Автореферат и диссертация по медицине (14.01.04) на тему:Возможности пробиотической терапии внебольничных пневмоний

На правах рукописи

Донец Владимир Николаевич

ВОЗМОЖНОСТИ ПРОБИОТИЧЕСКОИ ТЕРАПИИ ВНЕБОЛЬНИЧНЫХ ПНЕВМОНИЙ (КЛИНИКО-ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.01.04 — внутренние болезни 03.02.03 — микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

г * ПАР 2015

Санкт-Петербург — 2015

005561085

005561085

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители:

доктор медицинских наук профессор Симаненков Владимир Ильич

доктор медицинских наук профессор Суворов Александр Николаевич

Официальные оппоненты:

Казанцев Виктор Александрович - доктор медицинских наук профессор, федеральное государственное бюджетное военное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации, 1-я кафедра (терапии усовершенствования врачей), профессор

Сидоренко Сергей Владимирович - доктор медицинских наук профессор, федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт детских инфекций Федерального медико-биологического агентства», отдел молекулярной микробиологии и эпидемиологии, руководитель

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится « си2015 года в 73 с';часов на заседании диссертационного совета Д' 208.086.04 при государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (191015, Санкт-Петербург, ул. Кирочная, д. 41).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «СевероЗападный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (195067, Санкт-Петербург, Пискаревский пр., д. 47) и на сайте www.szgmu.ru Автореферат разослан « /"(/» ^¿УуУлл*^_2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета ,2/ /

доктор медицинских наук доцент Н.В. Захарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

Несмотря на успехи в лечении внебольничных пневмоний (ВП), их исходы остаются неудовлетворительными. В настоящее время в РФ пневмонии занимают 6-е место в структуре причин смерти, а среди инфекционных болезней - 1-е место (Чучалин А.Г., 2010; Хамитов Р.Ф., 2011). По данным ВОЗ, в 2012 году инфекции нижних дыхательных путей в мире делили 3-4 место с ХОБЛ по уровню летальности. Интенсификация антибактериальной терапии не привела к кардинальным изменениям в течении ВП. В последние десятилетия описывается значительное число нежелательных явлений, связанных с проведением массивной антибактериальной терапии (Вовк Е.И., 2008; Чучалин А.Г., 2010).

В генезе ВП существенную роль играет состояние иммунной системы. Однако использование средств, стимулирующих иммунную реактивность, не приводит к изменению течения ВП. В ряде зарубежных литературных источников выдвинута гипотеза о существовании оси кишечник-легкие «gut-lung axis», но описана она только в экспериментах на животных (Chen L-W., 2011; Wiersinga J., 2014). В связи с этим перспективным является включение в комплексное лечение ВП пробиотической терапии.

В доступной литературе имеются лишь единичные работы, посвященные изучению возможностей пробиотической терапии при ВП (Крюков А.Е., 2006; Симаненков В.И., 2010). Аутопробиотическая терапия у пациентов с ВП до настоящего времени не проводилась.

Степень разработанности темы исследования

В настоящее время возможность использования пробиотиков в комплексной терапии внебольничных пневмоний недостаточна изучена. В доступной литературе есть лишь отдельные статьи по использованию пробиотиков при ВП, но они не показали достоверно более высокой эффективности по сравнению с антибиотиками, в частности, использование Линекса не повлияло на течение пневмонии. Согласно гипотезе «gut-lung axis» существует стимулирующее влияние кишечной микробиоты на фагоцитарную активность альвеолярных

макрофагов (Бгс М.А., 2014). Это влияние снижается в случае подавления микробиоты, например, в случае антибиотикотерапии.

Все вышеперечисленное доказывает необходимость проведения дальнейших исследований в этой области. Перспективным является использование аутопробиотиков, которые имеют целый ряд преимуществ над коммерческими пробиотиками.

Цель исследования

Оценить влияние различных вариантов пробиотической терапии на течение и исходы внебольничных пневмоний.

Задачи исследования

Для реализации поставленной цели были сформулированы следующие задачи, которые можно разбить на два блока:

Решение первых трех задач было направлено на разработку оригинальных методик аутопробиотической терапии.

1. Оценить в экспериментах на животных влияние пробиотика на функциональные характеристики слизистой оболочки кишки.

2. Разработать технологию выделения «чистой» культуры аутолактобацилл и приготовления закваски на ее основе.

3. Осуществить сравнительное исследование у добровольцев безопасности и переносимости аутопробиотиков содержащих энтерококки и лактобациллы.

В ходе решения следующих трех задач проводилось непосредственное изучение влияния пробиотической терапии на течение внебольничных пневмоний.

4. Оценить состояние микробиоты кишечника у больных с внебольничными пневмониями.

5. Изучить влияние пробиотической терапии на состояние микробиоты кишечника у больных с внебольничными пневмониями.

6. Сопоставить результаты лечения внебольничных пневмоний в условиях стандартной терапии и при включении в комплексное лечение аутопробиотика и коммерческого пробиотика.

Научная новизна исследования

Впервые в данной работе в исследовании на добровольцах был апробирован оригинальный аутопробиотик на основе лактобацилл.

Впервые проведена оценка влияния аутопробиотика на основе энтерококков на течение внебольничных пневмоний, на состояние микробиоценоза кишечника у пациентов с внебольничными пневмониями.

Впервые показано, что включение аутопробиотика в стандартные схемы лечения ВП позволяет ускорить процесс разрешения внебольничных пневмоний.

Теоретическая и практическая значимость работы

Учитывая высокую заболеваемость ВП, а также высокую смертность от пневмоний необходим поиск новых подходов к терапии, которые не должны ограничиваться только антибактериальной терапией. Антибактериальная терапия проводится в основном эмпирически, что часто приводит к необходимости смены антибиотиков и связанным с этим увеличением длительности их использования. Последнее обстоятельство ведет к дальнейшему увеличению антибиотикорезистентности, которая в данный момент находится на высоком уровне. Необходимо учитывать крайне негативное влияние антибиотиков, особенно при пероральном приеме, на кишечную микробиоту. Все вышеперечисленное позволяет говорить о значимости использования различных вариантов пробиотиков в комплексной терапии внебольничных пневмоний.

С практической точки зрения в результате исследования разработана оригинальная технология получения аутопробиотика на основе лактобацилл. Впервые в схему лечения внеболышчпой пневмонии была включена персонифицированная симбионтной терапия на примере аутопробиотика на основе Е./аесшт. Установлена возможность увеличения количества пациентов, достигших полного регресса инфильтративных изменений в легких, и положительного влияния на клиническое течение у больных с внебольничной пневмонией при использовании аутоэнтерококков.

Поскольку технология выделения чистой культуры лактобацилл требует значительного времени, аутопробиотик на основе этих бактерий можно в

дальнейшем использовать в терапии хронических заболеваний, сопровождающихся дисбиотическими расстройствами.

Методология и методы исследования

Как будет подробно описано ниже, диссертационное исследование являлось клинико-экспериментапьным и состояло из трех этапов.

В ходе первого этапа проводилось изучение влияния пробиотиков на основе Enterococcus faecium на активность пищеварительных ферментов у крыс - самцов Вистар, которые были разделены на три равные группы. Срок эксперимента составил 9 дней (3 дня антибиотики per os, а с 3 и по 9 день перорально крысам вводилась либо молочнокислая закваска, содержащая Е. faecium L-5, либо молоко). Животные контрольной группы ежедневно в течение первых трех дней получали дистиллированную воду в объеме 500 мкл, а затем в течение 6 дней— молоко в том же объеме, что и для первых двух групп крыс.

В ходе всего эксперимента наблюдали за физической активностью, массой тела животных, количеством съеденной пищи и характером стула.

В последний день этой серии опытов, у животных отбирали пробы химуса, слизи и эпителия, для оценки активности фермента мальтазы (НФ 3.2.1.20) и морфологических изменениях слизистой оболочки, о которых судили по изменению массы эпителия слизистой оболочки в пробах, полученных из равных по длине (5 см) отрезков кишки. Определение активности мальтазы осуществляли в соответствии с методикой, описанной в работах В.В. Егоровой и соавторов.

На втором этапе исследования осуществлялось сравнительное исследование двух аутопробиотиков (на основе E.faecium и лактобацилл) на здоровых добровольцах.

Для всех добровольцев являлось обязательным ознакомление и подписание информированного согласия. Здоровые добровольцы путем рандомизации были разделены на две группы в соотношении 1:1. Первая группа добровольцев получала пробиотик на основе E.faecium, а вторая - аутоштаммы лактобацилл.

Исследуемая закваска принималась в 2 приема по 100 мл молочнокислой закваски, содержащей по 108 собственных энтерококков и лактобацилл соответственно в течение 10 дней.

Перед исследованием и непосредственно после его завершения проводился физикальный осмотр волонтеров. В ходе исследования, добровольцы вели дневник, где ежедневно фиксировали такие параметры, как жалобы, общее самочувствие, характер стула и вес тела. Кроме того, проводилось оценка параметров биохимического анализа крови, а также в динамике изучалась микробиота кишечника.

Во время третьего этапа осуществлялось динамическое наблюдение за пациентами с внебольничной пневмонией, которые кроме стандартной антибиотикотерапии получали либо аутопробиотик, либо коммерческий пробиотик на основе Е./аесшт Ь-З. Третья группа получала базовую среду. Больные включались в исследование только после оценки критериев включения и исключения. Перед началом любых процедур все пациенты обязательно подписывали форму информированного согласия, одобренного в локальном этическом комитете ГБОУ ВПО «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова» Минздрава РФ. Путем рандомизации пациенты были поделены на 3 равные группы. В связи с тем, что набор клинического материала осуществлялся с 2007 г. по 2010 г., диагноз ВП устанавливался в соответствии с Национальными практическими рекомендациями по диагностике, лечению и профилактике внебольничных пневмоний у взрослых 2006 года Российского респираторного общества.

Для лечения пациентов исследуемых групп использовались стандартные схемы и режимы антибиотикотерапии.

Исследуемый препарат включался в схему лечения внебольничной пневмонии на 7-8 дни после начала лечения. Данный временной интервал необходим для полного цикла приготовления молочнокислой закваски.

Больные получали молочнокислую закваску (содержащую собственные энтерококки или Е. /аесшт Ь-З) или базовую среду (молоко после

автоклавирования) по 50 мл 2 раза в день в течение 10 дней. Пациентам не было известно, какой препарат они получают.

В течение исследования кроме стандартной истории болезни заполнялись карты пациентов, где отмечались жалобы, самочувствие пациентов, фиксировалась температура тела, частота дыхания и вес, проводилась оценка характера стула по Бристольской шкале. В начале и в конце исследования проводился подробный осмотр пациентов и оценивался клинический анализ крови в динамике, а также бактериология кишечной микробиоты.

Учитывая особенности культуральных свойств E.faecium и E.faecalis, с помощью селективных сред проводили ориентировочную идентификацию энтерококков до вида. Более точную идентификацию чистой культуры и исследование на наличие факторов патогениости осуществляли методом ПЦР.

Всем пациентам, участвовавшим в настоящем исследовании, при поступлении в стационар проводилось рентгенологическое исследование легких. Повторная рентгенография проводилась через 7-8 дней после первичной, а при частичном регрессе инфильтративных изменений - еще через 7-9 дней после повторного обследования.

Полученные данные статистически обрабатывались при помощи программы Statistica 5.5. В диссертационном исследовании достоверность и ошибка среднего рассчитывались с помощью t-критерия Стыодента. В тех случаях, когда распределение отличалось от нормального, использовались методы непараметрической статистики (тест Mann-Uitney для несвязанных и Wilcoxon для связанных выборок). Достоверными считались различия, при которых коэффициент доверительной вероятности (р) был ниже 0,05. Для установления различий между группами наблюдения использовали критерий хи-квадрат.

Положения, выносимые на защиту

1. У практически здоровых лиц аутопробиотики, содержащие энтерококки и лактобациллы, достоверно не меняют состояние изучавшихся компонентов микробиоты кишки.

2. В комплексной терапии внебольничной пневмонии более целесообразно использовать аутопробиотик на основе энтерококков, чем коммерческие пробиотики.

3. Применение аутопробиотика на основе энтерококков увеличивает количество пациентов, достигших полного регресса инфильтративных изменений в легких при контрольном рентгенологическом исследовании.

Степень достоверности н апробации результатов

Достоверность опубликованных результатов, подтверждается точностью регистрации первичной документации, адекватной статистической обработкой полученных данных.

Результаты диссертации доложены на «Гастро-2009»; на Международном конгрессе по экологической микробиологии (Санкт-Петербург, 2009); на V международном конгрессе Психосоматическая медицина-2010 (Санкт-Петербург, 2010); на Международной конференции по пробиотикам АРС (Словакия, 2010).

Результаты работы внедрены в клиническую практику СПбГБУЗ «Городская больница №26».

Материалы диссертации используются в учебном процессе на кафедре терапии и клинической фармакологии ГБОУ ВПО «СЗГМУ им. И.И. Мечникова» Минздрава РФ.

По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, а также патент (№ 2460778 РФ, МПК C12N 1/20 А61К 35/74 А23С 9/127 «Способ получения аутопробиотика на основе Enterococcus faecium, представителя индигенной микрофлоры кишечника хозяина»).

Личное участие автора в получении результатов

Личное участие автора заключалось в выполнении экспериментальной части исследования, выделении чистой культуры энтерококков и получении молочнокислой закваски, выполнении отбора добровольцев и больных с ВП, проведении обследования и лечебных мероприятий пациентов, опроса больных, а также проведении статистической обработки и анализе полученных данных.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 156 листах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав (обзора научной литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждение), а также выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 105 отечественных и 136 зарубежных источников. Работа содержит 24 таблицы и 40 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Первый этап исследования (экспериментальный)

Эксперимент по изучению влияния пробиотиков на морфо-функциональные характеристики кишки проводили на 36 половозрелых белых лабораторных крысах-самцах линии Wistar. Содержание, питание, уход за животными и выведение их из эксперимента осуществляли в соответствии с правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных (Приложение к приказу МЗ СССР от 12.08.1977 № 755). Все животные содержались при сходных условиях в отношении температуры, влажности и освещения, а также рациона питания. Срок эксперимента составил 9 дней. Перед проведением эксперимента животные были разделены на три группы: А, Б и К (по 12 крыс в каждой группе). С целью индукции дисбиоза, животным групп А и Б ежедневно per os в течение трех дней вводили ампициллин и метронидазол в нетоксических дозах. Затем крысам группы А с третьего дня в течение 6 дней вводили 500 мкл молочнокислой закваски, содержащей 5,5x108 КОЕ /мл Е. faecium L-5. Крысам группы Б с 3-го по 9-й день ежедневно вводили молоко в объеме 500 мкл. Животные группы К ежедневно в течение первых трех дней получали дистиллированную воду в объеме 500 мкл, а затем в течение 6 дней — молоко в том же объеме.

Программа обследования животных включала следующие разделы: лабораторный, морфологический и статистическая обработка данных.

У крыс в последний день эксперимента отбирали пробы химуса, слизи и эпителия из двенадцатиперстной, тощей, подвздошной и толстой кишок для оценки активности фермента мальтазы и морфологических изменениях слизистой оболочки, о которых судили по изменению массы эпителия слизистой оболочки в пробах, полученных из равных по длине (5 см) отрезков кишки. Определение активности мальтазы осуществляли в соответствии с методикой, описанной В.В. Егоровой и соавторами.

Второй этап исследования (исследование на добровольцах)

После экспериментального этапа было проведено сравнительное исследование на переносимость и безопасность аутопробиотиков на основе собственных Е./аесшт и собственных лактобацилл. В исследование включено 14 практически здоровых добровольцев, которые путем рандомизации разделены на две группы по 7 человек с обязательной процедурой подписания информированного согласия. Первая группа получала пробиотик на основе собственных Е./аесшт, вторая — аутопробиотик на основе лактобацилл. Для приготовления закваски, содержащей аутопробиотические штаммы, использовали чистые культуры энтерококков и лактобацилл, выделенные из собственных фекалий каждого добровольца.

Длительность приема исследуемого препарата составляла 10 дней. Препарат принимался в 2 приема по 100 мл молочнокислой закваски, содержащей по 108 КОЕ/мл собственных энтерококков и лактобацилл.

Для оценки динамики клинических проявлений в течение исследования добровольцы вели дневник, в котором отмечали жалобы, самочувствие, характер стула по Бристольской шкале, вес тела ежедневно. Перед исследованием и непосредственно после проводился физикальный осмотр волонтеров.

Кроме того, оценивались биохимические показатели крови на основные показатели и электролиты, бактериологическое исследование микробиоты кишечника.

Третий этап исследования (клинический раздел исследования)

В ходе этого этапа скринировано 82 пациента с внебольничными пневмониями. Из общего количества скринированных больных после оценки критериев включения/исключения было рандомизировано 60 пациентов с ВП (23 женщины и 37 мужчин), средний возраст составил 37,8 лет. В связи с тем, что набор клинического материала осуществлялся с 2007 г. по 2010 г., диагноз ВП устанавливался согласно Национальным практическим рекомендациям 2006 г. по диагностике, лечению и профилактике внеболышчных пневмоний у взрослых Российского респираторного общества.

Обследование и лечение пациентов проводилось в условиях стационара на базе терапевтических отделений СПбГБУЗ «Городская больница № 26». Перед началом любых процедур все пациенты обязательно подписывали форму информированного согласия, одобренного в локальном этическом комитете ГБОУ ВПО СЗГМУ им. И.И. Мечникова.

Путем рандомизации пациенты были разделены на 3 группы по 20 человек. Пациенты первой группы, начиная с 7-го дня, в комплексной терапии включали молочнокислую закваску, содержащую 108 КОЕ /мл собственных энтерококков в 1 мл закваски. Во второй группе больные терапию молочнокислой закваской, содержащей Е. faecium L-3 в титре 108 КОЕ/мл в 1 мл закваски в том же режиме. Третья группа (контрольная) из 20 человек с установленным диагнозом ВП — получала терапию базовой средой по схеме такой же, как и в первых двух группах. Режим приема молочнокислой закваски во всех группах наблюдения - по 50 мл 2 раза в день в течение 10 дней. Пациентам не было известно, какой препарат они получают.

Для лечения пациентов исследуемых групп использовались стандартные схемы и режимы антибиотикотерапии. Большинство пациентов получали комбинации макролидов /цефалоспоринов II-III генераций и макролидов/пенициллинов.

Программа обследования всех больных с ВП включала клинико-лабораторный, инструментальный, бактериологический, молекулярно-генетический разделы и статистическую обработку полученных данных.

Клинико-лабораторпый раздел

Заполнялась карта пациента, где путем баллирования отмечалась выраженность жалоб, оценивалось самочувствие пациентов, фиксировалась температура тела, частота дыхания, проводилась оценка характера стула по Бристольской шкале. В начале и в конце исследования проводился детальный физикальный осмотр пациентов. В динамике оценивался клинический анализ крови.

Инструментальный раздел

Всем пациентам при поступлении проводилось рентгенологическое исследование легких в виде обзорной рентгенографии органов грудной полости в передней прямой и боковой проекциях. Повторная рентгенография проводилась у всех пациентов через 7-8 дней после первичной. При частичном регрессе инфильтративных изменений рентгенография выполнялась и третий раз, как в стационаре, так и амбулаторно, через 7-9 дней после повторной.

Бактериологический раздел

Бактериологическое исследование кала проводилось дважды: до включения в исследование и непосредственно после 10 дней приема пробиотической терапии или контроля. Микробиологическое исследование проводили в соответствии с Отраслевым стандартом 2003 г. Кроме того, осуществлялось бактериологическое исследование мокроты при поступлении пациентов в стационар.

Молекулярно-генетический раздел

Метод заключался в уточнении видовой принадлежности полученных штаммов энтерококков и исследовании их на отсутствие факторов патогенности при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Статистическая обработка полученных данных

Статистическая обработка данных проводилась с помощью программы «Статистика» версия 5.5. Достоверность и ошибка среднего рассчитывались с помощью критерия Стыодента. При распределение, которые были отличными от нормального, использовались методы непараметрической статистики. Достоверными считались различия при коэффициенте доверительной вероятности

< 0.05 (р<0,05). Для выявления различий между группами наблюдения использовали критерий хи-квадрат.

Результаты исследования и их обсуждение

Экспериментальный раздел

В ходе экспериментального этапа исследования показано, что в конце периода наблюдения у крыс масса слизистой оболочки толстой кишки в группах крыс, получавших сначала антибактериальные препараты, а затем, соответственно, молочнокислую закваску или молоко, были выше, чем в контрольной группе. В то же время, снижалась масса слизистой оболочки в верхних отделах тонкой кишки, что могло явиться результатом действия пробиотических энтерококков при их введении per os.

В конце периода наблюдения в группе Б активность мальтазы в эпителии достоверно не отличается от группы контроля во всех отделах кишечника. Однако в группе А активность мальтазы в эпителии двенадцатиперстной кишки, а также в верхнем отделе тощей кишки снижена примерно на 65-70% по сравнению с группами Б и К (рисунок 1).

В отличие от группы А, у животных групп Б и К в тощей кишке мальтаза сконцентрирована в основном на поверхности слизистой. Можно предположить также, что у крыс группы А в верхних отделах кишечника существенный вклад в расщепление углеводов вносит микробиота, продукты метаболизма которой оказывают репрессирующее влияние на массу слизистой оболочки и активность мембранных карбогидраз энтероцитов.

I <

£а

Р

12-перст>ная кишка

■

Ш

Р

I

Верхний отдел тощей кишки

Нижний отдел тощей кишки

■ А □ Б ПК

Подвздошная кишка

Толстая *

Рис. I. Активность мальтазы в эпителии слизистой оболочки различных отделов кишечника у крыс групп А, Б и К

Таким образом, полученные результаты могут свидетельствовать о том, что применение пробиотика на основе Е./аесшт у крыс с индуцированным дисбиозом способствует снижению массы слизистой оболочки в верхних отделах кишки. Кроме того, под влиянием пробиотика у крыс с дисбиозом происходит снижение активности сахаролитического фермента мальтазы в верхних отделах тонкой кишки и перераспределение его активности от эпителия в сторону химуса (содержит слущенный эпителий и микробиоту), где уровень ее повышается. Полученные результаты можно объяснить тем, что в условиях пробиотической терапии, последние берут на себя дополнительную функцию внутриполостного пищеварения, в связи с чем, адаптивно снижается нагрузка на ферментативную систему кишки.

Исследование на добровольцах

По результатам этого исследования планировалось осуществить выбор аутопробиотика, применимого для использования в комплексном лечении ВП.

При сравнительном динамическом изучении двух аутопробиотиков было установлено, что по клиническим параметрам в обеих группах достоверных различий не получено. При анализе биохимических параметров достоверных различий, как в динамике, так и между группами получено не было.

В результате исследования микробного пейзажа значимых отличий в динамике по всем параметрам в группах наблюдения не получено. При сравнении результатов между группами значимых отличий при использовании двух аутонробиотиков получено не было за исключением изменения в количестве Proteus spp. и грибов рода Candida в группе пациентов, получавших аутолактобациллы, но, при этом, изменения были в пределах диапазона нормы (не >104 в обоих случаях) (рисунок 2).

Рис. 2. Сравнительная характеристика данных микробиологического исследования у добровольцев в группах энтерококков и лактобацилл (после приема аутопробиотика)

Исследование на практически здоровых добровольцах показало хорошую переносимость двух аутопробиотиков, их безопасность для испытуемых, что позволяет использовать оба аутопробиотика в дальнейших клинических исследованиях на пациентах. Для дальнейшего использования в качестве аутопробиотика с лечебной целью была выбрана закваска на основе Е./аесшт. Это связано с более коротким сроком выделения и культивирования энтерококков (7 дней), а также, более высоким процентом высевания энтерококков (для лактобацилл он не превышал 60%). Срок высевания лактобацилл составлял 14-30

дней. Это не позволило использовать эти бактерии для лечения острой патологии, в частности, ВП.

Клинический раздел

По всем показателям группы были сравнимы, достоверных различий между ними не выявлено. Соотношение мужчин и женщин составило 1,6:1. Среди исследованных пациентов преобладали люди до 40 лет - 65,5%, в возрасте от 40 до 59 лет - 23%, а в возрасте старше 60 лет - 11,5%. Длительность госпитализации составляла от 6 до 27 дней, в среднем 11,7 койко-дней. Достоверной разницы между группами по длительности госпитализации не выявлено.

По локализации инфильтративных изменений в легких преобладали поражения нижней доли правого легкого - 40%, нижней доле левого легкого - 22 % и в 10% случаев в процесс вовлекались средняя доля правого легкого и оба легких. По течению пневмонии группы не имели достоверных отличий. В 90-95 % случаев пневмония характеризовалась нетяжелым течением, а у оставшихся 510% больных - тяжелым течением. Высеять микробиоту из мокроты удалось лишь у 17% обследованных больных. Преобладала смешанная флора в различных сочетаниях.

После приема аутопробиотика у больных достоверно уменьшились кашель и проявления астенического синдрома. В группе пациентов, получавших E.faecium L-3, после его приема достоверно уменьшились кашель и проявления астенического синдрома. В контрольной группе при контрольном осмотре значимо уменьшился только кашель.

Достоверную положительную динамику почти по всем клиническим параметрам в группах наблюдения можно объяснить эффектами антибактериальной терапии. Тем не менее, определенный вклад, вероятно, вносит аутопробиотик, поскольку при сравнительном анализе между группами аутопробиотика и контроля, выявлены достоверные изменения по таким параметрам, как кашель (М±гп 0,1+0,1 и 0,5±0,1 соответственно; р=0,03), астенический синдром (М±ш 0,2±0,1 и 0,6±0,1 соответственно; р=0,03) и аппетит (M±m 1,9+0,1 и 1,5+0,1 соответственно; р=0,04). При сравнительном анализе

других групп пациентов, достоверных отличий по клиническим показателям не выявлено (рисунок 3).

□ аутопробиотак ■ E.faecium L3 ы контрольная группа

4 1

-Е И I

1

* г _

* 1 л.

It!

Рис. 3. Сравнительная характеристика клинических симптомов у пациентов после лечения аутопробиотиком, E.faecium L-3 и базовой средой

Примечание: * - р<0,05

При сравнении параметров клинического анализа крови после пробиотической терапии характерно достоверно более высокий уровень лимфоцитов у пациентов, получавших аутопробиотик по сравнению с контролем. По остальным параметрам достоверных различий между группами нет. Уровень лимфоцитов, при этом, не выходил за пределы нормативов, принятых в стационаре. Более высокий уровень лимфоцитов в группе аутопробиотика после терапии может быть связан с существованием оси кишечник-легкие («gut-lungs axis»).

Во всех группах при контрольной рентгенографии удалось добиться увеличения количества пациента с полным регрессом инфильтративных изменений в легких, но достоверное снижение отмечалась только в группе аутопробиотика (р<0,05).

В Аутопробиотик ■ E.faecium L3 □ Контрольная группа

До пробиотической терапии После пробиотической терапии

Рис. 4. Сравнительная характеристика регресса инфильтративных изменений в легких по группам наблюдения

Примечание: * - р<0,01 между у группами пациентов, получавших аутопробиотик и базовую среду; ** - р<0,01 между у группами пациентов, получавших аутопробиотик и E.faecium L-3; *** - р 0,0-1 между у группами пациентов, получавших контроль и E.faecium L-3

При сравнительном анализе установлена достоверная разница в количестве пациентов, достигших полного регресса инфильтративных изменений в группе, получавших аутопробиотик, по сравнению с группой E.faecium L-3 и контролем при контрольной рентгенографии легких (р<0,01). Количество пациентов, достигших полного регресса инфильтративных изменений, достоверно выше у пациентов, получавших базовую среду по сравнению с пациентами, получавшими E.faecium L-3 (р=0,04) (рисунок 4).

Анализ кишечной микробиоты был проведен, как в динамике в группах наблюдения, так и при сравнении между группами. Производилась оценка по степени дисбиоза и по отдельным представителям микробиоты. При исследовании кишечной микробиоты, исходно у всех пациентов, выявлены дисбиотические изменения.

Нами было выявлено, что в группе контроля достоверных изменений по отдельным параметрам кишечной микробиоты не выявлено. По степеням дисбиоза в группе контроля наблюдается уменьшение дисбиотических проявлений с исчезновением пациентов с дисбиозом III ст.

У пациентов, получавших E.faecium L-3 отмечается положительная динамика по степеням дисбиоза, которая проявляется исчезновением пациентов с дисбиозом III ст. и появлением пациентов, у которых дисбиоз не выявлен. По отдельным микроорганизмам в группе пациентов, получавших E.faecium L-3, в динамике отмечается достоверное снижение только количества грибов рода Candida.

У пациентов после лечения аутопробиотиком определено достоверное снижение грибов рода Candida (р=0,03, и достоверное увеличение количества клебсиелл (р=0,04). При этом их количество не вышло за пределы допустимой нормы у взрослых. В группе аутопробиотика также есть позитивная динамика в виде уменьшения пациентов с дисбиозом II ст. Кроме того, на фоне аутопробиотика количество E.coli с нормальной ферментативной активностью стало нормальным и не отличалось от других групп

I □ аутолробиот*1к ■ E.faecium L3 н контрольная группа!

й IT TJ г_ т I

1 ь ч е. д-Ji, FF* . Ift . ^ . Jii . fffc 3 =

„ у// А/ у / ss

<У

Г <f У «f

/// <о~ J? J?

Рис. 5. Сравнительная характеристика количественного содержания изучавшихся компонентов кишечной микробиоты у пациентов после лечения аутопробиотиком, E.faecium L-3 и базовой средой (данные представлены в виде десятичных log)

При сравнительном анализе достоверных различий между группами наблюдения после лечения не выявлено, как по степеням дисбиоза, так и по отдельным изучавшимся компонентам микробиоты кишки (рисунок 5).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенное диссертационное исследование свидетельствует о рациональности включения в комплексное лечение внебольничных пневмоний пробиотической терапии. Исследование показало большую целесообразность включения аутопробиотика на базе энтерококков.

Включение в комплексную терапию аутопробиотика, содержащего энтерококки, безопасно и не вызывает нежелательных явлений. Использование аутопробиотика на основе энтерококков в комплексной терапии ВП повышает ее эффективность.

Обнаружено отсутствие жесткой корреляции между степенью влияния аутопробиотика на изучавшуюся симбионтную микробиоту кишки и рентгенологическими изменениями в легких.

ВЫВОДЫ

1. У практически здоровых людей применение в течение 10 дней аутопробиотиков на основе энтерококков и лактобацилл не меняет качественное и количественное состояние изучавшихся компонентов кишечной микробиоты, что может свидетельствовать об ее стабильности.

2. Клиническое изучение аутопробиотиков на основе энтерококков и лактобацилл у здоровых добровольцев продемонстрировало их безопасность и хорошую переносимость.

3. Сроки приготовления молочнокислой закваски, содержащей аутопробиотик, делают более оправданным использование при внебольничных пневмониях аутопробиотика на основе энтерококков.

4. Включение в комплексную терапию внебольничных пневмоний, требующих госпитализации, коммерческого пробиотика достоверно не увеличивает количество пациентов с полной редукцией инфильтративных изменений в легких по сравнению с контрольной группой пациентов.

5. Включение в комплексную терапию внебольничных пневмоний, требующих госпитализации, аутопробиотика на основе Е./аесшт позитивно влияет на клиническое течение пневмонии и увеличивает количество пациентов, которые при контрольной рентгенографии достигают полного регресса инфильтративных изменений в легких.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В комплексную терапию внебольничных пневмоний, требующих госпитализации, рекомендуется включить пробиотическую терапию.

2. При выборе пробиотической терапии более целесообразно использовать аутопробиотик на основе Е./аесшт.

ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ Перспективой дальнейшей разработки темы проведенной диссертационной работы является исследование на большем количестве пациентов с более длительным периодом последующего наблюдения и с оценкой более широкого спектра микроорганизмов. Кроме того, результаты исследования и предложенные гипотезы взаимосвязи кишечника и легких могут являться основой для проведения будущих научных работ по разработке новых подходов к комплексной терапии ВП путем воздействия на реактивность отдельных звеньев оси кишечник — легкие.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Борщёв, Ю.Ю. Влияние пробиотического штамма Еп1егососсиз £аесшт на пищеварительные ферменты кишечника в норме и при дисбиозе / Ю.Ю. Борщёв, В.Н. Донец, Е.И. Ермоленко, Н.М. Грефнер, Ю.В. Дмитриева, Л.В. Громова // Научные труды II Съезда физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека». - Кишинев, 2008. - С. 134.

2. Громова, Л.В. Действие пробиотических энтерококков на мембранное пищеварение у крыс / Л.В. Громова, В.Н. Донец, Ю.Ю. Борщёв, Н.М. Грефнер, Е.И. Ермоленко // Механизмы функционирования висцеральных систем: Сборник тезисов к VI Всероссийской конференции, посвященной 50-летию открытия А. М. Уголевым мембранного пищеварения. - СПб., 2008.-С. 55-56.

3. Донец, В.Н. Опыт использования пробиотиков при бронхо-легочной патологии / В. Н. Донец // Актуальные проблемы клинической медицины: Материалы конференции, посвященной 100-летию Колпинской Городской больницы №33. - СПб., 2008. - С. 24-26.

4. Донец, В.Н. Сравнительная характеристика просветной и пристеночной кишечной микрофлоры у лабораторных животных / В.Н. Донец, Ю.Ю. Ильясов // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины: Сборник тезисов к научно-практической конференции молодых ученых. - СПб., 2008. - С. 60-61.

5. Сундукова, З.Р. Опыт доклинического изучения аутопробиотиков / З.Р. Сундукова, В.Н. Донец // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины: Сборник тезисов к научно-практической конференции молодых ученых. — СПб., 2009. — С. 62-64.

6. Донец, В.Н. Воздействие аутопробиотиков на крыс в экспериментах при дисбиозе / В.Н. Донец, З.Р. Сундукова // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины: Сборник тезисов к научно-практической конференции молодых ученых. — СПб., 2009. - С. 28-30.

7. Симаненков, В.И. Сопоставление видовых и количественных характеристик полостной микрофлоры и пристеночной микрофлоры илеоцекальной зоны / В.И. Симаненков, А.Н. Суворов, З.Р. Сундукова, В.Н. Донец // Гастроэнтерология Юга России: Ежегодное научно-практическое издание. — Ростов-на-Дону, 2009. - С. 87-89.

8. Тарасова, Е.И. Влияние пробиотических энтерококков на иммунную систему крыс с экспериментальным дисбиозом кишечника / Е.И. Тарасова, Е.И. Ермоленко, В.Н. Допец, З.Р. Сундукова, А.Н. Суворов // 2-й Международный конгресс по пробиотикам Санкт Петербург - Пробиотики 2009, р. 140, М 39.

9. Донец, В.Н. Безопасность использования аутопробиотиков у добровольцев / В.Н. Донец, З.Р. Сундукова // 2-й Международный конгресс по пробиотикам Санкт Петербург - Пробиотики 2009, р. 46, М. 13.

10.Симаненков, В.И. Опыт экспериментального и доклинического изучения аутопробиотиков / В.И. Симаненков, В.Н. Донец, А.Н. Суворов, Е.И. Ермоленко, З.Р. Сундукова // Гастроэнтерология Юга России: Ежегодное научно-практическое издание. — Ростов-на-Дону, 2009. — С. 83-87.

11 .Борщев, Ю.Ю. Особенности действия пробиотических энтерококков и эшерихий на пищеварение в кишечнике крыс / Ю.Ю. Борщев, В.Н. Донец, Л.В. Громова, Е.И. Ермоленко, A.A. Груздков // 2-й Международный конгресс по пробиотикам Санкт Петербург - Пробиотики 2009, р. 17, М. 5.

12.Борщев, Ю.Ю. Изменение пищеварительной функции кишечника крыс под влиянием пробиотических энтерококков и эшерихий / Ю.Ю. Борщев, В.Н. Донец, Л.В. Громова, Е.И. Ермоленко, Н.М. Грефнер, A.A. Груздков // VII Всероссийская конференция с международным участием. Механизмы функционирования висцеральных систем. - СПб., 2009. - С. 71- 72.

13.Ермоленко, Е.И. Влияние пробиотических энтерококков на функциональные характеристики кишечника крыс при дисбиозе, индуцированном антибиотиками / Е.И. Ермоленко, В.Н. Донец, Ю.В. Дмитриева, Ю.Ю. Ильясов, Л.В. Громова // Вестник Санкт-Петербургского университета. - 2009. - Сер. 11. Медицина. - Вып. 1. -С. 157-167.

14.Сундукова, З.Р. Опыт клинического изучения аутопробиотиков / З.Р. Сундукова, В.Н. Донец, А.Н. Бочкарева // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины: Сборник тезисов к научно-практической конференции молодых ученых. - СПб., 2010. - С. 133-134.

15.Tarasova, Е. The influence of probiotic Enterococcus faecium strain L5 on the microbiota and cytokines expression in rats with dysbiosis induced by antibiotics / E. Tarasova, E. Yermolenko, V. Donets, Z. Sundukova, A. Bochkareva, I. Borschev, M. Suvorova, I. Ilyasov, V. Simanenkov, A. Suvorov // Beneficial Microbes. - 2010. - Vol. 1, № 3. - P. 265-270.

16.Соловьева, О.И. Динамика качества жизни больных с синдромом раздраженной кишки на фоне аутопробиотической терапии / О.И. Соловьева, В.И. Симаненков, З.Р. Сундукова, А.Н. Цапиева, В.Н. Донец, И.А. Шумихина // Профилактическая и клиническая медицина. - 2011. - Т. 39, № 2. - С. 288-290.

17.Соловьева, О.И. Возможности пробиотической терапии в гастроэнтерологии / О.И. Соловьева, В.И. Симаненков, А.Н. Суворов, В.Н. Донец, З.Р. Сундукова, И.А. Шумихина // Вестник Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования. -2011.-Т. 3, № 3. — С. 69-80.

18.Громова Л.В. Влияние пробиотических энтерококков на пищеварение у крыс при экспериментальном дисбиозе / Л.В. Громова, Е.И. Ермоленко, В.Н. Донец, Ю.Ю. Борщев, А.А. Груздков // Материалы 13-го Международного Славяно-Балтийского научного форума «Санкт-Петербург - Гастро - 2011». - Гастроэнтерология Санкт-Петербурга, 2011, № 2-3, М20 -М21.

19,Патент 2460778 РФ, МПК С^ 1/20 А61К 35/74 А23С 9/127. Способ получения аутопробиотика на основе Е^егососсиз Гаесшт, представителя индигснной микрофлоры кишечника хозяина / А.Н. Суворов, В.И. Симаиенков, З.Р. Сундукова, Е.И. Ермоленко, А.Н. Цапиева, В.Н. Донец, О.И. Соловьева. - № 2010154822/10; Заяв. 30.12.2010; Опубл. 10.09.2012, Бюл. N 25. - 11 с.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВАК

ВОЗ

ВП

ПЦР

ХОБЛ

GALT

высшая аттестационная комиссия всемирная ассоциация здравоохранения внебольничная пневмония полимеразная цепная реакция хроническая обструктивпая болезнь легких gut-associated lymphoid tissue - лимфоидная ткань, ассоциированная с кишечником

Подписано в печать 24.02.2015 Формат 60x90/16 Бумага офсетная. Усл. печ. л. 2,25 Тираж 100 экз. Заказ 86

Отпечатано в типографии «Адмирал» 199178, Санкт-Петербург, В.О., 7-я линия, д. 84 А