроцитов в п/зр), 3) выраженная (более 50 эритроцитов в п/зр).

Артериальная гипертензия диагностировалась, если уровень артериального давления был выше 95 перцентиля для данного возраста и пола, или, если ребенок получал гипотензивные препараты, за исключением ингибиторов аннгиотензинпревращающего фермента, когда они назначались с антипротеинурической и нефропротективной целью при отсутствии гипертонии.

Анемией считался уровень гемоглобина ниже 120 г/л.

Скорость клубочковой фильтрации (СКФ) рассчитыватась по формуле Шварца (Schwartz G.J., Brion L.P., Spitzer A., 1987).

Были выделены следующие стадии снижения СКФ в соответствии с классификацией Национатьного Почечного Фонда «Инициатива качества исходов болезней почек»: легкая - при СКФ 60-89 мл/'мин/1,73м2, умеренная - при СКФ 30-59 мл/мин/1,73м2, тяжелая -при СКФ 15-30 мл/мин/1,73 м2 и терминальная стадия - при СКФ<15 мл/мин/1,73 м2

(National Kidney Foundation: NKF-K/DOQI Clinical Practice Guidelines for Chronic Kidney Disease, 2002).

Результаты патогенетической терапии оценивали как полную ремиссию, частичную ремиссию и отсутствие эффекта. Полная ремиссия характеризовалась нормализацией анализов мочи и крови наряду с восстановлением функций почек. Частичная ремиссия выражалась в уменьшении протеинурии более чем на 50% и менее 1 г/24ч и повышении сывороточного альбумина более 30 г/л, в снижении в 5-10 раз гематурии, нормализации артериального давления и функций почек. При отсутствии эффекта перечисленные симптомы сохранялись и/или прогрессировали.

Пункционная биопсия почки полуоткрытым и, с 2002 г, чрескожным методом под ультразвуковым контролем, проведена у 471 больного в 1975 - 2009 г.г. Для оценки изменений в структуре и частоте отдельных форм гломерулярных заболеваний в зависимости от возраста и периода, мы выделили две группы: А - заболевшие в период с 1975 по 1994; и Б - заболевшие в период с 1995 по 2009.

Показаниями для биопсии были: 1) стероидрезистентный, стероидзависимый и часто рецидивирующий нефротический синдром; 2) персистирующая или рецидивирующая гематурия; 3) врожденный нефротический синдром. Диагноз первичного гломерулярного заболевания устанавливался, если: 1) не было признаков какого-либо системного заболевания; 2) серологические исследования на вирус гепатита В, вирус гепатита С (после 1990), антинуклеарный фактор были отрицательными. Исключались из исследования пациенты с везикоуретеральным рефлюксом или единственной почкой (в том числе после нефрэктомии), с семейной гематурией, мочекаменной болезнью, инфекцией мочевых путей.

Морфологические исследования ткани почки, полученной при биопсии, со световой, электронной микроскопией и иммунофлюоресценцией проводились д.м.н., проф. Варшавским В.А. и к.б.н. Голициной Е.П. на кафедре патологической анатомии (зав кафедрой - академик РАЕН, д.м.н., проф. Пауков B.C.) ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова», д.м.н. Леоновой JI.B. в лаборатории патоморфологии на базе Детской городской клинической больницы №1 г. Москвы (руководитель - д.м.н., проф. Талалаев А.Г.), к.м.н. Повилайтите П.Э. на базе ЭМ - ГУЗ Патологоанатомического бюро Ростовской области.

Специальные методы исследования.

Исследование IL-18 (п=96), кластерина (п=90) и липокалина-2 (NGAL) (п=93) проводилось у детей с нефротическим синдромом в лаборатории биохимии ФГБУ

«НЦЗД» РАМН (заведующий - д.м.н., проф. Баканов М.И.) в 2008-2009 годах. Контрольную группу составили 14 (8 мальчиков и б девочек) клинически здоровых детей.

IL-18, кластерин и липокалин-2 определялись в сыворотке крови и моче в разных клинических стадиях заболевания. Дети наблюдались в течение 6 мес-2 лет после забора крови и мочи. Мочу центрифугировали при 10.000 об/мин в течение 15 мин для получения супернатанта, который затем замораживали и хранили при -70"С. Для устранения влияния разведения (концентрирования), оценивалось соотношение этих показателей к креатинину в той же порции мочи. Кровь центрифугировали при 10.000 об/мин в течение 15 мин для получения сыворотки, которую затем замораживали и хранили при -70* С.

IL-18 определялся в крови и моче методом твердофазного знзим-связанного иммуносорбентного анализа (ELISA) с использованием иммуноферментного набора (Bender MedSystems GmbH, Vienna, Austria) в соответствии с протоколом производителя.

Кластерин определялся в крови и моче методом ELISA с использованием иммуноферментного набора (BioVendor GmbH, Heidelberg, Germany) в соответствии с протоколом производтеля. Образцы разводились согласно инструкции для достижения оптимальной плотности.

Липокалин-2 (NGAL) определялся в крови и моче методом ELISA с использованием иммуноферментного набора (BioVendor GmbH, Heidelberg, Germany) в соответствии с протоколом производителя. Образцы разводились согласно инструкции для достижения оптимальной плотности.

Ферментная реакция оценивалась с помощью автоматического микропланшетного фотометра при длине волны 450 нм. Абсорбция была пропорциональна концентрации IL-18, липокалина-2 и кластерина в исследуемых образцах. Калибровочные кривые строились с использованием значений оптической плотности, полученных для стандартов, поставляемых с наборами. Концентрации веществ в исследуемых образцах и контролях определялась при помощи построенных калибровочных кривых.

Молекулярно-генетическое исследование у детей с нефротичесюга синдромом проводилось в лаборатории мембранологии с группой генетических исследований ФГБУ «НЦЗД» РАМН в 2006-2009 гг (заведующий - д.м.н., проф. Пинелис В.Г.).

Проводился поиск мутаций и полиморфных вариантов генов NPHS2 и NPHS1. Применялись следующие молекулярно-генетические методы: выделение ДНК, полимеразная цепная реакция (ПЦР) прямое автоматическое секвенирование. Для выделения геномной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) из лейкоцитов цельной венозной крови использовался набор реактивов «Wizard Genomic DNA Purification Kit«

фирмы «Promega» (США) в соответствии с протоколом производителя. Выделенную ДНК хранили при - 20°С.

Амплификация экзонов генов NPHS2 и NPHS1 проводилась методом ПЦР на программируемом термоцикле «DNA Engine Thermal cyclers» (Bio-Rad) с использованием фермента Go Taq фирмы ' Promega" (США) для 2-8 экзонов и фермента Pfu фирмы "Promega" (США) дая 1 экзона.

Праймеры, используемые для амплификации и секвенирования, соответствовали описанным ранее (MaruvamaK.. et al., 2003):

Для NPHS1 с использованием фермента Go Taq фирмы "Promega" (США). Амплификация экзонов гена NPHSI проводилась с использованием праймеров на основании опубликованной ранее информации (Lenkkeri U., et al., 1999).

Для амплификации фрагментов использовался стандартный состав реакционной смеси: Taq Буфера х 10 (рН=8,6) - 2,5 мкл; Taq полимеразы 5 ед/мкл - 1 мкл; магния хлорида 25 шМ р-ра - 1,5 мкл; смеси дНТФ (5 шМ) - 0,5 мкл; геномной ДНК - 100 нг; деионизированной воды до конечного объема 25 мкл. Разделение продуктов амплификации и ферментативного гидролиза проводили с помощью электрофореза в агарозном геле. После разделения фрагментов гель окрашивали раствором бромистого этидия. Результаты исследования визуализировались на приборе гель-документации Gel Doc XR (Bio-Rad). Определение нуклеотидной последовательности генов подоцина и нефрина проводили на генетическом анализаторе ABI Prism 3100, Applied Biosystems, США. Секвенирование проводили в двух направлениях, как с прямого, так и с обратного праймеров. Для проведения сиквенсовой реакции использовали те же праймеры, что и для постановки ПЦР, и набор BigDye Terminators v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems). Для анализа результатов секвенирования применяли программу Chromas. Использовались электронные базы данных: On-line Mendelian Inheritance in Men (OMIM), Human Gene Mutation Database.

Перед проведением исследований у родителей пациентов было получено информированное согласие на диагностические и лечебные процедуры с гарантированным позитивным эффектом.

Статистические методы исследования.

Оценка соответствия вида распределения изучаемого признака закону нормального распределения проводилась с использованием критерия Шапиро-Уилка. При отсутствии

возможности определить закон распределения признака (малая выборка) использовались непараметрические методы.

При нормальном распределении полученные данные подверглись статистической обработке с вычислением средних арифметических (М), величин стандартного эмпирического отклонения (ст).

Для определения значимости различий между отдельными группами больных применялся критерий Стьюдента.

При распределении, отличном от нормального, данные представлены как медиана и интерквартильный размах (25-й; 75-й перцентили). Для оценки взаимосвязи признаков применялся корреляционный анализ Спирмена. По абсолютному значению коэффициента корреляции (rs) (от 0 до 1) оценивали количественную связь; при rs=0 корреляция отсутствует, при 0,09 < г, < 0,19 статистическая взаимосвязь очень слабая, при 0,2 < г„ < 0,49 статистическая связь слабая, при 0,5 < г„ < 0,69 статистическая взаимосвязь средняя, при 0,7 < rs < 0,99 статистическая взаимосвязь сильная. Значимость различий между группами для количественных переменных оценивали по критерию Манна-Уитни и Краскела-Уоллиса, для категориальных - по точному двустороннему критерию Фишера или х2 с поправкой Йетса. Выживаемость оценивалась методом Каплана-Мейера с применением логарифмического рангового критерия при сравнении двух выборок, критерия х2 ПРИ сравнении нескольких выборок и методом регрессии Кокса. В многофакторный регрессионный анализ включали переменные, для которых значения критерия статистической значимости при однофактормом анализе составляли р<0,25. Значимыми считались различия при р<0,05.

Анализ данных проводился на персональном компьютере с помощью пакета программ Statistica, версия 6.

Результаты исследования и их обсуждение 1. Структура гломерулярных заболеваний и клинико-морфологические сопоставления

При рассмотрении различных морфологических форм первичных гломерулярных заболеваний нами был отмечен рост выявления ФСГС и снижение встречаемости Mill Н в 90 годы (рис. 1).

Для детальной оценки изменений в структуре и частоте отдельных форм гломерулярных заболеваний в зависимости от возраста и периода, мы выделили две группы: А - заболевшие в период с 1975 по 1994; и Б - заболевшие в период с 1995 по 2009. В зависимости от возраста начала проявлений заболевания выделены следующие

возрастные группы: I группа — заболевшие в возрасте 1 года — 5 лет, II группа — заболевшие в возрасте 6-10 лет и III группа - заболевшие в возрасте 11-17 лет. Дети с началом заболевания в возрасте до года рассмотрены отдельно.

1975-79 1980-84 1985-89 1990-94 1995-99 2000-04 2005-09

-•-МПГН -•-ФСГС

Рис. 1. Динамика выявления ФСГС и МПГН при биопсии почки по данным нефрологического отделения НИИ педиатрии НЦЗД РАМН.

НСМИ был наиболее частым первичным гломерулярным заболеванием у детей как до 1995 года (28%), так и после (35%) (рис. 2 и рис. 3). Пик заболеваемости НСМИ приходился на возраст от I до 5 лет также в оба этих периода.

МПГН был вторым по частоте первичным гломерулярным заболеванием в период до 1995 года (23%) с пиком заболеваемости в возрасте 11 лет и старше, наиболее редко МПГН заболевали дети в возрасте от 1 до 5 лет. После 1995 года на второе место вышел ФСГС (21%), при этом встречаемость его во всех возрастных группах была сходной (рис. 2 и рис. 3).

^А нефропатия и не-^А МезПГН составляли 14% и 19%, соответственно, в оба изучаемых периода. При этом ^А нефропатия редко выявлялась у детей в возрасте от 1 до 5 лет (у 4%), и до, и после 1995 года (рис. 2 и рис. 3).

Относительно редко в любом возрасте обнаруживались мембранозная нефропатия и фибропластический (склерозирующий) ГН. Отмечен рост числа этих морфологических форм в старшей возрастной группе по сравнению с младшей: мембранозная нефропатия у

9% и 6% до 1995 г и у 6% и 1% после 1995 г, соответственно; фибропластический (склерозирующий) ГН у 13% и 2% до 1995 г., соответственно.

28%

НСМИ+стероидчувст

5%

фибропластический (склерозирующий) ГН

14% I рЛ нефропатия

4%

мембранозная нефропатия

не-^А МезПГН

Рис. 2. Структура первичных гломерулярных заболеваний в период с 1975 до 1995 года с учетом стероидчувствительного нефротического синдрома у небиопсированных больных по данным нефрологического отделения НИИ педиатрии НЦЗД РАМН

7%

35% НСМИ

21% ФСГС

19%

МезПГН

14% ЕцА нефропатия

2% фибропластический (склерозирующий) ГН мембранозная нефропатия

Рис. 3. Структура первичных гломерулярных заболеваний в период с 1995 до 2009 года по данным нефрологического отделения НИИ педиатрии НЦЗД РАМН

В группе детей, заболевших в возрасте от 1 до 5 лет, отмечен статистически значимый рост встречаемости ФСГС в период после 1995 года с 9% до 21% (р=0,04).

При дебюте гломерулярного заболевания в возрасте от 6 до 10 лет после 1995 года значимо реже стал выявляться МПГН (26% и 11%, соответственно) (р=0,01) и чаще ФСГС (4% и 24%, соответственно) (р=0,0001) по сравнению с периодом до 1995 года.

Наибольшие изменения отмечены в структуре гломерулярных заболеваний у детей в возрасте 11 лет и старше: после 1995 года у них резко снизилась заболеваемость МПГН с 34% до 10% (р=0,0007), уменьшилась встречаемость фибропластического (склерозирующего) ГН с 13% до 3% (р=0,048), чаще стал обнаруживаться НСМИ (5% и 17%) (р=0,03) и ФСГС (6% и 19%) (р=0,04).

Наши данные о росте встречаемости ФСГС и снижении встречаемости МПГН у детей согласуются с данными литературы (Bonilla-Felix М., 1999; West C.D., 1992).

По результатам нашего исследования, наиболее частым клинико-лабораторным синдромом у детей всех возрастных групп является нефротический синдром (от 44,6% до 86,5%). В возрасте до 6 лет нефротический синдром бьи основным проявлением первичных гломерулярных заболеваний. После 6 лет часто встречались бессимптомные изменения в анализах мочи (28,9%), а после 11 - нефротически-нефритический синдром (24,6%) (табл. 1). Различия между возрастными группами статистически значимы (р<0,0000).

В табл.2 показаны причины нефротического синдрома со статистически значимыми различиями (р=0,00001) между возрастными группами.

Таким образом, среди морфологических основ нефротического синдрома у детей лидируют НСМИ (38,8%) и ФСГС (22,4%) (общая группа). Нам, кроме того, удалось показать различия распределения морфологических форм в зависимости от возраста с уменьшением встречаемости НСМИ после 6 лет и увеличением не-IgA МезПГН у детей старше 11 лет.

Причиной нефритического синдрома были, в основном, пролиферативные гломерулярные заболевания у детей старшей возрастной группы.

Сочетание нефротического синдрома с нефритическим выявлялось, как правило, у детей старшей возрастной группы, при гистопатологическом исследовании наиболее часто обнаруживался МПГН.

Встречаемость основных почечных синдромов в зависимости от возраста у детей с первичными гломерулярными заболеваниями

синдром возраст дебюта заболевания

1 — 6 лет п=148 % 6-10 лет п=166 % 11 -17 лет п=130 %

нефротический 86,5 44,6 46,9

нефритический V 0 4,6

нефротически-нефритический 2,7 15,1 24,6

бессимптомные изменения в анализах мочи 8,1 28,9 14,6

макрогематурия 2,7 11,5 9,2

X2, р<0,0000

Таблица 2

Встречаемость установленных при нефробиопсии морфологических форм первичных гломерулярных заболеваний у детей с нефротическим синдромом

гистопатологический диагноз возраст дебюта заболевания

1—6 лет п=128 % 6 — 10 лет п=74 % 11-17 лет п=61 %

НСМИ 53,9 28,4 19,7

ФСГС 20,3 29,7 18,0

Мембранозная нефропатия 4,7 5,4 14,8

МПГН (I + II тип) 2,3 17,6 14,8

^А-нефроттия 1,6 2,7 8,2

Не-1§А МезПГН 14,1 9,5 18,0

Фибропластический (склерозирующий) ГН 3,1 6,8 6,6

1\ р=0,00001

У детей с бессимптомными изменениями в анализах мочи выявлялись в большинстве случаев ^А-нефропатия (38%) и пе-1дА МезПГН (44,3%) (общая группа), при этом встречаемость ^А-нефропатии росла с увеличением возраста. Менее часто обнаруживался МПГН (11,4%) (табл. 3).

Встречаемость установленных при нефробиопсии морфологических форм первичных гломерулярных заболеваний у детей с бессимптомными изменениями мочи

гистопат о логический диагноз возраст дебюта заболевания

1 — 6 лет п=12 % 6-10 лет п=48 % 11-17 лет п=19 %

НСМИ 0 0 0

ФСГС 16,7 0 10,5

Мембранозная нефролатия 0 0 0

МПГН 0 + II тип) 25 12,5 0

IgA-нефропатия 16,7 39,6 47,4

He-IgA МезПГН 41,7 47,9 36,8

Фибропластический (склерозируюший) ГН 0 0 5,3

Х-,р=0,037

У детей с макроскопической гематурией во всех возрастных группах преобладала IgA-нефропатия (дети до б лет - 75%, дети 6-10 лет - 79%, дети 11 лет и старше - 75%), за ней следовал не-IgA МезПГН (15,8% у детей 6-10 лет и 25%у детей 11 лети старше). При макроскопической гематурии различия между возрастными группами не были статистически значимыми.

Нами обнаружены различия клинических проявлений отдельных гломерулярных заболеваний в зависимости от возраста дебюта. Статистически значимые различия были получены для МПГН и не-IgA МезПГН.

При МПГН у детей старше 6 лет преобладал нефротически-нефритический синдром, у детей младшей возрастной группы заболевание наиболее часто проявлялось бессимптомными изменениями в анализах мочи (табл. 4).

He-IgA МезПГН у детей до 6 лет в основном проявлялся нефротическим синдромом, у детей с 6 до 10 лет - бессимптомными изменениями в анализах мочи, у подростков -нефротическим, нефротически-нефритическим синдромом и бессимптомными изменениями в анализах мочи (табл. 5). Проведенный нами анализ свидетельствует о неоднородности не-IgA МезПГН.

Основные клинические синдромы у детей с мембранопролиферативным гломерулонефригом

синдром возраст дебюта заболевания

1 — 6 лет п=8 % 6-10 лет 11=37 % 11 -17 лет п=27 %

нефротический 37,5 35,1 33,3

нефритический 0 0 11,1

нефротически-нефригический 12,5 46 55,6

бессимптомные изменения в анализах мочи 37,5 16,2 0

макрогематурия 12,5 2,7 0

р=0,016

Таблица 5

Основные клинические синдромы у детей с не-^А мезангиопролиферативным гломерулонефригом

синдром возраст дебюта заболевания

1-6 лет 11=25 % 6-10 лет п=39 % 11 -17 лет п=29 %

не фротический 72 18 37,9

нефритический 0 0 6,9

нефротически-нефритический 8 15,4 20,7

бессимптомные изменения в анализах мочи 20 51.3 24,1

макроге матурия 0 15,4 10,3

X2, р=0,0008

2. Течение и прогноз гломеруляриых заболеваний

А-нефропатия составила 15% от числа биопсированных детей с гломерулярными болезнями. Заболевают чаще мальчики, более трети детей заболевает в возрасте 7-9 лет. Наиболее характерным проявлением ^А-нефропатии являлось сочетание асимптоматической протеинурии с гематурией (у 85%), нефротический синдром обнаруживался у 15% больных. Эпизоды макрогематурии отмечены у 47% больных.

В настоящее время нет общепринятых протоколов терапии ^А-нефропатии с доказанной эффективностью. По данным литературы при ^А-нефропатии применяются различные схемы лечения преднизолоном в сочетании с другими иммуносупрессивными препаратами.

Иммуносупрессивная терапия при [уЛ-нефропатии применялась в основном у детей с нефротическим синдромом, стандартный курс преднизолона оказался эффективным у половины больных, адкилирующие агенты - у трети, остальные виды терапии назначались ограниченному числу больных, но можно отметить успешное действие Сандиммуна неорала (у всех 3 детей, получавших его, была получена ремиссия).

Согласно результатам наших исследовании, почечная выживаемость у детей с ^А-нефропатией через 5 лет от дебюта была 100%, через 10 лет - 94% (рис. 4). Умеренной стадии ХБП через 5 лег достигли 2% больных с ^А-нефропатией, через 10 лет - 14%. Наши данные по почечной выживаемости сходны с таковыми, полученными в японских исследованиях (95% через 5 лет и 94% через 10 лет) (УозЫкалуаN. Но Н, 1989).

120% 110% 100% 90%

5

|; 8о%

з:

К

« '70%

| 60%

о

с: . :

50% "■ 40% 30%

: '0 2а ; . 40 60 80 100- 120 140 160 180

Длительность наблюдения мес

Рис. 4. Кривая почечной выживаемости больных с 1аА-нсфропатией (конечная точка -терминальная стадия ХБП)

Отмечено негативное влияние на почечную выживаемость при 1^'А-нефропатии уровня протеинурии: терминальная стадия ХБП за время наблюдения была зафиксирована у 4 из 11 детей с нефротическим уровнем протеинурии, у 3 из 13 детей с умеренной протеинурией и у 1 из 44 детей с небольшой (менее 1 г/сут) протеинурией (р=0,0001). Быстрее прогрессировав заболевание у детей с выраженной и умеренной протеинурией и до умеренной стадии ХБП (р=0,0001).

Отчетливое отрицательное действие на почечную выживаемость оказывал отечный синдром (р=0,00008).

Протеинурия больше 1 г/сут и особенно отечный синдром коррелировали со склеротическими изменениями гломерул (га=0,3; р=0,01 и г,=0,42; р=0,0004,

Анализ времени до наступления исхода о Завершенные + Цензурированные

соответственно). На взаимосвязь степени протеинурии с тяжестью морфологических изменений гломерул указывалось и в нескольких других работах (Hattori S., et al., 1985; Andreoli S.P., Yum M.N, 1986).

По результатам нашего исследования, в отличие от результатов работы Yoshikawa N., Ito Н., наличие эпизодов макрогематурии не улучшало прогноз (Yoshikawa N, Ito Н, 1987). Это может быть связано с тем, что в наших наблюдениях макрогематурия часто сопровождатась протеинурией более 1 г/сут и/или артериальной гипертензией.

В работе установлено, что прогноз ухудшатся при наличии артериальной пшертензии (р=0,0003 для 3 стадии ХБП и р=0,0004 ятя терминальной стадии ХБП).

Мы обнаружили неблагоприятное влияние на прогноз дебюта IgA-нефропатии в подростковом возрасте (р=0,001 для умеренной и р=0,0009 для терминальной стадии ХБП).

Из морфологических признаков ускоряли прогрессирование атрофия канатьцев (р=0,002 для терминальной стадии и для 3 стадии ХБП) и склеротические изменения более 10% гломерул (р=0,04 для 3 стадии ХБП).

Мы покачали, что при фокально!! пролиферации заболевание может иметь прогрессирующее течение в случае наличия склеротических изменений гломерул и/или атрофии канатьцев.

Изменения сосудов в виде склероза и утолщения интимы сосудов, были обнаружены нами только у 10% детей с IgA-нефропатией, влияние этих признаков на прогрессирование у детей, в отличие от взрослых (Nicholls К.М., et al., 1984; D'Amico G., et al., 1986), доказать не удалось.

В нашем исследовании среди независимых факторов прогрессирования оказались возраст дебюта старше 10 лет, уровень протеинурии более 1 г/л и наличие атрофии канальцев по данным гистологического исследования почечной ткани.

По нашим данным, ne-/gA МезПГН представлен неоднородной группой болезней и включает гломерулонефриты с преимущественным отложением IgM и IgG, каждый из которых имеет свои клинико-лабораторные особенности. IgM-мезангиопролиферативный гломерулонефрит начинается в среднем в возрасте 5,5 лет, наиболее часто проявляется нефротическим синдромом, в 50% - стероидрезистентньш, у большинства - в сочетании с гематурией.

Мезангиатьньш IgG гломерулонефрит является редкой формой гломерулонефритов. Из-за редкости этого заболевания его прогноз остается мато изученным. Большая часть исследований проведена в Японии, у подавляющего числа пациентов течение заболевания описывалось в них как благоприятное. В противоположность этом}', во Франции

большинство больных с мезангиальным IgG гломерулонефритом достигли хронической почечной недостаточности (Fakhouri F, et al., 2002). Предполагается, что исход заболевания может зависеть от расы.

У пациентов в нашем исследовании основным проявлением мезангиального IgG гломерулонефрита была гематурия, только один ребенок достиг терминальной стадии хронической болезни почек за время наблюдения. У него заболевание проявлялось протеинурией больше 1 г/сут, гематурией и артериальной гипертензией. Однако по данным исследования Варшавского В.А., проведенного у взрослых пациентов, мезангиопролиферативный гломерулонефрит с IgG депозитами является наименее благоприятным вариантом мезангиопролиферативного гломерулонефрита (Варшавский В.А. и др., 1999). Эти различия могут объясняться разным возрастом дебюта заболевания.

По нашим данным, почечная выживаемость у детей с не-IgA МезПГН составила через 5 лет 96%, через 10 лет - 82,6% (рис. 5). Умеренной стадии ХБП через 5 лет достигли 12,4% больных, через 10 лет - 36,5%.

Нам не встретились исследования по течению и прогнозу не-IgA МезПГН у детей, но наши данные сопоставимы с результатами исследования Vikse у взрослых (Vikse В.Е., 2002).

В отличие от IgA-нефропатии протеинурия различного уровня не оказывала значимого влияния ни на почечную выживаемость, ни на достижение 3 стадии ХБП при не-IgA МезПГН. Но было доказано негативное влияние отечного синдрома (р=0,02 для терминатьной стадии и р=0,001 для 3 стадии ХБП).

.110%

Mids«

;; loo% if

■ 4:: ss% 2 '

g . 90% i

äi 85% • 1 80% 75% :; '. 70%

:•'••'.:: 65%

i;.. •.::. о. 20 . . 40 : so 80 • 100 120. : 140 . 160 .180

Длительность наблюдения, r/ec

Рис. 5. Кривая почечной выживаемости больных с не-IgA МезПГН (конечная точка терминальная стадия ХБП)

Анализ времени до.наступления исхода Завершенные -1-■ Цензуриров»нные

......

В нашем исследовании повышение артериального давления было фактором прогрессирования не-Г^Л МезПГН до 3 стадии ХБП (р=0,02 для терминальной стадии и р=0,001 для 3 стадии ХБП), почечная же выживаемость не зависела от натичия артериальной гипертензии.

Нами выявлено ускорение прогрессирования не-1§А МезПГН у детей в возрасте старше 10 лет (р=0,01 для 3 стадии ХБП и р=0,05 для терминальной стадии ХБП).

Так же как и в работах, посвященных изучению ^А-нефропатии, при не-^А МезПГН плохими прогностическими факторами оказались признаки хронического повреждения: атрофия канальцев (р=0,02 для терминальной стадии и р=0,0006 для 3 стадии ХБП) и склеротические изменения более 10% гломерул (р=0,004 для для терминальной стадии и р=0,0004 для 3 стадии ХБП).

Независимыми факторами прогрессирования не-^А МезПГН были: возраст дебюта старше 10 лет, отечный синдром, склероз более 10% гломерул и атрофия канальцев при исследовании биоптата почечной ткани.

Наиболее эффективными в лечении не-ГцА МезПГН, проявляющимся стероидрезистентным нефротическим синдромом, являются Сандиммун-неорал и Селлсепт (ремиссии были достигнуты у всех 7 детей, получавших ЦсА и у всех 5 детей, получавших микофенолата мофетил, в то время как пульс-терапия метилпреднизолоном привела к ремиссии у 4 из 14 детей, алкилирующие агенты оказались эффективными у 3 из 20 детей).

МГГГН начинается, как правило, в возрасте старше 7 лет, более чем у половины детей (у 59,7%) проявляется нефротическим синдромом, который у всех сочетается с гематурией, а V части - с нефритическим синдромом, у остальных - изолированным мочевым синдромом. Характерными для МПГН были артериатьная гипертензия 61,1%), анемия, выявленная у трети больных (31,9%), снижение СЗ-компонента комплемента (у 40,6%). Фокальный МПГН в нанпгх наблюдениях обнаружен у 4 из 72 больных. Из 39 детей с МПГН, которым проведено электронно-микроскопическое исследование почечной ткани, II тип болезни обнаружен у 6 (15,3%), у остальных - I тип МПГН.

По результатам анализа Каплана-Мейера почечная выживаемость при МПГН составила 91% через 5 лет от начата заболевания и 74% - через 10 лет (рис. 6). Умеренной стадии ХБП достигли 17% пациентов через 5 лет и 47% - через 10 лет.

Анализ времени до наступления исхода

0 Зэвершвжы а ^ Цензурировании*

::: -«о» :

: : 110% . 100%

;. а 50*

'2

2 80%

: I '

5/70%

¡ 60%

Л': -':

:: 40% 30%

О . 20 40 60 ВО 100 :120 140 : 160 Д^тельнасть наблюдения, мес. ■

Рис. 6. Кривая почечной выживаемости больных с МПГН (конечная точка - терминальная стадия ХБП)

В нашем исследовании 3 стадии ХБП быстрее достигали дети с дебютом в возрасте старше 13 лет. При анализе терминальной стадии ХБП возрастные отличия оказались статистически незначимыми.

По нашим данным, из клинических синдромов, факторами риска для наступления как 3, так и терминальной стадии ХБП, были нефротический синдром (р=0,04 для терминальной стадии и р=0,03 для 3 стадии ХБП) и артериальная гипертензия (р<0,05 для терминальной стадии и для 3 стадии ХБП).

Эпизоды макрогематурии у пациентов в нашем исследовании встречались чаще, чем сообщалось ранее (у 46% по сравнению с 10-20%). Однако, гематурия различной степени, в том числе макрогематурия, не ускоряла у них прогрессирование ХБП.

Одним из характерных признаков МПГН является снижение уровня Сз в сыворотке крови. Мы выявили снижение Сз у меньшего числа больных (у 24 из 59 обследованных) по сравнению с литературными данными. Это может объясняться тем, что уровень Сз в дебюте был известен только у отдельных пациентов, поэтому мы изучали уровень С:, на момент биопсии, когда большинство больных уже получали преднизолон, и у некоторых из них Сз мог нормализоваться (МсЕпегу Р.Т., е( а!.. 1980). Но наши данные об отсутствии влияния шпокомплементемии на течение МПГН согласуются с результатами предыдущих исследований (МсЕпегу Р.Т., е1 а1., 1980; БсЬллеПг Я., е1 а1., 2001).

МПГН часто сопровождается снижением СКФ уже в дебюте. По нашим данным снижение СКФ в дебюте было зарегистрировано у 17 (23,6%) пациентов. Так же как в других работах, мы обнаружили влияние этого показателя на прогрессирование

заболевания (р<0,0001 для 3 и терминальной стадии ХБГ1). При этом, если функции почек восстанавливались в течение полугода, то последующее течение МПГН практически не отличалось от течения заболевания у пациентов без снижения СКФ в дебюте. Если же нарушение функции почек сохранялось дольше б месяцев, то дальнейшее прогрессирование становилось практически неизбежным.

Анемия при МПГН часто регистрируется еще до наступления хронической почечной недостаточности. В нашем исследовании анемия была выявлена почти у 1/3 детей. Кроме того, анемия оказатась прогностическим фактором, как для 3, так и для терминальной стадии ХБП (р=0,01 и р=0,004, соответственно).

Из морфологических изменений с развитием терминальной стадии ХБП были связаны МПГН II типа (р<0,049). атрофия канальцев (р=0,03) и склеротические изменения более 20% гломерул (р=0,006).

Фокальный мембранопролиферативный ГН (п=4) отличатся относительно стабильным течением. У троих детей заболевание проявлялось гематурией в сочетании с небольшой и умеренной протеинурией, у одного из них через 4 года от дебюта присоединился нефротический синдром, у одного в дебюте имелся нефротический синдром, но на фоне иммуносупрессивной терапии удалось добиться частичной клинико-лабораторнон ремиссии. Функции почек оказатась сниженными только у ребенка с присоединившимся нефротическим синдромом, никто за время наблюдения не достиг 3 стадии ХБП.

Лечение преднизолоном (стандартный юре), аткилирующими агентами, азатиопршюм. пульсовыми введениями мегилпреднизолона значительного эффекта на течение МПГН не оказывало. С 2000 года в отделении для лечения гломерулярных заболеваний используется новый иммуносупрессивный препарат Селлсепт. По нашим данным, ремиссии у больных, получающих Селлсепт, достигаются чаще, чем при других видах терапии (р<0,05 при сравнении с каждым из других видов терапии) (табл.6).

Таблица 6.

Эффективность лечения МПГН

Терапия Ремиссия (п) Отсутствие эффекта №

Преднюолон (стандартный курс) п=32 11 41

Пульс-терапия метилпреднизожшом и яредшоолон п=]6 14

Алкилирующие агенты и преднизолон п=28 б 22

Азатиоприн и преднизолон п=7 1 б

Селлсепт и преднизолон п=11 8 3

Мембрапозпая пефропатия (п=20) проявлялась нефротическим синдромом у всех пациентов (полным у 65% и неполным у 35%), гематурия выявлялась у 65%, артериальная пшертензия - у трети.

Дети с неполным нефротическим синдромом (п=7, медиана возраста Ме=13, размах 11-14) были старше детей с развернутым нефротическим синдромом (п=13, Ме=7,1 размах 4-11) (1Г критерий, р=0,004).

Стандартный курс преднизолона привел к ремиссии у 3 из 19 детей. Хлорбутин был подключен у 7 из не ответивших на преднизолон пациентов, эффективен он был у 4, однако у 1 ремиссия была неполной, а у 2 - непродолжительной. У 1 пациента ремиссия была достигнута после присоединения Селлсепта. У одного протеинурия контролировалась только ингибиторами ангиотензинпревращающего фермента При дебюте заболевания до 8-летнего возраста, ремиссия на фоне терапии преднизолоном была достигнута у 3 из 6 детей, а при начале заболевания в более позднем возрасте, ни у кого из 13 (р=0,02). Общее число ремиссий (в том числе после присоединения цитостатиков) также различалось у детей до и после 8-летнего возраста (у 5 из 6 и у 3 из 13, соответственно) (р=0,04). Ухудшало ответ на преднизолон наличие артериальной гипертензии в дебюте: ремиссия была достигнута у 3 из 15 детей с нормальным артериальным давлением и ни у кого из 4 детей с артериальной гипертензией. Различия не достигли статистической значимости (р>0,05).

При НСМИ (п=102) заболевание проявлялось нефротическим синдромом у всех детей (развернутым - у 85, неполным - у 17). Дети, у которых НСМИ проявлялся неполным нефротическим синдромом (п=17, Ме=9,0; размах от 6 до 14) были старше детей с развернутым нефротическим синдромом (п=85, Ме=3,0; размах от 2 до 5,4) (р=0,002).

Гематурия и гиперазотемия в дебюте встречались при НСМИ редко и ассоциировались с возрастом до 2-х лет (г,=0,29; р=0,003 и гЕ=0,34; р=0,0005, соответственно).

При стероидчувствительном НСМИ возраст дебюта у детей с рецидивирующим течением (п=21, Ме=2,1; размах от 2 до 3) отличатся от возраста пациентов и со стероидзависимым нефротическим синдромом (п=37, Ме=4,0; размах от 3 до 6,3), и с нефротическим синдромом, зависимым от высоких доз кортикостероидов (п=17, Ме=6,0; размах от 3.8 до 8,3) (р=0,00004 и р=0,002, соответственно).

Стероидрезистентность при НСМИ обнаруживалась у детей всех возрастных групп, но преобладата при начате заболевания в возрасте до 2-х лет (у 14 из 23) и от 13 лет (у 4 из 7). Реже всего стероидрезистентным нефротический синдром был при дебюте в

возрасте от 2 до 6 лег (у 5 из 48), чаще он встречался у заболевших в возрасте от 6 до 12 лет (у 4 из 24).

ФСГС (п=73) у подавляющего большинства проявлялся полным нефротическим синдромом (у 72%), неполный нефротический синдром выявлялся у 20,5%. Дети с неполным нефротическим синдромом (п=14, Ме=7,8; интерквартильньш размах 5-12) были старше детей с развернутым нефротическим синдромом (п=49. Ме=5; интерквартильный размах 2-10) (р=0,03).

Артериальная гипертензия в дебюте ФСГС была свойственна детям старше 10 лет (г8=0,32; р=0,01).

По нашим данным, почечная выживаемость через 5 лет от начала заболевания ФСГС составила около 80%, через 10 лет - 58% (рис. 7).

Анализ времени до наступления исхода о Завершенные * Цензурирояшкые : 120% |—--—:———:--- . , .—:_______

110% - ■ ......

...бо%............- .. ;

&.....-.....+ —

50% —1—-■------..-;_

о 20 40 60 20 . 100 120 ко . 160 Длительность наблюдения, мес

Рис. 7. Кривая почечной выживаемости больных с ФСГС (конечная точка - терминальная стадия ХБП)

В нашем исследовании не было обнаружено влияние возраста и пола на прогрессирование ФСГС.

По результатам нашего исследования, персистирование умеренной и выраженной протеинурии значимо ускоряло прогрессирование ФСГС до 3 стадии ХБП (р=0,003). При этом дети с постоянной выраженной протеинурией значительно быстрее достигали 3 стадии ХБП, чем дети с умеренной протеинурией (р=0,04), различия в наступлении терминальной стадии ХБП не достигли статистической значимости.

Наибольшим отрицательным влиянием на функции почек обладал нефротический синдром (р=0,00005 для 3 стадии ХБП и р=0,0002 для терминальной стадии ХБП).

По нашим данным, артериальная гипертензия и гематурия не являлись прогностическими признаками при ФСГС.

Сывороточный креатинин в дебюте был повышен у 7 из 68 пациентов, у всех повышение было транзиторным. Влияния этого показателя на прогрессирование ФСГС обнаружено не было.

По нашим данным, на первый 8-недельный курс преднизолона ответили 23 % из 66 детей его получавших. Ответ на преднизолон был полным у 10 детей (15 % от общей группы), частичным у 5 (8 % от общей группы), еще у 7 (11 % от общей группы) развилась вторичная стероидрезистентность. Такой режим терапии преднизолоном применяется для лечения первичного нефротического синдрома согласно рекомендациям International Study of Kidney Disease in Children (Международные исследования заболеваний почек у детей) (ISKDC, 1981; Yoshikavva N., et al., 1986). При лечении ФСГС по такой схеме ремиссии редко превышают 30%. Однако, Pei с соавторами и Cattran и Rao сообщили о 44% ремиссий у взрослых и детей с первичным ФСГС при увеличении продолжительности первоначального курса преднизолона (в среднем до 6 месяцев) (Pei Y., et al., 1987; Cattran DC., Rao P., 1998).

По результатам нашего исследования, отсутствие ответа на терапию преднизолоном (с учетом вторичной стероидрезистентности) ускоряло прогрессирование ФСГС (р=0,05 для 3 стадии ХБП и р=0,02 для терминальной стадии ХБП), что соответствует литературным данным (Cattran D C., Rao P., 1998; Chun M.J., et al., 2004; Gipson D.S., et al., 2006).

У стероидрезистентных пациентов мы применяли пульс-терапию метилпреднизолоном, аткилирующие агенты и циклоспорин А. По нашим данным, наиболее эффективной терапией при ФСГС у детей является сочетание циклоспорина А (Сандиммун-неорат) с кортикостероидной терапией, в том числе в сверхвысоких дозах. Ремиссии были достигнуты у 50 % пациентов при использовании в лечении Сандиммуна-неорала с преднизолоном и у 76 % - при включении в эту схему пульсовых введений метилпреднизолона.

Нам также удалось доказать, что достижение ремиссии у стероидрезистентных больных имеет прогностическое значение (р=0,00007 и р=0,00001, соответственно). Это согласуется с данными исследования Cattran (Cattran D C., et al., 1999).

По результатам нашей работы, с ухудшением почечной выживаемости и ускорением прогрессирования до 3 стадии ХБП была связана атрофия канатьцев (р=0,04 и р=0,01, соответственно) и инфильтрация интерстиция (р=0,05 и р=0,03, соответственно). Глобальный склероз более 20% гломерул ускорял прогрессирование до 3 стадии ХБП (р=0,05), влияния этого показателя на почечную выживаемость за время наблюдения не обнаружено.

По нашим данным, независимым фактором ирогрессирования было отсутствие ремиссии заболевания, никакие гистологические признаки не вошли в число независимых факторов.

3. Врожденный и инфантильный нефротнческий синдром

В возрасте до года заболели 29 детей. 12 из них были с врожденным, а 19 - с инфантильным нефротическим синдромом.

У половины детей с врожденным нефротическим синдромом гистологическая картина образцов почечной ткани соответствовала ВНС финского типа, у остальных диффузному мезангиатьному склерозу и ФСГС.

У детей с инфантильным нефротическим синдромом при морфологическом исследовании в основном выявлялись минимальные изменения, ФСГС, реже -мембранозная нефропатия. Инфантильный нефротнческий синдром у 14 из 17 детей характеризовался стероидрезистентностью, у 6 нз них ремиссию удаюсь получить на фоне терапии ЦсА.

Молекулярно-генетический анатиз был проведен у 15 детей, заболевших до года При врожденном нефротическом синдроме NPHS1 мутации обнаружены у 6 из 6 обследованных, мутация NPHS2 была найдена у 1 из 4 обследованных.

В нескольких исследованиях из Европы и стран Ближнего Востока было показано, что у 10% -30% пациентов со спорадическим СРНС, он был вызван мутациями в гене NPHS2 (Boute N., et al., 2000; Karle S M., et al„ 2002)

По нашим данным, из 35 детей со спорадическим СРНС в возрасте от 3 месяцев до 15 лет NPHS2 мутации были выявлены в 17% случаев. При этом все дети со спорадическим СРНС, вызванным мутацией в гене NPHS2, заболели в возрасте до года. Всего из заболевших в этом возрасте было обследовано 7 детей и 5 из них (71%) были с гомозиготными или компаунд гетерозиготными NPHS2 мутациями.

NPHS2 мутации были выявлены также у 2 детей с семейным нефротическим синдромом, заболевших в возрасте 6 и 7 лет. Наиболее часто выявлялась новая мутация Е87Х (у 4 из 7, причем у 3 в гомозиготном положении), второй по частоте была известная мутация, широко распространенная в Европе, R138Q (у 2 из 7, у обоих в гетерозиготном положении).

4. Значение маркеров острого почечного повреждения для ХБП, развившейся в результате гломерулярных заболевании

С целью поиска более специфичных показателей состояния функций почек, чем сывороточный креатинин, мы изучили 3 новых биомаркера: интерлейкин 18, кластерлн и

липокалин-2. Все они являются маркерами острого почечного повреждения, а их значение для ХБП, развившейся в результате первичных гломерулярных заболеваний, только изучается. Кроме того, предполагается, что интерлейкин18 и кластерин могут участвовать в патогенезе гломерулярных заболеваний.

Икгерлейкин 18 (IL-18) является провоспалительным цитокином, опосредующим воспаление и ишемическое повреждение многих органов. Наиболее доказано участие IL-18 в иммунном ответе Т-хелперных клеток 1 типа (Th 1) (Fantuzzi G., Dinarello С.А., 1999). Но IL-18 не является эксклюзивным стимулятором только Th 1 иммунного ответа, он может участвовать и в Th 2 типе иммунитета, например, при отсутствии IL-12 (Xu D., et al., 2000; Yoshimoto Т., et al., 2000).

Исследования, касающиеся участия IL-18 в Th 2 иммунном ответе немногочисленны (Printza N., 2008). Мало изучалось клиническое значение IL-18, в том числе у детей с нефротическим синдромом (Matsumoto К., Kanmatsuse К., 2001).

При анализе уровней IL-18 в сыворотке крови в референтной группе были выявлены различия его содержания в зависимости от возраста У детей до 6 лет медиана составила 319,8 пг/мл (интерквартильный размах от 64,8 до 339,8 пг/мл), тогда как в возрасте старше 6 лет медиана равнялась 60,4 пг/мл (интерквартильный размах от 29 до 116,2 пг/мл) (р=0,02).

Исследование содержания IL-18 в моче в пересчете на креатинин в референтной группе выявило, что у здоровых детей медиана и интерквартильный размах составили 15,5 пг/мг креатинина (от 6,1 до 23,1 пг/мг кр.) вне зависимости от возраста.

Уровень сывороточного IL-18 у обследованных нами стероидчувствительных пациентов не превышал референтных значений ни в активную стадию, ни в стадию ремиссии.

Уровень IL-18 в моче у стероидчувствительных пациентов в активной стадии (Ме=274,5 пг/мг кр.; интерквартильный размах от 104 до 336,6 пг/мг кр.) был значимо выше, чем в стадии ремиссии (Ме=14,2 пг/мг кр.; интерквартильный размах от 3,7 до 28,5 пг/мг кр.) и у детей референтной группы (Ме=15,5 пг/мг кр.; интерквартильный размах от 6,1 до 23,1 пг/мг кр.) (р<0,0001 и р=0,0001, соответственно).

При стероидчувствительном нефротическом синдроме наблюдалась положительная корреляционная связь между IL-18 в моче и протеинурией. Коэффициент корреляции Спирмена (rs=0,63, р<0,0001) (рис. 8).

450 400 350

J 300

? 250

: 2

| 200

| 150

5 100

: 50 0 -50

-2 0 ' 2 ' i 8 8 10 протеинурия (г/л)

Рис. 8. Корреляция уровня IL-18 в моче и протеинурии при стероидчувствительном нефрогическом синдроме

При стероидрезистентном нефротическом синдроме повышенные значения сывороточного IL-I8 наблюдались в основном при пролиферативных гломерулярных заболеваниях (Ме=473 пг/мл; интерквартильный размах от 420,4 до 515,4 пг/мл и Ме=60,4 пг/мл; интерквартильный размах от 29 до 116,2 пг/мл, соответственно) (р=0,001).

При стероидрезистентном нефротическом синдроме сравнительный анализ трех морфологических групп (МПГН и МезПГН из-за малочисленности были объединены в одну группу пролиферативных гломерулопатий) выявил статистически значимые различия уровня IL-18 в моче при отсутствии ремиссии: при НСМИ медиана составляла 122,6 пг/мг кр.; интерквартильный размах от 67,8 до 468,3 пг/мг кр., при ФСГС - Ме=42,5 пг/мг кр.; интерквартильный размах от 19.3 до 83,7 пг/мг кр., при пролиферативных гломерулопатиях - Ме=7.3 пг/мг кр.; интерквартильный размах от 7,1 до 10 пг/мг кр. (р=0,0004). При пролиферативных формах гломерулопатий отмечена диссоциация между повышением концентрации IL-18 в сыворотке крови и нормальными его значениями в моче.

Кластерин (аполипопротеин J) - это высококонсервативный гликопротеин с молекулярной массой 75-80 кДа (Fritz I.B., 1992). Ассоциация кластерина с иммунными отложениями в экспериментальных моделях и при гломерулонефрите у человека указывает на его способность модулировать ответ на индуцированное иммунными комплексами повреждение (Rosenberg М.Е., 2002).

О / /.........

■■■■■■ ' ............° - - /: ■ /

:" ' °

с

/ /''

- - .•' ,/' /

.''/'у'

у

Медиана уровней кластерина в сыворотке крови в референтной группе (п=14) равнялась 40,4 мкг/мл (интерквартильный размах от 29,8 до 61,9 мкг/мл). Исследование содержания кластерина в моче в пересчете на креатинин в референтной группе выявило, что у здоровых детей медиана и интерквартильный размах составляет 8,0 нг/мг креатинина (от 2,3 до 16,1 нг/мг кр.). Показатели не зависели от возраста.

Концентрация кластерина в сыворотке крови у стероидрезистентных больных в активную стадию (Ме=6,66 мкг/мл; интерквартильньш размах от 5,82 до 28,81 мкг/мл) была значимо ниже, чем в стадию полной ремиссии (Ме=44,15 мкг/мл; интерквартильный размах от 22,85 до 122,76 мкг/мл) и в референтной группе (р=0,01 и р=0,0003, соответственно).

При выделении различных морфологических групп было установлено, что для НСМИ (п=5) характерны нормальные значения сывороточного кластерина в активной стадии заболевания (Ме=35,63 мкг/мл; интерквартильный размах от 31,28 до 43,55 мкг/мл) в отличие от ФСГС (п=7) и пролиферативных гломерулярных заболеваний (п=4) (Ме=6,02 мкг/мл; интерквартильный размах от 5,61 до 6,85 мкг/мл и Ме=6,23 мкг/мл; интерквартильный размах от 4,99 до 6,46 мкг/мл, соответственно). Различия статистически значимы (р=0,007) (рис. 9).

Рис. 9. Уровень сывороточного кластерина при рецидиве стероидрезистентного нефротического синдрома у детей с НСМИ, ФСГС и мезангиопролиферативным ГН.

У детей со стероидчувствительным нефротическим синдромом содержание кластерина в крови не определялось.

У стероидрезистентных пациентов в активной стадии (п=14) уровень кластерина в моче в пересчете на креатинин (Ме=1,4 нг/мг кр.; интерквартильный размах от 0,5 до 4,3 нг/мг кр.) был значимо ниже, чем у детей в стадии неполной ремиссии (п=14) (Ме=6,1 ht/мг кр.; интерквартильный размах от 3,1 до 12,0 нг/мг кр ), в стадии полной ремиссии (п=22) (Ме=14,7 нг/мг кр.; интерквартильный размах от 4,4 до 61,2 нг/мг кр.) и в контрольной группе (р=0,003, р=0,002 и р=0,005, соответственно).

Морфологические группы по содержанию кластерина в моче не различались (р=1,0).

У детей со стероидрезистентным нефротическим синдромом, начавших получать терапию Сандиммуном неоралом до -5-ти летнего возраста (п=14), через 20 мес от начала лечения, уровень кластерина/кр. в моче (медиана 16,7 нг/мг кр.; интерквартильный размах от 3,3 до 71,8 нг/мг кр.) был значимо выше, чем у детей, у которых терапия циклоспорином А была начата в более позднем возрасте (п=14) (медиана 3,8 нг/мг кр.; интерквартильный размах от 0,6 до 11,7 нг/мг кр.) р=0,02 и у детей, не получавших ЦсА (п=7) (медиана 1,8 нг/мг кр.; интерквартильный размах от 1,0 до 6,3 нг/мг кр.) р=0,037.

Наименьшим уровень кластерина/кр в моче был у детей со стероидрезистентным нефротическим синдромом, у которых ремиссия не наступила в течение последующего года (п=4) (медиана 0,1 нг/мг кр.; интерквартильный размах от 0 до 0,4 нг/мг кр.) по сравнению с детьми в активной стадии, у которых ремиссия была достигнута (п=10) (медиана 2,2 нг/мг кр.; интерквартильный размах от 1,0 до 5,6 нг/мг кр.) р=0,005.

Пять детей со стероидрезистентным нефротическим синдромом с выпадающими значениями кластерина в моче (медиана 297,0 нг/мг кр.; интерквартильный размах от 247,4 до 305 нг/мг кр.), не включенных в основной статистический анализ, находились в активной стадии заболевания и получали Сандиммун-неорал в сочетании с преднизолоном. Четверо из них начали получать Сандиммун неорал в возрасте до 2-х лет. Длительность терапии не превышала 1 года. Возраст этих детей на момент обследования (Ме=2 года, интерквартильный размах от 2 до 3 лет) был значимо меньше, чем у детей, которые получали такую же терапию, но значения кластерина в моче у которых не были выпадающими (Ме=13,5 года, интерквартильный размах от 6 до 16 лет) р=0,007. У 3 из этих 5 детей заболевание носило прогрессирующий характер, им потребовалось подключение диализа и/или трансплантация почки, еще у 1 отмечалось повышение уровня сывороточного креатинина.

У стероидчувствительных пациентов с выраженной протеинурией на момент обследования (п=8) уровень кластерина в моче (Ме=2,2 нг/мг кр.; интерквартильный размах от 0 до 7,8 нг/мг кр.) был ниже, чем в референтной группе и у

стероидчувствительных больных в стадии ремиссии (п=30) (Ме=10,3 нг/мг кр.; интерквартильный размах от 2,5 до 30,9 нг/мг кр.) р=0,02 и р=0,01, соответственно.

У 5 детей со стероидчувствительным нефротическим синдромом показатели кластерина в моче остались низкими в стадии ремиссии, 4 из них были зависимыми от высоких доз преднизолона. Среди стероидчувствительных детей с нормальными значениями кластерина в моче в стадии ремиссии зависимыми от высоких доз преднизолона оказались 3 из 25 (р=0,006).

Не было выявлено отличий в содержании кластерина в моче при стероид-чувствительном и стероидрезистентном нефротическом синдроме в активной стадии.

По нашим данным, выявление повышенного уровня кластерина в моче у детей с нефротическим синдромом указывает на повреждение канальцев, не связанное с клубочковой протеинурией, возможно вызванное ЦсА нефротоксичностью. Повышенные значения кластерина в моче были выявлены нами у детей младшего возраста, получавших ЦсА.

Известно, что тубуло-интерстициальные изменения играют ведущую роль в прогрессировании первичных гломерулярных болезней [Eddy A.A., Neilson E.G., 2006]. Мы изучили новый биомаркер раннего повреждения канальцев липокалин-2, также называемый NGAL (нейтрофильный желатиназассоциированный липокалин) у детей с I и II стадиями ХБП в результате первичных гломерулярных заболеваний.

Медиана уровней липокалина-2 в сыворотке крови в референтной группе (п=14) равнялась 23 нг/мл (интерквартильный размах от 0,5 до 41,6 нг/мл). Исследование содержания липокалина-2 в моче в пересчете на креатинин в референтной группе показало, что у здоровых детей медиана и интерквартильный размах составляют 0,2 нг/мг креатинина (от 0,04 до 2,8 нг/мг кр.). Показатели не зависели от возраста.

При стероидчувствительном нефротическом синдроме показатели липокалина-2/креатинин в моче в активную стадию были выше, чем в референтной группе (Ме=3,5 нг/мг кр; интерквартильный размах от 2,1 до 22,9 нг/мг кр. и Ме=0,2 нг/мг кр; интерквартильный размах от 0,04 до 2,8 нг/мг кр., р=0,02). Между собой активная стадия и стадия ремиссии у стероидчувствительных пациентов по содержанию липокалина 2/креатинин в моче также различались (Ме=3,5 нг/мг кр; интерквартильный размах от 2,1 до 22,9 нг/мг кр. и Ме=0,9 нг/мг кр; интерквартильный размах от 0,6 до 2,0 нг/мг кр., р=0,02). Уровень липокалина 2/креатинин в моче у стероидчувствительных пациентов в стадию ремиссии не отличался от этого показателя в референтной группе (р=0,12).

При стероидчувствительном нефротическом синдроме уровень липокалина 2/креатинин в моче коррелировал с протеинурией (rs=0,34; р=0,04).

При стероидрезистентном нефротическом синдроме как в активной стадии, так и в стадиях неполной и полной ремиссии содержание липокалина-2/креатинин в моче значимо превышало таковое в референтной группе (Ме=10,1 нг/мг кр; интерквартильный размах от 4,1 до 57,4 нг/мг кр; Ме=4,0 нг/мг кр.; интерквартильный размах от 1,9 до 7,0 нг/мг кр.; Ме=1,1 нг/мг кр.; интерквартильный размах от 0,6 до 4,6 нг/мг кр. и Ме=0,2 нг/мг кр; интерквартильный размах от 0,04 до 2,8 нг/мг кр. и критерий, р=0,0001; р=0,0004 и р=0,03, соответственно).

Уровни липокалина-2/креатинин в моче в активной стадии, стадиях неполной и полной ремиссии статистически значимо различались между собой (р=0,01). При последующем попарном сравнении при наличии выраженной протеинурии содержание липокалина-2/креатинин в моче было значимо выше, чем при небольшой протеинурии (р=0,045) и при ее отсутствии (р=0,006). После применения поправки Бонферрони статистически значимыми остались различия между выраженной протеинурией и ее отсутствием.

При стероидрезистентном нефротическом синдроме выявлена прямая корреляционная связь уровня липокалина-2/креатинин в моче с протеинурией (г3=0,49; р=0,0001) (рис. 10) и выраженностью тубуло-интерстициальных изменений (г5=0,77; р=0,000) (рис. 11).

Рис. 10. Корреляция уровня липокалина-2/креатинин в моче и протеинурии при стероидрезистетном нефротическом синдроме

260 240 220 200

J 160

s. 160

X

§ 140

S 120

CL

1 100 I 80

o

f. 60 40 20 0 -20

Рис. 11. Корреляция уровня липокалина-2/креатинин в моче и выраженности ТИИ при стероидрезистетном нефротическом синдроме

0

О

......° .........о..... ..............о.........

2 3

выраженность ТИИ (баллы)

Сывороточный липокалин-2 обратно коррелировал с СКФ при стероидрезистентном нефротическом синдромом (rs=-0,7; р=0,0001) (рис. 12).

180 160 140 120

с

| 100 СЧ

í 80 с

| 60 с

40 20 0 -20

40 60 80 100 120 140 160 180

СКФ

Рис. 12 Корреляция уровня липокалина-2 в крови и СКФ при стероидрезистентном нефротическом синдроме

При выделении стероидрезистентных больных с нормальной СКФ в стадии ремиссии было обнаружено, что при дебюте заболевания в возрасте до 2-х лет уровень липокалина/креатинин в моче превышал нормальные значения у 6 из 8 детей, а при

дебюте в возрасте старше 2-х лет - у 8 из 27 (р-0,03); если длительность терапии циклоспорином А была равна или превышала 36 месяцев, уровень липокалина/креатишш в моче был повышенным у 7 из 10 детей, при меньшей длительности терапии - у 5 из 22 (р=0,02); при длительности заболевания > 36 мес, повышение уровня липокалина/креатинин в моче было выявлено у 10 из 19 детей, а при меньшей длительности - у 4 из 16 (различия статистически незначимы).

У стероидчувствительных пациентов с нормальной СКФ в стадии ремиссии повышение уровня липокалина/креатинин в моче не зависело от возраста дебюта (он не был повышен у 2 детей, заболевших в возрасте до 2-х лет и был повышен у 5 из 22 детей с дебютом заболевания в возрасте старше 2-х лет), длительности болезни (он был повышен у 3 из 20 детей при длительности болезни > 36 мес, и у 2 из 9 детей при длительности болезни < 36 мес), но зависаю от длительности терапии циклоспорином А; повышение было констатировано у 3 из 6 детей при длительности терапии > 36 мес и у 2 из 23 детей при длительности терапии < 36 мес (р=0,04.'5).

На основании результатов наших исследований, можно сделать вывод, что возраст младше 2-х лет у детей со стероидрезистентным нефротическим синдромом и длительность терапии циклоспорином А более 36 мес являются предрасполагающими факторами к повреждению канальцев.

Таким образом, в работе представлена современная структура гломерулярных заболеваний по данным нашей клиники, установлены их возрастные особенности. Мы дали клинико-лабораторную характеристику каждой из морфологических форм первичных гломерулопатий, охарактеризовали течение, выделив факторы прогрессирования. Важную диагностическую и прогностическую информацию несут изученные нами биомаркеры.

На основании результатов собственных исследований нами предложена концепция, согласно которой развитие и течение гломерулярных заболеваний зависит от взаимодействия: 1) генетических факторов, предопределяющих или предрасполагающих к возникновению заболевания; 2) факторов окружающей среды, изменение которых приводит к изменению структуры гломерулярных заболеваний и 3) факторов прогрессирования, которые определяют скорость снижения функций почек у детей с гломерулярными заболеваниями.

Выводы

В структуре первичных гломерулярных заболеваний у детей преобладает нефротический синдром с минимальными изменениями, за последние 15 лет увеличилась частота фокально-сегментарного гломерулосклероза, достигшего 21%, уменьшилась частота мембранопролиферативного гломерулонефрита до 7%. Наиболее выраженные изменения в структуре гломерулярных заболеваний отмечены у детей старшей возрастной группы.

2. Распределение первичных гломерулярных заболеваний у детей зависит от возраста их дебюта: у детей до года чаще всего встречаются гломерулярные заболевания, связанные с мутациями подоцитарных генов, в возрасте 1-6 лет преобладает нефротический синдром с минимальными изменениями, в возрасте старше 6 лет -иммунокомплексные гломерулярные заболевания.

3. Возраст начала болезни влияет на клинико-лабораторные симптомы гломерулярных заболеваний. МПГН у детей с дебютом в возрасте старше 11 лет наиболее часто проявлялся сочетанием нефротического и нефритического синдромов, у детей с дебютом до 6 летнего возраста в 37,5 % случаев характеризовался изолированным мочевым синдромом. Не-1уА- мезангиопролиферативный гломерулонефрит у детей, заболевших до 6 летнего возраста, проявлялся в основном нефротическим синдромом, у детей с дебютом в возрасте от 6 до 10 лет - изолированным мочевым синдромом, а у заболевших в возрасте старше 11 лет частота нефротического синдрома, изолированного мочевого синдрома и сочетания нефротического и нефритического синдромов были одинаковыми.

Первичные гломерулярные заболевания имеют особенности клинических проявлений в зависимости от возраста дебюта: при одних и тех же морфологических формах гломерулярных заболеваний, дети с такими клиническими проявлениями как артериатьная гипертензия и неполный нефротический синдром, достоверно старше детей, у которых они отсутствуют.

Скорость прогрессирования гломерулярных заболеваний зависит от возраста. При ^А-нефропатии и не-1§А мезангиопролиферативном гломерулонефрите скорость клубочковой фильтрации быстрее

снижается у детей, заболевших в возрасте старше 10 лет, при мембранопролиферативном гломерулонефрите - у детей с дебютом в возрасте старше 13 лет. Наиболее благоприятно протекают гломерулярные заболевания при дебюте в возрасте от 2 до 6 лет, единственным гломерулярным заболеванием, имеющим прогрессирующее течение в этом возрасте, является ФСГС. Не-!§А мезангиопролиферативный гломерулонефрит представлен неоднородной группой болезней и включает гломерулонефриты с преимущественным отложением в мезангиуме 1о\1 и 1аО, каждый из которых имеет свои клинико-лабораторные особенности. ^М-меангиопролифератнвнын гломерулонефрит начинается в среднем в возрасте 5.5 лет, наиболее часто проявляется нефротическим синдромом, в 50% - стероидрезистентным, у большинства - в сочетании с гематурией. Основным проявлением ^С-мезангиопролиферативного гломерулонефрита является гематурия, в наших наблюдениях этот вариант ГН прогностически благоприятен.

Мутации МРНН2 клинически проявляются до 6-летнего возраста. Из мутаций Д'Ж2 в России наиболее часто встречается не описанная ранее мутация Е87Х. Гломерулярные заболевания, вызванные мутациями N¡'N32, не имеют специфических фенотипических, клинических и гистологических признаков.

Причиной первичного врожденного нефротического синдрома у российских детей в основном являются мутации, но могут

обнаруживаться и №Н52 мутации.

Эффективность и осложнения иммуносупрессивной терапии при нефротическом синдроме зависят от возраста. Ремиссии чаще достигаются у детей, заболевших в возрасте 2-6 лет. Артериальная гапертензия на фоне терапии чаще присоединяется у детей старшего возраста, нефротоксичному действию препаратов более подвержены дети младшего возраста.

Интерлейкин-18 участвует в развитии нефротического синдрома у детей, обусловленного как НСМИ и ФСГС, так и пролиферативными формами гломерулярных заболеваний. Различия в степени и длительности активации интерлейкина-18 при нефротическом синдроме зависят от возраста и от характера морфологических изменений

клубочков. Референтные значения интерлейкина-18 в крови у детей зависят от их возраста.

10. Для активной стадии нефротического синдрома характерны низкие

значения кластерина как в крови, так и в моче. Выраженный дефицит кластерина отрицательно влияет на течение заболевания как у стероидчувствительных, так и у стероидрезистентных пациентов: у первых самые низкие цифры кластерина в моче ассоциировались с зависимостью от высоких доз преднизолона, у вторых - с резистентностью к различным видам терапии. Содержание кластерина в моче выше 200 нг/мг креатинина свидетельствует о повреждении канальцев и высокой вероятности прогрессирующего течения заболевания

П. Уровень липокачина в крови является чувствительным показателем

состояния клубочковой фильтрации у детей с гломерулярными заболеваниями, проявляющимися нефротическим синдромом. Повышение уровня липокалина в крови свидетельствует о снижении СКФ. Показатель липокалин/креатинпн мочи соответствует выраженности тубуло-интерстициальных изменений.

12. Наиболее эффективными препаратами для достижения ремиссии

стероидрезистентного нефротического синдрома являются: при МПГН -Селлсепт, при ФСГС - сочетанное применение Сандиммуна-неорала и терапевтических, в том числе сверхвысоких, доз преднизолона, при не-1яА мезангиопролиферативном гломерулонефрите - Сандиммун неорал и Селлсепт.

Практические рекомендации

1. У детей с инфантильным нефротическим синдромом молекулярно-генетическое исследование на мутации в гене ЫРН$2 необходимо проводить до начата терапии кортикостероидами и до нефробиопсии.

2. При решении вопроса об отмене терапии у детей с мембранопролиферативным гломерулонефритом в стадии ремиссии следу ет учитывать концентрацию 1Ь-18 в крови.

3. При выявлении высокого уровня кластерина в моче при назначении циклоспорина А, необходимо проведение нефробиопсии для исключении нефротоксичности.

4. У детей с мембранопролиферативным гломерулонефритом I типа в терапию рекомендуется включать микофенолата мофетил.

5. Для уточнения функций почек у детей с нефротическим синдромом предлагается исследовать уровень липокалина-2 в сыворотке крови.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Voznesenskaya Т., Sergeeva Т. The response of nephrotik syndrome to a therapy in children with different forms of primary glomerulonephritis // Abstracts of 33rd Annual Meeting of the European Society for Paediatric Nephrology,- Prague, 1999.-P. 127.

2. Сергеева ТВ., Цыгин АН., Тимофеева А.Г., Вознесенская Т.С. Протоколы применения кортикостероидов при гломерулонефрите у детей // Международный журнал медицинской практики.-2000.-№6.-С.64-6б.

3. Вознесенская Т С., Сергеева ТВ., Цыгин АН. Пульс-терапия солумедролом при гломерулолнефрите у детей // Материалы 2 съезда педиатров-нефрологов России. Москва, 2000. - С. 27.

4. Вознесенская Т.С., Сергеева ТВ., Цыган АН. Артериальная гипертония у детей с мембранопролиферативным гломерулонефритом // Материалы 2 съезда педиатров-нефрологов России. Москва, 2000. - С. 27.

5. Сергеева Т.В., Цыгни А.Н., Чумакова О.В., Вознесенская Т.С., Вашурина Т.В., Гаранкина Т.И., Гозалишвили Т.В., Кутафина Е.К., Кучеренко А.Г., Маткеримов ДА., Сенцова Т.Е. Факторы прогрессирования гломерулонефрита у детей II Российский педиатрический журнал.-2000.- №5,- С.20-22.

6. Сергеева Т.В., Цыгин АН., Вознесенская Т.С., Чумакова О.В., Комарова О.В., Кутафина Е.К. Лечение гломерулонефрита у детей // Методические рекомендации для врачей,- М., 2001,- 28 С.

7. Вознесенская Т.С., Зябкнна А.Г., Сергеева Т.В. Применение низкомолекулярного гепарина-фрагмина при нефротическом синдроме у детей II Нефрология и диализ. -2002. -Т.4. -№1.-С.38-40.

8. Вознесенская Т.С., Сергеева Т.В. Нефротический синдром при болезни минимальных изменений (почки), фокально-сегментарном гломерулосклерозе и фокальном мезангпопролиферативном гломерулонефрите // Терапевтический архив. - 2002. -Т. 74. - №6,- С.31-33.

9. Вознесенская Т.С., Сергеева Т.В. Применение селлсепта (мофетила микофенолата) в терапии детей с нефротическим синдромом // Тезисы докладов IX Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - Москва, 2002. -С. 405.

10. Вознесенская Т.С., Сергеева Т В., Варшавский В.А., Дмитриенко С.В. Эффективность мофетила микофенолата при стероидрезистентном нефротическом синдроме у детей // Материалы II Российского Конгресса «Современные методы диагностики и лечения в детской нефрологии и урологии»,- Москва, 2002. -С.71-72.

11. Цыгин А.Н., Вознесенская Т.С., Панкратенко Т.Е., Сикачев А Н., Тимофеева А.Г., Сергеева Т.В. Ингибиторы ангиотензинконвертирующего фермента и прогрессирование гломерулопагий у детей // Материалы II Российского Конгресса «Современные методы диагностики и лечения в детской нефрологии и урологии» -Москва, 2002. -С.85.

12. Voznesenskaya Т., Sergeeva Т., Varshavskiy' V., Thoumakova О. Micophenolate Mofetil (Cellcept) in Therapy of Nephrotic Syndrome in Children // Abstracts of international congress «Progress in neonatal intensive care and pediatric nephrology». Swiss-Polish Comission PMU. -Katowice, 2002. - P. 20.

13. Сергеева ТВ., Цыгин АН., Вознесенская Т.С. Современная иммуносупрессивная терапия в педиатрии. Лечение стероидрезистентного нефротического синдрома у детей // Материалы I Российского конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирурпш».- Москва, 2002 г.- С. 5-7.

14. Вознесенская Т.С., Сергеева Т.В. Лечение нефротического синдрома // В кн.: Руководство по фармакотерапии и детской хирургии. Том 3: Нефрология. Под редакцией М.С. Игнатовой/ Под общей редакцией А.Ю. Царегородцева, В.А. Таболина. - М.: Медпрактика. - М, 2003. - 436 С.

15. Вознесенская Т.С., Кутафнна Е.К., Гордеева Г.Ф., Сергеева Т.В., Боровик Т.Э. Влияние Шз полиненасыщенных жирных кислот на показатели липидного обмена у детей с нефротическим синдромом // Вопросы детской диетологии.- 2003,- №2.-С. 90-93.

16. Вознесенская Т.С., Сергеева Т.В. Мофетнла микофенолат в терапии нефротического синдрома у детей II Нефрология и диализ. -2003,- т.5, № 1, -С. 4547.

17. Сергеева Т.В., Вознесенская Т.С., Цыгин А.Н. Новое в лечении нефротического синдрома // Педиатрическая фармакология.- 2003.- т.1, № 2.-С. 10-13

18. Кутафина Е.К., Боровик Т.Э., Вознесенская Т.С. Коррекция некоторых нарушений липидного обмена у детей с нефротическим синдромом // Сборник материалов VII Всероссийского конгресса «Здоровое питание населения России». -Москва, 2003,- С. 81-82.

19. Сергеева Т.В., Вознесенская Т.С., Цыгин А.Н.Первый опыт применения в России мофетнла микофенолата (Селлсепта) для лечения нефротического синдрома у детей // Материалы IX конгресса педиатров России. «Актуальные проблемы педиатрии».-Москва, 2004,- С. 382.

20. Цыган А.Н., Вознесенская Т.С., Варшавский В.А., Сергеева Т.В. Лечение фокально-сегментарного гломерулосклероза у детей циклоспорином А // Материалы IX конгресса педиатров России. «Актуальные проблемы педиатрии»,- Москва, 2004,- С. 444.

21. Tsvgin A., Voznesensky Т., Varshavsky V.. SergeevaT. Treatment of focal and segmental glomerulosclerosis in children with methylprednisolone pulses and cyclosporine A // International workshop. Treatment strategies in idiopathic nephrotic syndrome. - Basel, Switzerland, 2004.

22. Voznesenskava Т., Sergeeva Т., Varshavsky V„ Tsygin A. Effect of mycophenolate mofetil in nephrotic children // Abstracts of the thirteenth international congress of the International Pediatric Nephrology Association.- Adelaide, 2004. - C.220.

23. Tsygin A., Voznesenskaya Т., Varshavsky V., Sergeeva T. Cyclosporine A in focal and segmentary glomerulosclerosis in children // Abstracts of the thirteenth international congress of the International Pediatric Nephrology Association.- Adelaide, 2004. - C. 145.

24. Вознесенская Т.С. Эффективность и токсичность циклоспорина А. Мониторинг концентрации // Нефрология и диализ. - 2005. - Т.7, №2. -С. 135-138,

25. Цыгин А.Н., Сергеева Т.В., Вознесенская Т.С., Панкратенко Т.Е., Дмитриенко С.В. Успешное применение Селлсепта при вторично стероидрезистентном нефротическом синдроме // Врач.-2006.-№10.-С.31-35

26. Voznesenskaya Т., Sergeeva Т., Tsygin A. Mycophenolate Mofetil treatment in children with primary membraneproliferative glomerulonephritis // Abstracts of 40th Annual Meeting of the European Society for Paediatric Nephrology.- Palermo, Italy, 2006.-P.366.

27. Вознесенская T.C., Шарнова Ж.П., Цыгин АН., Сергеева Т.В. Инфантильный первичный нефротический синдром (по данным одного нефрологического центра) // Сборник тезисов V Российского конгресса детских нефрологов. - Воронеж 2006 -С.41-42.

28. Tikhomirov Е., Averyanova N., Bayazutdinova G., Voznesenskaya Т., Tsygin A. Novel human pathological mutations. Gene symbol: NPHS2. Disease: steroid-resistant nephrotic syndrome // Human Genetics.- 2007,- V.122(5).-P.548-549.

29. Тимофеева А.Г., Сергеева Т.В., Маргиева Т.В., Вознесенская Т.С., Комарова О.В., Цыгнн А.Н. Эффективность иммуносупрессивной терапии при нефротическом синдроме у детей II Вопросы современной педиатрии. -2007.-Т6, Л"«5.-С.113-116.

30. Цыгин АН., Тимофеева А.Г., Вознесенская Т.С., Панкратенко Т.Е. Нефротический синдром // В кн.: Рациональная фармакотерапия детских заболеваний. Под ред. Баранова А. А., книга I.-M, 2007,- С. 1024-1026.

31. Комарова О.В., Цыгин А.Н, Леонова Л.В, СергееваТ.В, Батурина Т В., Зробок О.А., Вознесенская Т.С., Картамышева Н.Н., Маргиева ТВ, Тимофеева А.Г. Динамика уровня сывороточного креатинина у детей с фокально-сегментарным гломерулосклерозом (ФСГС) в условиях терапии циклоспорином А. // Нефрология и диализ,- 2007,- Т.9, №3.-С.254.

32. Tikhomirov Е., Averyanova N., Voznesenskaya Т., Tsygin A. Novel human pathological mutations. Gene symbol: NPHS1. Disease: Congenital nephrotic syndrome, Finnish type II Human Genetics. -2008,- V.124(3).-P.304

33. Tikhomirov E., Voznesenskaya Т., Tsygin A. Novel human pathological mutations. Gene symbol: Nl'HSl. Disease: Congenital nephrotic syndrome, Finnish type II Human Genetics. -2009,- V.125(3).-P.334.

34. Вознесенская T.C, Тихомиров EE.. Аверьянова НС, Цыгин АН, Сергеева ТВ. Мутации NPHS1 и NPHS2 у детей с врожденным и инфантильным нефротнческим синдромом // Материалы VI Съезда Российского общества медицинских генетиков. -Ростов-на-Дону, 2010,- С. 39.

35. Voznesenskaya Т, Tikhomirov Е, Averyanova N, Tsygin A. Mutations in NPHS1 in Russian Patients with Finnish-Type Congenital Nephrotic syndrome // Abstracts of the 15th international congress of the International Pediatric Nephrology Association -New York 2010.-P.1921.

36. Tsygin A, Tikhomirov E„ Leonova L, Voznesenskaya T, MargievaT. NPHS2 mutations as a cause of childhood steroid-resistant focal and segmentary glomerulosclerosis/minimal change disease (FSGS/MCD) in central Russia // Abstracts of the 15th international congress of the International Pediatric Nephrology Association.-Nevv York, 2010.-P. 1885.

37. Тимофеева А.Г., Сергеева T.B., Маргиева Т.В,, Вознесенская Т.С., Комарова О.В., Цыгин А.Н. Иммуносупрессивная терапия при нефротическом синдроме у детей II Медицинский вестник Северного Кавказа.- 2010.- Т19, №3.- С.63-64.

38. Voznesenskaya Т., Tikhomirov Е„ Averyanova N, Tsygin A.NPHS2 gene mutations in Russian children with steroid-resistant nephrotic syndrome // Abstracts on CD-ROM, XLVII ERA-EDTA congress, Munich, Germany. - 2010 - [Su096]

39. Вознесенская T.C., Сергеева T.B., Цыгин A.H., Кутафина Е.К., Леонова Л.В. Особенности течения мезангиокапиллярного гломерулонефрита, начавшегося в детском возрасте Н Российский педиатрический журнал.-2011.-Т.9,№1.- С. 7-12.

40. Вознесенская Т.С., Бершова Т.В., Сергеева Т.В., Кутафина Е.К. Значение интерлейкина-18 при нефротическом синдроме у детей II Российский педиатрический журнал. -2012.- №2.- С. 9-12.

41. Вознесенская Т.С., Сергеева Т.В. Особенности течения и факторы риска прогрессирования идиопатической IgA-нефропатии у детей II Российский педиатрический журнал. -2012.- №3,- С. 28-34.

42. Сергеева Т.В., Картамышева Н.Н., Маргиева Т.В., Молчанова Е.А., Вознесенская Т.С., Комарова О.В., Тимофеева А.Г., Батурина Т.В., Зробок О.Л., Дмитриепко С.В., Мазо A.M., Цыгпн А.Н. Клинико-фуикциональные параллели при хронической болезни почек у детей II Педиатрическая фармакология.- 2012.- т.9, № 4.-С.64-69.

43. Вознесенская Т.С., Сергеева Т.В. Идиопатическая мембранозная иефропатия у детей: клиническое течение и прогноз II Российский педиатрический журнал-2013.- №3.- С. 13-15.

44. Сергеева Т.В., Батурина Т.В., Вознесенская Т.С., Цыгип А.Н. Эволюция основных представлений о первичвых гломеруляряых почечных болезнях у детей // Российский педиатрический журнал,- 2013,- №4- С. 36-41.

45. Вознесенская Т.С., Бершова Т.В., Сергеева Т.В. Липокалин как маркер хронической болезни почек у детей со стероидрезистентным нефротическим синдромом // Российский педиатрический журнал. -2013,- №5.- С. 20-24.

каталог наследственных заболеваний

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

NGAL нейтрофильный желатиназассоциированный липокалин HGMD Human Gene Mutation Database каталог генетических мутаций человека

IL-18 интерлейкин 18

OMIM Online Mendelian Inheritance in Man человека

АД артериальное давление

в/в внутривенно

ВОЗ Всемирная Организация Здравоохранения

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота ММФ микофенолата мофетил МН мембранозная нефропатия

МезПГН мезангио-пролиферативный гломерулонефрит Ml IIН мембрано-пролиферативный гломерулонефрит НСМИ нефротический синдром с минимальными изменениями ПЦР полимеразная цепная реакция

СКФ скорость клубочковой фильтрации

ФСГС фокально-сегментарный гломерулосклероз

Подписано в печать 30 декабря 2013 г.

Формат 60x90/16

Объём 2,5 п л.

Тираж 120 экз.

Заказ №060314497

Оттиражировано на ризографе в ООО «УниверПринт»

ИНН/КПП 7728572912\772801001

Адрес: г. Москва, улица Ивана Бабушкина, д. 19/1.

Тел. 740-76-47, 989-15-83.

1Шр:/Лу\у\у. univerprint.ru