Автореферат и диссертация по медицине (14.01.30) на тему:Возрастные особенности экспрессии сигнальных молекул в буккальном эпителии

На правах рукописи

СЕДОВ Евгений Викторович

ВОЗРАСТНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ СИГНАЛЬНЫХ МОЛЕКУЛ В БУККАЛЬНОМ ЭПИТЕЛИИ

14.01.30 - геронтология и гериатрия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

005540125

Санкт-Петербург - 2013

2 8 НОЯ 2013

005540125

Работа выполнена в лаборатории биогеронтологии отдела биогеронтологии Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор, Кирилл Ленарович Козлов; Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Кветная Татьяна Викторовна

Официальные оппоненты:

Аничков Николай Мильевич, заслуженный деятель науки РФ, член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Северо-Западный государственный университет им. И.И. Мечникова» Минздравсоцразвития России, заведующий кафедрой патологической анатомии

Прощаев Кирилл Иванович, доктор медицинских наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет», профессор кафедры внутренних болезней №2 .

Ведущая организация:

ФГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» МЗ РФ.

Защита диссертации состоится «12» декабря 2013 г. в 13.00 часов на заседании диссертационного совета Д 601.001.01 при Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии по адресу: 197110, Россия, Санкт-Петербург, пр. Динамо, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН (197110, Россия, Санкт-Петербург, пр. Динамо, д. 3). Автореферат разослан «11» ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор Козина Л.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Старение является гетерогенным процессом, что позволяет использовать для оценки степени его выраженности различные биологические объекты и молекулярные маркеры [Kvetnoy I.M. et al., 2003; Anisimov V.N., Khavinson V.H., 2010;]. В настоящее время в различных исследованиях биологического возраста и темпа старения организма используется более 150 биохимических, эндокринологических, морфологических, иммунологических, антропометрических и клинико-физиологических параметров [Ахаладзе Н.Г., 2010; Кветной И.М., Пальцев М.С., 2008]. В связи с этим одной из актуальных задач геронтологии является поиск биологических объектов (органов и тканей) исследование которых на биохимическом, молекулярно-биологическом и генетическом уровнях позволяет своевременно диагностировать признаки ускоренного старения. Одним из основных требований, предъявляемым к возможным тканям - индикаторам старения организма является их доступность для прижизненной молекулярной диагностики. В качестве такого материала можно рассматривать буккальный (щечный) эпителий (БЭ).

БЭ можно рассматривать как пограничную зону между внешней и внутренней средой организма. Изменения функциональной активности клеток БЭ (процессы клеточного обновления и дифференцировки, экспрессия различных сигнальных молекул) во многом отражают состояние локального и системного гомеостаза организма, а также его нарушения при старении [Хусаинова И.С. и соавт, 1997]. В 2003 г. была высказана гипотеза о том, что использование БЭ в сочетании с другими тканями организма является достаточно объективным подходом к оценке биологического возраста [Jackson S.H. et al., 2003] Ранее было установлено, что биологический возраст коррелирует с продолжительностью течения ассоциированных с возрастом заболеваний.

По данным отечественных и зарубежных исследователей, БЭ является легкодоступным материалом, позволяющим оценивать биологический возраст человека по показателям электрофизиологических характеристик ядер этих клеток, отслеживать процесс ускоренного старения при возрастной патологии и эффективность лечения. БЭ можно рассматривать как альтернативный источник биологического материала для теломерного теста, а морфологические особенности ядер эпителиоцитов отражают темпы ускоренного старения при наследственных и нейродегенеративных заболеваниях. Перспективным направлением использования БЭ в качестве объекта для оценки темпа старения организма является иммуногистохимический анализ различных сигнальных молекул, участвующих в процессах пролиферации и апоптоза, например белок pl6(INK4a) - общепризнанный маркер клеточного старения [Baker D.J. et. al., 2011]. Другим общепринятым маркером биологического

старения является гормон мелатонин, однако нами не было найдено данных о возрастных особенностях его экспрессии в БЭ.

Забор материала с внутренней поверхности щеки является неинвазивной процедурой, кроме того, данный объект исследования обладает большой информативностью (изучение экспрессии сигнальных молекул, возможность оценки электрокинетических характеристик клеток и т.п.) и может быть применим для прижизненной диагностики биологического возраста и темпа старения организма.

Несмотря на успешные попытки применения БЭ в качестве объекта для диагностики возрастной и другой социально-значимой патологии, до сих пор отсутствует единое мнение о том, какие именно сигнальные молекулы могут наиболее эффективно применяться для оценки биологического возраста и темпа старения организма.

Цель и задачи исследования

Целью диссертационного исследования явилось изучение возрастных особенностей экспрессии сигнальных молекул, обеспечивающих функциональную активность клеток буккального эпителия и поддержание гомеостаза организма.

Для достижения указанной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи:

1. Изучить возрастные особенности экспрессии маркеров ремоделирования межклеточного матрикса - металлопротеиназ ММР2, ММР9 и их ингибитора Т1МР1 в буккальном эпителии у людей разного возраста.

2. Оценить экспрессию маркера роста эндотелия сосудов УЕвР в буккальном эпителии у людей разного возраста.

3. Выявить возрастную динамику экспрессии маркера нейроэндокринной функции буккального эпителия - хромогранина А у людей разного возраста.

4. Оценить динамику экспрессии маркера старения - мелатонина в буккальном эпителии у людей разного возраста.

5. На основании полученных данных выявить возможные сигнальные молекулы, которые могут служить маркерами в диагностике, профилактике и лечении социально-значимых заболеваний у людей различного возраста.

Научная новизна работы

Впервые установлено, что в буккальном эпителии происходит снижение в 4 раза экспрессии матриксной металлопротеиназы-9 (ММР9), участвующей в расщеплении эластина, у лиц старческого возраста, в то время как экспрессия матриксной металлопротеиназы-2 (ММР2), расщепляющей фибронектин, коллаген IV типа и тенасцин у людей в возрасте 22-89 лет не изменяется. Выявлено, что с возрастом почти в 2 раза

возрастает экспрессия тканевого ингибитора матриксной металлопротеиназы-9 -Т1МР1.

Впервые показано, что в буккальном эпителии у лиц старших возрастных групп происходит резкое уменьшение экспрессии фактора роста эндотелия сосудов \ZEGF.

Впервые получены данные свидетельствующие о том, что клетки буккального эпителия человека выполняют эндокринную функцию -в их цитоплазме верифицированы гранулы, содержащие хромогранин А и мелатонин. Впервые показано, что с возрастом в буккальном эпителии наблюдается снижение экспрессии хромогранина А и мелатонина примерно в 6-7 раз, что указывает на снижение эндокринной функции буккального эпителия при старении.

Практическая значимость работы

Установлено, что в буккальном эпителии человека экспрессируется мелатонин. Показано, что в среднем, пожилом и старческом возрасте количество мелатонина прогрессивно снижается по сравнению с молодыми людьми. Полученные данные могут явиться основой для разработки нового неинвазивного метода определения биологического возраста человека и темпа старения организма. Определение уровня мелатонина в буккальном эпителии по сравнению с изучением уровня этого маркера в крови, а также его метаболита моче является наиболее удобным и доступным методом, как для пациентов, так и специалистов.

Исследование возрастной динамики маркеров - фактора роста эндотелия сосудов УЕСБ, матриксной металлопротеиназы-9 (ММР9), тканевого ингибитора матриксной металлопротеиназы-9 (Т1МР1), особенно хромогранина А, в буккальном эпителии открывает новые перспективы для диагностики и оценки эффективности лечения различных ассоциированных с возрастом заболеваний, в том числе и тех, которые связаны с патологией нейроиммуноэндокринной регуляции.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. В буккальном эпителии верифицировано возрастное снижение экспрессии матриксной металлопротеиназы ММР9 при одновременном повышении синтеза ее ингибитора Т1МР1, что свидетельствует о нарушении расщепления эластина. В то же время, уровень экспрессии металлопротеиназы ММР2, расщепляющей тенасцин, коллаген IV типа и фибронектин, при старении не изменяется.

2. При старении происходит снижение активности образования капилляров в ткани буккального эпителия, о чем свидетельствует возрастное снижение экспрессии фактора роста эндотелия сосудов УЕОБ.

3. Буккальный эпителий обладает эндокринной функцией, что подтверждается морфологически выявленным наличием гранул

в цитоплазме буккальных клеток, а также иммуноцитохимически верифицированная экспрессия хромогранина А и мелатонина. С возрастом в клетках буккального эпителия экспрессии хромогранина А снижается почти в 7 раз, а мелатонина - в 6 раз.

4. Выявленное возрастное снижение экспрессии мелатонина в буккальном эпителии может явиться основой для разработки нового метода определения темпа старения организма и биологического возраста, наряду с исследованием экспрессии мелатонина в крови и экскреции его метаболита в моче.

5. Снижение экспрессии в буккальном эпителии маркеров ремоделирования межклеточного матрикса (ММР9, TIMP1), функциональной активности эндотелия сосудов (VEGF), эндокринной функции, (хромогранина А, мелатонина) является интегральным показателем различных заболеваний, ассоциированных с возрастом.

Апробация работы

Основные результаты и положения диссертационной работы доложены и обсуждены на научно-практической геронтологич'еской конференции с международным участием «Пушковские чтения» (Санкт-Петербург, 2012); VII Ежегодной научно-практической конференции с международным участием «Здоровье — основа человеческого потенциала: проблемы и пути их решения» (Санкт-Петербург, 2012); Научной конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы геронтологии и гериатрии» (Киев, 2013); Международном форуме «Старшее поколение» (Санкт-Петербург, 2013); IV Ежегодной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Репродуктивная медицина - взгляд молодых-2013» (Санкт-Петербург, 2013); IV International symposium interactions of the nervous and immune systems in health and disease (Санкт-Петербург, 2013); I Международного форума «Молекулярная медицина - новая модель здравоохранения XXI века: технологии, экономика, образование» и конференции «Этические, правовые, экономические и социальные аспекты внедрения молекулярно-генетических технологий. Диалог с обществом» (Санкт-Петербург, 2013).

Реализация результатов исследования

Материал диссертации отражен в главе 24 «Буккальный эпителий: экспрессия сигнальных молекул и их роль в диагностике социально-значимой патологии человека» в руководстве Пальцев М.А., Кветной И.М. «Руководство по нейроиммуноэндокринологии» 3-е изд. -М.: ОАО «Издательство «Медицина», - 2013. - 856 е.: ил., рекомендованном Департаментом образовательных медицинских учреждений и кадровой политики Минздрава России в качестве учебника для студентов медицинских вузов. Результаты работы используются в научной, педагогической и практической деятельности Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН, НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта

СЗО РАМН, Белгородского государственного национального исследовательского университета.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 14 работ, из них 3 - статьи в журналах, включенных в Перечень ВАК Минобрнауки РФ, 1 глава в руководстве и 10 тезисов докладов.

Связь с научно-исследовательской работой института

Диссертационная работа является научной темой, выполняемой по основному плану НИР Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, 4 глав, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Текст диссертации изложен на 105 страницах, содержит 3 таблицы, иллюстрирован 25 рисунками. Список литературы содержит 193 источника, из них отечественных - 41, зарубежных - 152.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика исследуемого материала Образцы БЭ эпителия людей разного возраста были получены в ФГБУ «Клиническая больница № 122 им. Л. Г. Соколова» ФМБА и СПб ГБУЗ «Городская больница Святого Великомученика Георгия» (Санкт-Петербург, Россия). Донорами являлись как мужчины, так и женщины в возрасте от 22 до 89 лет, которые были распределены в 4-е группы - молодого, среднего, пожилого и старческого возраста (табл. 1). Все исследуемые группы доноров были однородны по тендерному составу.

Таблица 1

Распределение образцов буккального эпителия по группам

в зависимости от возраста пациентов

№ группы Возрастная категория Возраст (средний возраст) пациентов, лет Число пациентов

1 молодой возраст 22-35 (27,5 ±3,8) 30

2 средний возраст 45-59 (53,2 ±4,0) 25

3 пожилой возраст 60-74 (73,3 ±5,1) 25

4 старческий возраст 75-89 (84,9 ± 1,9) 20

Забор БЭ из ротовой полости (слизистая оболочка щеки) осуществляли не ранее чем через 4 часа после приема пищи в течение, а также после полоскания полости рта физиологическим раствором. Цитологические мазки

готовили с применением 2-х методов: стандартных цитологических мазков на предметных стеклах и методом жидкостной цитологии с использованием автоматизированной системы Novoprep «NRS» (Франция). В качестве гистологической окраски использовали гематоксилин и эозин.

Иммуноцитохимический метод

Образцы БЭ помещали на покрытые поли-L-лизином предметные стекла (Sigma). Для иммуноцитохимического исследования использовали первичные и вторичные антитела. В качестве первичных антител применялись моноклональные мышиные анти-человеческие антитела к маркерам сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF (1:75, Novocastra), мелатонину (1:100, Dako), хромогранину А (1:100, Novocastra), металопротеиназам ММР2 и ММР9 (1: 50, Novocastra) и их ингибитору TIMP1 (1:75, Novocastra). В качестве вторых антител использовали универсальный набор, содержащий биотинилированные анти-мышиные и анти-кроличьи иммуноглобулины (Novocastra). Визуализацию иммуногистохимической реакции проводили с применением комплекса авидина с биотинилированной пероксидазой (ABC-kit), с последующим проявлением пероксидазы хрена диаминобензидином (Novocastra).

Иммунофлуорецентная конфокальная микроскопия

Иммунофлуоресцентную конфокальную микроскопию (ИКФМ) проводили на нефиксированных суспензиях клеток БЭ. Мазки клеток обрабатывались соответствующими первичными антителами (см. иммуноцитохимический метод). Выявление экспрессии VEGF и хромогранина А проводили с использованием наборов для иммунофлуоресцентной визуализации щелочной фосфатазы Vector Red (Vector Lab.) согласно коммерческому протоколу фирмы. Левамизол (1.25 шМ) добавлялся при инкубации со щелочной фосфатазой набора для блокады эндогенной активности фермента. Изучение препаратов проводили в конфокальном микроскопе Olympus FluoView FVIOOO при увеличении х400 и хЮОО.

Морфометрия и анализ микрофотографий

Иммуноцитохимические микроизображения БЭ архивировали с помощью микроскопа Nikon Eclipse Е400, соединенного с цифровой камерой Nikon DXM1200. Морфометрический анализ полученных изображений проводили на персональном компьютере Intel Pentium 4 в программе «Видеотест-Морфология 5.2». На каждом препарате исследовали 10 полей зрения при увеличении х400 [Автандилов, 2006]. Площадь экспрессии (%) рассчитывали как отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади поля зрения. Оптическую плотность окрашивания выявленных продуктов измеряли в условных единицах. Указанные параметры отражают интенсивность синтеза или накопления исследуемых сигнальных молекул.

Статистическая обработка результатов

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием методов параметрической и непараметрической статистики. Методы описательной (дескриптивной) статистики , включали в себя оценку среднего арифметического значения стандартного отклонения от среднего значения и доверительного интервала - для признаков, имеющих непрерывное распределение; а также частоты встречаемости признаков с дискретными значениями.

Характер статистического распределения признаков анализировали с помощью %2-критерия. Для оценки межгрупповых различий значений признаков, имеющих непрерывное распределение, применяли ^критерий Стьюдента.

Статистическая обработка результатов выполнялась с использованием стандартного пакета программ прикладного статистического анализа ^аЙБЙса 7.0). Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы (об отсутствии значимых различий) принимали равным 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Возрастные особенности ремоделирования межклеточного матрикса в буккальном эпителии человека

По данным иммуноцитохимического исследования площадь и оптическая плотность экспрессии ММР2 в БЭ достоверно не изменялись во всех исследуемых возрастных группах (рис. 1А, табл. 2). Экспрессия ММР9 в БЭ изменялась в зависимости от возраста доноров. В группах доноров молодого и среднего возраста площадь экспрессии ММР9 достоверно не различалась, однако оптическая плотность экспрессии этого маркера снижалась в группе доноров среднего возраста по сравнению с группой молодого возраста на 29% (рис. 1Б, табл. 2). В группе доноров пожилого возраста по сравнению с группой доноров молодого возраста площадь и оптическая плотность экспрессии снижались соответственно в 2,2 и 1,9 раза (рис. 1Б, табл. 2). В группе доноров старческого возраста по сравнению с группой доноров молодого возраста площадь и оптическая плотность экспрессии ММР9 снижались соответственно в 4,6 и 3,5 раза (рис. 1Б, табл. 2).

Отмечено достоверное снижение площади экспрессии ММР9 в группе доноров пожилого возраста по сравнению с группой доноров среднего возраста и в группе доноров старческого возраста по сравнению с группами доноров среднего и пожилого возраста (рис. 1Б).

Рис. 1. Возрастные особенности экспрессии металлопротеиназы-2 (А) и металлопротеиназы-9 (Б) в буккальном эпителии человека по данным иммуноцитохимического анализа.

* - р<0,05 - по сравнению с соответствующим показателем в 1-ой группе доноров (22-35 лет); ** - р<0,05 - по сравнению с соответствующим показателем во 2-ой группе доноров (45-59 лет); # - р<0,05 - по сравнению с соответствующим показателем в 3-ей группе доноров (60-74 года).

Таблица 2

Возрастные особенности экспрессии маркеров ремоделирования межклеточного матрикса в буккальном эпителии человека по данным иммуноцитохимического исследования

№ группы доноров, Возрастная категория Возраст (лет) Оптическая плотность экспрессии, у.е.

Маркер

ММР2 ММР9 ТІМР1

1-ая молодой возраст 22-35 0,22±0,03 0,28±0,03 0,24±0,04

2-ая средний возраст 45-59 0,21±0,02 0,20±0,03* 0,26±0,03

3-ая пожилой возраст 60-74 0,23±0,04 0,15±0,02*'" 0,36±0,02*' **

4-ая старческий возраст 75-89 0,20±0,02 0,08±0,02*'# 0,41±0,04*

* - р<0,05 - по сравнению с соответствующим показателем в 1-ой группе доноров; ** - р<0,05 - по сравнению с соответствующим показателем во 2-ой группе доноров; # - р<0,05 - по сравнению с соответствующим показателем в 3-ей группе доноров.

Площадь и оптическая плотность экспрессии Т1МР1 достоверно не различалась в группах доноров молодого и среднего возраста, однако повышалась на 23% и 31% соответственно в группах пожилого и старческого возраста (рис. 2). Оптическая плотность экспрессии Т1МР1 в группах доноров пожилого и старческого возраста по сравнению с группой доноров

молодого возраста повышалась соответственно в 1,5 и 1,7 раза (табл.1).

**

-I *

22-35 лет 45-59 лет 60-74 года "5-89 лет

Рис. 2. Возрастные особенности экспрессии тканевого ингибитора матриксных металлопротеиназ Т1МР1 в буккальном эпителии человека по данным иммуноцитохимического анализа

* - р<0,05 - по сравнению с соответствующим показателем в 1-ой группе доноров (22-35 лет); ** - р<0,05 - по сравнению с соответствующим показателем во 2-ой группе доноров (45-59 лет).

Полученные данные свидетельствуют о том, что с возрастом в БЭ человека процесс ремоделирования межклеточного матрикса смещается в сторону повышения синтеза ингибитора матриксных металлопротеиназ Т1МР1, что может указывать на нарушение межклеточных взаимодействий и замедление процессов клеточного обновления.

Так как было установлено, что с возрастом в БЭ снижается экспрессия ММР9, но не изменяется экспрессия ММР2, можно предположить, что Т1МР1 ингибирует в большей степени ММР9, либо происходит снижение ее продукции в БЭ. Важно отметить, что снижение с возрастом экспрессии ММР9 при сохранении синтеза ММР2 указывает на замедление процессов расщепления эластина - субстрата ММР9, тогда как гидролиз фибронектина, коллагена и тенасцина - мишени действия ММР2 - с возрастом не изменяется.

Возрастные особенности экспрессии маркера роста эндотелия сосудов УЕСР в буккальном эпителии человека

По данным иммуноцитохимического исследования площадь и оптическая плотность экспрессии УЕОР в группе доноров среднего возраста достоверно снижались по сравнению с группой доноров молодого возраста соответственно на 12% и 19% (рис. ЗА, табл. 3).

В дальнейшем наблюдалось еще более выраженное снижение экспрессии УЕвР. Так, в группе доноров пожилого возраста площадь и оптическая плотность экспрессии этого маркера снижались по сравнению с группой доноров молодого возраста в 1,8 и 2,1 раза соответственно (рис. ЗА, табл. 3).

Таблица 3

Возрастные особенности экспрессии маркеров функциональной активности буккального эпителия человека по данным иммуноцитохимического исследования

№ группы доноров, возрастная категория Возраст, лет Оптическая плотность экспрессии, у.е.

маркер

УГОР хромогранин А мелатонин

1-ая молодой возраст 22-35 0,31±0,04 0,23±0,03 0,18±0,02

2-ая средний возраст 45-59 0,25±0,03* 0,21±0,02 0,19±0,01

3-ая пожилой возраст 60-74 0,15±0,02*'" 0,16±0,02*'" 0,18±0,02

4-ая старческий возраст 75-89 0,09±0,01 *•**'" 0,14±0,02*'# 0Д7±0,01

* - р<0,05 - по сравнению с соответствующим показателем в 1-ой группе доноров; ** - р<0,05 - по сравнению с соответствующим показателем

во 2-ой группе доноров; # - р<0,05 - по сравнению с соответствующим показателем в 3 группе доноров.

А

Б

Рис. 3. Возрастные особенности экспрессии маркера роста эндотелия сосудов УЕСР в буккальном эпителии человека А - по данным иммуноцитохимического анализа, Б - по данным иммунофлуоресцентного анализа.

* - р<0,05 - по сравнению с соответствующим показателем в 1-ой группе доноров (22-35 лет); ** - р<0,05 - по сравнению с соответствующим показателем во 2-ой группе доноров (45-59 лет); # - р<0,05 - по сравнению с соответствующим показателем в 3-ей группе доноров (60-74 года).

В группе доноров старческого возраста площадь и оптическая плотность экспрессии снижались наиболее интенсивно по сравнению с группой доноров молодого возраста - соответственно в 4,1 и 3,4 раза (рис. ЗА, табл. 3). Достоверное снижение площади и оптической плотности экспрессии УБОР наблюдалось в группе доноров пожилого возраста по сравнению группой доноров среднего возраста и в группе доноров старческого возраста по сравнению с группами доноров зрелого и пожилого возраста (рис. ЗА, табл. 3).

По данным иммунофлуоресцентного исследования площадь экспрессии УЕвР в группе доноров среднего возраста достоверно снижалась по сравнению с группой доноров молодого возраста на 14% (рис. ЗБ). Установлено, что в группе доноров пожилого возраста площадь экспрессии этой молекулы снижалась по сравнению с группой доноров молодого возраста на 20%, то есть сохранялась на уровне группы доноров среднего возраста (рис. ЗБ). В группе доноров старческого возраста площадь и оптическая плотность экспрессии снижались по сравнению с группой доноров молодого возраста на 72% (рис. ЗБ). Кроме того, достоверное снижение площади экспрессии УЕОБ наблюдалось в группе доноров пожилого возраста по сравнению с группой доноров среднего возраста

и в группе доноров старческого возраста по сравнению с группами среднего и пожилого возраста (рис. ЗБ).

Таким образом, методами иммунофлуоресцентной конфокальной микроскопии и иммуноцитохимии установлено, что с возрастом экспрессия УЕОБ в БЭ достоверно снижается. Необходимо отметить, что наиболее выраженное снижение экспрессия УЕОЯ в БЭ наблюдается у людей старческого возраста, тогда как у лиц среднего и пожилого возраста данный показатель менее значителен.

Возрастные особенности эндокринной функции буккального эпителия человека

Возрастные особенности экспрессии хромогранина А

По данным иммуноцитохимического анализа площадь и оптическая плотность экспрессии хромогранина А прогрессивно снижаются с возрастом. В группе доноров среднего возраста площадь экспрессии хромогранина А снижалась на 48%, а оптическая плотность не изменялась относительно группы доноров молодого возраста (рис. 4А, табл. 3). В группе доноров пожилого возраста площадь и оптическая плотность экспрессии этого биогенного амина снижались соответственно в 2,14 раза и на 24% по сравнению с группой доноров молодого возраста (рис. 4А, табл. 3). В группе доноров старческого возраста площадь и оптическая плотность экспрессии хромогранина А уменьшались соответственно в 6,6 раза и на 64% по сравнению с доноров молодого возраста (рис. 4А, табл. 3). Площадь экспрессии хромогранина А в группе доноров пожилого возраста была так же достоверно ниже, чем в группе доноров среднего возраста, а доноров старческого возраста -достоверно ниже по сравнению с группами доноров среднего и пожилого возраста (рис. 4А).

Данные иммунофлуоресцентного анализа подтвердили результаты, полученные методом иммуноцитохимического исследования. Площадь экспрессии хромогранина А по результатам иммунофлуоресцентной микроскопии в группе доноров среднего возраста снижалась на 11% относительно группы доноров молодого возраста (рис. 4Б). В группе доноров пожилого возраста площадь экспрессии этого маркера снижалась на 48% по отношению к группе доноров молодого возраста (рис. 4Б).

А

Рис. 4. Возрастные особенности экспрессии хромогранина А - в буккальном эпителии человека - по данным иммуноцитохимического анализа, Б - по данным иммунофлуоресцентного анализа.

* - р<0,05 - по сравнению с соответствующим показателем 'в 1 -ой группе доноров (22-35 лет); ** - р<0,05 - по сравнению с соответствующим показателем во 2-ой группе доноров (45-59 лет); # - р<0,05 - по сравнению с соответствующим показателем в 3-ей группе доноров (60-74 года).

В группе доноров старческого возраста площадь экспрессии хромогранина А уменьшалась на 27% по сравнению с группой доноров молодого возраста (рис. 4Б). Площадь экспрессии хромогранина А в группе доноров пожилого возраста была так же достоверно ниже, чем в группе доноров среднего возраста, а в группе доноров старческого возраста -достоверно ниже по сравнению группами доноров среднего и пожилого возраста (рис. 4Б).

Возрастные особенности экспрессии мелатонина

По данным иммуноцитохимического исследования площадь экспрессии мелатонина в группе доноров среднего возраста достоверно снижалась по сравнению с группой доноров молодого возраста на 43% (рис. 5). В дальнейшем наблюдалось еще более выраженное снижение площади экспрессии мелатонина. Так, в группе доноров пожилого возраста площадь экспрессии этого маркера снижалась по сравнению с группой доноров молодого возраста в 2,9 раза (рис. 5). В группе доноров старческого возраста площадь экспрессии мелатонина снижались наиболее интенсивно по сравнению с группой доноров молодого возраста - в 6,3 раза (рис. 5).

0.7

22-35лет 45-59 лет 6(1-'4 годи "5-89 лет

Рис. 5. Возрастные особенности экспрессии мелатонина в буккальном эпителии человека по данным иммуноцитохимического анализа. * - р<0,05 - по сравнению с соответствующим показателем в 1-ой группе доноров (22-35 лет); ** - р<0,05 - по сравнению с соответствующим показателем во 2-ой группе доноров (45-59 лет); # - р<0,05 - по сравнению с соответствующим показателем в 3-ей группе доноров (60-74 года).

Достоверное снижение площади экспрессии мелатонина наблюдалось также в группе доноров пожилого возраста по сравнению с группой доноров среднего возраста и в группе доноров старческого возраста по сравнению с группами доноров среднего и пожилого возраста (рис. 5).

Следует, отметить, что оптическая плотность экспрессии мелатонина не изменялась ни в одной из исследуемых возрастных групп (табл. 3).

Анализируя полученные результаты об отсутствии изменений оптической плотности экспрессии мелатонина, на фоне резкого снижения площади экспрессии данного гормона, можно предположить, что при старении организма в БЭ снижается количество мелатонинпродуцирующих клеток, тогда как количество рецепторов к этому гормону на отдельно взятой клетке не изменяется.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Известно, что БЭ может быть использован в качестве возможного материала для неинвазивной прижизненной диагностики социально-значимых заболеваний [Мейер А.Б., 2010; Соёа1у в. е1 а!., 2001]. В пользу этого предположения свидетельствует тот факт, что забор материала с внутренней поверхности щеки является неинвазивной процедурой, кроме того, данный объект исследования обладает большой информативностью [РоШо АЛ. ег а1., 1998].

БЭ можно рассматривать как пограничную зону между внешней и внутренней средой организма [Калаев В.Н. и соавт., 2010]. Таким образом, изменения функциональной активности клеток БЭ (процессы клеточного обновления и дифференцировки, экспрессия различных сигнальных молекул)

во многом отражают состояние локального и системного гомеостаза организма или его нарушения при патологических состояниях [Mills С.С. et al., 1999; Kagnoff M.F., Eckmann L., 1997].

Следовательно, БЭ, доступный для прижизненного цитологического исследования, может служить источником важной диагностической и прогностической информации о состояния здоровья, стрессовых воздействиях, влиянии факторов внешней среды, соматической патологии и биологического возраста человека [Хусаинова И.С. и соавт., 1997; Ahmer O.R. et al., 1999].

В настоящем исследовании БЭ рассматривается как материал для возможной диагностики процессов старения организма. В качестве сигнальных молекул-кандидатов нами были выбраны белки, участвующие в ремоделировании межклеточного матрикса, фактор роста эндотелия сосудов и биологически активные молекулы - хромогранин А, мелатонин -маркеры нейроиммуноэндокриных взаимодействий.

Матриксные металлопротеиназы (ММР) синтезируются в различных тканях и играют центральную роль в обмене белков соединительной ткани, в процессах нормального развития матрикса, ангиогенезе, миграции лейкоцитов, адгезии, дифференцировке, пролиферации и онкогенной трансформации клеток. Нарушение синтеза ММР может стать причиной различных заболеваний, кроме того, установлено, что их экспрессия в различных тканях при старении снижается [Линькова Н.С. и соавт., 2011; Lausch Е. et al., 2009].

Нами установлено, что с возрастом в БЭ человека процесс ремоделирования межклеточного матрикса смещается в сторону повышения синтеза ингибитора матриксных металлопротеиназ TIMP1, что может указывать на нарушение межклеточных взаимодействий и замедление процессов клеточного обновления.

Полученные результаты исследования позволили установить, что с возрастом в БЭ снижается экспрессия ММР9, в то время как экспрессия ММР2 с возрастом не изменяется. Это дает основание предположить, что TIMP1 ингибирует в большей степени ММР9, либо ее продукция в БЭ снижается. Важно отметить, что снижение с возрастом экспрессии ММР9 при сохранении синтеза ММР2 указывает на замедление процессов расщепления эластина - субстрата ММР9, тогда как гидролиз фибронектина, коллагена и тенасцина - мишени действия ММР2 - с возрастом не изменяется.

Фактор роста эндотелия сосудов VEGF является маркером образования новых кровеносных сосудов и роста незрелых кровеносных сосудов [Bruns A.F. et al., 2012]. Стимулируя функциональную активность эндотелиальных клеток, VEGF играет центральную роль в процессе ангиогенеза. Было показано, что многие опухоли экспрессируют VEGF. Кроме того, уровень VEGF непосредственно регулируется такими факторами окружающей среды как pH, давление, концентрация кислорода. Влияние различных факторов внешней среды заключается в опосредованной

через VEGF стимуляции важных для ангиогенеза факторов, включая антиапоптотические белки, молекулы клеточной адгезии и ММР [Bautch V.L., 2012].

Методами иммунофлуоресцентной конфокальной микроскопии и иммуноцитохимии нами установлено, что с возрастом экспрессия VEGF в БЭ достоверно снижается, причем наиболее выраженное ее уменьшение наблюдается у людей старческого возраста, тогда как у лиц зрелого и пожилого возраста это снижение носит менее значительный характер. Снижение экспрессии фактора роста сосудов в БЭ может отражать уменьшение способности тканей к регенерации и нарушение их трофики не только в слизистой оболочки щеки, но и во всех тканях и органах. Таким образом, изучение экспрессии VEGF является методом интегральной оценки гомеостаза организма при старении.

По данным гистологического исследования буккальные клетки имеют хорошо различимую цитоплазму, занимающую примерно 80% клетки и небольшое, округлой формы ядро, расположенное в ее центре. В некоторых случаях в цитоплазме клеток верифицируются небольшие округлые везикулы, в которых, вероятно, находятся биологически активные вещества, секретируемые БЭ. В связи с этим нами было предпринято исследование экспрессии в БЭ молекул - маркеров нейроиммуноэндокринной системы — хромогранина А и мелатонина.

Хромогранин А является цитоплазматическим маркером нейроэндокринных клеток. Этот белок секретируются при повышенной продукции пептидов. По данным иммуноцитохимического исследования, с возрастом наблюдается линейное снижение экспрессии хромогранина А в БЭ. Так, максимальное снижение синтеза этого белка выявлено у лиц старческого возраста — почти в 7 раз по сравнению с молодыми людьми. Кроме того, по данным иммунофлуоресцентной конфокальной микроскопии экспрессия хромогранина А у пожилых людей почти в 2 раза ниже по сравнению лицами зрелого возраста. Полученные данные указывают на возрастное снижение скорости метаболизма и эндокринной функции буккальных клеток.

Мелатонин является общепризнанным маркером старения. Снижение уровня ночного пика его секреции наблюдается как при ускоренном и естественном старении, так и при различной полиморбидной патологии [Kvetnoy I.M., 1999]. Установлено, что экспрессия мелатонина в БЭ у людей с возрастом резко снижается. Наиболее значительное снижение наблюдается у лиц пожилого и старческого возраста, что хорошо согласуется с данными возрастного снижения уровня синтеза этого гормона в других экстрапинеальных источниках [Кветная Т.В., 2005; Polyakova V.O. et al., 2011]. При этом следует отметить, что возрастное снижение экспрессии мелатонина по данным иммуноцитохимического исследования наблюдается только по показателю площади экспрессии, тогда как оптическая плотность экспрессии мелатонина с возрастом не изменяется. Полученные результаты позволяют предположить, что при старении в БЭ снижается число клеток,

синтезирующих мелатонин, но не количество рецепторов к мелатонину на одной клетке. Таким образом, изучение экспрессии мелатонина в БЭ может служить дополнительным неинвазивным методом оценки биологического возраста человека.

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что в БЭ с возрастом наблюдается изменение экспрессии ряда сигнальных молекул - маркеров межклеточных взаимодействий (ММР9, Т1МР1), роста сосудистой сети (УЕОБ), эндокринной функции (хромогранин А) и старения организма (мелатонин). Следует отметить, что у людей молодого и зрелого возраста экспрессия данных молекул в БЭ сохраняется на стабильно высоком уровне, тогда как резкое изменение их синтеза характерно для людей пожилого и старческого возраста. Поскольку все указанны молекулы являются так же маркерами различной соматической патологии, изучение их экспрессии в БЭ, являясь неинвазивным и простым в исполнении методом, открывает новые перспективы для предиктивной диагностики, оценки и прогноза эффективности лечения и темпов старения организма.

ВЫВОДЫ

1. В клетках буккального эпителия впервые верифицирована экспрессия различных сигнальных молекул, степень продукции которых изменяется при старении организма, что обусловливает возможность рассматривать буккальный эпителий как легкодоступный материал для молекулярной диагностики патологических процессов.

2. При старении в буккальном эпителии наблюдается замедление процессов ремоделирования межклеточного матрикса, отражением чего служит достоверное снижение экспрессии матриксной металлопротеиназы-9 (ММР9) и одновременное достоверное повышение экспрессии ее тканевого ингибитора Т1МР1 .

3. В буккальном эпителии у лиц среднего и особенно пожилого и старческого возраста происходит достоверное снижение экспрессии фактора роста сосудов УЕСР, являющегося интегральным показателем трофической функции тканей и органов.

4. С возрастом в буккальном эпителии наблюдается достоверное снижение экспрессии хромогранина А, что свидетельствует возрастной инволюции эндокринной функции.

5. В буккальном эпителии у людей среднего, пожилого и старческого возраста наблюдается достоверное снижение уровня экспрессии мелатонина, что позволяет судить и темпе старения организма.

6. Достоверные изменения в буккальном эпителии экспрессии сигнальных молекул - маркеров функциональной активности клеток, межклеточных взаимодействий, эндокринной функции (ММР9, Т1МР1, УЕСР, хромогранина А, мелатонина) свидетельствуют о потенциальной возможности их использования как маркеров биологического возраста, диагностических и прогностических маркеров различной полиморбидной патологии, ассоциированной с возрастом.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Исследование экспрессии мелатонина в буккальном эпителии может быть рекомендовано для оценки биологического возраста человека.

2. Сочетанное исследование экспрессии мелатонина и хромогранина А в буккальном эпителии может быть использовано в качестве дополнительного критерия эндокринной функции организма у лиц старших возрастных групп.

3. Комплексное исследование ряда сигнальных молекул - маркеров функциональной активности клеток буккального эпителия (ММР9, TIMP1, VEGF, хромогранина А, мелатонина) может быть рекомендовано для интегральной оценки состояния здоровья людей пожилого и старческого возраста, а также для предиктивной диагностики, ассоциированных с возрастом заболеваний.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах, включенных в Перечень ВАК Минобрнауки РФ

1. Буккальный эпителий как объект оценки биологического возраста и темпа старения организма / Седов Е.В., Линькова Н.С., Козлов К.Л., Кветная Т.В., Коновалов С.С. // Успехи геронтологии. - 2013. - Т.26, №4. - С. 574-578.

2. Иммуноцитохимическое исследование буккального эпителия: оптимизация диагностики рака молочной железы / Коновалов С.С., Литвякова О.М., Линькова Н.С., Седов Е.В., Кветная Т.В., Мурсалов С.У., Дурнова А.О., Толибова Г.Х., Костылев A.B. // Молекулярная медицина. - 2012. - №6. - С. 57-59.

3. Экспрессия факторов дифференцировки клеток в буккальном эпителии человека при старении / Кветная Т.В., Линькова Н.С., Седов Е.В., Мурсалов С.У., Козлов К.Л. // Успехи геронтологии. - 2013.- Т.26, №3. - С. 432-436.

Главы в руководстве

4. Буккальный эпителий: экспрессия сигнальных молекул и их роль в диагностике социально-значимой патологии человека / Пальцев М.А., Кветной И.М., Седов Е.В., Линькова Н.С., Полякова В.О., Коновалов С.С., Кветная Т.В., Литвякова О.М., Козлов К.Л. // В кн. «Руководство по нейроиммуноэндокринологии». - М.: ОАО «Издательство «Шико». - 2013. - С. 716-731.

Тезисы докладов

5. Возрастная динамика экспрессии матриксных металлопротеиназ в буккальном эпителии / Седов Е.В., Козлов К.Л., Кветной И.М., Костылев A.B. // VIII научно-практическая конференция «Пушковские чтения» и Симпозиум «Полиморбидность в гериатрической практике: пожилой пациент в общеврачебной практике» - СПб., Россия. - 2012.- С. 85-86.

6. Мелатонин как маркер старения буккального эпителия / Козлов К.Л., Седов Е.В., Кветной И.М., Линькова Н.С. // VIII научно-практическая конференция «Пушковские чтения» и Симпозиум «Полиморбидность

в гериатрической практике: пожилой пациент в общеврачебной практике». - СПб., Россия.-2012. -С. 53-54.

7. Роль экспрессии сигнальных молекул в буккальном эпителии в диагностике рака молочной железы / Коновалов С.С., Литвякова О.М., Седов Е.В., Полякова В.О., Кветной И.М., Линькова Н.С., Костылев А.В. // VII Всероссийская научно-практическая конф. с международным участием «Здоровье -основа человеческого потенциала: проблемы и пути их решения». - СПб., Россия. -

2012. - С. 543-544.

8. Верификация иммунных клеток в буккальном эпителии: перспективы диагностики социально-значимых заболеваний и персонифицированной таргетной терапии / Кветной И.М., Полякова В.О., Линькова Н.С., Седов Е.В., Кветная Т.В., Козлов K.JL, Коновалов С.С., Костылев А.В. // IV International symposium interactions of the nervous and immune systems in health and disease. - СПб., Россия. - 2013. - С. 108.

9. Линькова, Н.С. Буккальный эпителий как возможный объект для исследования старения нейроиммуноэндокринной системы / Линькова Н.С., Седов Е.В. // Международный форум «Старшее поколение». - СПб., Россия. -

2013.-С. 93.

10. Прогностическая значимость маркеров иммунокомпетентных клеток в буккальном эпителии / Коновалов С.С., Литвякова О.М., Седов Е.В., Линькова Н.С., Костылев А.В., Дурнова А.О. // IV International symposium interactions of the nervous and immune systems in health and disease. СПб., Россия,- 2013. -С. 113-114.

11. Седов, Е.В. Роль экспрессии маркера CD64 в буккальном эпителии в диагностике рака молочной железы // IV Ежегодная научная конференция молодых ученых и специалистов «Репродуктивная медицина: взгляд молодых-2013». - СПб., Россия. - 2013. - С. 81-82.

12. Седов, Е.В. Экспрессия VEGF в буккальном эпителии как маркер старения организма // Научная конф. молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы геронтологии и гериатрии». - Киев, Украина. - 2013. - С. 52.

13. Экспрессия сигнальных молекул в буккальном эпителии: новые возможности молекулярной диагностики заболеваний человека / Пальцев М.А., Полякова В.О., Кветной И.М., Седов Е.В., Кветная Т.В., Козлов К.Л., Коновалов С.С. //1 Международный форум «Молекулярная медицина - новая модель здравоохранения XXI века: технологии, экономика, образование». - СПб, Россия.-2013.-С. 140-143.

14. Экспрессия транскрипционного фактора ERB3 в буккальном эпителии человека как возможный показатель старения / Седов Е.В., Козлов К.Л., Кветная Т.В., Костылев А.В., Дурнова А.О. // Международный форум «Старшее поколение». -СПб., Россия. - 2013. - С. 112-113.

Седов Евгений Викторович ВОЗРАСТНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ СИГНАЛЬНЫХ МОЛЕКУЛ

В БУККАЛЬНОМ ЭПИТЕЛИИ //Автореф. дис. канд. мед. наук: 14.01.30-СПб., 2013,-21 с._

Подписано в печать «25» октября 2013. Формат 60x84 1/16.

Бумага офсетная. Печать офсетная. Печ. л. 1,0.

Тираж 100 экз. Заказ 116 Отпечатано с готового оригинал-макета.

ЗАО «Принт-Экспресс» 197101, С.-Петербург, ул. Большая Монетная, 5 лит. А.

СПИСОК ЦИТИРУЕМЫХ источников

Автандилов Г.Г. Диагностическая медицинская плоидометрия. - М.: Медицина, 2006. -192 е.; Ахаладзе Н.Г. Биологический возраст как проблема теоретической и практической медицины // Предиктивная медицина. - 2010. - №5-6. - С. 18-22.; Калаев В.Н., Игнатова И.В., Карпова С.С., Артемова О.В. Частота буккалышх эпителиоцитов с микроядрами у лиц, страдающих парадонитом // Вестник Воронежского государственного университета. Серия химия, биология. - 2010. - С. 82 - 85.; Линькова Н.С., Полякова В.О., Кветной ИМ. Единый механизм ремоделирования межклеточного матрикса в ткани тимуса и эпифиза при старении // Успехи геронтологии. - 2011. - Т. 24., № 3. - С. 420-422.; Мейер А.Б. Генотоксические и цитотоксические эффекты в буккальных эпителиоцитах детей, проживающих в экологически различающихся районах Кузбасса // Цитология. - 2010. - Т.52, №4. - С. 305-310.; Пальцев МЛ., Кветной И.М., Полякова В.О., Гурко Г.И., Мурсалов С. У. Нейроимуноэндокринные механизмы старения и возрастной патологии. - 2012. - СПб, Наука. - 463 е.; Хусаинова И.С., Варулева И.Ю., Кожина НЛ. Оценка цитологических показателей буккального эпителия для диагностики функционального состояния человека// Клиническая лабораторная диагностика. - 1997. - № 3. - С. 10-12.; A hitter O.R., Essery S.D., Saadi А.Т., Raza M.W., Ogilvie MM., Weir DM., Blackwell C.C. The effect of cigarette smoke on adherence of respiratory pathogens to buccal epithelial cells. FEMS Immunol Med Microbiol 1999; 23: 27—36.; Anisimov V.N., Khavinson V.Kh. Peptide bioregulation of aging: results and prospects. // Biogerontology. - 2010. - Vol. 11. - P. 139-149.; Baker D.J., Wijshake Т., Tchkonia Т., LeBrasseur N.K., Childs B.G., van de Sluis В., Kirkland J.L., van Deursen J.M. Clearance of pl6Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders // Nature. - 2011. - Vol. 479. - P. 232-236.; Bautch V.L. VEGF-directed blood vessel patterning: from cells to organism // Cold Spring Harb Perspect Med. - 2012. Vol. 2(9). - P. 324-329.; Bruns A.F., Yuldasheva N„ Latham AM., Bao L., Pellet-Many C., Frankel P., Stephen S.L., Howell G.J., Wheatcroft S.B., Kearney M.T., Zachary I.C., Ponnambalam S.A. Heat-Shock Protein Axis Regulates VEGFR2 Proteolysis, Blood Vessel Development and Repair //PLoS One. - 2012. - Vol. 7, N11. - P. 456-459.; Godaly G., Bergsten G., Hang L., Fiscer H., Frendeus В., Lundstedt A.-C., Samuelsson M., Samuelsson P., Svanborg C. Neutrophil recruitment, chemokine receptors, and resistance to mucosal infection // J. Leukoc Biol . -2001. - Vol. 69. - P. 899—906.; Jackson S.H., Weale M.R., Weale R.A. Biological age - what is it and can it be measured? //Arch Gerontol Geriatr. - 2003. -Vol. 36, N 2. - P.103-115.; KagnoffM.F., Eckmann L, Epithelial cells as sensors for microbial infection // J Clin Ivest. - 1997. - Vol. 100. - P. 6-10.; Kvetnoy I.M. Extrapineal melatonin: location and role within diffuse neuroendocrine system // Histochem J. - 1999. - Vol. 31, N 1. -P. 1-12Kvetnoy IM., Polyakova V.O., Trofimov A.V., Yuzhakov V.V., Yarilin A.A., Kurilets E.S., Mikhina L.N., Sharova N.I., Nikonova M.F. Hormonal function and proliferative activity of thymic cells in humans: immunocytochemical correlations // Neuroendocrinology Letters. — 2003. - N 24. - P. 263-268.; Lausch E„ Keppler Jt, Hilbert K, Cormier-Daire V., Nikkei S., Nishimura G., Unger S., Spranger J., Superti-Furga A., ZabeJ B. Mutations in MMP9 and MMP13 determine the mode of inheritance and the clinical spectrum of metaphyseal anadysplasia // Am. J. Hum. Genet. - 2009. - Vol. 85. - P. 168-178.; Mills P. R., Davies R.J., Devalia J.L. Airway epithelial cells, cytokines and pollutants // Am J Resp Crit Care Med. -1999. - Vol. 160(5Pt2 ). P. 38-43.; Polito A.J., Proud D. Epithelil cells as regulators of airway inflammation // J Allergy Clin Immunol. - 1998. - Vol. 102. - P. 714-718.; Polyakova V.O., Linkova N.S., Kvetnoy I.M., Khavinson V.Kh. Functional unity of the thymus and pineal gland and study of the mechanisms of aging // Bull Exp Biol Med. - 2011 . - Vol. 151, N5.-P. 627-630.