Автореферат и диссертация по медицине (14.00.53) на тему:Нейроиммуноэндокринные маркеры старения кожи

Направахрукописи

СМИРНОВА Ирина Олеговна

НЕЙРОИММУНОЭНДОКРИННЫЕ МАРКЕРЫ СТАРЕНИЯ КОЖИ

14.00.53 — геронтология и гериатрия 14.00.11 - кожные и венерические болезни

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Санкт - Петербург - 2004

Работа выполнена в отделе клеточной биологии и патологии Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН, на кафедре дерматовенерологии Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И. Мечникова МЗ и СЗ РФ

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор Кветной Игорь Моисеевич

доктор медицинских наук, профессор Данилов Сергей Иванович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Рыжак Галина Анатольевна

доктор медицинских наук, профессор Королькова Татьяна Николаевна

доктор медицинских наук, профессор Самцов Алексей Викторович

Ведущее учреждение

Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П.Павлова МЗ и СЗ РФ

диссертационного совета Д 601.001.01 при Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН по адресу: 197110, Санкт-Петербург, пр. Динамо.З-

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН (197110, Санкт-Петербург, пр. Динамо,3).

Защита состоится

2004 г. на заседании

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета • кандидат биологических наук,

Козина Л.С.

//г/^У

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. По мере развития молекулярной медицины, в последние годы, наряду с интегральным биологическим возрастом организма, возникла необходимость определения возраста систем, органов и отдельных клеток. В связи с этим проводится активный поиск комплекса параметров, отражающих функциональную способность ткани, органа или клетки при отсутствии болезни, для обозначения которых используется термин «биомаркеры старения» [G.T. Baker, R.L. Sprott, 1988]. При этом, очевидно, что биомаркеры старения должны отражать фундаментальные биологические процессы, нести информацию о функциональном состоянии органа или ткани и обменных процессах, протекающих в них, а также коррелировать с физиологическим возрастом [О.В. Коркушко и соавт., 2002; R. Arking, 1991; Ingram etal., 2001].

Разработка биомаркеров старения кожи является актуальной проблемой геронтологии и дерматологии. Это связано с тем, что в коже, непосредственно подверженной внешним влияниям, наиболее значимым из которых является ультрафиолетовое облучение (УФО), регрессивные изменения развиваются раньше, чем в других органах (нередко в молодом возрасте), [Д.Е. Фицпатрик, 1999; К. Seharffeter-Kohanek et al., 2000] и своевременное использование эффективных мер профилактики может предотвратить развитие преждевременной или ускоренной инволюции кожи [О.С. Озерская, 2000].

В дерматологии в качестве биомаркера старения чаще всего используют показатели содержания коллагеновых и эластических волокон в папиллярной дерме [J. Uitto, E.F. Peknstein, 1998; A. Ryu, 2000], считая, что они интегрально отражают комплекс изменений основных элементов дермы и характеризуют ее морфо-функциональное состояние. Однако существенным недостатком этого биомаркера является то, что он не отражает состояния

эпидермиса. В связи с этим представляется целесообразным разработать более широкий комплекс морфо-функциональных параметров кожи, учитывающий наряду с показателями содержания коллагеновых и эластических волокон в дерме также и состояние эпидермиса.

Известно, что основными фундаментальными процессами, определяющими постоянство структурно-функциональной организации ткани вообще и кожи, в частности, являются клеточное обновление, цитодифферен-цировка и клеточная гибель [О.Д. Мяделец, В.П. Адаскевич, 1997]. Координация процессов биосинтеза, обмена и воспроизведения генетической информации в различных клеточных популяциях эпидермиса и дермы осуществляется представленными в коже клетками классических регуляторных систем организма - нервной, иммунной и эндокринной, формирующими локальную нейроиммуноэндокринную систему кожи (НИЭСК) [И.М. Кветной, В.Х. Хавинсон, 2002,2003; L. Misery, 1996; A. Slominski, J. Wortsman, 2000].

Представление о НИЭСК сформировалось в последнее десятилетие в рамках концепции, о диффузной нейроиммуноэндокринной системе, как. универсальной системе регуляции гомеостаза [I.M. Kvetnoy, 1996 2002]. Особенности взаимоотношений структурных элементов НИЭСК, характер синтезируемых ими сигнальных молекул при действии повреждающих факторов и заболеваниях кожи активно изучаются в последние годы [P. Alard et al., 1999; (XBauer, E. Razin, 2000; A. Jarvikallio et al, 2002, и др.]. Однако структурно-функциональная организация НИЭСК при старении практически не изучена. Выявление возрастных особенностей морфо-функциональной организации НИЭСК, как основной системы регуляции гомеостаза в коже, представляется актуальным и перспективным для более глубокого понимания процессов, происходящих при инволюции эпидермиса и дермы, патогенеза ассоциированных со старением дерматозов и совершенствования методов профилактики и коррекции возрастных изменений кожи.

Цель и задачи исследования

Изучение возрастных особенностей структурно-функциональной организации НИЭСК и определение спектра нейроиммуноэндокринных маркеров хронологического и индуцированного УФО старения кожи.

В рамках указанной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи:

1. Изучить динамику экспрессии клетками эпидермиса и дермы нейроэндокринных сигнальных молекул - серотонина, мелатонина, хро-могранина А и синтазы оксида азота - при хронологическом и индуцированном УФО старении кожи.

2. Изучить динамику экспрессии клетками эпидермиса и дермы сигнальных молекул иммунной системы — CD35, CD 1а и HLA-DR — при хронологическом и индуцированном УФО старении кожи.

3. Изучить динамику экспрессии клетками эпидермиса и дермы сигнальных молекул, регулирующих пролиферацию, дифференцировку и апоптоз в эпидермисе и дерме при хронологическом и индуцированном УФО старении кожи.

4. Установить корреляции между морфометрическими изменениями показателей экспрессии нейроэндокринных, иммунных молекул и маркеров пролиферации, дифференцировки и апоптоза при хронологическом и фотостарении кожи.

5. Изучить значение возрастных изменений экспрессии нейроэн-докринных и иммунных сигнальных молекул в развитии ассоциированных со старением дерматозов на примере базально-клеточного рака кожи.

Научная новизна работы

Получены результаты, способствующие развитию и углублению представлений о регуляции гомеостаза кожи человека. Выявлены закономерности изменений структурно-функциональной организации компонентов

НИЭСК при хронологическом и индуцированном УФО старении (фотостарении) кожи.

Впервые обнаружена конституциональная экспрессия мелатонина и его основного предшественника серотонина клетками базального слоя эпидермиса, а также мелатонина и хромогранина A тучными клетками дермы.

Установлено, что динамика экспрессии мелатонина и серотонина кера-тиноцитами и тучными клетками имеет сходный характер при хронологическом и фотостарении кожи. Усиление экспрессии мелатонина и серотонина при фотостарении представляет собой компенсаторно-приспособительные механизмы, направленные на ликвидацию последствий повреждающего действия УФО.

Особенности экспрессии нейроэндокринных сигнальных молекул свидетельствуют о том, что хронологическое старение кожи сопровождается постепенным подавлением нейроэндокринной активности компонентов НИЭСК. В свою очередь фотостарение характеризуется неоднозначными нейроэндокринными сдвигами: с одной стороны, способность тучных и эн-дотелиальных клеток абсорбировать и синтезировать биологически активные пептиды прогрессивно усиливается с возрастом, с другой, у пожилых пациентов происходит истощение деятельности кератиноцитов по продукции серотонина и мелатонина.

Результаты исследования экспрессии сигнальных молекул иммунной системы свидетельствуют о том, что снижение потенциальной способности клеток, в первую очередь клеток Лангерганса (КЛ) эпидермиса, вступать в межклеточные взаимодействия при реализации адаптивного иммунного ответа, хотя и более выражено при фотостарении кожи, но сопровождается компенсаторной гиперплазией в дерме С035-иммунопозитивных клеток и аккумуляцией клеток, экспрессирующих антигены HLA-DR.

Характер возрастной динамики инволюкрина в коже, а также установленные корреляции между показателями его экспрессии и экспрессии антигена Е167 и CgA указывают на то, что обнаруженные изменения реактивности этого белка отражают особенности гомеостаза кожи, ассоциированные с ее хронологическим и фотостарением. В связи с этим инволюкрин следует расценить как новый перспективный маркер для оценки морфо-функционального состояния кожи при ее старении.

Продемонстрировало, что при хронологическом старении антиапопто-тический потенциал в первую очередь приобретают низкодифференциро-ванные клетки эпидермиса, а при фотостарении - клетки на разных этапах кератинизации.

Результаты регрессионного анализа свидетельствуют о существовании тесных связей между нейроэндокринными и иммунными сигнальными молекулами в коже человека, а также внутриклеточными молекулами, контролирующими процессы пролиферации, дифференцировки и апоптоза. Впервые зарегистрированы достоверные разнонаправленные корреляции между показателями экспрессии мелатонина и антигена Е167 (положительная), Вс1-2 и р53 (отрицательные) при хронологическом и фотостарении кожи, а также между показателями экспрессии CgA и антигена CD 1а (отрицательная) при фотостарении.

Выявлено участие экспрессируемых'клетками НИЭСК сигнальных молекул, в частности CgA, мелатонина, СБ 1а и HLA-DR в возникновении ба-зально-клеточного рака кожи. Продемонстрировано, что гиперплазия тучных клеток, экспрессирующих CgA, и подавление экспрессии клетками кожи антигенов CD 1а и HLA-DR при фотостарении является предрасполагающим фактором для развития базально-клеточного рака кожи. Показано также, что с появлением нейроэндокринной активности в клетках базально-клеточного рака кожи, в частности экспрессии CgA и мелатонина, происходит снижение темпа роста опухоли.

Практическая значимость работы

Впервые определен спектр молекулярных и нейроэндокринных параметров, отражающих фундаментальные биологические процессы и характеризующих особенности регуляции гомеостаза кожи при ее хронологическом и фотостарении.

Показано, что среди изученных внутриклеточных сигнальных молекул, наиболее полно отражают фундаментальные процессы и несут информацию о функциональном состоянии кожи при ее старении инволюкрин и белки р53, Вс1-2.

В качестве нейроиммуноэндокринных маркеров старения кожи рекомендуется использовать показатели экспрессии С^А, мелатонина, а также антигена СБ 1а. Показано, что изменения этих параметров играют важную роль в патогенезе иволютивных процессов в коже и отражают регуляторные особенности кожи при ее хронологическом и фотостарении. Обнаружение разнонаправленных корреляций между показателями экспрессии мелатони-на, CgA и антигена СБ 1а, а также молекул, определяющих качественный и количественный состав эпидермиса и дермы, свидетельствует о высокой ценности комплекса этих показателей как биомаркеров старения кожи.

Полученные данные об изменениях структурно-функциональной организации НИЭСК, ассоциированных с хронологическим и индуцированным УФО старением, позволят разработать критерии оценки эффективности мероприятий, направленных на профилактику и коррекцию хронологического и преждевременного старения кожи.

Основные положения, выносимые на защиту 1. Кератиноциты эпидермиса, тучные и эндотелиальные клетки дермы являются звеньями нейроиммуноэндокринной системы кожи, регулирующей физиологические функции кожи, а продуцируемые ими вещества — сигнальными молекулами для локальной координации межклеточных и межтканевых взаимодействий.

2. Возрастная инволюция кожи характеризуются морфо-функциональными изменениями структурных компонентов нейроим-муноэндокринной системы кожи, которые носят специфические черты при хронологическом и фотостарении.

3. Хронологическое старение кожи сопровождается постепенным подавлением нейроэндокринной и иммунной активности компонентов ней-роиммуноэндокринной системы кожи, а фотостарение характеризуется неоднозначными нейроиммуноэндокринными сдвигами.

4. Среди изученных параметров возрастные особенности морфо-функционального состояния кожи при хронологическом и фотостарении кожи наиболее полно отражают показатели экспрессии инволюк-рина и белков р53 и Вс1-2, что определяет возможность их использования для оценки биологического возраста кожи.

5. При хронологическом и фотостарении кожи имеется тесная связь между экспрессией мелатонина, антигена Е167 и белка р53 в эпидермисе. Со снижением секреции мелатонина, оказывающего питостатическое и антиоксидантное действие, происходит аккумуляция в клетках белка р53, характеризующегося проапоптотическими эффектами, что отражает комплекс приспособительных реакций, направленных на сохранение гомеостаза стареющей кожи.

6. Фотостарение кожи сопровождается гиперплазией тучных клеток, экс-прессирующих С&Л что является одним из факторов, повышающих риск развития базально-клеточного рака. Возникновение базально-клеточного рака ассоциируется со снижением экспрессии клетками кожи антигенов СБ 1а и НЬЛ-БЯ.

Апробация и реализация результатов исследования Материалы исследования представлены и доложены на I Российском конгрессе дерматовенерологов (Санкт-Петербург, 2003); Всероссийской конференции дерматовенерологов «Современные направления развития ди-

агностики, лечения и профилактики ИППП и дерматозов» (Нижний Новгород, 2004); III Съезде иммунологов России (Екатеринбург, 2004); XIII Всероссийской конференции «Нейроиммунология» (Санкт - Петербург, 2004); I Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2004 г.); XXI научной конференции дерматовенерологов "Псевдолимфомы" (Москва, 2004 г.); на научно-практической конференции, посвященной 300-летию Санкт-Петербурга и 100-летаю больницы им. Императора Петра Великого (Санкт-Петербург, 2003 г.); на ежегодных научно-практических конференциях профессорско-преподавательского состава СПбГМА им. И. И. Мечникова (Мечниковские чтения) (Санкт-Петербург, 2001-2004 гг.)

Материалы исследования используются в научной, педагогической и практической деятельности Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН и в учебном процессе на кафедре дерматовенерологии Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И. Мечникова МЗ и СР РФ.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 24 печатные работы, в том числе 1 монография.

Связь с научно-исследовательской работой Института

Диссертационная работа является научной темой, выполняемой по основному плану НИР Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 275 станицах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, характеристики материала и методов исследования, трех глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа содержит 15 таблиц и 68 рисунков, в том числе 18 монтажей,

скомпонованных из 40 микрофотографий. Список литературы включает 306 источника, из них 257 иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Объектом исследования служил операционный и секционный материал от 237 пациентов (229 женщин и 8 мужчин) в возрасте от 19 до 64 лет. Особенности хронологического старения кожи изучали на закрытой от инсоляции коже заушной области, а фотостарения — на подверженной хроническому УФО коже височной области головы.

Операционный материал был получен от 221 пациента (213 женщин и 8 мужчин) 19 — 64 лет при пластических операциях, проведенных в ожоговом отделении СПбНИИ скорой помощи им. И. И. Джанелидзе за период с 1998 по 2004 гг. В исследование не включали пациентов, страдающие заболеваниями эндокринной и иммунной систем, а также хроническими воспалительными заболеваниями кожи, в том числе в стадии ремиссии, так как особенности их общего и локального нейроиммуноэндокринного статуса могли отразиться на полученных результатах. Кроме того, при отборе пациентов учитывали тип светочувствительности кожи на основании оценки ее реакции на УФО [Д.Е. Фицпатрик, 1999] — в исследование были включены пациенты с первым, вторым и третьим типом светочувствительности. Кроме того, исследовали аутопсийный материал, полученный от 16 практически здоровых женщин молодого возраста (19-25 лет), погибших в результате несчастных случаев.

Все пациенты были разделены на пять возрастных групп (табл. 1.). При разделении пациенток на группы учитывали фазы их репродуктивной жизни [В.И. Кулакова, В.П. Сметник, 2001]. В первую и вторую группы наблюдений вошли женщины от 19 до 51 года, у которых климактерические симпто-

мы отсутствовали. Третью группу наблюдений составили пациентки, находящиеся в перименопаузе, четвертую и пятую - в постменопаузе.

Таблица 1

Распределение пациентов по возрастным группам

Параметры Возрастные группы

1 2 3 4 5

Количество пациентов 31 (27+4) 43 73 78 5

Возраст пациентов, лет 19-27 43-51 49-55 55-60 60-64

Средний возраст пациентов, М±о 23,19+2,31 46,41+2,64 52,47+1,5 57,74+1,49 64,2+1,92

Для выявления особенностей организации НИЭСК при ассоциированных со старением заболеваниях кожи изучено 243 наблюдения базально-клеточного рака кожи. Их них обследовано 37 пациентов (16 мужчин, 21 женщина), обратившихся в клинику кожных и венерических болезней больницы им. Петра Великого за период с 1997 по 2003 гг., и проанализировано 206 наблюдений (95 мужчин, 111 женщин) базально-клеточного рака кожи из архивов кафедры дерматовенерологии и патологической анатомии СПбГМА им. И.И.Мечникова за период с 1977 по 2000 гг. Возраст пациентов варьировал от 25 до 87 лет, преобладали лица старше 50 лет (134 пациента, 55,6 %).

Для анализа зависимости частоты возникновения базально-клеточного рака кожи от степени подверженности кожи УФО выделяли следующие участки кожного покрова:

- постоянно облучаемые ультрафиолетовым светом (кожа лица, волосистой части головы, шеи и кистей);

- периодически облучаемые ультрафиолетовым светом (кожа туловища, плеч, предплечий и нижних конечностей);

- практически не облучаемые ультрафиолетовым светом (кожа лобка, ягодиц и молочных желез).

Для гистологического исследования кусочки кожи фиксировали в 10% нейтральном формалине (рН 7,2) и заливали в парафин. Обзорную окраску проводили гематоксилином и эозином. Тучные клетки селективно выявляли 1% раствором толуидиного синего (Fluka) в 0,5 М НС1 при рН 0,5. Коллаге-новые и эластические волокна окрашивали пикрофуксином по Ван-Гизону и орсеином.

Иммуногистохимические исследования проводили с использованием ультраспецифичной кроличьей антитсыворотки к мелатонину (CIDtech Res. Corp; 1:100) и моноклональных мышиных антител к серотонину (Dako; 1:100), CgA (Novocastra, RTU), эядотелиальной синтазе оксида азота (eNOS) (Novocastra; 1:150), антигенам CD35 (Novocastra; 1:80) и CDla (Novocastra, RTU), системе антигенов II класса главного комплекса гистосовместимости (ГКГ) HLA-DR (Novocastra; 1:50), антигену Ki67 (Novocastra; 1:200), инво-люкрину (Novocastra; 1:100), белкам р53 (Novocastra; 1:50), Bcl-2 (Novocastra; 1:80), Mcl-1 (Novocastra; 1:20), а также к ядерному антигену пролиферирующих клеток (PCNA - proliferative cell nuclear antigen) (Dako; 1:200).

В качестве вторых антител использовали универсальный набор, содержащий биотинилированные анти-мышиные и анти-кроличьи иммуноглобулины. Визуализацию окрасок проводили с применением комплекса авиди-на с биотинилированной пероксидазой (ABC-kit) и последующим проявлением пероксидазы хрена диаминобензидином (все реагенты от Novocastra).

Для типирования иммунопозитивных клеток на полутонких срезах проводили иммуноцитохимическую реакцию с антителами к CgA и мелато-нину. После прицельной заточки блоков готовили ультратонкие срезы на ультратоме LKB-7A, которые контрастировали уранилацетатом и цитратом

свинца. Электронно-микроскопическое исследование проводили в электронном микроскопе JEM-100S (Jeol).

Для оценки результатов гистологических и иммуногистохимических исследований использовали систему компьютерного анализа микроскопических изображений, состоящую из светового оптического микроскопа Nikon Eclipse E400, цифровой камеры Nikon DXM1200, компьютера на базе Intel Pentium 4 и программного обеспечения «Видеотест-Морфология 4.0».

Морфометрический анализ состояния кожи при старении включал определение толщины эпидермиса, числа рядов клеток в нем, доли коллагено-вых и эластических волокон в дерме с вычислением их соотношения. Среднее количество тучных клеток, а также CD35-, eNOS-, CgA-, СК20- иммуно-позитивных клеток подсчитывали в 1 мм2 кожи. Результаты исследования экспрессии антигенов Ki67, PCNA и HLA-DR-, белков р53 и Вс1-2 выражали как среднее значение иммунопозитивных клеток или ядер на 1 мм2 эпидермиса или дермы. Индексы Ki-67, PCNA, р53 и Вс1-2 вычисляли по отношению числа иммунопозитивных ядер к общему числу ядер в эпидермисе или дерме, выраженному в процентах. Результаты исследования экспрессии молекулы CD la выражали как среднее количество иммунопозитивных клеток в 1 мм2 кожи и процент площади ее экспрессии в эпидермисе (по соотношению площади иммуноокрашивания к площади эпидермиса, выраженном в процентах). Иммуноокрашивание клеток эпидермиса антителами к серото-нину и мелатонину также выражали как процент его площади, а клеток дермы - как среднее количество иммунопозитивных клеток в 1 мм2 кожи. Кроме того, оценивали интенсивность экспрессии исследуемых молекул, выраженную в условных единицах оптической плотности (OpDEC, y.e.). Иммунопо-зитивную реакцию с антителами к инволюкрину, белку Мс1-1 и eNOS характеризовали с использованием показателей интенсивности (OpDEC, y.e.) и показателей площади иммуноокрашивания в эпидермисе или дерме.

Статистическая обработка полученных данных производилась на персональном компьютере IBM с помощью пакета прикладных программ Excel и Statgraphics 3,0 (Statistical Graphics Corporation, США). Рассчитывались средние значения и их квадратичное отклонение. Оценка достоверности разности между средними значениями проводилась с использованием критерия t Стьюдента. Для измерения меры связи между изменениями изучаемых показателей использовали регрессионный анализ, определяли коэффициент корреляции между показателями и достоверность корреляционной связи по критерию Фишера.

Результаты исследований и их обсуждение

Хронологическое старение кожи. В ходе иммуногистохимического исследования кожи заушной области у 237 человек разного возраста в дерме обнаружены клетки, дающие выраженную иммунопозитивную реакцию с антителами к CgA. Ультраструктурное исследование выявило в цитоплазме этих клеток электронноплотные секреторные гранулы, характерные для тучных клеток.

Таким образом, применение иммуногистохимического метода позволило впервые обнаружить CgA, маркер эндокринных APUD-клеток, в цитоплазме мастоцитов кожи человека. Известно, что основные физиологические функции мастоцитов связаны с синтезом, накоплением и секрецией разнообразных биологически активных веществ [И.С. Фрейдлин, 2001]. Электронно-микроскопическое изучение секреторных лизосом, в которых эти клетки депонируют вырабатываемые или абсорбируемые ими продукты, показало, что некоторые ультраструктурные черты этих органелл сходны с таковыми секреторных гранул апудоцитов [J.C. Stinchcombe, G.M.Griffiths, 1999]. Поскольку основной функцией CgA в эндокринных клетках является участие в биосинтезе секреторных гранул и укладке в них биологически активных

пептидов [Y.P. Loh et al., 2004; W.B. Hutter, 2004], очевидно, что и в масто-цитах он выполняет эту роль.

Морфометрический анализ показал, что количество иммунопозитив-ных к CgA мастоцитов имеет слабую тенденцию к увеличению с возрастом пациентов. Со второй-третьей по седьмую декаду жизни значения показателя выросли не более чем на 10% и составили у пациентов старше 60 лет 359,15 ± 12,99 клеток по сравнению 314,16 ± 5,69 клеток в 1мм2 кожи у 19 — 27-летних (р< 0,01).

Иммуногистохимическое исследование с использованием антител к мелатонину и его основному предшественнику серотонину выявило диффузное окрашивание клеток базального слоя эпидермиса. Характерной особенностью иммунореактивности базальных кератиноцитов была аккумуляция иммунопозитивного материала в их апикальном полюсе. Полученные результаты согласуются с имеющимися в литературе данными об экспрессии компонентов системы биосинтеза индолалкиламинов в клетках эпителия кожи [A Slonimski et al., 2003] и позволяют утверждать, что эпидермис человека является местом биосинтеза эндогенных серотонина и мелатонина.

Кроме того, клетки, экспрессирующие мелатонин, были обнаружены в дерме. При электронно-микроскопическом исследовании установлен их мас-тоцитарный фенотип. В большинстве изученных случаев имелась обратная зависимость между интенсивностью иммуноокрашивания клеток эпидермиса и дермы антителами к мелатонину: выраженная иммунопозитивная реакция тучных клеток определялась на участках кожи, характеризующихся практически полным отсутствием таковой в кератиноцитах, и наоборот. Эти данные предполагают способность мастоцитов активно абсорбировать мела-тонин, секретированный клетками эпидермиса.

Таким образом, проведенное иммуногистохимическое исследование впервые обнаружило экспрессию мелатонина и серотонина клетками эпидермиса кожи человека in situ. Известно, что оба вещества играют важную

роль в нейроэндокринной регуляции процессов жизнедеятельности органов и тканей, в том числе клеточной пролиферации. В связи с этим особого внимания заслуживает факт экспрессии этих биогенных аминов клетками ба-зального слоя, образованного наиболее функционально активными и уязвимых к действию эндогенных и экзогенных факторов полустволовыми и стволовыми эпителиоцитами [J. Ponten 2001; Т. Reya et al., 2001].

При хронологическом старении кожи отмечалась тенденция к снижению экспрессии серотонина и мелатонина (рис. 1). При этом количество ке-ратиноцитов, экспрессирующих эти биогенные амины, оставалось стабильным до 55 лет и достоверно снижалось только у пациентов старше 60 лет (8,17 ± 0,03% по сравнению с 10,82 ± 0,26% у 19 -27 летних, р< 0,001 и 10,16 ± 0,31 по сравнению с 11,94 ± 0,15%, р < 0,001, соответственно).

20 j -г 350

о-,----< -к- -1- -и-i-O

19-27 43-51 49-55 54-60 старше 60 Возраст

| -■— Площадь экспрессии серотонина, % площади эпидермиса |

| ♦ Площадь экспрессии мелатонина, % площади эпидермиса I

' -*—Количество тучных клеток, иммунопозитивных кмзлатонииу в 1мм2 кожи I

Рис. 1. Динамика показателей экспрессии серотонина имелатонина прихронологическом старении кожи.

Заметное уменьшение числа мелатонин-иммунопозитивных тучных клеток определялось в коже пациентов старше 50 лет и составляло 211,59 ± 6,59 клеток в 1мм дермы, а после 60 лет - 205,66 ± 5,0 клеток в 1мм дермы

(по сравнению с 269,02 ± 15,87 клеток у пациентов 19-27 лет, соответственно, р < 0,001). Наличие сильной достоверной связи между динамикой показателей площади экспрессии мелатонина в эпидермисе и количеством им-мунопозитивных к нему мастоцитов в дерме (г= +0,66, Б<0,0001) позволяет предположить, что уменьшение числа последних отражает ассоциированное с возрастом снижение синтеза и секреции этого биогенного амина кератино-цитами.

В тоже время оптическая плотность иммунопозитивных к серотонину и мелатонину клеток эпидермиса и дермы существенно не менялась с возрастом. Стабильность этих показателей свидетельствует о том, что снижение экспрессии изученных веществ в коже пожилых происходит не за счет ослабления их синтеза или накопления, а за счет уменьшения числа клеток, продуцирующих эти биогенные амины.

Иммуногистохимическая реакция с использованием антител к выявила окрашивание цитоплазмы эндотелиальных клеток сосудов дермы. Морфометрический анализ установил, что в процессе старения кожи оптическая плотность экспрессии фермента достоверно снижалась уже к 54 годам (1,76 ± 0,1 0pDEC у.е. по сравнению с 2,1 ± 0,11 0pDEC у.е., р < 0,001), а площадь экспрессии - у пациентов старше 60 лет (0,89 ± 0,09% по сравнению с 0,99 ± 0,06, р < 0,001). Так как функция N0 состоит в торможении сократительного аппарата сосудистых гладкомышечных клеток, то уменьшение активности синтезирующего его фермента у женщин в стойкой менопаузе вероятнее всего ассоциируется с отсутствием вазоспастических эффектов эстрогенов на а2-адренорецепторы миоцитов сосудов [8. Лгога й а1., 1998].

Слабая конституциональная экспрессия антигенов II класса ГКГ НЬЛ-DR, обозначаемая как HLЛ-DR 1о" [Д.В. Мазуров и соавт., 2002], в коже пациентов 19-27 лет осуществлялась КЛ эпидермиса и гетерогенной по составу популяцией клеток дермы, характеризующихся полиморфизмом размеров и формы. При старении кожи отмечена тенденция к некоторому сни-

жению экспрессии антигенов HLA-DR. Уменьшение числа иммунопозитив-ных клеток явно определялось после 54 лет и достигало статистически значимых различий с таковым у 19-27 летних у лиц старше 60 лет (116,32 ± 3,82 клеток в 1 мм2 кожи по сравнению с 127,18 ± 2,39 клеток в 1 мм2 кожи, р < 0,05; рис. 2.), достоверно коррелируя с возрастом пациентов в старших возрастных группах (г=-0,74, F<0,0001). Следует отметить, что уменьшение количества клеток, экспрессирующих антигены HLA-DR, происходило преимущественно за счет снижения числа иммунопозитивных КЛ в эпидермисе.

Рис. 2. ДинамикапоказателейэкспрессииантигеновCDla, HLA-DRиCD35 прихронологическом старении кожи.

Снижение количества CDla-иммунопозитивных КЛ при старении кожи также коррелировало с возрастом пациентов (г=-0,82, F<0,0001). Их число в 1 мм2 кожи уменьшалось у лиц 49-55 лет практически на 25 %, а после 60 лет - более чем на 30 % по сравнению с таковым у 19 - 27-летних (641,61 4 11,61 клеток и 581,86 ± 12,54 клеток, соответственно по сравнению с 876,79 ± 14,0 клеток, р < 0,0001). Уменьшение, количества КЛ сопровожда-

лось изменением их топической локализации в эпидермисе: у пациентов молодого возраста они располагались преимущественно в супрабазальных отделах эпидермиса, а у пациентов старше 50 лет - между базальными керати-ноцитами.

Соответственно уменьшению количества КЛ происходило снижение показателя площади экспрессии антигена CD la в эпидермисе, также коррелирующее с возрастом пациентов (г=-0,91, F<0,0001). К 50 годам этот показатель уменьшался на 20 %, а к 60 годам становился практически в 2 раза ниже, чем у пациентов 19 - 27 лет (8,75 ± 0,27%, р < 0,001 и 5,26 ± 0,13 %, р<0,0001, соответственно по сравнению с 11,14 ± 0,35% площади эпидермиса). Снижение площади экспрессии CD la являлось следствием уменьшения числа иммунопозитивных КЛ (корреляция между показателями г=+0,69, F<0,0001), а также отражало уменьшение размеров клеток и/или числа и размеров их дендритных отростков, а, следовательно, способности КЛ к межклеточному взаимодействию.

В тоже время существенных изменений количественных и качественных параметров, отражающих экспрессию CD35 антигена, при старении кожи не обнаружено. Так как молекула CD35 или CR1 принадлежит к группе рецепторов врожденной иммунной системы [А.А. Ярилин, 1999], то стабильность количественных и качественных показателей ее экспрессии у пациентов разных возрастных групп свидетельствует о сохранении способности клеток к распознаванию и захвату антигенного материала при хронологическом старении кожи.

Изучение возрастной динамики экспрессии внутриклеточных сигнальных молекул, определяющих постоянство качественного и количественного состава кожи, обнаружило, что хронологическое старение характеризуется снижением пролиферативной активности кератиноцитов, изменениями в соотношении белков-регуляторов апоптоза, а также усилением экспрессии ин-волюкрина, маркера терминальной дифференцировки кератиноцитов.

Уменьшение индекса Е167 и количества иммунопозитивных клеток в 1мм2 эпидермиса и коррелировало с возрастом пациентов (г=-0,87, Б<0,0001 и г=-0,9, Б<0,0001, соответственно). При этом статистически значимые изменения показателей отмечены уже у пациентов старше 49-55 лет, а после 60 лет абсолютное и относительное число делящихся клеток снижалось практически в 2 раза (723,41 ± 16,52 клеток и 475,95 ± 17,83 клеток по сравнению с 1050,38 ± 25,63 клеток в 1 мм2 кожи, р < 0,0001 и 9,44 ± 0,39 % и 7,73 ± 0,47% по сравнению с 13,25 ± 0,56% иммунопозитивных клеток эпидермиса, р < 0,0001, соответственно).

Во-всех исследованных случаях экспрессия антигена Е167 клетками дермьгвыявлялась непостоянно (примерно в половине исследованных полей зрения) и независимо от возраста пациентов была представлена единичными иммунопозитивными клетками. Это обстоятельство затрудняло проведение количественной оценки экспрессии указанного маркера, однако свидетельствовало о низкой пролиферативной активности клеток дермы.

Иммуноокрашивание инволюкрина в коже заушйой области определялось в цитоплазме кератиноцитов верхних отделов шиповатого слоя эпидермиса и усиливалось в клетках зернистого слоя. При старении кожи оптическая плотность экспрессии этого белка возрастала у пациентов 49 — 55 лет на 25% по сравнению с показателями пациентов 19 -'27-летних, а у лиц, старше 60 лет, практически на 35% (2,28 ± 0,08 ОрБЕС у.е, р < 0,05 и 2,76 ± 0,09 ОрБЕС у.е., р< 0 ,001, соответственно, по сравнению с 1,97 ± 0,06 ОрБЕС у.е.). Регрессионный анализ обнаружил достоверную связь между оптической плотность инволюкрина и возрастом пациентов (г= +0,63, Б<0,001), а также оптической плотности экспрессии инволюкрина и индексом Е167 (г= -0,77, Б < 0,0001): иммуноокрашивание белка усиливалось по мере снижения пролиферативной активности эпидермиса. -

В эпидермисе пациентов молодого бозраста (19 — 27 лет) иммуноокра-шивание ядер кератиноцито» антителами к белку р53 определялось в клетках

нижних и средних отделов. Ассоциированное со старением кожи истончение эпидермиса характеризовалось нивелированием зависимого от дифференци-ровки кератиноцитов градиента иммуноокрашивания их ядер и тенденцией к увеличению индекса р53. Так в коже заушной области доля р53-иммунопозитивных кератиноцитов достоверно увеличивалась у пациентов старше 54 лет (с 54,30 ± 1,42 % до 58,16 ± 1,03 % кератиноцитов, р < 0,005) и еще несколько возрастала после 60 лет (до 59,24 ± 1,01 % кератиноцитов, р < 0,005; рис. 34). Кроме того, оптическая плотность экспрессии р53 повышалась со второй-третьей по седьмую декаду жизни на 11 % (с 1,94 ± 0,03 ОрБЕС у.е. до 2,27 ± 0,02 ОрБЕС у.е., р < 0,001). Экспрессия белка р53 выявлена также в клетках дермы. Причем абсолютное число иммунопозитивных клеток и индекс р53 имели тенденцию к увеличению с возрастом пациентов.

Морфометрический анализ экспрессии белков Вс1-2 и Мс1-1 в эпидермисе пациентов разных возрастных групп обнаружил, что рост оптической плотности экспрессии белка Вс1-2 был более существенным, чем Мс1-1: с третьей по седьмую декады жизни они возрастали на 20 % и 15 %, соответственно (с 2,23 ± 0,08 ОрБЕС у.е. до 2,96 ± 0,03 ОрБЕС у.е., р < 0,001 и с 2,19 ± 0,02 ОрБЕС у.е. до 2,57 ± 0,05 ОрБЕС у.е., р < 0,001). Параллельно более чем на 15 % увеличился индекс Вс1-2 (с 8,2 ± 0,46 % до 9,92 ± 0,11 % клеток эпидермиса, р < 0,01). Описанные особенности экспрессии Вс1-2 и Мс1-1 свидетельствуют о преимущественном повышении резистентности к проапоптотическим сигналам менее дифференцированных клеток эпидермиса. Выявленная тесная корреляция между показателями экспрессии Вс1-2 и Е167 (г = - 0,89, Е < 0,001) позволяет считать усиление иммунореактивности первого одним из компенсаторных механизмов, обеспечивающих увеличение продолжительности жизни низкодифференцированных клеток эпидермиса при снижении их пролиферативной активности.

Что касается экспрессии антиапоптотических белков Вс1-2 и Мс1-1 клетками дермы, то она характеризовалась существенной вариабельностью

количественных показателей (абсолютного числа иммунопозитивных клеток и индексов Вс1-2 и Мс1-1) в изученных полях зрения. Тем не менее, обращало на себя внимание, что интенсивность иммуноокрашивания клеток дермы существенно превышала таковую эпидермиса и оставалась на стабильно высоком уровне по мере старения пациентов.

Со старением кожи ассоциировалось уменьшение как абсолютного, так и относительного числа (индекса) РСКА-иммунопозитивных клеток. Абсолютное количество иммуноокрашенных клеток снижалось со второй-третьей по седьмую декаду жизни на 33% (с 1112,67 ± 34,67 клеток до 841,34 ± 23,12 клеток, р < 0,0001), а индекс РСКА - на 24% (с 15,95 ± 0,65 % до 10,76 ± 0,24%, р < 0,0001). Известно, что молекула РСКА поли функциональна и является ко-фактором ДНК-полимеразы Е, вовлеченной в репарацию генетического материала, и/или ДНК-полимеразы 8, принимающей участие в синтезе ДНК в пролиферирующих клетках. Поэтому изменения количественных показателей ее экспрессии с возрастом могут отражать ассоциированные со старением изменения в системе репарации ДНК или пролифе-ративной активности клеток. Корреляционный анализ установил тесную связь между индексами РСКА и Е167 (г = + 0,85, Б < 0,0001). Изучение серийных срезов, окрашенных антителами к РСКА и белкам К167 и р53, обнаружило, что плотность распределения и локализация клеток, экспрессирую-щих РСКА, чаще совпадали с таковыми клеток, иммунореактивных к антигену К167. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что в коже закрытых от инсоляции участков кожи экспрессия РСКА характерна в первую очередь для пролиферирующих клеток.

Корреляционный анализ связей между показателями экспрессии маркеров пролиферации, дифференцировки, апоптоза клеток, а также нейро-эндокринных и иммунных сигнальных молекул обнаружил при хронологическом старении кожи достоверные корреляции между показателями экспрессии мелатонина в эпидермисе и индексами К167 (г = +0,68, Б < 0,0001),

Вс1-2 (г = -0,72, Б < 0,0001) и р53 (г = -0,56, Б < 0,0001). Хотя наличие связи между изменениями показателей не доказывает их непосредственную причинно-следственную зависимость, обращает на себя внимание тот факт, что со снижением секреции мелатонина, известного цитостатическими эффектами, происходит повышение индекса р53, характеризующегося проапоптоти-ческим действием. Изменения экспрессии последнего могут отражать комплекс приспособительных реакций, направленных на сохранение гомеостаза стареющей кожи, в том числе и в ответ на ассоциированное с возрастом подавление синтеза и секреции мелатонина, обладающего цитостатическим действием.

* * »

Таким образом, наиболее полно изменения морфо-функционального состояния кожи в процессе ее хронологического старения характеризуют показатели экспрессии антигена СБ 1а, инволюкрина, антигена Е167, белков р53 и Вс1-2 клетками эпидермиса. Они отражают фундаментальные процессы и регуляторные особенности в коже, а также коррелируют с физиологическим возрастом пациентов, что определяет возможность их использования в качестве биомаркеров хронологического старения кожи. Тесные корреляционные связи между показателями экспрессии мелатонина и маркерами пролиферации и апоптоза, а также возрастом пациентов старше 40 лет, определяет перспективность его использования для характеристики регулятор-ных процессов в коже в процессе ее старения.

Фотостарение кожи. Фотостарение кожи сопровождалось увеличением содержания в дерме мастоцитов, экспрессирующих С&Л. Со второй-третьей по седьмую декады жизни их количество выросло более чем в 1,5 раза (с 509,24 ± 6,73 клеток до 950,64 ± 16,47 клеток в 1 мм2 кожи, р < 0,0001) и превышало таковое в коже заушной области у этих же пациентов (359,15 ± 12,99 клеток в 1 мм2 кожи, р < 0,0001). Обнаруженные изменения

являлись следствием ассоциированной с фотостарением гиперплазии тучных клеток, а также — увеличением доли мастоцитов, иммунореактивных к маркеру (с 60 - 70% в коже заушной до 80 - 90% в коже височной области). Параллельное повышение оптической плотности экспрессии CgA свидетельствует об активации синтетической и секреторной функции мастоцигов.

Кроме того, в коже височной области определялось иммуноокрашива-ние антителами к CgA эндотелиальных клеток сосудов дермы. Причем у пациентов, которым операция проводилась в сезон с высоким уровнем естественной инсоляции (апрель — май), отмечалось увеличение оптической плотности экспрессии маркера эндотелиоцитами на

ОЕС у.е. до 2,44 ± 0,07 ОрЮЕС у.е.). Имеются сведения, что эндотелиальные клетки абсорбируют CgA при повышении его уровня в сыворотке крови, ассоциированном с патологией сердечно-сосудистой системы или гормонально-активными опухолями [Е. Feггeгo е! а1., 2002, 200]. При этом основным биологическим действием считают стабилизацию цитоскелета эндоте-лиоцитов и нормализацию проницаемости сосудистой стенки. Поэтому, появление экспрессии в эндотелиоцитах дермы при фотостарении кожи, сопровождающимся, в частности, гиперплазией тучных клеток и усилением их секреторной активности, является одним из паракринных механизмов регуляции гомеостаза дермы в условиях индуцированного хроническим УФО воспаления.

Об активации нейроэндокринных свойств эндотелиальных клеток при фотостарении кожи свидетельствует и повышение экспрессии еК08. Оптическая плотность экспрессии фермента имела тенденцию к росту (с 2,1 ± 0,1 ОрБЕС у.е. у 19 - 27-летних до 2,19 ± 0,12 ОрБЕС у.е. после 60 лет, р < 0,05) и достоверно превышала таковую в коже заушной области.

В двух исследованных случаях (женщины 43 и 50 лет) были обнаружены единичные клетки, дающие положительную реакцию с антителами к CgA, в эпидермисе, где они располагались среди кератиноцитов базального

слоя. В обоих наблюдениях их содержание коррелировало с количеством КМ, определенным по экспрессии одного из их наиболее надежных маркеров - цитокератина 20. Эти данные позволили идентифицировать иммуноре-активные к CgA клетки эпидермиса как КМ. Проведение комплексного анализа зависимости экспрессии CgA KM и показателей иммуноокрашивания других нейроэндокринных молекул клетками кожи не представлялось возможным в связи с малым количеством наблюдений. Тем не менее, необходимо отметить появление реактивности к CgA в эпидермисе на фоне усиления реактивности к нему других клеток (мастоцитов, эндотелиоцитов).

Описанные особенности иммуноокрашивания клеток эпидермиса и дермы антителами к CgA в свете данных о широком спектре ауто- и пара-кринных эффектов этого биологически активного пептида [S.A. Feldman, L.E. Eiden, 2003] свидетельствуют об активации компонентов НИЭСК в коже, подверженной хронической инсоляции. Усиление экспрессии CgA, ассоциированное с фотостарением кожи, определяется в первую очередь гиперплазией иммунореактивных к нему тучных клеток и активацией способности к синтезу или абсорбции этого белка эндотелиальными клетками, а, возможно, и клетками эпидермиса.

В коже височной области, подверженной хроническому УФО, количество кератиноцитов, иммунопозитивных к серотонину и мелатонину, и оптическая плотность экспрессии изученных биогенных аминов оставались относительно стабильными до 50 лет. Следует отметить, что показатели экспрессии изученных биогенных аминов в эпидермисе височной области в этих возрастных группах были выше, чем в заушной области. В старших возрастных группах (после 55 лет) экспрессия серотонина и мелатонина снижалась в первую очередь за счет уменьшения числа иммунореактивных клеток и в меньшей степени - оптической плотности иммуноокрашивания. Так площадь экспрессии обоих биогенных аминов в эпидермисе пациентов старше 60 лет снизалась практически в два раза по сравнению с показателя-

ми у 19 - 27 летних (с 13,09 ± 0,05% до 6,72 ± 0,79% площади эпидермиса, р<0,0001 и с 17,56 ± 0,23% до 8,41 ± 0,8%, р < 0,0001, соответственно).

Рис. 3. Динамика показателей экспрессии серотонина и мелатонина при фотостарении кожи.

Количество тучных клеток, экспрессирующих мелатонин, в дерме височной области пациентов было выше, чем в дерме заушной области, во всех возрастных группах. Оно оставалось относительно стабильным до 60 лет.

Эти результаты могут указывать на то, что в коже, подверженной хроническому воздействию УФО, отмечается усиление продукции и абсорбции мелатонина и серотонина, действие которых направлено на регуляцию клеточного цикла и нивелирование последствий окислительного стресса.

Динамика количественных показателей экспрессии антигенов II класса ГКГ НЬЛ-БЯ клетками кожи при фотостарении носила сходный характер с таковой при хронологическом старении. Однако снижение числа НЬЛ-Бг10'-иммунопозитивных клеток в коже височной области достигало достоверных значений несколько раньше, чем в коже заушной области, уже к 54 годам

(118,74 ± 2,84 клеток по сравнению с 131,39 ± 4,89 клеток в 1 мм2 кожи, р<0,05). При этом статистически значимых различий средних величин показателя в коже открытых и закрытых участков внутри возрастных групп не отмечалось. Характерной особенностью конституциональной экспрессии HLA-DR в коже височной области являлось практически полное подавление ее иммунореактивности в эпидермисе. Следовательно, отсутствие значимых различий количества HLA-DR-иммунопозитивных клеток в коже закрытых и открытых участков обеспечивалось увеличением фракции иммунореактив-ных клеток в составе воспалительного инфильтрата в фотоповрежденной дерме.

Рис 4 Динамика показателей экспрессии антигенов CDla, HLA-DR и CD35 при фотостарении кожи.

Количество CDla-иммунопозитивных КЛ в 1 мм2 кожи снижалось к 49 - 55 годам на 30% (с 882,13 ± 16,33 клеток до 630,68 ± 9,38 клеток в 1мм2, р<0,001), а после 60 лег - практически в два раза (до 471,44 ± 24,08 клеток в Л мм2, р<0,0001) по сравнению с таковым у лиц 19-27 лет. Уменьшение показателя площади экспрессии антигена CDla в эпидермисе было еще более

значительным. У пациентов старше 54 лет он составил не более 50% от уровня 19 — 27 летних, а после 60 лет снижался на 70% (с 12,09 ± 0,13% до 5,87±0,12%, р < 0,0001 и до 3,62 ± 0,17 % площади эпидермиса, г = 31, р < 0,0001, соответственно). Изменения обоих показателей коррелировали с возрастом пациентов (г = -0,79, F < 0,001 и г = -0,82, F < 0,001) и были достоверно ниже таковых в коже заушной области. Другой характерной особенностью экспрессии антигена CD 1а при фотостарении было уменьшение показателей оптической плотности его экспрессии, свидетельствующие о снижении интенсивности синтеза молекулы.

Качественные параметры экспрессии CD35 (или CR1) с возрастом пациентов оставались стабильными. В тоже время количество CD35-иммунопозитивных клеток достоверно увеличивалось у пациентов старше 54 лет (с 420,69 ± 10,84 клеток у 19 - 27-летних до 630,29 ± 8,64 клеток в 1 мм2 дермы, р < 0,001). Известно, что мембранный рецептор CR1 ^Б35) экспрес-сируется представителями резидентной и рециркулирующей популяций им-мунокомпетентных клеток кожи. Поэтому обнаруженное повышение реактивности молекулы может являться результатом активации местных клеточных элементов - мастоцитов и макрофагов - и/или воспалительной инфильтрации фотоповрежденной кожи Т- и В-лимфоцитами и нейтрофилами.

Таким образом, проведенное нами исследование обнаружило разнонаправленную возрастную динамику экспрессии сигнальных молекул иммунной системы. При фотостарении кожи происходит прогрессивное снижение CD 1а- и HLA-DR-иммунопозитивных КЛ, обеспечивающих связь между первичным и антиген-специфическим иммунным ответом. На этом фоне гиперплазия С035-иммунореактивных клеток и аккумуляция клеток, экспрес-сирующих антигены II класса ГКГ HLA-DR, в дерме представляется компенсаторным механизмом, направленным на сохранение иммунных функций кожи.

Пролиферативная активность клеток, оцениваемая по показателям экспрессии белка К167, при фотостарении оставалась на относительно стабильном уровне до 55 лет, хотя и характеризовалась выраженными индивидуальными различиями. Только у более пожилых людей количество К167-иммунопозитивных клеток в 1 мм2 и индекс К167 достоверно уменьшалось (р < 0,05). Ранжирование пациентов в соответствии с сезонным уровнем естественного УФО на момент проведения операции обнаружило, что стабильно высокий уровень значений показателей был обусловлен усилением деления клеток эпидермиса на фоне повышения инсоляции в весенний период времени. Так средние значения индекса К167 варьировали в младшей возрастной группе от 11,98 ± 1,12% в осенне-зимний период до 14,03 ± 0,92% весной, а в группе пациентов 54 - 60 лет от 8,31 ± 1,07% до 10,75 ± 1,03%, соответственно.

- ' Фотостарение кожи сопровождалось значительным усилением экс--прессии инволюкрина в эпидермисе. Показатели оптической плотности экспрессии белка возрастали более чем на 30 %-уже к 54 годам (с 1,98 ± 0,09 ОрБЕС у.е; до 2,7 ±0,12 ОрБЕС у.е., р < 0,001) к сохраняла слабую тенденцию к увеличению у лиц старшего возраста. Другой характерной особенностью было появление иммуноокрашивания инволюкрина в более глубоких (ш сравнению с закрытыми от инсоляции участками кожи) отделах эпидермиса Это сопровождалось увеличением показателя площади экспрессии белка со второй/третьей по седьмую декаду жизни практически в 2 раза (с 11,28 ± 1,19 до 20,25 ± 1,14%, р < 0,0001). Цифровые значения площади экспрессии инволюкрина в эпидермисе достоверно превышали таковые в коже заушной области этих же пациентов старших возрастных групп (р<0,0001).

Следует отметить, что изменения обоих показателей иммунореактив-ности инволюкрина достоверно коррелировали с возрастом пациентов, причем для оптической плотности экспрессии белка связь была более тесной

(г= +0,73, Б < 0,0001). Кроме того, регрессионный анализ обнаружил связь между оптической плотностью экспрессии инволюкрина и индексом Ю67 (г = - 0,61, Б < 0,0001), а также между площадью его иммуноокрашивания и индексом Ю67 (г = - 0,65, Б< 0,0001). Однако если при хронологическом старении эта связь была сильной, то при фотостарении - средней силы. Эти данные, с одной стороны, можно расценивать как свидетельство зависимости процессов терминальной дифференцировки кератиноцитов от скорости обновления эпидермиса, а с другой - значение других особенностей гомео-стаза кожи при фотостарении, определяющих терминальную дифференци-ровку эпителиальных клеток. В качестве таких факторов могут выступать биологически активные пептиды, синтезируемые мастоцитами дермы, так как между количеством этих клеток и оптической плотности экспрессии инволюкрина установлено наличие корреляционной связи (г = + 0,48, Б<0,0001). В литературе также имеются сведения о зависимости экспрессии инволюкрина от влияния факторов микроокружения. Следовательно, возрастные изменения экспрессии инволюкрина в эпидермисе открытых и закрытых участков, обнаруженные нами, отражают ассоциированные с хронологическим и фотостарением кожи особенности ее гомеостаза.

Индекс р53 достоверно увеличивался уже у пациентов старше 43 лет -с 57,68 ± 1,51% до 62,79 ± 0,77% клеток эпидермиса (р < 0,05) - и достигал на седьмой декаде жизни 76,09 ± 1,45%, превышая таковой у лиц 19-27 лет на 25% (р < 0,001). Параллельно со второй-третьей по седьмую декаду жизни на 26% возрастала оптическая плотность экспрессии белка (с 2,18 ± 0,11 ОрБЕС у.е. до 2,96 ± 0,02 у.е. у лиц старше 60 лет, р < 0,01).

Динамика экспрессии белка р53 клетками дермы в процессе фотостарения кожи несколько отличалась от таковой в эпидермисе. Появление индуцированной УФО воспалительной инфильтрации ассоциировалось с увеличением доли и абсолютного числа клеток, экспрессирующих белок р53, со второй/третьей по седьмую декады жизни пациентов более чем в 1,5 раза -

с 41,78 ± 4,85% до 64,95 ± 5,67% (р < 0,01) и с 558,67±9,34 клеток до 747,83±12,35 клеток в 1мм2 дермы (р < 0,01).

Таким образом, проведенное исследование выявило, что фотостарение кожи сопровождается аккумуляцией белка р53 в ядрах кератиноцитов, а также увеличением доли клеток эпидермиса и дермы, экспрессирующих маркер. Эти изменения, можно расценивать как компенсаторные и развивающиеся на фоне хронического мутагенного воздействия УФО и стимулированного им повышения пролиферативной активности клеток. В пользу этого предположения может свидетельствовать наличие тесной связи между показателями индексов р53 и Ю67 (г = - 0,69, Р < 0,001).

Морфометрический анализ экспрессии белков Вс1-2 и Мс1-1 в эпидермисе височной области пациентов разных возрастных групп обнаружил, что, как и хронологическое, фотостарение кожи сопровождалось возрастанием показателей оптической плотности обоих маркеров и количества Вс1-2-иммунопозитивных клеток. Индекс Вс1-2 и абсолютное число экспрес-сирующих его клеток увеличились со второй/третьей по седьмую декаду жизни на 25 % и 60 %, соответственно (с 8,4 ± 0,17% до 10,89 ± 0,12%, р < 0,01 и с 671,27 ± 9,76 клеток до 1239,75 ± 16,67 клеток в 1 мм2 эпидермиса, р < 0,001), и достоверно превышали таковые в коже заушной области. Оптическая плотность экспрессии белка Мс1-1 в эпидермисе височной области увеличивалась со второй-третьей по седьмую декады жизни на 20% (с 2,29 ± 0,08 OpDEC у.е. до 2,87 ± 0,45 OpDEC у.е., р < 0,01) и была более чем на 10% выше значений показателя в коже заушной области. Среди всех перечисленных показателей только оптическая плотность экспрессии белка Мс1-1 коррелировала с возрастом пациентов (г = + 0,71, Р < 0,001).

В дерме также отмечено усиление экспрессии белков-блокаторов апоптоза, в первую очередь за счет увеличения относительного (с 14,54 ± 3,68% до 44,4±6,3%, р < 0,001) и абсолютного числа клеток, экс-

прессирующих Bcl-2 (с 224,56 ± 23,54 клеток до 871,29+49,67 клеток в 1 мм2 дермы, р < 0,001) и небольшого повышения его оптической плотности.

Таким образом, проведенное исследование установило, что при фотостарении кожи в клетках эпидермиса и дермы происходит аккумуляция Вс1-2 и Мс1-1, обеспечивающих резистентность к проапоптотическим сигналам. Причем в эпидермисе антиапоптотический потенциал в равной мере приобретают кератиноциты, находящиеся на разных этапах кератинизации.

Значения индекса PCNA были достоверно выше у пациентов от 49 до 50 лет по сравнению с таковыми у молодых (19 — 27 лет), а у пациентов более старшего возраста снижались до исходного уровня. Характерной особенностью экспрессии PCNA в эпидермисе височной области, подверженном хронической инсоляции, являлось появление иммунопозитивных ядер в супрабазальных клетках. При этом в коже пациентов, которым операция проводилась в сезон с высоким естественным уровнем УФО, отмечено формирование фокусов клеток, характеризующихся гиперэкспрессией маркера. Корреляционный анализ между показателями экспрессии клетками эпидермиса антигенов PCNA, Ki67 и белка р53 обнаружил наличие хорошей положительной связи между индексами PCNA и р53 (г = + 0,71, F < 0,001). В тоже время связь между индексами PCNA и Ki67 имела отрицательную направленность и была менее сильной (г = - 0,50, F < 0,01).

Наличие связи между индексами PCNA и р53, а также особенности распределения PCNA-иммунопозитивных клеток позволяют предположить, что экспрессия этой молекулы при фотостарении кожи в большей степени отражает фракцию клеток, в которых происходит репарация генетического материала. При этом согласно данным F. Ponten и соавт. (1995), репрессия промотора PCNA происходит после его связывания белком р53.

Изучение характера связи между изменениями нейроэндокринных и иммунных показателей, а также показателями пролиферации, дифференци-ровки и апоптоза при фотостарении кожи, обнаружило достоверные корре-

6ЙБДКОТ*КЛ I Clertftyvr I 33

» 03- tW «kr I

ляции различной силы и направленности между индивидуальными показателями экспрессии CgA и CD la, а также показателями экспрессии мелатонина и белков-регуляторов апоптоза.

Корреляции между количеством CgA-иммунопозитивных клеток и количеством и площадью экспрессии антигена CD la имели умеренную силу связи и были отрицательными (г = - 0,36 и г = - 0,34, соответственно, F<0,001), т.е. по мере возрастание числа мастоцитов в дерме количество КЛ в эпидермисе уменьшалось. В тоже время зависимости между возрастными изменениями экспрессии HLA-DR и количеством тучных клеток, иммуноре-активных к CgA не обнаружено. Полученные данные сопоставимы с результатами исследований, проведенных другими авторами [Р.Н. Hart et al., 2000, 2002], которые установили наличие функциональной зависимости между степенью индуцированной ультрафиолетом иммуносупрессии и количеством тучных клеток в дерме. Анализ собственных и литературных данных позволяет допустить, что, по крайней мере, часть иммуносупрессивных изменений в коже при фотостарении опосредована через действие сигнальных молекул, секретируемых мастоцитами.

Отрицательные корреляции между показателями площади экспрессии мелатонина в эпидермисе и индексами Вс1-2 и р53 характеризовалась тесной связью (г = - 0,85 и г = - 0,84, соответственно, F < 0,001). Это свидетельствует о том, что изменения экспрессии белков Вс1-2 и р53 кератиноцитами тесно

связаны с изменениями интенсивности синтеза этими клетками мелатонина.

* * *

Таким образом, наиболее полно возрастные особенности морфо-функционального состояния кожи, подверженной хронической инсоляции, характеризуют показатели экспрессии мелатонина, CgA, антигенов CD la и HLA-DR, инволюкрина и белков р53 и Вс1-2 клетками эпидермиса. Они отражают фундаментальные процессы и регуляторные особенности в коже, а

также коррелируют с физиологическим возрастом пациентов, что определяет возможность их использования в качестве биомаркеров старения кожи.

Значение возрастных изменений экспрессии нейроэндокринных и иммунных сигнальных молекул в развитии базально-клеточного рака

кожи. Роль возрастных изменений экспрессии указанных нейроэндокрин-ных, иммунных и внутриклеточных сигнальных молекул в развитии ассоциированных со старением дерматозов изучено на примере базально-клеточного рака кожи, являющегося самой частой опухолью кожи [Б.А.Беренбейн, А.М.Вавилов, 1996].

--■"1(57,3%)

5 (2%)

В частота БКРК на закрытых участках кожи В частота БКРК на участках, периодически подвергающихся УФО И частота БКРК на открытых участках кожи

Рис. 5. Частота возникновения базальноклеточногорака кожи (БКРК) в зависимости от степени ее подверженности УФО.

Проведенное исследование зависимости частоты возникновения ба-зально-клеточного рака кожи от степени подверженности кожи УФО установил, что практически в 99% случаев (242 из 247 наблюдений) опухоль возникала на участках кожного покрова постоянно или периодически подвергающихся инсоляции (рис. 5). Эти данные позволяют считать БКРК одним из клинических маркеров фотостарения кожи. Кроме того, важным фактором, способствующим развитию опухоли, являлась повышенная чувстви-

тельность кожи к УФО. Среди обследованных больных преобладали лица с I и II типами светочувствительности кожи, имеющие в анамнезе рецидивирующие фотодерматозы.

Иммуногистохимическое исследование 37 наблюдений базально-клеточного рака кожи обнаружила в большинстве исследованных случаев (26 наблюдений, 70,3%) гиперплазию CgA-иммунопозитивных тучных клеток. Их число достигало 1604,96 ± 16,34 клеток на 1 мм2 кожи и достоверно превышало содержание мастоцитов в коже височной (950,64 ± 16,47 клеток, р < 0,01) и заушной (359,15 ± 12,99 клеток, р < 0,0001) области у здоровых пациентов этого же возраста. При этом плотность распределения мастоцитов, экспрессирующих CgA, в коже больных не зависела от локализации опухоли (т.е. от степени подверженности кожи инсоляции). Показатели оптическая плотность экспрессии белка мастоцитами составили в среднем 2,66 ±0,12 OpDEC y.e. и превышали таковые в коже здоровых пациентов как на закрытых, так и открытых инсоляции участках, что свидетельствует об активации их секреторной деятельности. С аккумуляцией мастоцитов, экспрес-сирующих CgA, ассоциировалось появление выраженного иммуноокраши-вание антителами к этому белку эндотелиальных клеток поверхностных сосудов дермы и некоторых клеток воспалительного инфильтрата.

По современным представлениям, изменения функциональной активности стромы могут быть промотором опухолевой трансформации клеток эпителия [A.Krtolica, J.Campisi, 2002, 2003]. Кроме того, между количеством тучных клеток в дерме и степенью чувствительности кожи к повреждающему действию УФО имеются четкие функциональные корреляции [Р.Н. Hart et al., 2000, 2002]. Эти данные позволяют предположить, что гиперплазия CgA-иммунопозитивных тучных клеток и ассоциированное с фотостарением кожи повышение их нейроэндокринной активности являются фактором, повышающими риск развития базально-клеточного рака.

В 11 наблюдениях (29,7%) отмечено появление выраженной иммуно-реактивности опухолевых клеток к CgA. В 4 из этих наблюдений иммуноги-стохимическое исследование выявило в опухолевой ткани клетки, иммуно-позитивные к мелатонину. Характерной особенностью экспрессии CgA в коже в этих наблюдениях было снижение интенсивности его экспрессии клетками воспалительного инфильтрата в дерме, в том числе мастоцитами -оптическая плотность их иммуноокрашивания составила 2,21 ±0,18 ОрБЕС у.е. (р< 0,01). Таким образом, появление нейроэндокринной активности в опухолевых клетках в виде экспрессии CgA сопровождалось подавлением таковой в дерме.

Количество СБ 1а иммунопозитивных КЛ в прилегающем к опухоли эпидермисе снижалось до 213,56 ± 28,74 клеток в 1 мм2 кожи и было достоверно ниже, чем в коже заушной (581,86 ± 12,54 клеток) и височной (471,44 ± 24,08) области у здоровых пациентов этой же возрастной группы (р < 0,001). В опухолевой ткани иммунореактивность молекулы полностью отсутствовала. Экспрессия антигенов ЫЬА-БЯ снижалась как в эпидермисе, так и в дерме, причем иммунореактивность КЛ эпидермиса к нему отсутствовала практически полностью.

В настоящее время установлено, что основным фактором, определяющим опухолевую прогрессию новообразования, является пролиферативная активность опухолевых клеток. Ее изучению придается особое значение в связи с использованием этого параметра для прогнозирования реакции злокачественных опухолей на лекарственную терапию. Проведенное исследование обнаружило существенный рост показателей экспрессии антигена К167. Так, индекс К167 составил 38,18 ± 9,95% , а абсолютное число проли-ферирующих клеток — 2321,75 клеток в 1 мм2 опухолевой ткани. Причем увеличение количества Кл67-иммунопозитивных клеток отмечено и в прилегающем к новообразованию эпидермисе.

Разделение пациентов, страдающих базально-клеточным раком, на подгруппы в соответствии с нейроэндокринной активностью опухолевых клеток показало, что с появлением экспрессии клетками CgA и мелатонина ассоциируется снижение пролиферативной активности опухолевой ткани. Так индекс Ет67 в опухолях, экспрессирующих CgA и/или мелатонин был достоверно ниже, чем в новообразованиях, иммунонегативных к изучаемым белкам (р < 0,01, табл. 2).

Таблица 2

Показатели экспрессии сигнальных молекул клетками базально-клеточного рака (БКРК) с различной нейроэндокринной активностью

Показатели экспрессии

Подгруппы Площадь Оптическая Индекс Ю67, %,

экспрессии плотность М±т

белка в опухо- OpDEC у.е.,

левой ткани, % М±т

БКРК,

иммунонегативный 0 0 42,73 ± 8,43

к ОД и мелатони-

ну

БКРК,

иммунопозитивный 82,48 ±2,71 2,46 ± 0,04 29,09 ±5,68

к CgA

БКРК, иммунопозитивный 27,75 ± 6,5 2,32 ±0,04 25,25 ±6,17

к мелатонину

Таким образом, проведенное исследование подтвердило значение ассоциированных со старением изменений экспрессии сигнальных молекул НИЭСК, в частности CgA, мелатонина, CD 1а и HLA-Dr, в возникновении ба-зально-клеточного рака кожи. Гиперплазия тучных клеток, экспрессирующих CgA, и подавление экспрессии клетками кожи антигенов CD 1а и HLA-Dr при фотостарении является предрасполагающим фактором для развития опухоли. Напротив, с появлением нейроэндокринной активности в клетках базально-клеточного рака кожи, в частности экспрессии CgA и мелатонина, происходит снижение темпа роста опухоли. В связи с этим представляется

целесообразным при клинико-морфологической оценке базально-клеточного рака кожи применять иммуногистохимическую реакцию для выявления этих маркеров.

Нейроиммуноэндокринные маркеры старения кожи

Проведенное иммуногистохимическое и морфометрическое исследование динамики экспрессии нейроэндокринных, иммунных и внутриклеточных сигнальных молекул в процессе хронологического и фотостарения кожи, а также при базально-клеточном раке кожи, позволило выделить спектр параметров, характеризующих функциональную активность кожи в процессе ее возрастной инволюции.

Среди изученных внутриклеточных сигнальных молекул, определяющих постоянство качественного и количественного состава кожи, наиболее полно морфо-функциональное состояние эпидермиса как при хронологическом, так и фотостарении отражали показатели экспрессии инволюкрина (оптическая плотность и площадь экспрессии в эпидермисе) и белков р53 (индекс р53 и оптическая плотность) и Вс1-2 (индекс Вс1-2 и оптическая плотность). Эти маркеры легко выявляются в иммуногистохимических реакциях, отражают фундаментальные процессы и несут информацию о функциональном состоянии кожи. Их изменения тесно коррелируют с физиологическим возрастом пациентов, а также имеют специфические особенности динамики при хронологическом и фотостарении кожи. Кроме того, эти параметры практически не коррелируют друг с другом, что повышает информативность каждого из них в оценке биологического возраста кожи. Для более полной оценки характера возрастных изменений экспрессии белка р53 при фотостарении в комплекс маркеров целесообразно включать исследование РСКЛ, отражающего фракцию клеток, в которых происходит репарация генетического материала.

В качестве нейроиммуноэндокринных маркеров старения кожи можно рекомендовать показатели экспрессии CgA (количество иммунопозитивных клеток и в меньшей степени оптическая плотность экспрессии) и мелатонина (процент площади иммуноокрашивания в эпидермисе и число иммунопози-тивных клеток в дерме), а также антигена СБ 1а (количество иммунопози-тивных клеток и площадь экспрессии эпидермисе). Изменения этих параметров играют важную роль в патогенезе иволютивных процессов в коже и отражают регуляторные особенности кожи, что подтверждено наличием множественных корреляций с показателями экспрессии маркеров пролиферации, дифференцировки и апоптоза.

выводы

1. Нейроиммуноэндокринные взаимодействия клеток эпидермиса и дермы играют ключевую роль в обеспечении локальных и общерегулятор-ных процессов в коже. Кератиноциты эпидермиса, тучные и эндотелиальные клетки дермы являются активными звеньями локальной нейроиммуноэндок-ринной системы, а продуцируемые и экспрессируемые ими молекулы — се-ротонин, мелатонин, хромогранин А, эндотелиальная синтаза оксида азота, антигены СБ 1а, СБ35 и ЫЬА-БЯ - сигнальными молекулами для координации межклеточных и межтканевых взаимодействий. Это подтверждается наличием тесных разнонаправленных корреляционных связей между показателями экспрессии нейроэндокринных, иммунных молекул и внутриклеточных молекул, контролирующих процессы пролиферации, дифференцировки и апоптоза клеток кожи.

2. В процессе старения кожи экспрессия мелатонина и серотонина в клетках эпидермиса и дермы являются стабильными показателями до 50 - 55 лет. Снижение экспрессии этих биогенных аминов у лиц старше 60 лет происходит за счет уменьшения количества продуцирующих их клеток.

3. Выраженные корреляции между возрастными изменениями показателей экспрессии маркеров пролиферации и апоптоза и количеством клеток, синтезирующих мелатонин, свидетельствуют о важной роли мелатонина в старении кожи. Таким образом, показатели экспрессии мелатонина в коже представляются перспективным маркером ее старения.

3. При старении кожи снижается способность клеток Лангерганса вступать в межклеточные взаимодействия при реализации адаптивного иммунного ответа. Это обусловлено снижением экспрессии ими антигенов ЫЬА-БЯ и СБ 1а. Ярко выраженная зависимость динамика показателей экспрессии антигена СБ 1а от возраста определяет удобство их использования в качестве маркера, старения кожи.

5. В процессе фотостарения усиливается продукция и абсорбция серо-тонина и мелатонина кератиноцитами и тучными клетками, поглощение хромогранина А эндотелиальными клетками, а также развивается гиперплазия СО35-иммунореактивных клеток и аккумуляцию клеток, экспрессирую-щих антигены II класса ГКГ ЫЬА- БЯ, в дерме. Показатели экспрессии этих сигнальных молекул могут использоваться в качестве параметров, отражающих специфические особенности регуляторных систем в коже при ее фотостарении.

6. Тучные клетки играют ключевую координирующую роль в регуляции нейроиммуноэндокринных процессов в коже при фотостарении. Об этом свидетельствует широкий спектр экспрессируемых ими сигнальных молекул, а также строгие корреляции между изменениями экспрессии мастоци-тами хромогранина А и мелатонина, с одной стороны, экспрессией антигена СБ 1а клетками Лангерганса, мелатонина и инволюкрина кератиноцитами, с другой.

7. Возрастные изменения экспрессии инволюкрина в эпидермисе закрытых и открытых участков отражают ассоциированные с хронологическим и фотостарением особенности гомеостаза кожи. В пользу этого свидетельствуют строгие корреляции между экспрессией инволюкрина и проли-феративной активностью, а также между экспрессией инволюкрина и количеством иммунопозитивных к хромогранину А тучных клеток в дерме, что свидетельствует о возможности использования инволюкрина в качестве биомаркера старения кожи.

8. Гиперплазия тучных клеток, экспрессирующих хромогранин А, и снижение экспрессии антигенов СБ 1а и ЫЬА-БЯ клетками Лангерганса являются факторами, предрасполагающими к развитию базально-клеточного рака при фотостарении кожи.

9. Усиление экспрессии хромогранина А и мелатонина в клетках ба-зально-клеточного рака кожи сопровождается снижением пролиферативной активности опухоли, что следует учитывать при оценке прогноза базально-клеточного рака кожи.

10. Дисбаланс синтеза и секреции гормонов и сигнальных молекул в клетках кожи, проявляющийся в многообразных изменениях экспрессии нейроиммуноэндокринных маркеров, является ключевым фактором старения кожи и играет ведущую роль в патогенезе дерматозов, ассоциированных с возрастом.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для оценки состояния эпидермиса при старении кожи рекомендуется проводить иммуногистохимическое исследование экспрессии инволюк-рина, белков р53 и Вс1-2. Эти маркеры легко выявляются в иммуногистохи-мических реакциях, отражают фундаментальные процессы и несут информацию о функциональном состоянии кожи.

2. Для оценки регуляторных особенностей кожи при ее хронологическом старении рекомендуется использовать показатели экспрессии мелато-нина (процент площади иммуноокрашивания в эпидермисе и число иммуно-позитивных клеток в дерме), антигена СБ 1а (количество иммунопозитивных клеток и площадь экспрессии эпидермисе), а также антигена Ю67 (индекс Ю67)

3. В качестве параметров, отражающих специфические особенности регуляторных систем в коже при ее фотостарении, целесообразно использовать показатели экспрессии хромогранина А, мелатонина, антигена СБ 1а и РСМА.

4. При клинико-морфологической оценке базально-клеточного рака кожи следует учитывать, что экспрессия опухолевыми клетками хромогра-нина А и мелатонина является благоприятным прогностическим признаком. Поэтому при патогистолоическом исследования рекомендуется применять иммуногистохимяческую реакцию для выявления этих маркеров.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Базальноклеточный рак кожи как маркер фотостарения / И.О. Смирнова, О.Н. Смирнова, ВА Пирятинская, И.Д. Радченко // Материалы научно-практич. конфер., посвященной 300-летию Санкт-Петербурга и 100-летию больницы им. Императора Петра Великого. - Вестник Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И. Мечникова. - 2003. - № 1. -С. 177.

2. Гиперплазия тучных клеток как фактор, предрасполагающий к развитию ба-зально-клеточного рака кожи / И.О. Смирнова, И.М. Кветной, СИ. Данилов О.И. Смирнова // Материалы III Съезда иммунологов России. - Екатеринбург, 2004. - С.86.

3. Маркеры старения эпидермиса / И.О. Смирнова, И.М. Кветной, СИ. Данилов, О.Н. Смирнова // Альманах «Геронтология и i ериатрия» - 2004. - Выи. 3.-С. 244-246.

4. Мелатонин как биологический маркер старения кожи / И.О. Смирнова, И.М. Кветной, СИ. Данилов, О.Н. Смирнова, СМ. Иванченко // Вестник Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И. Мечникова. - 2004. - N3. - С. 79 - 82.

5. Нейроиммуноэндокринные маркеры старения кожи / И.О. Смирнова, И.М. Кветной, С.И.Данилов, О.Н. Смирнова // Материалы I международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность». - Москва, 2004. -С.168-169.

6. Нейроиммуноэндокринология кожи и молекулярные маркеры ее старения / И.О. Смирнова, И.М. Кветной, И.В. Князькин, СИ. Данилов- СПб.: Изд-во «Система», 2004. - 256 с.

7. Нейроэндокринная система кожи и ее роль в реализации эффектов ультрафиолетового облучения / И.О. Смирнова, И.М. Кветной, Н М. Аничков, О.Н. Смирнова // Новые данные о редких и распространенных заболеваниях: Сб научных трудов/ Под ред. член-корр. РАМН Н.М. Аничкова. - СПб, Российское отделение Международной академии патологии, 2003. - С. 203 - 210.

8. О взаимосвязи некоторых клеточных маркеров дермы и эпидермиса при фотостарении кожи / И.О. Смирнова, И.М. Кветной, СИ. Данилов, Н.М. Аничков, О.Н. Смирнова // Российский журнал кожных и венерических болезней. -2004.-N5.-C56-58.

9. Смирнова И.О. Возрастные особенности экспрессии керагиноцитами Р53 / И.О. Смирнова, СИ. Данилов, О.Н. Смирнова // Избранные вопросы дерматовенерологии и медицинской косметологии, вып. 6: Материалы научно-практич. конфер., посвященной 80-летию ГККВД г. Владивостока. - Владивосток, 2004.- С. 132 - 133

Ю.Смирнова И.О. Иммуноцитохимические маркеры кератиноцитов при фотостарении кожи / И О. Смирнова, И.М. Кветной // Эстетическая медицина. -2004.-Т. 3,№1.-С22-28

П.Смирнова И.О. Инволюкрин как иммуноцитохимический маркер старения кожи / И.О. Смирнова, И.М. Кветной, СИ. Данилов, О.Н. Смирнова // Тезисы научных работ 1 Российского конгресса дерматовенерологов. - СПб, 2003.-С. 177

12. Смирнова И.О. К вопросу о роли ультрафиолетовой радиации в патогенезе базалтно-клеточного рака кожи / И.О. Смирнова, Д.В. Радченко, О.С. Нечаева // Актуальные вопросы дерматологии, микологии и инфекций, передающихся половым путем: Сб. науч. трудов. - Благовещенск, 2000. - С. 124 -125.

13. Смирнова И.О. Количество тучных клеток и экспрессия инволюкрина при старении кожи // Проблемы укрепления здоровья и профилактика заболеваний: Материалы начно-практич. конфер./ Под ред. акад. РАМН А.В. Шабро-ва, проф. В.Г. Маймулова. - СПб,СПбТМА им. И.И. Мечникова, 2004. - С. 270

Н.Смирнова И.О. Морфо-функциональные особенности тучных клеток при фотостарении кожи // Нейроиммунология — 2004. — Т.П, N2. - С. 95 - 96.

15. Смирнова И.О. Нейроэндокринные клетки кожи экспрессируют индолами-ны - серотонин и мелатонин / И О. Смирнова, И.М. Кветной // Тезисы научных работ Всероссийской конференции дерматовенерологов. — Нижний Новгород, 2004.-С. 177.

16. Смирнова И.О. Некоторые молекулярные маркеры тучных клеток при ба-зально-клеточном раке кожи // Материалы I международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность». - Москва, 2004. — С. 170 -171.

17. Смирнова И.О. Современные представления о нейроэндокринной регуляции пигментации кожи / И.О. Смирнова, И.М. Кветной, СИ. Данилов 1/ Сборник статей научно-практического общества врачей-косметологов Санкт-Петербурга, вып. 5. - СПб, 2004. - С. 40 - 44.

18. Смирнова И.О. Старение кожи: клеточные маркеры эпидермиса и дермы // Сборник статей научно-практического общества врачей-косметологов Санкт-Петербурга, вып. 5. - СПб, 2004. - С. 34 - 36

19. Смирнова И.О. Фотостарение кожи - молекулярные маркеры эпидермиса и дермы / И.О. Смирнова, И.М. Кветной // Успехи геронтологии. - 2004. -Ш5.-С77-85.

20. Смирнова И.О. Функциональная морфология старения кожи // Успехи ге-ронтологии.-2004.-Вып. 13.-С.44-51.

21. Смирнова И.О. Хроническое фотоповреждение и базальноклеточный рак кожи / И.О. Смирнова, О.Н.Смирнова // Актуальные вопросы дерматовенерологии: Сб. научных трудов. - Томск, 2002. - С. 55 - 56.

22. Смирнова И.О. Число тучных клеток и базальноклеточный рак при фотостарении кожи эпидермиса // Альманах «Геронтология и гериатрия» - 2004. -Вып. 3.-С. 111- 112.

23. Смирнова И.О. Экспрессия серотонпна и мелатонина клетками кожи человека // Проблемы укрепления здоровья и профилактика заболеваний: Материалы начно-практич. конфер./ Под ред. акад. РАМН А.В. Шаброва, проф. В.Г. Маймулова. - СПб,СШГМА им. И.И. Мечникова, 2004. - С. 271

24. Хмельницкий О.О. Клинико-морфологический анализ базалиом кожи / О.О. Хмельницкий, И.Н. Чупров, И.О. Смирнова // Медико-социальные проблемы профилактики, диагностики и лечения заболеваний: Сб. научных трудов / Под ред. А.В. Шаброва и В.Г. Маймулова - СПб.: СПбГМА, 2000. - С. 252 -253.

Смирнова И.О. Нейроиммуноэндокринные маркеры старения кожи // Автореф. дис.... док. мед. наук: 14.00.53; 14.00.11. - СПб., 2004. -46с.

Формат 60х84 1/8. Объем 2,0 усл. п. л. Тираж 120 экз. Заказ 03-10. Бесплатно.

Подписано к печати 26.10.2004.

Отпечатано с готового оригинал-макета Издательство «Система»

«s 2 1 4 2 5

Актуальность проблемы. По мере развития молекулярной медицины в последние годы наряду с интегральным биологическим возрастом организма возникла необходимость определения возраста систем, органов и отдельных клеток. В связи с этим проводится активный поиск комплекса параметров, отражающих функциональную способность ткани, органа или клетки при отсутствии болезни, для обозначения которых используется термин «биомаркеры старения» [Baker G.T., Sprott R.L., 1988]. При этом очевидно, что биомаркеры старения должны отражать фундаментальные биологические процессы, нести информацию о функциональном состоянии органа или ткани и обменных процессах, протекающих в них, а также коррелировать с физиологическим возрастом [Коркушко О.В. и соавт., 2002; Arking R., 1991; Ingram D.K. et al., 2001].

Разработка биомаркеров старения колеи является актуальной проблемой геронтологии и дерматологии. Это связано с тем, что в коже, непосредственно подверженной внешним влияниям, наиболее значимым из которых является ультрафиолетовое облучение (УФО), регрессивные изменения развиваются раньше, чем в других органах (нередко в молодом возрасте) [Фицпатрик Д.Е., 1999; Seharffeter-Kohanek К. et al., 2000], и своевременное использование эффективных мер профилактики может предотвратить развитие преждевременной или ускоренной инволюции кол-си [Озерская О.С., 2000].

В дерматологии в качестве биомаркера старения чаще всего используют показатели содержания коллагеновых и эластических волокон в папиллярной дерме [Uitto J., Peknstein E.F., 1998; Ryu A., 2000], считая, что они интегрально отражают комплекс изменений основных элементов дермы и характеризуют ее морфо-функциональное состояние. Однако существенным недостатком этого биомаркера является то, что он не отражает состояния эпидермиса. В связи с этим представляется целесообразным разработать более широкий комплекс морфо-функциональных параметров кожи, учитывающий наряду с показателями содержания коллагеновых и эластических волокон в дерме также и состояние эпидермиса.

Известно, что основными фундаментальными процессами, определяющими постоянство структурно-функциональной организации ткани вообще и кожи в частности являются клеточное обновление, цитодифференцировка и клеточная гибель [Мяделец О.Д., Адаскевич В.П., 1997]. Координация процессов биосинтеза, обмена и воспроизведения генетической информации в различных клеточных популяциях эпидермиса и дермы осуществляется представленными в коже клетками классических регуляторных систем организма - нервной, иммунной и эндокринной, формирующими локальную нейроиммуноэндокринную систему кожи (НИЭСК) [Кветной И.М., Хавинсон В.Х., 2002, 2003; Misery L., 1996; Slominski A., Wortsman J., 2000].

Представление о НИЭСК сформировалось в последнее десятилетие в рамках концепции о диффузной нейроиммуноэндокринной системе, как универсальной системе регуляции гомеостаза [Kvetnoy I.M., 1996; 2002]. Особенности взаимоотношений структурных элементов НИЭСК, характер синтезируемых ими сигнальных молекул при действии повреждающих факторов и заболеваниях кожи активно изучаются в последние годы [Alard P. et al., 1999; Bauer О., Razin Е., 2000; Jarvikallio A. et al., 2002, и др.]. Однако структурно-функциональная организация НИЭСК при старении практически не изучена. Выявление возрастных особенностей морфо-функциональной организации НИЭСК, как основной системы регуляции гомеостаза в коже, представляется актуальным и перспективным для более глубокого понимания процессов, происходящих при инволюции эпидермиса и дермы, патогенеза ассоциированных со старением дерматозов и совершенствования методов профилактики и коррекции возрастных изменений кожи.

Целью исследования являлось изучение возрастных особенностей структурно-функциональной организации НИЭСК и определение спектра нейроиммуноэндокринных маркеров хронологического и индуцированного УФО старения кожи.

В рамках указанной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи:

1. Изучить динамику экспрессии клетками эпидермиса и дермы нейроэндокринных сигнальных молекул - серотонина, мелатонина, хромогранина А и синтазы оксида азота - при хронологическом и индуцированном УФО старении кожи.

2. Изучить динамику экспрессии клетками эпидермиса и дермы сигнальных молекул иммунной системы - CD35, CD 1а и HLA-DR -при хронологическом и индуцированном УФО старении кожи.

3. Изучить динамику экспрессии клетками эпидермиса и дермы сигнальных молекул, регулирующих пролиферацию, дифференцировку и апоптоз в эпидермисе и дерме при хронологическом и индуцированном УФО старении кожи.

4. Установить корреляции между морфометрическими изменениями показателей экспрессии нейроэндокринных, иммунных молекул и маркеров пролиферации, дифференцировки и апоптоза при хронологическом и фотостарении кожи.

5. Изучить значение возрастных изменений экспрессии нейроэндокринных и иммунных сигнальных молекул в развитии ассоциированных со старением дерматозов на примере базально-клеточного рака кожи.

Научная новизна работы

Получены результаты, способствующие развитию и углублению представлений о регуляции гомеостаза кожи человека. Выявлены закономерности изменений структурно-функциональной организации компонентов НИЭСК при хронологическом и индуцированном УФО старении (фотостарении) кожи.

Впервые обнаружена конституциональная экспрессия мелатонина и его основного предшественника серотонина клетками базального слоя эпидермиса, а также мелатонина и хромогранина A (CgA) — тучными клетками дермы.

Установлено, что динамика экспрессии мелатонина и серотонина кератиноцитами и тучными клетками имеет сходный характер при хронологическом и фотостарении кожи. Усиление экспрессии мелатонина и серотонина при фотостарении представляет собой компенсаторно-приспособительные механизмы, направленные на ликвидацию последствий повреждающего действия УФО.

Особенности экспрессии нейроэндокринных сигнальных молекул свидетельствуют о том, что хронологическое старение кожи сопровождается постепенным подавлением нейроэндокринной активности компонентов НИЭСК. В свою очередь, фотостарение характеризуется неоднозначными нейроэндокринными сдвигами: с одной стороны, способность тучных и эндотелиальных клеток абсорбировать и синтезировать биологически активные пептиды прогрессивно усиливается с возрастом, с другой, у пожилых пациентов происходит истощение деятельности кератиноцитов по продукции серотонина и мелатонина.

Результаты исследования экспрессии сигнальных молекул иммунной системы свидетельствуют о том, что снижение потенциальной способности клеток, в первую очередь, клеток Лангерганса (КЛ) эпидермиса, вступать в межклеточные взаимодействия при реализации адаптивного иммунного ответа, хотя и более выражено при фотостарении кожи, но сопровождается компенсаторной гиперплазией в дерме CD35-иммунопозитивных клеток и аккумуляцией клеток, экспрессирующих антигены HLA-DR.

Характер возрастной динамики иммуноокрашивания инволюкрина в коже, а также установленные корреляции между показателями его экспрессии и экспрессии антигена Ki67 и CgA указывают на то, что обнаруженные изменения реактивности этого белка отражают особенности гомеостаза кожи, ассоциированные с ее хронологическим и фотостарением. В связи с этим инволюкрин следует расценить как новый перспективный маркер для оценки морфо-функционального состояния кожи при ее старении.

Продемонстрировано, что при хронологическом старении антиапоптотический потенциал в первую очередь приобретают низкодифференцированные клетки эпидермиса, а при фотостарении -клетки на разных этапах кератинизации.

Результаты регрессионного анализа свидетельствуют о существовании тесных связей между нейроэндокринными и иммунными сигнальными молекулами в коже человека, а также внутриклеточными молекулами, контролирующими процессы пролиферации, дифференцировки и апоптоза. Впервые зарегистрированы достоверные разнонаправленные корреляции между показателями экспрессии мелатонина и антигена Ki67 (положительная), Вс1-2 и р53 (отрицательные) при хронологическом и фотостарении кожи, а также между показателями экспрессии CgA и антигена CD 1а (отрицательная) при фотостарении.

Выявлено участие экспрессируемых клетками НИЭСК сигнальных молекул, в частности CgA, мелатонина, CD.la и HLA-DR, в возникновении базально-клеточного рака кожи. Продемонстрировано, что гиперплазия тучных клеток, экспрессирующих CgA, и подавление экспрессии клетками кожи антигенов CD la и HLA-DR при фотостарении являются предрасполагающими факторами для развития базально-клеточного рака кожи. Показано также, что с появлением нейроэндокринной активности в клетках базально-клеточного рака кожи, в частности, экспрессии CgA и мелатонина, происходит снижение темпа роста опухоли.

Практическая значимость работы

Впервые определен спектр молекулярных и нейроэндокринных параметров, отражающих фундаментальные биологические процессы и характеризующих особенности регуляции гомеостаза кожи при ее хронологическом и фотостарении.

Показано, что среди изученных внутриклеточных сигнальных молекул, наиболее полно отражают фундаментальные процессы и несут информацию о функциональном состоянии кожи при ее старении инволюкрин и белки р53, Вс1-2.

В качестве нейроиммуноэндокринных маркеров старения кожи рекомендуется использовать показатели экспрессии CgA, мелатонина, а также антигена CD 1а. Показано, что изменения этих параметров играют важную роль в патогенезе инволютивных процессов в коже и отражают регуляторные особенности кожи при ее хронологическом и фотостарении. Обнаружение разнонаправленных корреляций между показателями экспрессии мелатонина, CgA и антигена CD 1а, а также молекул, определяющих качественный и количественный состав эпидермиса и дермы, свидетельствует о высокой ценности комплекса этих показателей как биомаркеров старения кожи.

Полученные данные об изменениях структурно-функциональной организации НИЭСК, ассоциированных с хронологическим и индуцированным УФО старением, позволят разработать критерии оценки эффективности мероприятий, направленных на профилактику и коррекцию хронологического и преждевременного старения кожи. Основные положения, выносимые на защиту

1. Кератиноциты эпидермиса, тучные и эндотелиальные клетки дермы являются звеньями нейроиммуноэндокринной системы кожи, регулирующей физиологические функции кожи, а продуцируемые ими вещества - сигнальными молекулами для локальной координации межклеточных и межтканевых взаимодействий.

2. Возрастная инволюция кожи характеризуется морфо-функциональными изменениями структурных компонентов нейроиммуноэндокринной системы кожи, которые имеют специфические черты при хронологическом и фотостарении.

3. Хронологическое старение кожи сопровождается постепенным подавлением нейроэндокринной и иммунной активности компонентов нейроиммуноэндокринной системы кожи, а фотостарение характеризуется неоднозначными нейроиммуноэндокринными сдвигами.

4. Среди изученных параметров возрастные особенности морфо-функционального состояния кожи при хронологическом и фотостарении кожи наиболее полно отражают показатели экспрессии инволюкрина и белков р53 и Вс1-2, что определяет I возможность их использования для оценки биологического возраста кожи.

5. При хронологическом и фотостарении кожи имеется тесная связь между экспрессией мелатонина, антигена Ki67 и белка р53 в эпидермисе. Со снижением секреции мелатонина, оказывающего цитостатическое и антиоксидантное действие, происходит аккумуляция в клетках белка р53, характеризующегося проапоптотическими эффектами, что отражает комплекс приспособительных реакций, направленных на сохранение гомеостаза стареющей кожи.

6. Фотостарение кожи сопровождается гиперплазией тучных клеток, экспрессирующих CgA, что является одним из факторов, повышающих риск развития базально-клеточного рака. Возникновение базально-клеточного рака ассоциируется со снижением экспрессии клетками кожи антигенов CD 1а и HLA-DR.

Апробация и реализация результатов исследования

Материалы исследования представлены и доложены на I Российском конгрессе дерматовенерологов (Санкт-Петербург, 2003); Всероссийской конференции дерматовенерологов «Современные направления развития диагностики, лечения и профилактики И111111 и дерматозов» (Нижний Новгород, 2004); III Съезде иммунологов России (Екатеринбург, 2004); XIII Всероссийской конференции «Нейроиммунология» (Санкт — Петербург, 2004); I Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2004); XXI научной конференции дерматовенерологов "Псевдолимфомы" (Москва, 2004); на научно-практической конференции, посвященной 300-летию Санкт-Петербурга и 100-летию больницы им. Императора Петра Великого (Санкт-Петербург, 2003); на ежегодных научно-практических конференциях профессорско-преподавательского состава СПбГМА им. И.И. Мечникова (Мечниковские чтения) (Санкт-Петербург,2001 - 2004).

Материалы исследования используются в научной, педагогической и практической деятельности Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН и в учебном процессе на кафедре дерматовенерологии Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И. Мечникова МЗ и CP РФ.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 24 печатные работы, в том числе 1 монография.

Связь с научно-исследовательской работой Института

Диссертационная работа является научной темой, выполняемой по основному плану НИР Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 275 станицах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, характеристики материала и методов исследования, трех глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа содержит 15 таблиц и 68 рисунков, в том числе 18 монтажей, скомпонованных из 40 микрофотографий. Список литературы включает 306 источника, из них 257 иностранных авторов.

ВЫВОДЫ

1. Нейроиммуноэндокринные взаимодействия клеток эпидермиса и дермы играют ключевую роль в обеспечении локальных и общерегуляторных процессов в коже. Кератиноциты эпидермиса, тучные и эндотелиальные клетки дермы являются активными звеньями локальной нейроиммуноэндокринной системы, а продуцируемые и экспрессируемые ими молекулы - серотонин, мелатонин, хромогранин А, эндотелиальная синтаза оксида азота, антигены CD la, CD35 и HLA-DR — являются сигнальными молекулами для координации межклеточных и межтканевых взаимодействий. Это подтверждается наличием тесных разнонаправленных корреляционных связей между показателями экспрессии нейроэндокринных, иммунных молекул и внутриклеточных молекул, контролирующих процессы пролиферации, дифференцировки и апоптоза клеток кожи.

2. В процессе старения кожи экспрессия мелатонина и серотонина в клетках эпидермиса и дермы являются стабильными показательными до 50 - 55 лет. Снижение экспрессии этих биогенных аминов у лиц старше 60 лет происходит за счет уменьшения количества продуцирующих их клеток.

3. Выраженные корреляции между возрастными изменениями показателей экспрессии маркеров пролиферации и апоптоза и количеством клеток, синтезирующих мелатонин, свидетельствуют о важной роли мелатонина в старении кожи. Таким образом, показатели экспрессии мелатонина в коже представляются перспективным маркером ее старения.

3. При старении кожи снижается способность клеток Лангерганса вступать в межклеточные взаимодействия при реализации адаптивного иммунного ответа. Это обусловлено снижением экспрессии ими антигенов

HLA-DR и CDla. Ярко выраженная зависимость динамики показателей экспрессии антигена CDla от возраста определяет удобство их использования в качестве маркера старения кожи.

5. В процессе фотостарения усиливается продукция и абсорбция серотонина и мелатонина кератиноцитами и тучными клетками, поглощение хромогранина А эндотелиальными клетками, а также развивается гиперплазия СОЭ5-иммунореактивных клеток и аккумуляция клеток, экспрессирующих антигены II класса главного комплекса гистосовместимости HLA-DR, в дерме. Показатели экспрессии этих сигнальных молекул могут использоваться в качестве параметров, отражающих специфические особенности регуляторных систем в коже при ее фотостарении.

6. Тучные клетки играют ключевую координирующую роль в нарушении нейроиммуноэндокринных процессов в ^ коже при фотостарении. Об этом свидетельствует широкий спектр экспрессируемых ими сигнальных молекул, а также строгии корреляции между 1 изменениями экспрессией мастоцитами хромогранина А и мелатонина, с одной стороны, экспрессией антигена CDla клетоками лангерганса, мелатонина, и инволюкрина кератиноцитами, с другой.

7. Возрастные изменения экспрессии инволюкрина в эпидермисе закрытых и открытых участков отражают ассоциированные с хронологическим и фотостарением особенности гомеостаза кожи. В пользу этого свидетельствуют строгие корреляции между экспрессией инволюкрина и пролиферативной активностью, а также экспрессией инволюкрина и количеством иммунопозитивных к хромогранину А тучных клеток в дерме, что свидетельствует о возможности использования инволюкрина в качестве биомаркера старения кожи.

8. Гиперплазия тучных клеток, экспрессирующих хромогранин А и снижение экспрессии антигенов CDla и HLA-DR являются факторами, предрасполагающими к развитию базально-клеточного рака при фотостарении кожи.

9. Усиление экспрессии хромогранина А и мелатонина в клетках базально-клеточного рака кожи сопровождается снижением пролиферативной активности опухоли, что следует учитывать при оценке прогноза базально-клеточного рака кожи.

10. Дисбаланс синтеза и секреции гормонов и сигнальных молекул в клетках кожи, проявляющиеся в многообразных изменениях экспрессии нейроиммуноэндокринных маркеров, является ключевым фактором старения кожи и играет ведущую роль в патогенезе дерматозов, ассоциированных с возрастом.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для оценки состояния эпидермиса при старении кожи рекомендуется проводить иммуногистохимическое исследование экспрессии инволюкрина, белков р53 и Bcl-2. Эти маркеры легко выявляются в иммуногистохимических реакциях, отражают фундаментальные процессы и несут информацию о функциональном состоянии кожи.

2. Для оценки регуляторных особенностей кожи при ее хронологическом старении рекомендуется использовать показатели экспрессии мелатонина (процент площади иммуноокрашивания в эпидермисе и число иммунопозитивных клеток в дерме), антигена CD 1а (количество иммунопозитивных клеток и площадь экспрессии эпидермисе), а также антигена Ki67 (индекс Ki67)

3. В качестве параметров, отражающих специфические особенности регуляторных систем в коже при ее фотостарении, целесообразно использовать показатели экспрессии хромогранина А, мелатонина, антигена CD 1а и PCNA.

4. При клинико-морфологической оценке базально-клеточного рака кожи следует учитывать, что экспрессия опухолевыми клетками хромогранина А и мелатонина является благоприятным прогностическим признаком. Поэтому при патогистологическом исследовании рекомендуется применять иммуногистохимическую реакцию для выявления этих маркеров.