Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Характеристика колонизационной резистентности слизистых оболочек дыхательного тракта при бронхитах у детей

На правах рукописи

МЕТЕЛЬСКАЯ ВАЛЕРИЯ АЛЕКСЕЕВНА

ХАРАКТЕРИСТИКА КОЛОНИЗАЦИОННОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ СЛИЗИСТЫХ ОБОЛОЧЕК ДЫХАТЕЛЬНОГО ТРАКТА ПРИ БРОНХИТАХ У ДЕТЕЙ

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология 03.02.03 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

16 МАЙ 2013

Москва - 2013

005058028

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека Научные руководители: Алёшкии Владимир Андрианович доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ

Воропаева Елена Александровна

кандидат биологических наук

Официальные оппоненты: Пашков Евгений Петрович

доктор медицинских наук, профессор кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Минздрава России (г. Москва) Пухальский Александр Леонидович

доктор медицинских наук, профессор, главный научный сотрудник Федерального государственного бюджетного учреждения «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук (г. Москва)

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава России (г. Москва)

Защита состоится Ж мая 2013 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 208.046.02 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10.

Автореферат разослан «_»_2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Л.И. Новикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Бронхит - одно из наиболее частых после ОРВИ заболеваний органов дыхания у детей. В среднем, регистрируемая заболеваемость бронхитами в детском возрасте составляет около 100 случаев на 1000 детей в год (Середа Е.В., 2001; Таточенко В.К., 2004). Широкий диапазон в показателях распространенности бронхитов, судя по всему, объясняется тем, что при обращении в поликлинику зачастую диагностируется не острый бронхит, а ОРВИ. Также к гиподиагностике рецидивирующих форм бронхитов ведет расширенное использование понятия «часто болеющие дети» (Самсыгина Г.А., 2009).

Основную роль в развитии бронхитов играют вирусы, вирусно-бактериальные ассоциации и внутриклеточные возбудители (Самсыгина Г. А. с соавт., 1998).

Начало большинства заболеваний органов дыхания, в том числе и бронхитов, связано с развитием патологических процессов в слизистых оболочках дыхательных путей, которые в норме задерживают и элиминируют около 70% поступающих извне патогенов. Барьерные функции слизистых оболочек осуществляются с помощью механизма колонизационной резистентности. Термин «колонизационная резистентность», впервые введенный Van der Waaij D. в 1971 году, трактуется как совокупность взаимосвязанных физиологических, микробиологических и иммунологических факторов организма, придающих стабильность индигенной (нормальной) микрофлоре и препятствующих колонизации организма посторонними микроорганизмами (тендеров Б. А., 1998).

Функции индигенной микрофлоры разнообразны. Она способствует синтезу незаменимых аминокислот, продуцирует различные витамины, пантетоновую кислоту, биотин. Основная функция индигенной микрофлоры заключается в поддержании колонизационной резистентности организма (Шендеров Б.А., 1998; Sierra Р. et al., 2000; Stepanovic S. et al., 2001).

В норме представители патогенной и условно-патогенной микрофлоры не оказывают отрицательного влияния на организм, но, вследствии различных нарушений, они, активно размножаясь, могут заселять нетипичные для них экологические ниши, становясь причиной инфекционных процессов различной локализации (Shibusawa Т. etal., 1991; Парфенов А. И. с соавт., 1998)........

Бронхит является аэрогенной инфекцией, поэтому именно в верхних отделах респираторного тракта после ингаляционной антигенной стимуляции на слизистых оболочках происходит нарушение иммунологического гомеостаза и запускаются локальные защитные реакции для поддержания колонизационной резистентности организма. Эти защитные реакции обозначаются термином «местный иммунитет слизистых оболочек» (Карякина Е.В. с соавт., 2004).

Защита на местном уровне развивается путем формирования типичной воспалительной реакции после взаимодействия патогенов с мембранными То11-подобными рецепторами (TLR), которые являются представителями системы рецепторного врож-

денного иммунного ответа. Затем происходит активация белков системы комплемента, генов цитокинового каскада, иммуноглобулинов. Все эти процессы определяют уровень мукозальной колонизационной резистентности, благодаря которой происходит блокирование жизнедеятельности, дезинтеграция и удаление инфекционного агента из организма (Абатуров А.Е., 2006).

Среди факторов местной иммунной защиты, участвующих в формировании колонизационной резистентности слизистых оболочек ротоглотки и обусловливающих баланс воспалительно - противовоспалительных реакций респираторного тракта, значительная роль отводится как индигенной микрофлоре, так и цитокинам, интерферо-нам, факторам роста, комплементу, лизоциму, sc, slgA и др. (Маянский А.Н. с соавт., 1993; Kowalski M.L. et al., 1993).

Но, несмотря на это, клиническому изучению саливарного уровня цитокинов посвящены единичные работы, связанные, в основном, с патологией слизистой оболочки ротовой полости. А большинство исследователей при оценке местного иммунитета слизистых ротоглотки ограничиваются анализом содержания только slgA. Содержание и соотношение других биологически активных веществ в слюнной жидкости, вносящих значительный вклад в формирование колонизационной резистентности организма, мало изучены, особенно у детей.

Буккальные эпителиоциты, так же как и слюна, могут быть индикатором нарушений саливарного гомеостаза. Их рецепторный аппарат подвергается воздействию протеолитических и гликозидазных ферментов секрета ротовой полости. Содержание таких ферментов заметно повышается во время заболеваний. В результате этого воздействия происходит нарушение колонизационной резистентности слизистых оболочек, которое проявляется в колонизации организма условно-патогенными и патогенными микроорганизмами, и тем самым создается угроза инфекционных осложнений (Weinmeister K.D. et al., 1994).

Актуальность работы заключается в необходимости изучения факторов, которые участвуют в формировании колонизационной резистентности слизистых оболочек ротоглотки, и установления их роли в патогенетических механизмах развития бронхитов у детей.

Цель исследования

Изучение системы мукозального иммунитета и микробиоценоза ротоглотки у детей с разными формами бронхитов и их роли в формировании колонизационной резистентности слизистых оболочек.

Задачи исследования

1. Установить этиологически значимых возбудителей бронхитов у детей.

2. Оценить состояние колонизационной резистентности слизистых оболочек респираторного тракта у здоровых и больных бронхитами детей по показателям естественной и экспериментальной адгезии с применением в качестве тест-объектов клеток назофа-рингеального и буккального эпителия.

3. Провести комплексный анализ бактериологических посевов с задней стенки глотки и показателей клеточных и гуморальных факторов местного иммунитета в слюне у здоровых и больных бронхитами детей.

4. Оценить роль микрофлоры и саливарных иммунологических факторов в формировании колонизационной резистентности слизистых оболочек ротоглотки.

Научная новизна

Впервые проведено комплексное изучение антиинфекционной резистентности детей, больных бронхитами, базирующееся на оценке колонизационной резистентности слизистой оболочки задней стенки глотки.

Установлено, что колонизационная резистентность слизистой оболочки задней стенки глотки является интегрирующей составляющей мукозального иммунитета.

Показано, что при остром и хроническом бронхите наблюдается снижение уровня естественной колонизации буккального эпителия «оральными» стрептококками и, как следствие этого, отмечается снижение устойчивости назофарингеального эпителия к экспериментальной адгезии с использованием тест-культур.

Выявлена взаимосвязь показателей местного иммунитета (секреторных иммуноглобулинов, лизоцима и цитокинов) с уровнями экспрессии эпителиоцитами задней стенки глотки То11-подобных рецепторов. При высокой инфекционной нагрузке (микст-инфекции) у пациентов с острым бронхитом наблюдались более высокие уровни экспрессии генов ТЬК-2, -3, -4 и -8, показателей в^А, бс, лизоцима и провос-палительных цитокинов ИЛ-1, ИЛ-8, ИНФ-у, ФНО-а , ГМ-КСФ, чем у детей с хроническим бронхитом.

Установлено, что по комплексной оценке уровней экспрессии эпителиальными клетками задней стенки глотки генов ТЬЯ-2, ТЪЯ-4, ТЬЯ-З, ТЬЯ-8 и продукции цитокинов ИЛ-1, ИЛ-8, ИНФ-у, ФНО-а и ГМ-КСФ при бронхитах у детей можно охарактеризовать стадию течения заболевания. Так, при бронхите пятикратное повышение уровней этих показателей свидетельствует, чаще всего, об его остром течении, а отсутствие значительного повышения указывает на хроническое течение бронхита.

Впервые разработаны комплексные информативные критерии оценки нарушения микробиоценоза задней стенки глотки, которые помогут усовершенствовать диагностику и терапию бронхитов у детей.

Полученные результаты позволили расширить знания о микробиологических и иммунологических факторах организма, которые вместе с индигенной (нормальной) микрофлорой участвуют в формировании колонизационной резистентности слизистых оболочек дыхательного тракта при бронхитах у детей.

Практическая значимость

Выведенные нормативы показателей микробиологических, иммунологических и биохимических факторов, вносящих значительный вклад в формирование индигенной микрофлорой колонизационной резистентности слизистых оболочек верхних дыхательных путей в детском возрасте, могут помочь в совершенствовании диагностики и лечении бронхитов у детей, а также использоваться в научно-исследовательской работе.

Метод определения уровней экспрессии генов ТЬК. с использованием ПЦР в реальном времени, совмещенной с обратной транскрипцией с применением специфических праймеров (патент РФ № 2327995 «Способ диагностики хронического уроге-нитального хламидиоза», зарегистрирован 27.06.2008 г.), был апробирован на эпителиальных клетках задней стенки глотки и может быть введен в клинико-диагностическую практику при диагностике бронхитов для определения стадии заболевания. Метод воспроизводится в условиях стандартной ПЦР-лаборатории.

Внедрение результатов работы в практику

По материалам диссертации издано учебное пособие «Микроэкология и гуморальный иммунитет слизистых открытых полостей человека в норме и при патологических состояниях», рекомендованное учебно-методическим объединением по медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России в качестве учебного пособия для системы послевузовского профессионального образования врачей. Издано также пособие для врачей «Роль инфекции в развитии патологии верхнего отдела дыхательных путей у детей» (утверждено проректором по учебной работе и международному сотрудничеству Российской медицинской академии последипломного образования, член-корр. РАМН, профессором И.В. Поддубной).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Нарушение антиинфекционной резистентности слизистой оболочки задней стенки глотки при бронхитах у детей проявляется в количественных изменениях ее микробиологических и иммунологических показателей, которые в норме вместе с индиген-ной микрофлорой участвуют в формировании колонизационной резистентности и препятствуют колонизации организма посторонними микроорганизмами.

2. Изменения систем врожденного и приобретенного иммунитета при бронхитах сопровождаются выраженным дисбалансом иммунологических показателей мукозаль-ного иммунитета.

3. Состояние микробиоценоза ротоглотки у детей с бронхитами взаимосвязано с уровнем мукозального иммунитета.

Апробация работы

Диссертация апробирована на совместном заседании секций «Медицинская биотехнология» и «Общая и прикладная иммунология» Ученого совета ФБУН • - МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, протокол № 2 от 28 февраля 2013 г.

Результаты диссертационной работы были представлены на Научно-практической конференции, посвященной 50-летию детского инфекционного отделения МОНИКИ (Москва, 2008); Юбилейной Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 90-летию Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н.Блохиной Роспотребнадзора и 20-летию Приволжского окружного центра по профилактике и борьбе со СПИД (Нижний Новгород, 2009); Юбилейной научно-практической конференции, посвященной 100-летию Ростовского научно-исследовательского института микробиологии и паразитологии (Ростов-на-Дону, 2009); XIV научно-практической конференции ГОУ ДПО «Пензенский инсти-

6

тут усовершенствования врачей» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (Пенза, 2009); XVI, XVII, XVIII Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 2009, 2010, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 научных работ, в том числе 5 - в рецензируемых изданиях; 7- в сборниках материалов конференций; 1-учебное пособие для системы послевузовского профессионального образования врачей; 1- пособие для врачей. Получен 1 патент на изобретение.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 119 страницах печатного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы (глава 1), материалы и методы исследований (глава 2), результаты собственных исследований (глава 3), заключение, выводы, список цитируемой литературы. Диссертация иллюстрирована 5 рисунками и 9 таблицами. В библиографическом указателе приведено 185 источников, из них 93- на русском и 92 - на иностранном языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований

Результаты диссертационной работы основаны на лабораторном исследовании 1472 образцов биологического материала от 96 детей в возрасте 3-10 лет, клинически обследованных в ДГКБ им. Святого Владимира (МОНИКИ, г. Москва) и Истринской районной детской поликлинике (г. Истра, Московская область) за период 2007-2010 гг. Из них 51 ребенок - с острым и 15 детей - с хроническим бронхитом (средний возраст больных детей - 4,0±2,2 года). Группу контроля составили 30 клинически здоровых детей в возрасте 3-10 лет (средний возраст - 5,0±2,9 года). Всего было обследовано 49 мальчиков и 47 девочек.

У здоровых детей пробы слюны и крови собирали одновременно, строго натощак, не ранее, чем через 2 недели после окончания любого инфекционного процесса, и не ранее, чем через 1 месяц после ревакцинации. У больных детей исследуемые образцы собирали при таких же условиях, но в самом начале заболевания.

Клиннко-лабораторные методы исследования.

Микробиологические, иммунологические, ПЦР - исследования проводились на базе ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского. Биохимические исследования выполнялись на базе Истринской районной больницы.

Сбор клинико-анамнестических данных и лабораторную трактовку результатов анализов проводили совместно с врачом-педиатром Истринской районной детской поликлиники Юдиной И.В. и врачами ДГКБ им. Святого Владимира к.м.н. Савицкой Н.М. и к.м.н. Целипановой Е.Е. под руководством д.м.н. профессора Феклисовой Л.В.

Микробиологические методы. Родовую и видовую идентификацию микрофлоры проводили на основании изучения морфологических, культуральных и биохимических свойств с использованием микротестов-систем фирмы «РЫУА- ЬасЬеша Б^лоБ^ка» (Чешская Республика) и согласно руководствам (Медицинская микробиология, 1998; Приложение 1 к приказу МЗ СССР № 535 от 22.04.85).

Адгезию оценивали по индексам ИЕКНЭ и ИЕКБЭ, которые определяли по методу Маянского А.Н, основанному на количественном подсчете «оральных» стрептококков, адгезированных на эпителиоцитах ребенка в естественных условиях (Маян-ский А. Н. и др., 1987). О естественной колонизации судили по числу клеток «оральных» стрептококков в пересчете на 1 эпителиоцит.

Индексы экспериментальной (искусственной) колонизации НЭ (ИИКНЭ) и БЭ (ИИКБЭ) оценивали с использованием тест-штаммов Streptococcus salivarius, Staphylococcus aureus и Klebsiella pneumoniae. Тест-штаммы S. salivarius и К. pneumoniae были клиническими изолятами, полученными от детей, а штамм S. aureus № 6538-р был получен из коллекции ГИСК им. JI.A. Тарасевича. Расчет индексов был произведен по методу D. Goldman и Е. Goetzl в модификации А.Н. Маянского путем высчитывания среднего количества бактерий, прикрепившихся к 1 эпителиоциту (Маянский А. Н. и др., 1987).

Расчет коэффициента адгезии (К), который представляет собой процент эпите-лиоцитов, имевших на своей поверхности адгезированные микробы, проводили по Брилис В.И. и др. (1986).

Иммунологические методы. Определение наличия IgM- и IgG-антител к Chlamydophila pneumoniae проводили с использованием тест-системы «Medac» (Германия), к Mycoplasma pneumoniae - «Savyondiagnostics» (Израиль), к аденовирусу, к вирусам гриппа А и В, к респираторно-синцитиальному вирусу (РСВ) - «DRG» (Германия). Для определения наличия IgM- и IgG-антител к вирусу простого герпеса 1 типа, а также диагностику инфекционного мононуклеоза, которую проводили на основании определения IgM- и IgG-антител к капсидному антигену вируса Эпштейна-Барр, применяли тест-системы «ВСМ Diagnostics» (США).

Количественное содержание в слюне цитокинов ИЛ-1, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-9, ИЛ-10, ИЛ-12, ИНФ-у, ФНО-а, ГМ-КСФ оценивали методом проточной флюори-метрии на двухлучевом лазерном автоматизированном анализаторе (ВЮ-Plex Protein Assay System, «BioRad», США) с использованием тест-систем «10-Р1ех» (определяемый динамический диапазон 2-32000 пкг/мл) и прогрэммы «Bio-Plex Manager» («BioRad», США).

Количественное определение в слюне иммуноглобулинов (IgG, IgM, IgA, slgA) и свободного секреторного компонента (sc) проводили методом радиальной иммуно-диффузии по Манчини в модификации Е.В. Чернохвостовой с соавт. (1987).

Количественное определение содержания общего IgE в слюне и в крови проводили с использованием набора реагентов «IgE общий - ИФА - БЕСТ» (ЗАО «Вектор-Бест», Россия).

У всех детей определялся коэффициент сбалансированности (Кеб) факторов местного иммунитета полости рта. Это интегрированный показатель состояния местного иммунитета полости рта, который учитывает функциональные связи лизоцима с иммуноглобулинами и является маркером воспаления. Расчет проводили по формуле Толкачевой Н.И. (1987):

IgG x 40%

Кеб =----------------- где:

IgA ^ liz x 0,6

IgG и IgA- концентрация Ig в слюне (г/л); liz - активность лизоцима смешанной слюны (%); 40% - условная норма активности лизоцима; 0,6 - соотношение IgG/ IgA, которое определяется у здоровых людей.

Состояние местного иммунитета полости рта считается благоприятным при Ксб=0,1-0,9 (сбалансированность факторов не нарушена); при Ксб=0,91-2,0 регистрируется пограничное состояние (такие пациенты относятся к группе риска); при Ксб=2,1 и более - сбалансированность факторов нарушена (это показатель больных с неблагоприятным состоянием местного иммунитета слизистых оболочек полости рта).

Молекулярно-генетические методы. Для количественного определения экспрессии генов TLR-2, TLR-4, TLR-3 и TLR-8 использовали метод полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с обратной транскрипцией (OT-Real-Time PCR), выполняемый с помощью амплификатора iCycler 1Q5 («Bio-Rad», США). Конструирование специфических олигонуклеотидных праймеров проводили с применением компьютерных программ: Vector NTI Advance 9.0 (PC) (http://www.invitrogen.com/site/us/en/home.html), DNASTAR. Праймеры были синтезированы на базе ЗАО «Синтол» (Москва).

Уровни экспрессии генов TLR стандартизировали по гену GAPDH. Нормализация количества изучаемых транскриптов к общему количеству кДНК в пробе проводилась с помощью отношений TLR2/GAPDH, TLR3/GAPDH, TLR4/GAPDH, TLR8/GAPDH. Экспрессию генов TLR оценивали в относительных единицах (ОЕ).

Биохимические методы. Количественное определение содержания альбумина в слюне проводили с помощью набора реагентов «Альбумин» («Chronolab», Испания) с бромкрезоловым зеленым.

Количественное определение содержания общего белка в слюне проводили с помощью набора реагентов «Общий белок в моче ФС» («Diasys», Германия) с пиро-галлоловым красным. Данным набором допускается исследовать как мочу, так и спинномозговую жидкость. Для увеличения чувствительности метода образцы слюны брали в увеличенных объемах (50 мкл вместо 20 мкл).

• ... Активность фермента лизоцима-слюны определяли-фотонефелометрическим методом Дорофейчука В.Г. (1968), с помощью фотоэлектроколориметра.

Статистические методы. Математическую обработку полученных данных проводили в рамках параметрической и непараметрической базовой статистики (Гланц С., 1998) с использованием критерия Стьюдента, метода /Д коэффициента ранговой корреляции Спирмена (при rs >0,7 связь считали сильной; при 0,5<rs<0,7 связь являлась средней; при rs <0,5 связь считали слабой; при rs=0- линейная связь отсутствует), применяя стандартный пакет статистических программ Microsoft Excel 2007. Результаты считали достоверными при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Постоянная микрофлора биотопа ЗСГ у клинически здоровых детей, в основном, была представлена а - гемолитическими стрептококками, выявлявшимися в количестве 7,52±3,06 КОЕ/г, и непатогенными нейссериями (7,52±4,01 КОЕ/г), которые высевались у 100% детей.

Условно-патогенную группу микробов составляли стафилококки, энтеробакте-рии и грибы рода Candida, выделяемые у 3,7%-22,2% здоровых детей, в количестве 2,82 ±2,16 КОЕ/г. В составе микробиоценоза удельный вес составил для Streptococcus spp.- 42,5%, для Neisseria spp.- 42,5%, для S.aureus -8,4%, для грибов рода Candida-4,6%, для К. pneumoniae - 0,8%. ОМЧ составляло 17,86±9,23 lg КОЕ/г.

У 46,6% здоровых детей в задней стенке глотки обнаруживался какой-нибудь 1 вид из перечисленных условно-патогенных микроорганизмов, у 10% детей выявлялись ассоциации из 2 видов микробов при средней интенсивности колонизации условно-патогенными микроорганизмами 2,82 ±2,16 lg КОЕ/г.

При оценке микробиоценоза задней стенки глотки у всех обследованных детей определялись 4 микроэкологических варианта этого биотопа согласно разработанной нами ранее новой медицинской технологии (Воропаева Е.А., Афанасьев С.С., Алёш-кин В.А., Воробьев А.А. и др., 2006):

1) нормоценоз, характеризующийся отсутствием микроэкологических нарушений, присутствием индигенной микрофлоры Streptococcus spp. в количестве 5-6 lg КОЕ/г, Neisseria spp. - 4-6 lg КОЕ/г, при концентрации в слюне IgA< 20 мкг/мл, sIgA< 20 мкг/мл, IgM 0 мкг/мл, IgG< 50 мкг/мл, свободного секреторного компонента (sc)< 50 мкг/мл;

2) промежуточный тип (I степень дисбиотических нарушений), характеризующийся нарастанием нормофлоры: Streptococcus spp. - до 6-7 lg КОЕ/г, Neisseria spp. -6-7 lg КОЕ/г и появлением УПМ в количестве до 3-4 lg КОЕ/г, при концентрации в слюне IgA 20-50 мкг/мл, slgA 20-50 мкг/мл, IgM< 10 мкг/мл, IgG 50-100 мкг/мл, sc 50100 мкг/мл;

3) дисбиоз (II степень дисбиотических нарушений) микробиоценоза ротоглотки, при котором наблюдалось повышение количества нормофлоры Streptococcus spp.-

6-7 lg КОЕ/г, Neisseria spp.- 6-7 lg КОЕ/г, повышение уровня факультативно-анаэробной УПМ до 4-5 lg КОЕ/г, появление патогенных вариантов УПМ, при концентрации в слюне IgA 50-100 мкг/мл, slgA 50-100 мкг/мл, IgM 10-30 мкг/мл, IgG 100200 мкг/мл, sc 100-200 мкг/мл;

4) выраженный воспалительный процесс (III степень дисбиотических нарушений), характеризующийся значительным повышением содержания Streptococcus spp. -

7-8 lg КОЕ/г, Neisseria spp. - 7-8 lg КОЕ/г, УПМ и количества патогенных микроорганизмов до 6-8 lg КОЕ/г, при концентрации в слюне IgA>100 мкг/мл, sIgA>100 мкг/мл, IgM>30 мкг/мл, IgG >200 мкг/мл, sc>200 мкг/мл.

Различия в обсемененности слизистой задней стенки глотки индигенными микроорганизмами в контрольной группе и у больных бронхитами детей не были досто-

10

верны как по количественному содержанию, так и по частоте встречаемости. Выявлены достоверные различия по частоте инфицирования S.aureus и грибами рода Candida при остром бронхите по сравнению с пациентами с хроническим бронхитом и клинически здоровыми детьми (табл. 1).

Таблица 1 - Микробиологические показатели биотопа ЗСГ пациентов с бронхитами и детей контрольной группы

Клинически здо- Пациенты с острым Пациенты с хрониче-

ровые дети бронхитом ским бронхитом

Микроорганизмы Количество обследованных детей

30 51 15

Микрофлора задней стенки глотки: % встречаемости и

интенсивность колонизации ^ КОЕ/г (М+т)

Индигенная микрофлора

Streptococcus spp. 100% 100% 100%

(а-гемолитические) 7,52+3,06 7,65+3,88 7,67±3,99

Neisseria spp. 100% 100% 100%

7,52±4,01 7,56+3,24 7,13±3,35

Условно-патогенная микрофлора (УПМ)

S. pneumoniae 0 7,8% 6,6%

0 5,2+1,85 4,8+1,46

S. aureus 16,7% 41,2% 6,7%

2,88±1,79 4,67+2,34 4,0+2,32

Коагулазоотрицательные ста- 0 3,9% 3,9%

филококки 0 4,5+1,5 3+0,2

Е. coli 0 5,9% 7,4%

0 4,0+0 3,0+0

К. pneumoniae 3,7% 13,7% 6,7%

2,5+0,1 4,67+2,17 5,0±0

Enterobacter spp. 0 5,9% 0

0 3,6±1,12 0

P. aeruginosa 0 3,9% 3,9%

0 2,67± 1,23 2,5+0,4

Грибы рода Candida 22,2% 53,0% 20,0%

3,4±1,21 4,53±2,26 4,5+1,18

УПМ*, Lg КОЕ/г 2,82 ±2,16 6,11 ±2,56 3,76+1,32

ОМЧ", Lg KOE/r 17,86+9,23 21,32+9,68 18,56+8,66

Примечание: *- средний Lg КОЕ/г УПМ, **ОМЧ - общее микробное число.

Интенсивность колонизации задней стенки глотки условно-патогенными микроорганизмами была достоверно выше при остром бронхите, а при хроническом бронхите изменения не достоверны, по сравнению с клинически здоровыми детьми. Обследование 30 детей контрольной группы выявило, что у 14 (46,7%) наблюдался нормоценоз, у 13 (43,3%) - промежуточный тип. Дисбиоз был выявлен у 3(10%) детей.

Микробиоценоз задней стенки глотки у детей с острым бронхитом достоверно отличался от такового у здоровых: нормоценоз - у 11 (21,6%) пациентов (р<0,05); промежуточный тип - у 6 (11,8%) (р<0,01); дисбиоз - у 18 (35,3%) (р<0,05); выра-

женный воспалительный процесс - у 16 (31,4%) ( р<0,01). Следовательно, при остром бронхите нарушения микробиоценоза слизистых сдвигаются в сторону дисбиоза и выраженного воспалительного процесса.

Дети с хроническим бронхитом также достоверно отличались от группы здоровых детей по микробиоценозу задней стенки глотки: нормоценоз регистрировался у 3 (20%) пациентов (р<0,05); промежуточный тип - у 3 (20%) (р<0,01); дисбиоз - у 5 (33,3%) (р<0,05); выраженный воспалительный процесс - у 4 (26,7%) (р<0,01). Таким образом, при хроническом бронхите нарушения микробиоценоза слизистых оболочек также сдвигаются в сторону дисбиоза и выраженного воспалительного процесса.

Достоверных различий в нарушении микробиоценоза задней стенки глотки между группами детей с острым и хроническим бронхитом не выявлено.

У детей с бронхитами при проведении исследования на наличие IgG- и IgM-антител к вирусным и внутриклеточным патогенам актуальным было обнаружение наличия именно IgM-антител, которые появляются в острую фазу инфекции и, соответственно, дети в такой период особенно контагиозны. У 19,6% (п=13) из 66 больных детей были обнаружены IgG- и IgM-антитела к Chlamydophila pneumoniae. Из них, из 51 ребенка с острым бронхитом острый период заболевания был у 10,0% (п=5) детей, так как у них были обнаружены IgM-антитела, из 15 детей с хроническим бронхитом IgM-антитела выявились у 13,3% (п=2).

У 31,8% (п=21) детей выявились IgG- и IgM-антитела к Mycoplasma pneumoniae. Из них, из группы детей с острым бронхитом, острый период заболевания был у 5,8% (п=3) детей, из группы детей с хроническим бронхитом - у 13,3% (п=2) детей.

IgG- и IgM-антитела к вирусу Эпштейна-Барр были выявлены у 65,1% (п=43) детей. Из них, у детей с острым бронхитом, острый период заболевания был у 4,0% (п=2) детей, так как у них были обнаружены антитела класса IgM к капсидному (VCA) антигену, у детей с хроническим бронхитом - у 6,7% (п=1) детей.

У 31,8% (п=21) детей определялись IgG- и IgM-антитела к вирусу простого герпеса 1 типа. Из них, из группы детей с острым бронхитом, острый период заболевания был у 2,0% (п=1) детей, из группы детей с хроническим бронхитом - у 6,7% (п=1) детей.

IgG- и IgM-антитела к аденовирусу были выявлены у 53,0% (п=35) детей. Из них, у детей с острым бронхитом, острый период заболевания был у 41,2% (п=21) детей, из группы детей с хроническим бронхитом - у 13,3% (п=2) детей, причем титры IgM-антител были высокими и находились в пределах от 1:100 до 1:400.

У 16,6% (п=11) детей были IgG- и IgM-антитела к вирусу гриппа А. Из них, из группы детей с острым бронхитом, IgM-антитела были обнаружены у 10,0% (п=5) детей, из группы детей с хроническим бронхитом - у 13,3% (п=2) детей.

IgG- и IgM-антитела как к вирусу гриппа В, так и к РСВ, были выявлены у 9,1% (п=6) детей. Из них IgM-антитела к этим вирусным патогенам были обнаружены только в группе детей с острым бронхитом у 5,8% (п=3) детей к каждому виду вируса.

При анализе ассоциаций патогенных вирусных агентов выявлено, что значительный удельный вес при бронхитах у детей принадлежит: аденовирусу - у 34,8%

12

(n=23), Chlamydophila pneumoniae - у 10,6% (n=7), вирусу гриппа A - у 10,6% (n=7) и Mycoplasma pneumoniae - у 7,5% (n=5) детей. Меньший вклад в развитие острой респираторной патологии вносят: PCB - у 4,5% (п=3), вирус гриппа В - у 4,5% (п=3) и вирус Эпштейна-Барр - у 4,5% (п=3) детей. Вирус простого герпеса 1 типа в стадии острой инфекции выявлен только у 3,0% (п=2) детей (табл. 2). У клинически здоровых детей IgM-антитела к указанным патогенам не выявлены.

Таблица 2 - Частота встречаемости ^М-антител к вирусным и внутриклеточным патогенам при бронхитах у детей___

Патогены Острый бронхит, число пациентов/ частота встречаемости (%) Хронический бронхит, число пациентов/частота встречаемости (%) Общая группа детей с бронхитами/частота встречаемости (%)

Число обследованных 51 15 66

IgM-антитела

Вирус Эпштейна-Барр 2/4,0 1/6,7 3/4,5

Вирус простого герпеса 1/2,0 1/6,7 2/3,0

Респираторно-синцитиальный вирус 3/5,8 0 3/4,5

Вирус гриппа А 5/10,0 2/13,3 7/10,6

Вирус гриппа В 3/5,8 0 3/4,5

Аденовирус 21/41,2 2/13,3 23/34,8

Chlamydophila pneumoniae 5/10,0 2/13,3 7/10,6

Mycoplasma pneumoniae 3/5,8 2/13,3 5/7,5

У клинически здоровых детей установлена следующая зависимость между показателями естественной адгезии «оральными» стрептококками к буккальному эпителию и искусственной адгезией S. salivarius, S. aureus и К. pneumoniae к назофаринге-альному эпителию: при среднем уровне естественной обсемененности «оральными» стрептококками буккального эпителия (28,3±4,9 бактерий на 1 клетке), уровень искусственной обсемененности назофарингеального эпителия, например, S. salivarius, был также средним (34,0±8,3 бактерий на 1 клетке).

У детей с бронхитами обнаружена следующая закономерность (табл. 3): чем меньше «оральных» стрептококков было адгезировано на буккальном эпителии в естественных условиях (10,8±3,7 бактерий на 1клетке при остром бронхите и 10,7±2,6 бактерий на 1 клетке при хроническом бронхите), тем больше бактерий смогло адге-зироваться на'назофарингеальном эпителии при проведении искусственной адгезии (например, S. salivarius: 82,2±44,1 бактерий на 1 клетке при остром и 105,8±57,2 бактерий на 1 клетке при хроническом бронхите), то есть у больных детей существует обратная зависимость между показателями естественной и искусственной адгезии.

При оценке уровней экспрессии генов TLR-2, TLR-4, TLR-3 и TLR-8 (табл. 4) было установлено, что у пациентов с острым бронхитом они превышали таковые в группе контроля в 5 раз, а у больных с хроническим бронхитом - в 1,3-1,7 раза. У больных с острым бронхитом медианы уровней экспрессии генов TLR-2, TLR-4, TLR-3 и TLR-8 достоверно (по х2) отличались от таковых в группе контроля (р<0,00001),

Таблица 3 - Уровни колонизации микроорганизмами назофарингеального (НЭ) и

буккального эпителия (БЭ) у клинически здоровых и больных детей

Уровни Естественная адгезия Экспериментальная адгезия Б. заНуагшэ Экспериментальная адгезия S. aureus Экспериментальная адгезия

К. pneumoniae

НЭ БЭ НЭ БЭ НЭ БЭ НЭ БЭ

Клинически здоровые дети (п=20)

Низкий 0 14,8±1,9 0 24,3±3,8 0 27,8±4,9 0 10,0±1,4

0 1,0±0,0 0 1,0±0,0 0 1,5±0,55 0 0,67±0,52

Средний 29,7±7,3 28,3±4,9 34,0±8,3 21,3±2,6 19,7±3,8 19,3±2,9 16,4±3,2 8,0±0,95

1,3±0,5 1,75±0,5 1,66±0,5 1,0±0,0 1,0±0,0 1,0±0,0 1,0±0,0 1,0±0,0

Высокий 50,0±0,0 0 25,0±0 0 5,0±0,0 0 10,0±0,0 0

2,0±0,0 0 2,0±0,0 0 1,0±0,0 0 1,0±0,0 0

Дети с острым бронхитом (п=33)

Низкий 0 10,8±3,7 0 40,3±10,3 0 38,5±9,9 0 12,3±2,4

0 0,6±0,5 0 1,8±0,4 0 2,0±0,0 0 0,92±0,3

Средний 26,5±2,1 0 61,5±41,7 0 49,0±4,2 0 15,5±4,9 0

1,0±0,0 0 2,0±0,0 0 2,0±0,0 0 1,0±0,0 0

Высокий 113,1*22,7 0 82,2±24,1 0 77,5±25,3 0 18,6±3,2 0

2,9±0,3 0 2,1 ±0,3 0 2,1 ±0,3 0 1,0±0,0 0

Дети с хроническим бронхитом (п =12)

Низкий 0 10,7±2,6 0 32,1 ±8,1 0 46,0±7,2 0 16,0±3,4

0 0,8±0,4 0 1,7±0,5 0 2,0±0,0 0 1,0±0,0

Средний 49,0±0,0 0 63,0±0,0 0 54,0±0,0 0 12,0±0,0 0

2,0±0,0 0 2,0±0,0 0 2,0±0,0 0 1,0±0,0 0

Высокий 111,1±20,9 0 105,8±27,2 0 97,1 ±25,4 0 16,6±4,6 0

2,75±0,5 0 2,38±0,52 0 2,25±0,46 0 1,0±0,0 0

Примечания: числитель — показатели средних значений экспериментальной адгезии, полученных при исследовании назофарингеальных и буккальных клеток с разным уровнем на-тивной адгезии, выраженные в абсолютных числах; знаменатель - показатели средних значений экспериментальной адгезии при исследовании назофарингеальных и буккальных клеток с разным уровнем нативной адгезии, выраженные в баллах.

а у больных с хроническим бронхитом достоверно отличалась от детей группы контроля только медиана ТЬЯ-З (р<0,007). Также достоверно различались медианы экспрессии генов Т1Л1-2 (р<0,002), Т1Ж-4 (р<0,00001), ТЬЯ-З (р<0,0007) и ТЬЯ-8 (р<0,00001) при сопоставлении групп детей с острым и хроническим бронхитами. Выявлена сильная положительная корреляция между показателями уровней экспрессии генов ТЬЯ в группе детей с острым бронхитом: ТЬЯ-2 и ТЬЯ-З (г=0,83, р<0,05),

ТЬЯ-2 и ТЫ1-8 (г=0,74, р<0,01), ТЬЯ-4 и ТЬЯ-З (г=0,97, р<0,01), ТЫ1-4 и ТЬЯ-8 (г=0,85, р<0,02), ТЬЛ-З и ТЬК-8 (г=0,74, р<0,05) и в группе детей с хроническим бронхитом - ТЬЯ-2 и ТЬЯ-З (г=0,94, р<0,05), ТЬЯ-4 и ТЬЯ-8 (г=1,00, р<0,01), ТЬК-З и Т1Л1-8 (г=0,73, р<0,01).

Таблица 4 - Уровни экспрессии генов ТЬЯ врождённого иммунитета у клинически здоровых и больных детей__

Рецепторы врождённого иммунитета Острый бронхит, п= 32 (М±т/медиана) Хронический бронхит, п= 9 (М±ш/медиана) Клинически здоровые, п= 11 (М±т/медиана)

тъи-г 109,73±88,9/52,78 25,44± 19,68/25,17 18,95±7,5/15,13

Ти*-4 147,8±156,83/66,11 44,08±66,84/11,43 31,7±12,12/21,20

ТЬЯ-З 98,1 ±75,05/47,98 30,85±26,49/20,00 17,19±17,48/6,16

ТЬ[1-8 135,06±110,97/47,65 21,65±17,51/6,47 13,39±15,72/7,23

При остром и хроническом бронхитах взаимосвязь рецепторов врождённого иммунитета ТЬЯ-2, ТЫ1-4, ТЬЯ-З, ТЫ1-8 (контролируют запуск цитокинового каскада местной антиинфекционной резистентности, через который запускаются имму-

ноглобулиновое звено и воспалительная реакция) с микрофлорой биотопа определяет колонизационную резистентность слизистых оболочек и, вероятно, характеризует течение инфекционного процесса.

В работе были проанализированы уровни экспрессии То11-подобных рецепторов у детей всех обследованных групп в зависимости от характера инфицирования (табл. 5).

Таблица 5 — Влияние характера инфицирования на уровень экспрессии генов ТЬЯ

Группы пациентов Инфицированность Экспрессия рецепторов врожденного иммунитета (медиана)

Т1.К-2 ТЬЯ-4 ТЬЯ-З Ти*-8

Острый бронхит, 32 челов. Вирусные патогены 40,51 16,66 44,29 0,21

УПМ 52,78 66,11 55,63 39,45

Микст-инфекция 127,75 178,25 111,85 167,95

Интактные нет нет нет нет

Хронический бронхит, 9 челов. ■ Вирусные патогены 50,61 15,98 22,07 34,40

УПМ 28,66 159,78 68,35 32,59

Микст-инфекция 14,29 7,65 14,25 2,39

Интактные 15,62 11,86 25,75 37,00

Клинически здоровые, 11 челов. Вирусные патогены нет нет нет нет

УПМ 21,36 35,17 0 0

Микст-инфекция нет нет нет нет

Интактные 17,14 29,09 6,16 7,23

Примечания: вирусные патогены - пациенты, инфицированные только вирусными патогенами (диагностическое значение ^М-антител было не ниже 1:100); УПМ- пациенты, инфицированные только условно-патогенной микрофлорой (интенсивность колонизации не менее 5,0 КОЕ/г); микст-инфекция - пациенты с сочетанной вирусной и бактериальной инфици-рованностью; интактные - пациенты с не выявленной инфицированностью патогенами; достоверность различий оценивалась по "/_2( см. в тексте).

Достоверное повышение медианы экспрессии гена ТЫ1-2 регистрировалось только у детей с острым бронхитом при микст-инфекции по сравнению с детьми с

хроническим бронхитом (р<0,0001). Медиана экспрессии гена ТЬЯ-4 при остром бронхите была достоверно ниже при инфицировании УПМ при сопоставлении с группой с хроническим бронхитом (р<0,0001), достоверно выше при микст-инфекции при сопоставлении с той же группой (р<0,0001), а без инфицирования достоверно выше в контрольной группе по сравнению с пациентами с хроническим бронхитом (р=0,007). Медиана экспрессии гена ТЬЯ-З в группе детей с острым бронхитом была достоверно выше при сопоставлении с группой детей с хроническим бронхитом при инфицировании вирусными патогенами (р<0,006) и при микст-инфекции (р<0,0001). Медиана экспрессии гена ТЬЯ-8 в группе детей с острым бронхитом была достоверно выше при сопоставлении с группой детей с хроническим бронхитом при микст-инфекции (р<0,0001); при хроническом бронхите она была выше таковой при остром бронхите при инфицировании вирусными патогенами (р<0,0001), а без инфицирования достоверно выше по сравнению с контрольной группой (р=0,001). Следовательно, у детей при остром бронхите в ответ на выраженное бактериально-вирусное воздействие исследованные То11-подобные рецепторы отреагировали достоверным повышением экспрессии по сравнению с контрольной группой и детьми с хроническим бронхитом. Наиболее высокие значения экспрессии генов ТЬЯ имели место при микст-инфекции, что объясняется, в определённой степени, перекрёстным действием лиган-дов. При хроническом бронхите уровни экспрессии генов ТЬЯ незначительно отличались от контрольной группы.

Установлена достоверная взаимосвязь экспрессии генов ТЬЯ с другими факторами врождённого иммунитета: лизоцимом, ИЕКНЭ, э^А и ее.

Развитие иммунного ответа при вирусных и бактериальных инфекциях определяется спектром секретируемых цитокинов. Несмотря на сходную этиологическую и клиническую картину, дети с острым и хроническим бронхитом существенно различались по количественному содержанию в слюне цитокинов (табл. 6).

Таблица 6 - Уровни цитокинов в слюне у детей при бронхитах и в группе контроля

Цитокины (пкг/мг белка) Острый бронхит, п= 33 Хронический бронхит, п= 12 Клинически здоровые, п= 20

ИЛ-1 154,76±12,3 24,77±1,9 3,29±0,31

ИЛ-8 236,97±19,9 214,21±13,1 25,20±2,5

ИНФ-у 42,85±2,9 15,11±1,8 10,47±1,9

ФНО-а 3,8±0,5 5,4±0,4 0,4±0,2

ГМ-КСФ 5,34±0,5 3,08±0,3 0,98±0,3

ИЛ-4 1,4±0,4 1,0±0,5 0,66±0,И

ИЛ-6 1,5±0,6 2,1±0,7 0,6±0,3

ИЛ-9 5,2±0,9 5,1 ±0,5 4,85±0,7

ИЛ-10 0,3±0,2 0,3±0,2 0,15±0,11

ИЛ-12 0,1 ±0,03 0,06±0,02 0,06±0,02

Пятикратное повышение уровней экспрессии генов ТЬЯ-2, ТЬЯ-4, ТЬЯ-З, ТЬЯ-8, пятидесятикратное повышение ИЛ-1 (р<0,001), десятикратное повышение ИЛ-8 (р<0,001) и 4-5 кратное повышение ФНО-а, ИНФ-у и ГМ-КСФ (р<0,001) в группе де-

тей с острым бронхитом, в сравнении с группой контроля, свидетельствовало о хорошей местной антиинфекционной резистентности. У детей с хроническим бронхитом отмечалось незначительное (в 1,3-1,7 раза) повышение ИЛ-1, ИЛ-8, ИЫФ-у и ГМ-КСФ (р<0,05) по сравнению с контролем, что указывало на нарушение антиинфекционной резистентности и хроническое течение заболевания.

При сопоставлении групп детей с острым и хроническим бронхитом достоверные различия (р<0,05) выявлены по уровням ИЛ-1 и ИНФ-у. Уровни ИЛ-6, ИЛ-9, ИЛ-10, ИЛ-12 практически не различаются во всех исследуемых группах. Соотношение ИФН-у/ИЛ-4 при остром бронхите составляло, в среднем, 67,43, при хроническом бронхите - 13,45, у клинически здоровых детей - 46,27; между показателями выявлена достоверность различий (р<0,05).

При изучении саливарных показателей местного иммунитета полости рта детей с острым бронхитом были выявлены общие закономерности изменения уровней всех классов основных иммуноглобулинов (табл. 7).

У 13 детей было выявлено достоверное (р<0,05) увеличение уровня в слюне. Это свидетельствует о том, что на начальной стадии заболевания при остром бронхите на слизистых идет активная стимуляция местного иммунного ответа. Значения ^М были 1,0 ± 0,8 мкг/мг общего белка. Отличительной особенностью детей с острым бронхитом являлась более высокая, чем у здоровых, концентрация в слюне, которая составила 8,6 ± 5,6 мкг/мг общего белка. Достоверное (р<0,001) повышение уровня в слюне было выявлено у 32 больных детей. Это говорит о прямой взаимосвязи количества в слюне со степенью выраженности воспалительного процесса, которое имеет место при остром бронхите, так как относительно высокие концентрации уровня в слюне обусловлены просачиванием плазменного происхождения через поверхность воспаленного эпителия. У 28 детей выявлено достоверное (р<0,001) повышение уровня б^А, которое составило 29,0 ± 25,6 мкг/мг общего белка и у 5 детей было обнаружено достоверное (р<0,05) повышение уровня 1§А в слюне, которое составило 0,5 ±0,2 мкг/мг общего белка. Это может указывать на возможность активирующего действия вирусов, бактерий и внутриклеточных патогенов на синтез иммуноглобулинов, так как данные иммуноглобулины в слизи действуют как первая линия иммунной защиты слизистых, нейтрализующая патогены. Особенно их количество увеличивается при возникновении острой формы бронхита". Также достоверно (р<0,001) увеличивался уровень свободного секреторного компонента (ее) - у 21 больного ребенка по сравнению с детьми контрольной группы. Он составил 35,2± 25,0 мкг/мг общего белка. Показатели нарушения проницаемости слизистой ротоглотки у детей с острым бронхитом также были достоверно увеличены по сравнению со здоровыми детьми, у которых соотношение э^А/ слюны составляло 1,04. Соотношение э^А/ ^С слюны у детей с острым бронхитом составляло 3,7 (р<0,001), а соотношение б^А/ альбумин увеличивалось до 0,05 (р<0,001) по сравнению со здоровыми детьми, у которых оно составляло 0,01. Выраженное увеличение показателей соотношений э^А/альбумин и содержания альбумина указыва-

ет на местный синтез иммуноглобулинов и одновременное поступление 1§0 и 18М из сыворотки крови, а выявление в^А и яс обусловлено их местным синтезом.

Таблица 7- Показатели местного иммунитета ротовой полости у пациентов с острым

и хроническим бронхитом и детей контрольной группы

Показатели Нозологические формы

Клинически здоровые дети Острый бронхит Хронический бронхит

Количество образцов слюны

27 33 11

^0,мкг/мл/ мкг/мг общего белка 33±8/3,4±2,8 96±19/ 8,6±5,6 36±7/ 5,2±3,8

1;>М,мкг/мл/мкг/мг общего белка 0 11 ±2/ 1,0±0,8 22±5/ 3,2±2,6

IgA,мкг/мл/ мкг/мг общего белка 0 6±2/ 0,5±0,2 0

з^,мкг/мл/мкг/мг общего белка 58±11/6,0±3,3 325±44/ 29,0±25,6 93±16/ 13,5±11,0

1&Е, МЕ/мл 0,47±0,20 0,78±0,30 0,86±0,20

5С,мкг/мл/мкг/мг общего белка 172±30/ 17,5±7,7 394±73/ 35,2±25,0 242±40/ 35,1*19,0

51вА/1§0 слюны 1,04 3,7 2,7

sIgA/aльбyмин 0,01 0,05 0,02

Активность лизоцима, % 25,0±7,0 34,6± 2,8 22,0±2,8

Альбумин, г/л 6,0±2,0 7,1±1,6 4,2±2,0

Общий белок, г/л 9,8±3,3 11,2±3,0 6,9±3,0

Кеб 0,51 1,64 1,2

Количество образцов для исследования адгезии

20 33 12

ИЕКНЭ, абс.зкачение 32,0±9,5 98,7±39,5 104,2 ±43,4

ИЕКНЭ, баллы 1,4±0,5 2,6±0,8 2,6±0,5

ИЕКБЭ, абс.значение 20,2±7,6 10,8±3,7 10,7±2,6

ИЕКБЭ, баллы 1,3±0,48 0,6±0,5 0,8±0,4

Кол-во лейкоцитов на НЭ, клеток в п/з 2,5±1,2 9,9±5,4 5,1±1,1

Таким образом, полученные результаты свидетельствовали об увеличении проницаемости слизистых оболочек ротоглотки у детей с острым бронхитом по сравне-

нию со здоровыми детьми.

Уровень ИЕКНЭ детей с острым бронхитом значительно отличался от здоровых (32,0±9,5 ) и составлял 98,7±39,5 (р < 0,001).

При подсчете интегрированного показателя состояния местного иммунитета полости рта (Кеб) у детей с острым бронхитом выявлено, что его средние значения составляли 1,64, что существенно выше (р<0,001) по сравнению с группой контроля (0,51). У 32 детей, то есть у каждого второго ребенка с острым бронхитом, интегрированный показатель состояния местного иммунитета полости рта был повышен в

18

сравнении с детьми из группы контроля, то есть наблюдался выраженный дисбаланс иммунологических показателей в слюне,

Уровни ^Е в слюне детей, больных острым бронхитом достоверно отличались от таковых у детей контрольной группы (0,78±0,30 и 0,47±0,20, соответственно, р<0,05).

Таким образом, в слюне детей с острым бронхитом было выявлено достоверное увеличение уровней ^О, ^М, 1§Л, б^А, ее, ^Е, а также соотношений э^А/альбумин, ИЕКНЭ, и Кеб по сравнению с показателями клинически здоровых детей. Содержание альбумина составляло 7,1±1,6 г/л, оно не отличалось от здоровых детей 6,0±2,0 г/л. Не было выявлено существенного увеличения активности лизоцима у больных острым бронхитом (34,6±2,8%) по сравнению со здоровыми детьми (25,0±7,0%). Различия в содержании общего белка также были недостоверны (11,2±3,0 г/л) по сравнению со здоровыми детьми (9,8±3,3 г/л).

При изучении саливарных показателей местного иммунитета полости рта детей с хроническим бронхитом выявлены следующие изменения уровней иммуноглобулинов. У 3 детей было выявлено достоверное (р<0,05) увеличение уровня 1§М в слюне по сравнению с контрольной группой. Его значения составляли 3,2 ± 2,6 мкг/мг общего белка. У детей с хроническим бронхитом была выявлена более высокая, чем у здоровых, концентрация ^С в слюне, которая составляла 5,2 ± 3,8 мкг/мг общего белка. Но достоверного повышения уровня в слюне не было выявлено (р>0,1). По всей видимости, слизистые детей с хроническим бронхитом уже не так ярко реагируют на инфекцию, как это происходит при остром бронхите. У 4 детей было выявлено достоверное (р<0,002) повышение уровня б^А, среднее количество которого составляло 13,5 ± 11,0 мкг/мг общего белка. Повышения уровня 1§А в слюне у детей с хроническим бронхитом не было. Также достоверно (р<0,001) увеличивался уровень свободного секреторного компонента - у 6 больных детей по сравнению с детьми контрольной группы. Его значения составляли у детей с хроническим бронхитом 35,1 ± 19,0 мкг/мг общего белка.

Показатели проницаемости слизистой ротоглотки были не увеличены по сравнению со здоровыми детьми: соотношение й^А/ 1§0 - 2,7, а соотношение э^А/ альбумин - 0,02.

Уровень ИЕКНЭ детей с хроническим бронхитом составлял (104,2 ±43,4), он достоверно отличался от показателей здоровых детей (р< 0,001).

Не было выявлено достоверных различий в активности лизоцима у здоровых (25,0±7,0%), больных острым (34,6±2,8%) и больных хроническим (22,0±2,8%) бронхитом детей (р >0,1). Различия в содержании альбумина и общего белка в слюне детей с бронхитами и группы клинически здоровых детей также были недостоверны. Но наблюдавшееся снижение количества лизоцима, альбумина и общего белка у детей с хроническим бронхитом по сравнению со здоровыми детьми указывало на вяло текущий процесс заболевания.

При выведении среднего значения интегрированного показателя состояния местного иммунитета полости рта (Кс6) у детей с хроническим бронхитом его значе-

19

ния составили 1,2 единиц, то есть, он достоверно не увеличился по сравнению со здоровыми детьми (0,51) (р > 0,1). По среднегрупповому уровню показателя Кеб всех больных с хроническим бронхитом можно отнести к группе риска. Однако, при анализе индивидуальных показателей выявлено, что у 7 детей с хроническим бронхитом Кеб соответствовал значениям клинически здоровых детей (Ксб=0-0,9) и только 4 ребенка относились к группе риска (Ксб=0,91-2,10). Детей с неблагоприятным состоянием местного иммунитета слизистых оболочек полости рта (К^ более 2,1), которое можно бы было расценивать как воспаление, обнаружено не было.

Уровни IgE в слюне детей, больных хроническим бронхитом достоверно отличались от таковых у детей контрольной группы (0,86±0,20 и 0,47±0,20, соответственно, р<0,05).

Таким образом, в слюне детей с хроническим бронхитом выявлено достоверное увеличение по сравнению с клинически здоровыми детьми уровней IgM, IgE, sc, ИЕКНЭ, slgA. Различия в содержании IgG, IgA, соотношений slgA/IgG и sIgA/альбумин, лизоцима, альбумина, Кеб и общего белка были недостоверны.

Таким образом, при острых бронхитах в ответ на высокую инфекционную нагрузку (в виде микст-инфекции вирусными и условно-патогенными микроорганизмами) наблюдались более высокие уровни экспрессии TLR-2, TLR-4, TLR-3, TLR-8, провоспалительных цитокинов ИЛ-1, ИЛ-8, ИНФ-у, ФНО-а и ГМ-КСФ, показателей slgA, sc и лизоцима, чем у детей с хроническим бронхитом. Это свидетельствует о хорошей местной антиинфекционной резистентности, а отсутствие повышения указывает на её нарушение и хроническое течение заболевания. Указанные показатели можно использовать в диагностических и прогностических целях.

Выявление в слюне повышенных уровней общего IgE при остром и хроническом бронхите указывает на активизацию и увеличение количества инфекционного компонента, что подтверждает общепризнанную роль бронхов как «шокового органа» при аллергических состояниях.

Установлена достоверная корреляция уровней экспрессии генов То11-подобных рецепторов с показателями slgA, sc, лизоцимом и естественной колонизацией назофа-рингеального эпителия «оральными» стрептококками, что свидетельствует об их взаимосвязи как компонентов колонизационной резистентности, отражающих состояние врождённого иммунитета. Всё вместе указывает на важную роль колонизационной резистентности как интегрального показателя мукозального иммунитета. Выводы

1. Этиологически значимыми возбудителями бронхитов у детей преимущественно являются: аденовирус, Chlamydophila pneumoniae, вирус гриппа А, Mycoplasma pneumoniae. Меньший вклад в развитие бронхитов вносят: РСВ, вирус гриппа В, вирус Эпштейна-Барр и вирус простого герпеса 1 типа.

2. Адгезия как компонент колонизационной резистентности слизистых у клинически здоровых детей проявляется в устойчивости назофарингеального эпителия к Streptococcus salivarius, Staphylococcus aureus и Klebsiella pneumoniae при нормальном уровне естественной колонизации клеток буккального эпителия «оральными» стреп-

20

тококками. При остром и хроническом бронхите колонизационная резистентность проявляется в снижении уровня естественной колонизации клеток буккального эпителия «оральными» стрептококками, а клетки назофарингеального эпителия слабо устойчивы к адгезии тест-штаммами.

3. При комплексном анализе микробиоценоза задней стенки глотки у детей с острым и хроническим бронхитом регистрируются преимущественно 2 типа микроэкологических нарушений данного биотопа: дисбиоз и выраженный воспалительный процесс. Высеваемость условно-патогенной микрофлоры в титре 106 КОЕ/г и выше свидетельствует об её участии в развитии патологического процесса.

4. При остром бронхите наблюдаются более высокие уровни (в 5 и более раз) экспрессии генов TLR-2, TLR-4, TLR-3, TLR-8 эпителия слизистой задней стенки глотки, цитокинов ИЛ-1, ИЛ-8, ИНФ-у, ФНО-а и ГМ-КСФ, показателей slgA и se, в сравнении с группой контроля и детьми с хроническом бронхитом. Также было выявлено достоверное увеличение уровней IgG, IgM, IgA, IgE, a также соотношений slgA/IgG, sIgA/альбумин, ИЕКНЭ, и Кеб по сравнению с показателями клинически здоровых детей. У детей с хроническим бронхитом выявлено достоверное увеличение по сравнению с клинически здоровыми детьми уровней IgM, IgE, se, ИЕКНЭ, slgA.

5. Выявлена корреляционная связь уровней экспрессии То11-подобных рецепторов с уровнями естественной колонизации назофарингеального эпителия «оральными» стрептококками, условно-патогенными микроорганизмами и с саливарными показателями местного иммунитета ротоглотки - slgA, se, IgM, лизоцимом, цитокинами. Эта связь отражает состояние врождённого иммунитета и свидетельствует о взаимозависимости микрофлоры и мукозального иммунитета при формировании ими колонизационной резистентности слизистых оболочек дыхательного тракта при бронхитах у детей.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Метельская В.А., Алешкин В.А., Воропаева Е.А., Афанасьев С.С., Феклисова Л.В., Савицкая Н.М., Целипанова Е.Е., Гречишникова О.Г., Егорова Е.А.- Этиология острых и рецидивирующих респираторных заболеваний инфекционного генеза у детей // Современные технологии в диагностике, лечении и профилактике инфекционных болезней у детей. Материалы научно-практической конференции, посвященной 50-летию детского инфекционного отделения МОНИКИ.-2008.- M.- С.231.

2. Метельская В.А., Алешкин В.А., Зверев В.В., Гречишникова О.Г., Воропаева Е.А., Афанасьев С.С., Несвижский Ю.В., Афанасьев М.С., Байракова А.Л., Егорова Е.А. Современные методы лабораторной диагностики хламидиозов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2008. - № 4. — С.111-117.

3. Метельская В.А., Алешкин В.А., Воропаева Е.А., Афанасьев С.С., Гречишникова О.Г., Слободенюк В.В., Байракова А.Л., Егорова Е.А.- Изучение этиологии бронхоле-гочной патологии у детей // XVI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». Сборник материалов конгресса, тезисы докладов.-2009.- М,- С. 176-177.

21

4. Метельская В.А., Алешкин В.А., Воропаева Е.А., Афанасьев С.С., Гречишникова О.Г., Байракова A.JI., Егорова Е.А., Урбан Ю.Н., Слободенюк В.В.- Дисбиотические нарушения микробиоценоза ротоглотки у детей с бронхолегочной патологией // Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения. Материалы юбилейной Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 90-летию Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора и 20-летию Приволжского окружного центра по профилактике и борьбе со СПИД,- 2009,-Нижний Новгород.- С. 215-218.

5. Метельская В.А., Алёшкин В.А., Воропаева Е.А., Афанасьев С.С., Гречишникова О.Г., Байракова A.JI., Егорова Е.А., Урбан Ю.Н., Слободенюк В.В.- Иммунофермент-ный анализ в диагностике бронхолегочных заболеваний у детей в острой стадии // Актуальные вопросы инфекционной патологии. Сборник докладов Юбилейной научно-практической конференции, посвященной 100-летию Ростовского научно-исследовательского института микробиологии и паразитологии.-2009.- Ростов-на-Дону,- С. 276-277.

6. Метельская В.А., Алёшкин В.А., Воропаева Е.А., Афанасьев С.С., Гречишникова О.Г., Байракова A.JI., Егорова Е.А., Урбан Ю.Н., Слободенюк В.В.- Колонизационная резистентность слизистой задней стенки глотки у детей в норме и при бронхитах и пневмониях // Актуальные вопросы диагностики, лечения и реабилитации больных. Сборник материалов XIV научно-практической конференции ГОУ ДПО «Пензенский институт усовершенствования врачей» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.-2009.- Пенза.- С. 191-194.

7. Метельская В.А., Алёшкин В.А., Воропаева Е.А., Караулов A.B., Несвижский Ю.В., Афанасьев С.С., Матвеевская Н.С., Панурина P.JI., Бичучер A.M., Гречишникова О.Г., Байракова АЛ., Урбан Ю.Н., Алёшкин A.B., Слободенюк В.В., Егорова Е.А.-Колонизационная резистентность и иммунологическая реактивность слизистых ротоглотки у детей в норме и при бронхолёгочных заболеваниях //Вестник Российской академии медицинских наук.-2010.-№ 7.-С. 10-15.

8. Караулов A.B., Метельская В.А., Алёшкин В.А., Воропаева Е.А., Афанасьев С.С., Гречишникова О.Г., Несвижский Ю.В.,. Кокушков Д.В., Алёшкин A.B., Егорова Е.А., Урбан Ю.Н., Слободенюк В.В., Байракова АЛ.-Адгезия клетками назофаригеального и буккального эпителия индигенных и условно-патогенных микроорганизмов как показатель резистентности респираторного тракта детей с бронхитами и пневмониями // Иммунопатология, Аллергология, Инфектология. -2010.-№3.-С. 37-46.

9. Метельская В.А., Алёшкин В.А., Воропаева Е.А., Афанасьев С.С., Гречишникова О.Г., Егорова Е.А., Урбан Ю.Н.-Первичное инфицирование детей вирусными и внутриклеточными агентами. Роль в развитии бронхолегочных заболеваний в детском возрасте // Тезисы докладов XVII Российского национального конгресса «Человек и лекарство».-2010.-М.- С.434.

10. Карпова Е.П., Захарова И.Н., Солдатский Ю.Л., Афанасьев С.С., Тулупов Д.А., Воропаева Е.А., Вагина Е.А., Метельская В.А.-Роль инфекции в развитии патологии верхнего отдела дыхательных путей у детей. Пособие для врачей.- 2010.-М.- 218 с.

11. Топтыгина А.П., Метельская В.А., Воропаева Е.А., Алёшкин В.А., Караулов

A.B., Афанасьев С.С.-Изменения в цитокнновом профиле сыворотки крови и слюны детей при остром и хроническом бронхите // Российский иммунологический журнал.-2011.-Том 5(14), № 2.-С. 145-149.

12. Метельская В.А., Алёшкин В.А., Афанасьев С.С., Слободенкж В.В., Воропаева Е.А., Гречишникова О.Г., Егорова Е.А., Байракова А.Л.- Экспрессия генов TLR-2, TLR-4, TLR-3 и TLR-8 при бронхитах у детей // XVIII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». Сборник материалов конгресса, тезисы докладов.-2011.-М,-С.212.

13. Зверев В.В., Несвижский Ю.В., Воропаева Е.А., Афанасьев С.С., Алёшкин В.А., Караулов A.B., Галимзянов Х.М., Макаров О.В., Богданова Е.А., Рубальский О.В., Афанасьев М.С., Матвеевская Н.С., Афанасьев Д.С., Савченко Т.Н., Метельская

B.А., Рубальская Е.Е., Рубальский Е.О.-Микроэкология и гуморальный иммунитет слизистых открытых полостей человека в норме и при патологических состояниях. Учебное пособие для системы послевузовского профессионального образования вра-чей.-2011.-Астрахань-М.- 80 с.

14. Караулов A.B., Алёшкин В.А., Воропаева Е.А., Метельская В.А., Слободенюк В.В., Афанасьев М.С., Затевалов А.М., Топтыгина А.П., Афанасьев С.С., Несвижский Ю.В., Урбан Ю.Н., Рубальский Е.О., Матвеевская Н.С. - Показатели колонизационной резистентности слизистых ротоглотки как объективные критерии мукозалыюго иммунитета при бронхитах у детей // Иммунология (двухмесячный научно-практический журнал).-2012,- том 33, №5.- С.255 - 259.

Список сокращений

БЭ буккальный (щечный) эпителий

ГИСК Государственный институт стандартизации и контроля ГМ-КСФ гранулоцитарно,- макрофагальный колониестимулирующий фактор ДГКБ детская городская клиническая больница ЗСГ задняя стенка глотки

ИЕКБЭ индекс естественной колонизации буккального эпителия ИЕКНЭ индекс естественной колонизации назофарингеального эпителия ИИКБЭ индекс искусственной колонизации буккального эпителия ИИКНЭ индекс искусственной колонизации назофарингеального эпителия ИЛ интерлейкин

ИНФ-у интерферон гамма

Кеб коэффициент сбалансированности факторов местного иммунитета полости

рта

НЭ назофарингеальный эпителий

ОМЧ общее микробное число

ОРВИ острые респираторные вирусные инфекции

ПЦР полимеразная цепная реакция

PCB респираторно-синцитиальный вирус

УПМ условно-патогенная микрофлора

ФНО-а фактор некроза опухолей альфа

GAPDH глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа

IgA иммуноглобулин А

IgM иммуноглобулин М

IgG иммуноглобулин G

IgE иммуноглобулин Е

sc свободный секреторный компонент

slgA секреторный иммуноглобулин А

TLR То11-подобный рецептор

Подписано в печать: 10.04.2013 Тираж: 100экз.3аказ№9563 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинградский проспект д.74 (495)790-47-77 www.reglet.ru