Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Возможности аутогемохимиотерапии в экспериментальной онкологии и изучение некоторых механизмов ее действия

На правах¡ф^шри

РГб од

" 0 5*ФЕВ*200А "

Солдаткина Наталья Васильевна

ВОЗМОЖНОСТИ АУТОГЕМОХИМИОТЕРАПИИ В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ОНКОЛОГИИ И ИЗУЧЕНИЕ НЕКОТОРЫХ МЕХАНИЗМОВ ЕЕ ДЕЙСТВИЯ

14.00.14 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Ростов-на-Дону 2000

Работа выполнена в Ростовском научно-исследовательском онкологическом институте МЗ РФ,! директор - академик РАМН, профессор Сидоренко Ю.С.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Бордюшков Ю.Н.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Гаркави Л.М.

доктор биологических наук, профессор ХоронькоВ.В.

Ведущая организация - Волгоградская медицинская академия

,со

Защита состоится «22» декабря 2000г. в часов на заседании

диссертационного совета Д 084.73.01 при Ростовском научно-исследовательском онкологическом институте МЗ РФ (344037, г. Ростов-на-Дону, 14 линия, 63)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ростовского научно-исследовательского онкологического института МЗ РФ.

Автореферат разослан ^ / .11. 2000 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор у' Неродо Г. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальпость темы псслеловаппя.

Несмотря на значительные успехи, достигнутые в области лекарственного лечения злокачественных опухолей, поиск путей повышения эффективности и снижения токсичности химиотерапии продолжает оставаться актуальным (Гершанович М.Л. и соавт., 1995; Чиссов В.И.. 1999). Расширение возможностей химиотерапии в последние годы происходит за счет совершенствования стандартных методик и создания принципиально новых по механизму действия противоопухолевых агентов (Поддубная И.В., 1998).

В Ростовском научно-исследовательском онкологическом институте разработан и с успехом применяется для лечения злокачественных новообразо-ванни различных локализации ряд оригинальных методик пслпхимистерапхп* с использованием естественных сред организма в качестве растворителя химиопрепаратов : аутолимфохимиотерапия, аутоплазмохимиотерапия, ауто-гемохимиотерапия, аутоэритротромболейкохимиотерапия. Эти методики отличаются высоким противоопухолевым эффектом и низким токсическим воздействием на организм (Сидоренко Ю.С. и соавт., 1982, 1987, 2000; Верховцева А.И. и соавт., 1992; Лазутин Ю.Н., 1996; Словеснова В.Г., 1996; Владимирова Л.Ю., 1999, 2000; Орловская Л.А, и соавт., 1999, 2000; Попова И.Л., 1999; Семилеткин О.М., 1999).

Метод аутогемохимиотерапии, предложенный академиком РАМН Ю.С. Сидоренко в 1982 году и основанный на введении химиопрепаратов на аутокрови больных, прочно вошел в клиническую практику и доказал свою состоятельность (Сидоренко Ю.С. и соавт., 1982, 1987, 1996, 2000; Долматова O.K., 1995; Назарова О.Э. и соавт, 1996; Малейко М.Л., 1998; Орловская Л.А. и соавт., 1999), но следует отметить, что его применение сопровождается неполным пониманием механизмов его действия.

Ю.С. Сидоренко (1987) была выдвинута гипотеза о механизме действия аутогемохимиотерапии, согласно которой при искусственном депонировании химиопрепаратов in vitro в крови, подобно естественному депонированию химиопрепаратов в лимфатической системе в условиях их эндолимфатического введения, формируются принципиально новые комплексы химиогтрепараг-белок, обладающие, с одной стороны, сильным действием на опухолевую ткань, а, с другой стороны, отличающиеся незначительным общетоксическим влиянием на ткани макроорганизма. Помимо этого, при аутогемохимиотерапии происходит воздействие химиопрепаратов и на клетки крови, которое, возможно, создаст экстремальное состояние для этих клеток и формирует гипотетический «сигнал тревога» для организма. Это подтверждается универсальной положительной реакцией макроорганизма, повышающей иммунобиологические возможности, на реинфузию малых объемов крови (150,0-200,0 мл), подвергнутых воздействию гамма-лучей, ультрафиолетового излучения или ультразвука (Артюхов В.Г, Винюков Т.В, 1980; Гршценко В.И. и соавт., 1980; Несис А. И., 1980).

Проведенные исследования показали, что в процессе инкубации химиопрепаратов с кровью происходит их связывание с ее компонентами. Так, доксорубицин преимущественно связывается с мембранами эритроцитов и альбумином плазмы, циклофосфан- преимущественно с мембранами эритроцитов (Владимирова Л.Ю,, 2000),

Несмотря на проведенные исследования по изучению механизма противоопухолевой эффективности аутогемохимиотерапии, вопрос далек от полного разрешения. Накопленный за годы исследований опыт применения этого метода лечения позволяет предположить многоуровневый противоопухолевый механизм- от клетки до целого организма (Малейко М.Л., 1998; Горло Е.И., 2000; ЗубковаТ.В., Тарнопольская О.В., 2000).

Можно предположить, что раскрытие механизмов действия аутогемохимиотерапии позволит не только обосновать саму методику химиотерапии, но и разработать как ее более эффективные модификации, так и новые методы химиотерапии.

Цель исследования.

Разработка экспериментальной модели аутогемохимиотерапии и изучение некоторых механизмов ее действия.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Определение штамма опухоли и конкретного противоопухолевого препарата, вызывающего регрессию опухоли в условиях аутогемохимиотерапии.

2. Определение компонентов крови, связывание с которыми химиопрепарата обеспечивает высокую эффективность аутогемохимиотерапии.

3. Определение компонентов крови, связывание с которыми химиопрепарата снижает токсичность аутогемохимиотерапии,

4. Изучение особенностей распределения химиопрепарата в органах и тканях животных в условиях аутогемохимиотерапии.

5. Изучение морфологических особенностей в органах животных в условиях аутогемохимиотерапии.

6. Изучение лечебного патоморфоза опухоли в условиях аутогемохимиотерапии.

Научная новизна исследования.

Впервые разработана модель экспериментальной аутогемохимиотерапии. Получены новые данные о некоторых механизмах действия аутогемохимиотерапии, заключающиеся в снижении токсического воздействия на организм и повышении эффективности противоопухолевого воздействия связанного с клетками крови химиопрепарата, изменении характера распределения химиопрепарата, связанного с компонентами крови, в органах и тканях- создание депо связанного с клетками крови химиопрепарата в селезенке с постепенным выходом и длительным поддержанием концентрации химиопрепарата в кровеносном русле и опухоли; меньшем повреждающем и некотором стимулирующем влиянии связанного с клетками крови химиопрепарата на органы кроветворения и иммунологической защиты.

Практическая значимость исследования.

Разработана модель экспериментальной аутогемохимиотерапии, которая может быть рекомендована для дальнейших исследований.

Проведенный сравнительный анализ противоопухолевого и токсического эффекта различных способов введения химиопрепаратов способствует более полному представлению об эффективности и токсичности различных способов введения химиопрепаратов и целенаправленному их применению. Разработаны рекомендации по использованию в клинике различных методов введения химиопрепаратов на естественных средах организма.

Полученное в результате работы более полное представление о механизмах действия аутогемохимиотерапии будет способствовать более осознанному применению этого метода в клинике, позволит усовершенствовать, разработать и обосновать его модификации,

Внедрение результатов исследования в практику здравоохранения.

Модель экспериментальной аутогемохимиотерапии используется в работе лаборатории экспериментальной гормонотерапии опухолей Ростовского научно-исследовательского онкологического института.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработанная эффективная модель аутогемохимиотерапии в эксперименте на крысах с перевивными опухолями- асцитной (опухоль яичников) и солидной (саркома 45) демонстрирует меньшую токсичность введения химиопрепарата на аутокрови по сравнению с внутривенным введением,

2. Связывание химиопрепарата с клетками крови во время инкубации обеспечивай снижение гемаголегичеекбй токеичшеш и повышение противоопухолевого эффекта аутогемохимиотерапии саркомы 45.

3. Связывание химиопрепарата преимущественно с эритроцитами во время гшкубашш с кровыо приводит к накоплению их п органах ретикуло-эндотелиальной системы, депонированию в селезенке с последующим постепенным выходом и длительным поддержанием концентрации химиопрепарата в кровеносном русле и в опухоли. Связывание химиопрепарата с альбумином во время инкубации с кровью обеспечивает быстрое накопление и длительное пребывание химиопрепарата в высокой концентрации в быстропролиферирующих органах- опухоль, лимфоидные органы.

Апробация диссертации.

Основные положения диссертации Доложены На 56-ой конференции молодых ученых и специалистов РГМУ 2000г.

Апробация диссертации состоялась 2 ноября 2000г. на заседании Ученого Совета Ростовского научно-исследовательского онкологического института.

Публикации.

Результаты исследований, рассмотренных в диссертации, изложены в 4 печатных работах,

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на машинописного текста, состоит из

введения, обзора литературы, характеристики материала и методов исследования, 5 глав результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, указателя литературы, включающего в себя 194 отечественных и 110 зарубежных источников. Материалы диссертации иллюстрированы // рисунками, ¿'f таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал а методы исследования

Эксперименты выполнены в зимне-весенний период 1999 - 2000 гг, на 400 белых беспородных крысах (319 самцов и 81 самка) массой 150-200 г. в возрасте 2-3 месяца, содержавшихся в стандартных условиях.

В работе использовано два перевиваемых опухолевых штамма: саркома 45 (С-45) и асцитная опухоль яичников (ОЯ). Рост С-45 вызывали введением под кожу спины суспензии опухолевых клеток (разведение 1:1, объем 0,3 мл). Воздействие начинали при достижении опухолью размеров не менее 0,8 см3. Рост ОЯ вызывали путем введения 6 х 106 опухолевых клеток в брюшную полость. Воздействие начинали на следующие сутки после перевивки ОЯ,

В исследованиях использованы доксорубицин («Эбеве». Австрия) и циклофосфан («Конпо» «Евросервис», Россия). В качестве антикоагулянга использовали стандартные гемоконсервангы: глюгицир и гепарин.

Проведение аутогемохимиотерапии (АГХТ) осуществляли путем реинфу-зии крови (1,0 мл), проинкубированной в термостате 45 мин при 37*С с гемоконсервантом и химиопрепаратом, в яремную вену животных. Внутривенную химиотерапию (ВХТ) осуществляли путем введения в яремную вену химиопрепарата, растворенного в физиологическом растворе. Внутривенную химиотерапию в сочетании с аутогемотрансфузиями (ВХТ с АГТ) осуществляли путем введения в яремную вену химиопрепарата, растворенного в физиологическом растворе и последующей реинфузии через ту же иглу крови (1,0 мл), проинкубированной в термостате 45 мин при ЪТС с гемоконсервантом. Проведение аутогемотерапии (АГТ) осуществляли путем реинфузии крови (1,0 мл), проинкубированной в термостате 45 мин при 37°С с гемоконсервантом, в яремную вену. Проведение аутоэритротромболейкохимиотерапии (АЭТЛХТ) осуществляли путем реинфузии аутоэритротромболейкомассы, выделенной центрифугированием и проинкубированной в термостате 45 мин при 37°С с химиопрепаратом, и аутоплазмы, проинкубированной в термостате 45 мин при 37°С, в яремную вену животных Проведение аутоэритротромбо-лейкохимиотерапии связавшимся с клетками крови химиопрепаратом (АЭТЛХТ СХ) осуществляли путем реинфузии аутоэритротромболейкомассы, проинкубированной в термостате 45 мин при 37°С с химиопрепаратом и отмытой физиологическим раствором от несвязавшегося химиопрепарата, и , аутоплазмы, проинкубированной в термостате 45 мин при 37'С, в яремную вену | животных. Проведение аутоплазмохимиотерапии (АПХТ) осуществляли путем I

реинфузии аутоплазмы, выделенной центрифугированием и проинкубированной в термостате 45 мин при 37°С с химпопрепаратом, и аутоэритро-тромболейкомассы, проинкубированной в термостате 45 мин при 37°С, в яремную вену животных.

При оптимальном режиме для циклофосфана- двукратном введении в течение 5 дней (Лесная Н.А., 1980) внутривенно и на аутокрови животным вводили разные дозы препарата с последующим наблюдением за ними, контролем массы, уровня лейкоцитов периферической крови, формулы крови. Оказалось, что при внутривенном введении циклофосфана суммарная стопроцентная летальная доза равна 170 мг/кг. Эту дозу при внутривенном введении животные переносили только совместно с аутогемотрансфузиями, хотя продолжительность их жизни по сравнению с контролем сокращалась. При внутривенном введении хорошо переносимой дозой оказалась суммарная доза 50 мг/кг, поэтому ее мы считали терапевтической (ТД). При двукратном введении циклофосфана на аутокрови суммарная стопроцентная летальная доза оказалась равной 200 мг/кг. Доза 170 мг/кг при двукратном введении циклофосфана на аутокрови переносилась животными хорошо. Эту дозу мы считали высокой и использовали для введения препарата на естественных средах организма Стараясь приблизить условия исследования к клиническим, мы считаем важным сравнение именно групп животных с вводимой на аутокрови суммарной дозой 170 мг/кг с вводимой внутривенно суммарной дозой 50 мг/кг, поскольку они оказывают одинаковое токсическое воздействие на гемопоэз, не приводят к уменьшению продолжительности жизни животных по сравнению с контролем.

В опытах с доксорубицином использовали суммарную терапевтическую дозу 7,5 мг/кг в условиях двукратного введения на первые и седьмые сутки, рассчитанную по таблице перевода доз от человека к крысе с помощью переводного коэффициента (Рге1гас1 й а!., 1966).

Представив аутогемохимиотерапию как совокупность аутоэритротромбо-лейкохимиотерапии, аугоплазмохимиотерапии, внутривенной химиотерапии и аутогемотрансфузий исходя из того, что в процессе инкубации химиопрепарата с кровью происходит связывание его с клетками и белками крови, а также часть его остается свободной (Владимирова Л.Ю., 2000), мы оценивали вклад каждого «компонента» в противоопухолевый и токсический эффект аутогемохимиотерапии.

Эффективность различных противоопухолевых воздействий оценивали по динамике изменения объема саркомы 45, общего количества опухолевых клеток в асцитической жидкости крыс с ОЯ, проценту торможения роста опухоли (ГТТРО), средней удельной скорости роста опухоли, коэффициенту активности противоопухолевого действия, критерию Ъ, учитывающего как удельную скорость роста опухоли на временном интервале, так и абсолютную величину объема опухоли после воздействия (Эмануэль Н.М., 1977; Тимошенко Я.Г. и еоавт., 1986), среднему эффективному времени гибели животных (Красовский Г.Н., 1982).

s

Токсичность различных противоопухолевых воздействий на организм животных оценивали по динамике изменения общего количества лейкоцитов периферической крови, характеру адаптационных реакций (Гаркави JI.X. и соавт., 1985; 1990; Кузьменко Т.С., 1994; Selye Н., 1973), содержанию корти-зола в сыворотке кропи, в достаточной степени отражающего глюкокорти-коидную функцию коры надпочечников крыс (Кучерова Т.И. с соавт., 1992), состояшпо свободно-радикальных процессов перекисного окисления липидов в крови (интенсивности хемилюминесценции (XJI) (Шестаков В.А. и соавт., 1979), активности супероксиддисмутазы (Winterbum С.С. et al., 1975), величине поверхностного заряда мембран лимфоцитов по интенсивности флюоресценции отрицательно заряженного поверхностного зонда АНС- 1 -аншшнонафталин-8-сульфонат (Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е., 1980).

Распределение химиопрепаратов в органах и тканях животных оценивали по содержанию в них доксорубицина (Walter А., 1985), алкилированных производных циклофосфана (Hans J.C.F. Nolls et all., 1982) методом спектрофотометрии. Выделение из цельной крови чистых популяций лимфоцитов, нейтрофилов осуществляли в градиенте плотности фиколл-верографин или фнколл- урографин с последующим микроскопическим контролем. Плазму отделяли центрифугированием в режиме 1500 об/мин в течение 30 минут.

Изменения во внутренних органах животных при экспериментальной химиотерапии оценивали по результатам микроскопии срезов селезенки, тимуса, печени, легких (приготовленных по общепринятой методике). Особенности миелопоэза оценивали по результатам микроскопии мазков костного мозга Для оценки кроветворения использовали лейкоэритробласти-ческий индекс и индекс созревания нейтрофилов.

Для оценки морфологических изменений в саркоме 45 после экспериментальной химиотерапии, проводилась количественная характеристика общей структуры опухоли путем измерения площади паренхимы, стремы и некроза с помощью окулярной измерительной сетки Г.Г.Автандилова (Автандилов Г.Г., 1972).

Крыс умерщвляли методом декапитацни.

Статистическая обработка результатов исследования проводилась с использованием критерия Стьюдента (Урбах В.Ю., 1975), линейного коэффициента Пирсона (ЛакинГ.Ф., 1990), F-критерия (ЛакинГ.Ф., 1990).

Результаты исследования и их обсуждение

I. Противоопухолевая эффективность различных методов экспериментальной химиотерапии.

Использование предложенных схем экспериментальной химиотерапии показало (рис. 1а), что первое введение циклофосфана приводит к наименьшему объему саркомы 45 при его введении на аутокрови (АГХТ) и аутоэритротромболейкомассе (АЭТЛХТ). Также примерно одинаково, но достоверно (Р<0,05) меньше, чем у предыдущих групп, уменьшаются объемы опухолей животных, которым шшюфосфан вводили на аутоплазме (АПХТ) и

внутривенно в сочетании с аутогемотрансфузиями (ВХТ с АГТ). Еще больше (Р<0,05) объемы опухолей наблюдается у животных при внутривенном введении терапевтических доз циклофосфана (ВХТ ТД). Аутоэригротромбо-лейкохимиотерапия связавшимся с клетками крови циклофосфаном (АЭТЛХТ СХ) на 4-ые сутки после 1-го введения препарата еще не приводит к уменьшению объема опухоли (Р>0,1).

%

/ч

АЭТЛХТ СХ

;,копт-роль

Л

]

VI7ÍT

UAI

с

АГТ

ВХТ

Д AECÍ АЭТ- | ЛХТ'4

! ■ '

АЭТЛХТ СХ

ЙХТ

JJ.l JL

ТД

АГХТ ✓—;

/Ч_]

а.

б.

Рисунок 1. Изменепне объема саркомы 45 (в % от исходного) на 4-ые суткп после первого (а.) п на 4-ые сутки после второго (б.) введения циклофосфана различными методами

После второго введения циклофосфана (рис. 16), объемы опухолей животных при АГХТ и АЭТЛХТ остаются наименьшими (1 ПРО 97,14% и 96,29% соответственно). Больше (Р<0,05) объемы опухолей животных при АПХТ (ПТРО 91,43%). Затем следует (Р<0,05) ВХТ с АГТ (ПТРО 85,71%), после чего- ВХТ ТД (ПТРО 73,43%) (Р<0,05), При АЭТЛХТ связавшимся с клетками крови циклофосфаном к этому периоду уже наблюдается уменьшение объема опухоли (Р<0,05) (ПТРО 50,57%).

Выраженное отличие в динамике изменения объемов опухолей при аутоэритротромболейкохимиотерапии и аутоэритротромболейкохимиотерашш связавшимся с клетками крови химиопрепаратом мы считаем обусловленным тем, что при первой методике помимо химиопрепарата, прочно связанного с клетками крови, присутствует непрочно связанный с клетками крови и свободный химиопрепарат. Отсюда можно сделать вывод о том, что если свободный и непрочно связанный с клетками крови химиопрепарат обеспечивает непосредственный нриГИВооПухоЛевЫй эффект, то ЛроЧМо связанный с клетками крови химиопрепарат обеспечивает отсроченный во времени противоопухолевый эффект, вероятно, за счет того, что клетки крови труднее «отдают» опухоли прочно связанный с ними химиопрепарат.

Оценка количественных характеристик роста саркомы 45 (табл.1) показала, что 1-ое внутривенное введение терапевтической дозы циклофосфана приводит лишь к торможению роста опухоли, и только после 2-го введения наблюдается регрессия опухоли с отрицательной удельной скоростью роста

опухоли. При аутоэритротромболейкохимиотерапии связавшимся с клетками крови химиопрепаратом после 1-го введения противоопухолевый эффект еще не развивается и удельная скорость роста не отличается от таковой в контроле, а после 2-го введения уже наблюдается регрессия опухоли с отрицательной удельной скоростью роста опухоли,

У животных остальных групп уже на 1 интервале наблюдается регрессия опухоли с отрицательной удельной скоростью роста опухоли; увеличение значений коэффициента активности противоопухолевого действия и уменьшение значений удельной скорости роста опухоли на 2 интервале наблюдения. На 3 интервале наблюдения наибольшие значения коэффициента активности противоопухолевого действия и наименьшие удельные скорости роста опухоли оказываются у животных при аутогемохимиотерагши и аутоэршротромболейкохимиотерапии. Критерий Ъ также свидетельствует о том, что самыми эффективными из предложенных воздействий на саркому 45 являются аутогемохимиотерапия и аутоэршротромболейкохимиотерапия, величины критерия Ъ которых минимальны (0,073 и 0,106).

Таблица1

Удельная скорость роста саркомы 45 и коэффициент активности противоопухолевого действия при экспериментальной химиотерапии циклофосфаном на временных интервалах

Группы 1 интервал- от начала 2 интервал- от 4 сут. 3 интервал- от начала

животных опыта до 4 сут. после после 1-го введения до 4 опыта до 4 сут. после

1-го введения сут. после 2-го введения 2-го введения

АГХТ, -0,1256 -0,4685 - 0,2971

п=7 1,46-регресс 6,71 - регресс 2,671 - регресс

ВХТ с АГТ, -0,064 -0,067 -0,0652

п=7 1,275 - регресс 1,82-рсгрссс 1,355-рсгрссс

ВХТТД, 0,0753 -0,0598 0,04064

п=7 0,731 - торможение 1,73-регресс 0,7714 - торможение

АЭТЛХТ, -0,103 -0,473 -0,185

п=7 1,377 - регресс 6,77 - регресс 2,04 - регресс

АПХТ, * 0,083 -0,178 «0,13

п=7 1,303 - регресс 3,17-регресс 1,73 - регресс

АЭТЛХТ 0,2756 -0,098 0,09

СХ, п =7 -0,0077- нет эффекта 2,1951-регресс 0,494- торможение

контроль, п =7 0,2735 0,082 0,17?8

Изучение противоопухолевой эффективности различных методов химиотерапии циклофосфаном на крысах с асцитной опухолью яичников показало сходные результаты, кроме этого, на данной модели мы обнаружили, что сами аутогемотрансфузии могут вызывать регрессию опухоли и вносить тем самым вклад в противоопухолевый эффект аутогемохимиотерапии.

Оценка продолжительности жизни, являющаяся одним из наиболее важных критериев эффективности различных воздействий на опухоль, показала, что аутогемохимиотерапия увеличивает жизнь животных с

и

перевивной опухолью яичников на 74,72%, а внутривенная химиотерапия терапевтическими дозами на 29,67%. Внутривенная химиотерапия с аутогемотрансфузиями уменьшает продолжительность жизни животных на 42,86% за счет токсичности внутривенного введения высоких доз химиопрепарата. Опенка продолжительности жизни крыс с саркомой 45 при различных методах химиотерапии показала сходные результаты.

В результате исследования морфологических изменений в саркоме 45 при различных методах химиотерапии мы обнаружили, что однократное введение 100 мг/кг циклофосфана на аутокрови вызывает отчетливые дистрофические изменения опухолевых клеток и, по данным морфометрического исследования, достоверное уменьшение площади паренхимы опухоли до 45,9%, достоверное увеличение площади стромы опухоли до 50,2%, по сравнению с внутривенным введением той же дозы химиопрепарата, площадь паренхимы опухоли при котором 65,9% (Р<0,05), площадь стромы опухоли 33,4% (Р<0,05).

Таким образом, сравнение противоопухолевой эффективности различных методов экспериментальной химиотерапии показало, что в отличие от внутривенной химиотерапии, введение циклофосфана на естественных средах организма приводит к резкому угнетению скорости роста опухолей уже после первого введения химиопрепарата со значительным усилением эффекта при последующем введении, что наиболее ярко выражено при аутоэритро-тромболейкохимиотерапии и аутогемохимиотерапии. Эти методы экспериментальной химиотерапии саркомы 45 являются самыми эффективными из предложенных. Затем следует аутоплазмохимиотералия, после чего-внутривенная химиотерапия. Следовательно, наибольший вклад в противоопухолевый эффект аутогемохимиотерапии вносит связывание химиопрепарата с клетками крови, меньший вклад вносит связывание химиопрепарата с белками хиазмы и еще меньшую роль в противоопухолевом эффекте аутогемохимиотерапии играет свободный химиопрепарат. Эффект от введения только прочно связанного с клетками крови химиопрепарата развивается в отсроченное время. Связывание химиопрепарата с клетками крови во время инкубации обеспечивает многократное усиление противоопухолевого эффекта при повторном введении химиопрепарата

При сопоставлении полученных нами экспериментальных данных о большей эффективности аутогемохимиотерапии и аутоэритротромболейко-химиотерапии и данных, полученных при лечении рака молочной железы о большей эффективности аутоплазмохимиотерахши (Владимирова Л.Ю., 2000), можно прийти к выводу, что эффективность химиотерапии зависит не только от особенностей связывания химиопрепарата с компонентами крови во время инкубации, но и от особенностей самой опухоли.

П. Токсическое воздействие на организм различных методов экспериментальной химиотерапии.

Исследование динамики общего количества лейкоцитов периферической крови животных при различных методах введения доксорубшхина (рис.2) показало, что введение химиопрепарата на аутокрови (АГХТ) не приводит к

достоверному снижению уровня лейкоцитов (Р>0,1) по сравнению с контролем, в отличие от внутривенного введения той же дозы химиопрепарата (Р<0,05). Динамика изменения уровня лейкоцитов при внутривенной химиотерапии с аутогемотрансфузиями (ВХТ с AÍÍ") свидетельствует о том, что не только аутогемотрансфузии (АГТ), повышающие уровень лейкоцитов периферической крови (Р<0,05) и вызывающие иммуномодулирующий эффект (Миленко Т.А., 1970; Гайсенюк JI.A., 1989), снижают гематологическую токсичность химиотерапии, но и связывание химиопрепарата с компонентами крови во время инкубации. На 20-ые сутки опыта, используя метод дисперсионного анализа, мы обнаружили при аутогемохимиотералии достоверное повышение не только лейкоцитов, но и процентного содержания лимфоцитов периферической крови по сравнению с другими методами химиотерапии и контролем.

Рисунок 2. Динамика изменения уровня лейкоцитов периферической крови (в % от исходного) интактных крыс при двукратном введении доксорубицина различными методами

Чтобы выяснить, какую роль играет связывание химиопрепарата с теми или иными компонентами крови во время инкубации в снижении гематологической токсичности аутогемохимиотералии* мы исследовали динамику изменения уровня лейкоцитов периферической крови при различных методах гемокомпоненгной химиотерапии (рис.3) и обнаружили, что самое щадящее влияние на кроветворение оказывает аутоэритротромболейко-химиотерапия связавшимся с клетками крови химиопрепаратом, при которой количество лейкоцитов снижается до 66,91% от исходного (Р<0,05); несколько большее воздействие на гемопоэз оказывает аутоэритротромболейко-химиотерапия, при которой количество лейкоцитов снижается до 51,09% (Р<0,05), затем следуют аутогемохимиотерапия и внутривенная химиотерапия терапевтическими дозами химиопрепарата, уровень лейкоцитов при которых одинаков (29,51% и 28,11% от исходного соответственно (Р1<0,05; Р2<0,05); аутоплазмохимиотерапия приводит к выраженной лейкопении (количество лейкоцитов снижается до 21,01% (Р<0,05), но все животные остаются живы.

Внутривенное введение высоких доз химиопрегарата приводит к снижению количества лейкоцитов до 19,17% от исходного (Р<0,05) и гибели животных.

Рисунок 3. Динамика изменения уровня лейкоцитов периферической крови (в % от исходного) крыс с саркомой 45 при двукратном введении циклофосфанаразличными методами

Исследование характера адаптационных реакций при различных методах химиотерапии доксорубицином показало, что в процессе аутогемохимио-терапии, также как и при аутогемотранефузшк,, и у интшсгаых животных преобладают случаи развития неспецифических адаптационных реакций антистреСсорного типа (до 85%). При внутривенной химиотерапии преобладают случаи развития напряженных антистрессорных реакций и стресса (до 80%). При внутривенной химиотерапии с аутогемотрансфузиями, в отличие от предыдущих групп животных наблюдается одинаковое число случаев развития неспецифических адаптационных реакций антисгрессорного типа (до 43%) и напряженных антистрессорных реакций и стресса (до 57%). Эти данные свидетельствуют о том, что и аутогемотрансфузии, и связывание химиопре-парата с компонентами крови во время инкубации снижают токсичность химиотерапии.

В результате исследования содержания кортизола в сыворотке крови (табл.2) было обнаружено, что рост саркомы 45 в организме животных сопровождается достоверным повышением уровня кортизола в 2,3 раза по сравнению с интактными животными, что свидетельствует о стрессовой реакции организма на развитие опухоли. Проведение внутривенной химиотерапии «терапевтическими» дозами циклофосфана животным с саркомой 45 приводит к еще большему повышению уровня кортизола, в 1,7 раз по сравнению с опухолевыми животными контрольной группы. Таким образом! внутривенная химиотерапия повышает активность коры надпочечников животных, по-видимому, усугубляя стрессовое состояние организма. Проведение ауто гем охим и отер алии, несмотря на введение высоких доз

химиопрепарата, не сопровождается повышением уровня кортизола по сравнению с опухолевыми животными контрольной группы.

Таблица2

Влияние экспериментальной химиотерапии пиклофосфаноч на активность надпочечников белых крыс

Группы животных Интактные, п = 9 Контроль с С-45, п = 26 АГХТ, п = 7 вхттд, п = 7

кортизол (нмоль/л) 19,4±4,08* 44,23±4,19 52,33±3,53** 77,4±14,86* **

Примечание: * - различия с контролем с С-45 достоверны

** - различия с интактными животными достоверны

Показатели состояния свободно-радикальных процессов перекисного окисления липидов в крови (табл.3) свидетельствуют об увеличении показателей хемшпоминесценции (ХЛ) при развитии в организме животных опухолевого процесса по сравнению со значениями у ингакгных крыс. Так, величина светосуммы достоверно повысилась на 46%. Активность супероксиддисмутазы (СОД) при этом достоверно понизилась на 40%.

Таблица 3

Интенсивность хемнлюминесценции, активность супероксиддисмутазы н интенсивность флюоресценции АБС в крови крыс в процессе экспериментальной химиотерапии ииклофосфаном

Группы крыс Показатели хемилюминесценции Активность СОД (у.е./г. гемоглобина) Интенсивность флюоресценции АНС (у.е./лимфоцит)

светосумма (количество импульсов за 6 сек от запуска р-ции) высота быстрой вспьппки (мм)

1 группа-интактные 8721*930 п=9 79,2±10,2 п=10 13,16±1,32 п=8 20,05±1,45 п=16

2 группа-контроль с С45 12740±812* п=7 96,7±8,8 п=7 7,95±0,99* п=6 19,35*1,33 п=6

3 группа- вхттд 15752±2415* п=5 1И,6±14,8 п=5 7,62±1ДЗ* п=4 15,94±0,87* п=5

4 группа-АГХТ 7615±1043** *** ПР6 54,0±6,7** *** 13,76±2,37 «=7 21,75±0,86*** й^б

Примечание: * - различия достоверны по сравнению с 1 группой ** - различия достоверны по сравнению с 2 группой *** - различия между 3 и 4 грушами достоверны

После проведения крысам-опухоленосителям внутривенной химиотерапии показатели ХЛ оказались выше, чем у интактных животных: светосумма увеличилась на 81%, высота быстрой вспышки - на 41%; и эти показатели в данной группе были даже несколько выше, чем у контрольных животных-опухоленосителей, С выявленными изменениями интенсивности ХЛ коррелировало достоверное снижение активности СОД у животных после внутривенной химиотерапии на 42% по сравнению с интактными животными.

После аутогемохимиотерапии имело место снижение интенсивности ХЛ по сравнению с контрольными животными-опухоленосителями: величина

светосуммы достоверно снизилась на 40%, а высота быстрой вспышки- на 44%. При этом величина светосуммы достоверно не отличалась от таковой у интактных животных, а высота быстрой вспышки была даже ниже на 32% (тенденция к снижению). Активность СОД была выше, чем у контрольных животных-опухоленосителей на 73% и достоверно не отличалась от активности фермента у интактных животных. Интенсивность флюоресценции АНС у крыс после аутогемохимиотерапии была достоверно выше (на 36%), чем у животных после внутривенной химиотерапии (что свидетельствует о меньшем поверхностном отрицательном заряде мембран лимфоцитов, чем при внутривенной химиотерапии) и также достоверно не отличалась от значений у интактных крыс.

Таким образом, Полученные При Изучении токсического воздействия на организм различных методов экспериментальной химиотерапии данные позволяют прийти к выводу, что связывание химиопрепарата с клетками крови во время инкубации, присутствие в методике аутогемохимиотерапии аутогемотрансфузий снижает гематологическую токсичность химиотерапии. В Меньшей степени этому с1Юсобс1йуеГ связывание хйМйоИреПарата с белками плазмы крови. Кроме этого, аутогемохимиотерапия, в отличии от внутривенной химиотерапии, нормализует интенсивность свободно-радикальных процессов перекисного окисления литтидов, активность антиоксидантных ферментов и состояние мембран клеток крови, приводит к меньшему напряжению глюкокортикоидной функции коры надпочечников животных, вызывает развитие неспецифических адаптационных реакций антистрессорного типа, способствуя повышению резистентности организма

Ш. Распределепие хпмнопрепаратов в организме животных при различных методах экспериментальной хпмпотерашш.

Определенную ясность в решение вопроса о том, за счет чего связывание химиопрепарата с теми или иными компонентами крови повышает эффективность и снижает токсичность химиотерапии, вносит изучение распределения химиопрепарата в органах и тканях животных в условиях аутогемохимиотерапии.

Результаты исследования (табл.4) показали, что уже через 1 час после внутривенного введения цшслофосфана животным в крови его производные не определяются. Наиболее высокие их концентрации обнаружены в легких и печени, меньше - в селезенке. Через 1 час после> введения животным циклофосфана, проинкубированного с аутокровью, наиболее высокие концентрации его производных обнаружены в селезенке и эритроцитах. Меньшая их концентрация обнаружена з печени и костном мозге. То есть, при внутривенном введении циклофосфана его производные быстро исчезают из крови и столь же быстро накапливаются в органах, являющихся депо крови, что создает возможность их токсического повреждения.

Таблица 4

Содержание алкилированиых производных циклофосфана в органах н тканях крыс (у.е./г.тканн) через 1 час п 3 суток после однократного введения 100 мг/кг препарата

Объекп исследования Через 1 Час После в ведения Через 3 сушк После ввеДеНИя

АГХТ, п = 6 ВХТ, п = 6 АГХТ, п = 6 ВХТ, п = 6

селезенка 23±2,5 3,5±0,4* 5,5±0,6 0*

Печень 9±0,8 22±1,9* 8±0,7 0*

костный мозг 5±0,3 0* 0 0

саркома 45 0 0 4±0,3 0*

легкое 0 22,5*2,1 * 0 0

тимус 0 0 1,5*0,1 0*

плазма 0 0 0 0

эритроциты 16±1,0у.е./ил 0* 1,4±0,1у.е./мл 0*

лимфоциты 0 0 0 0

нейтрофилы 0 0 0 0

Примечание; * - различия между грушами достоверны (Р<0,001)

При введении циклофосфана на аутокрови наблюдается увеличение времени циркуляции в общем кровотоке его производных с эритроцитами, причем в довольно высокой концентрации. Выраженную тропность циклофосфана к селезенке и менее выраженную к печени и костному мозгу в условиях аутогемохимиотерапии считаем связанной с увеличением объема и ухудшением деформируемости эритроцитов, связавших химиопрепарат (Попова И.Л., 1999; Скороход A.A., 1999), что отражается на их способности к циркуляции и приводит к задержке в капиллярах органов ретикуло-эвдотелиальной системы (Генинг Т.П. и соавт., 1988; Скороход A.A., 1999). Дальнейшая судьба депонированных в селезенке эритроцитов может быть двоякой; фагоцитоз селезеночными макрофагами или отрыв части оболочки клетки с уменьшением ее объема и возвращением в общий кровоток, как это наблюдается при наследственном микросфероцигозе (Гаврилов O.K. и соавт., 1987).

Через 3 суток после внутривенного введения циклофосфана его алкилированные производные уже полностью отсутствовали в организме. В отличие от этого, через 3 суток после введения циклофосфана на аутокрови концентрация его производных в органах и тканях крыс хотя и уменьшалась (в 4 раза- в селезенке, в 10 раз- в эритроцитах), но еще относительно высока. Кроме этого, в эти сроки производные циклофосфана обнаружены в тимусе, хотя и в невысокой концентрации, и в достаточно высокой концентрации- в опухоли. Таким образом, при введении циклофосфана на аутокрови значительно увеличивается время его циркуляции в кровеносном русле с эритрощгтами. Селезенка, по-видимому, является депо эритроцитов, связавших химиопрепарат, с постепенным их выходом в кровеносное русло и поддержанием в нем концентрации химиопрепарата довольно длительное время. Увеличивается концентрация и длительность нахождения в опухоли

производных циклофосфана, вероятно, за счет увеличения туморотропности эритроцитов, связавших химиопрепарат.

В связи с тем, что при инкубации с кровью циклофосфан преимущественно связывается с эритроцитами (Владимирова Л.Ю., 2000), условно распределение циклофосфана при аутогемохимиотерапии можно считать распределением связанного с эритроцитами химиопрепарата. Исходя из этого, мы приходим к выводу, что связывание циклофосфана с эритроцитами приводит к их депонированию в селезенке с последующим их постепенным выходом и длительным поддержанием концентрации химиопрепарата в кровеносном русле и в опухоли. Изменения эритроцитов приводят к их задержке и в других органах р етикулоэ ндотелиаль но й системы (печени, тимуса, костного мозга). Меньшая тропность химиопрепарата, связанного с эритроцитами, к легким и печени снижает вероятность токсического повреждения этих органов, тогда как внутривенная химиотерапия сопровождается большим риском этих осложнений.

Изучение особенностей распределения доксорубицина (табл.5) показало, что через 1 час после внутривенного введения доксорубицина в крови еще обнаруживается его небольшое количество, связавшееся с эритроцитами. Столько же химиопрепарата обнаружено в тимусе. Наиболее высокие количества доксорубицина обнаружены в легких, печени, селезенке, опухоли. Через 1 час после введения доксорубицина на аутокровк наиболее высокие его концентрации обнаружены в селезенке, тимусе, опухоли, эритроцитах; меньшие - в легких и печени.

Таблица 5

Содержание доксорубицина в органах о тканях крыс (мкг) через 1 час и 3 суток после однократного введения 6,7 мг/кг препарата

Объект исследования Через 1 час после введения Через 3 суток после введения

АГХТ, п = 6 ВХТ, п = 6 АГХТ, п = 6 ВХТ, п = 6

селезенка 31,4*2,1 14,Ш,0* 8,6+0,8 0*

печень 5,7±0,4 14,1±0,9*_ 11,4±1,0 0*

опухоль 12,8±0.9 11,4±1,1 5,7±0,6 5,7±0,5

легкое 8,6±0,6 37,1±4,0* 0 0

тимус 17,1±1,5 2,9±0,3* 14,1±1,1 0*

плазма 0 0 0 0

эритроциты 11,4±0,9 2,9±0,2* 5,7±0,6 0*

лимфоциты 0 0 0 0

итого 87 82,4 45,5 5,7

Примечание: * - различие между группами достоверно (Р<0,001)

Итак, по истечении часа после внутривенного введения, основная часть доксорубицина покинула кровеносное русло с накоплением в органах, .являющихся депо крови (легкое, селезенка, печень), а также в опухоли, Небольшая часть химиопрепарата, связавшегося в крови с эритроцитами, еще продолжает циркулировать в общем Кровотоке. Такая же небольшая часть химиопрепарата задержалась тимусом. Быстрое накопление высокой

концентрации доксорубицина в опухоли является важным фактором в успешном лечении опухолей. А вот высокая концентрация химиопрепарата в легких, печени, селезенке создает возможность токсического повреждения этих органов при внутривенном введении химиопрепарата.

Через 1 час после введения доксорубицина на аутокрови, также как мы это наблюдали и после введения циклофосфана на аутокрови, химиопрепарат в высокой концентрации циркулирует в кровеносном русле на эритроцитах с созданием депо химиопрепарата в селезенке. Обращает на себя внимание высокая концентрация доксорубицина в тимусе и опухоли через 1 час после введения доксорубицина на аутокрови, чего мы не наблюдали в эти же сроки после введения циклофосфана на аугокрови.

Считаем, что это обусловлено особенностями связывания разных химиопрепаратов с компонентами крови во время инкубации. Так, если циклофосфан во время инкубации с кровью преимущественно связывается с эритроцитами, то доксорубшщи преимущественно связывается с эритроцитами и с альбумином (Владимирова Л.Ю., 2000). Если разницу в распределении введенных на аутокрови циклофосфана и доксорубицина объяснять связыванием части доксорубицина с альбумином, можно прийти к выводу, что комплекс альбумин- химиопрепарат обладает повышенной тропностью к быстропролиферирующим тканям органов (опухоль, лимфоидные органы).

Через 3 суток после внутривенного введения доксорубицин обнаруживается только в опухоли. В эти же сроки после введения доксорубицина на аутокрови обнаружено еще довольно большое его количество в органах и тканях животных. Наиболее высокие концентрации доксорубицина обнаружены в тимусе, печени, селезенке. Несколько меньше химиопрепарата обнаружено на эритроцитах, циркулирующих в кровеносном русле и в опухоли. То есть, через 3 суток после внутривенного введения основная часть доксорубицина выведена из организма, осталась только небольшая часть химиопрепарата в опухоли. А в эти же сроки после внутривенного введения циклофосфан не был обнаружен в органах и тканях крыс. Такое отличие, возможно, связано с тем, что часть доксорубицина, в отличие от циклофосфана, после внутривенного введения связалась с эритроцитами, что и обеспечило более длительное пребывание части химиопрепарата в организме и опухоли.

При введении доксорубицина на аутокрови значительно увеличивается время его циркуляции в кровеносном русле с эритроцитами. Селезенка является депо эритроцитов, связавших химиопрепарат, с постепенным их выходом в кровеносное русло и поддержанием в нем концентрации химиопрепарата довольно длительное время. Тимус длительно удерживает стабильную концентрацию химиопрепарата. Эти данные отличаются от распределения циклофосфана через 3 суток после его введения на аутокрови выраженной тропностью доксорубицина к лимфоидным органам (тимус и, вероятно, лимфатические узлы), что может быть обусловлено связыванием части доксорубицина с альбумином во время инкубации с кровью.

Таким образом, связывание химиопрепарата с эритроцитами во время инкубации с кровью приводит к их задержке в органах ретикуло-

эцдотелиальной системы, особенно в селезенке, которая становится депо химиопрепарата с последующим его постепенным выходом и длительным поддержанием концентрации химиопрепарата в кровеносном русле и в опухоли, вероятно, за счет увеличения туморотрошостй комплекса химиопрепарат- эритроцит. Связывание химиопрепарата с альбумином во время инкубации с кровью обеспечивает быстрое накопление и длительное пребывание химиопрепарата в высокой концентрации в быстропроли-ферирующих органах (опухоль, лимфоидные органы). Это способствует большей эффективности химиотерапевтического воздействия на опухоль и лимфогенные метастазы, но также может способствовать увеличению токсичности лечения.

VI. Морфологические изменения в органах животных при различных методах экспериментальной химиотерапия.

При изучении показателей микроскопической картины костного мозга и данных миелограмм животных на 3 сутки после внутривенного введения 100 мг/кг циклофосфана мы получили данные,, свидетельствующие о выраженном повреждении гемопоэтической ткани. Так, пунктаты костного мозга бедны клеточными элементами. На фоне жировых капель, элементов стромы и остеобластов разрозненно и небольшими группами расположены костномозговые элементы, находящиеся большей частью в состоянии некробиоза, аномальные фигуры митоза и значительно реже- оставшиеся неизмененными эозинофильные и нейтрофильные миелоциты, ядерные формы эритрокариоцигов.

Количество ретикулярных клеток составляет 54,3%о от общего числа миелокариоцитов. Обращали внимание изолированно лежащие крупных размеров (до 20>-25 мк) моноцитоидные клетки, характеризующиеся неправильной формой ядра и базофильной цитоплазмой, лишенной первоначальной азурофильной зернистости, то есть без признаков дифференцировки. Описанные атипические моноциты, по-видимому,- освободившиеся из синпитиалъных связей ретикулярные клетки. Индекс созревания нейтрофилов при внутривенной химиотерапии (1,18) больше такового в контрольной группе (0,82), что свидетельствует о задержке созревания гранулоцитов в костном мозге и, следовательно, малоэффективном гемопоэзе. Значение лейкоэритро-бластического индекса (2,57:1), близкое к контролю (3:1), обусловлено эозинофильной реакцией и значительным сужением эритроидного ростка кроветворения.

Характерной особенностью гемопоэтической ткани при аутогемохимио-терапии той же дозой циклофосфана является островковая гиперплазия костного мозга на фоне гипопластичных участков. Как и при внутривенной химиотерапии отмечались признаки угнетения процессов пролиферации и дифференцировки миелоидного и эритроидного ростков кроветворения; определялись дегенеративные формы и разрушенные клетки. Однако, общее число миелокариоцитов после аутогемохимиотерапии превышало их содержание После внутривенной химиотерапии. Заметно больше И количество

ретикулярных клеток (68,5%о), среда которых обращали внимание крупные субгигантские нейтрофилы, палочковдерные формы. Обнаруженные (как и при внутривенной химиотерапии) крупные ретикулярной природы моноцитоидные клетки при аутогемохимиотералии характеризовались наличием в цитоплазме азурофильной грануляции и увеличением числа митотических фигур, что свидетельствует об их дифференцировке в крупные промиелощпы и далее- в нейтрофильные метамиелоциты.

Таким образом, после аутогемохимиотералии имели место ранние признаки регенерации гемопоэза: восстановление миелопоэза происходило за счет размножения и дифференцнровки моноцитоидных (ретикулярной природы) клеток. Дифференцировка ретикулярных клеток в направлении эритроидных элементов, отмеченная у большинства экспериментальных животных после аутогемохимиотерапии, подтверждалась наличием эритрокариоцитов, сохранивших заостренность цитоплазмы, свойственную ретикулярным клеткам. Итак, уже на 3-й сутки после аутогемохимиотерапии отмечается резкое увеличение количества ретикулярных клеток, превращение их в гигантские моноциты и миелоидные элементы. Индекс созревания нейтрофилов при аутогемохимиотерапии (0,81) не отличается от такового у животных контрольной группы (0,82). Лейкоэригробластический индекс свидетельствует об умеренной аплазии костного мозга на 3-й сутки после аутогемохимиотерапии (1,8:1).

При морфологическом исследовании селезенки, являющейся одним из важнейших периферических органов системы иммунитета, где осуществляются межклеточные кооперации и сложная интеграция иммунокомпетентных клеток при клеточном и гуморальном иммунитете, на 3-й сутки после внутривенного введения 100 мг/кг циклофосфана были обнаружены изменения (снижение весового коэффициента селезенки, уменьшение размеров и количества лимфоидных фолликулов, числа лимфоидных элементов в них, отсутствие в них делящихся клеток, отсутствие герминативного центра фолликулов), которые могут свидетельствовать об угнетении лимфоидной ткани органа химиопрепаратом, введенным внутривенно. А на 3-й сутки после введения той же дозы циклофосфана на аутокрови в селезенке крыс обнаружены изменения, свидетельствующие о возможном повышении функциональной активности Т-зависимых зон лимфоидной ткани на фоне угнетения В- зависимых зон (увеличение в размерах периартериальной, мантийной и краевой зоны фолликулов с выраженной плазматизацией, гиперплазия ретикулярных и миелоидных элементов в красной пульпе и фолликулах, отсутствие герминативного центра фолликулов).

При морфологическом исследовании тимуса крыс, получавших внутривенную химиотерапию циклофосфаном в дозе 100 мг/кг, обнаружили изменения (снижение весового коэффициента, уменьшение количества лимфоцитов в корковом и мозговом слое, замещение лимфоидной ткани коркового вещества жировой клетчаткой), свидетельствующие об угнетении лимфоидной ткани органа химиопрепаратом. Морфологические изменения тимуса животных, которым циклофосфан вводили на аутокрови (интенсивная

пролиферация малых лимфоцитов с увеличением количества плазматических клеток, гиперплазия ретикулярных элементов), свидетельствуют, по-видимому, о некотором повышении функциональной активности органа.

При морфологическом исследовании печени и легких животных, получивпшх внутривенно циклофосфан в дозе 100 мг/кг, обнаружены отчетливые признаки повреждения этих органов (в печени- картина выраженной зернистой и вакуольной дистрофии гепатоцитов в сочетании с небольшими участками дискомплексашш в печеночных дольках и ступенчатых некрозов гепатоцитов, полнокровие центральных отделов долек, расширение пространств Дассе за счет отека; в легких- диффузный умеренно выраженный интерстициальный отек и лейкоцитарная инфильтрация стенок респираторных структур, крупные поля дистелектазов, чередующиеся с эмфизематозно расширенными альвеолами, отечность и полнокровие слизистой мелких бронхов, дистрофия и десквамация эпителия, сужение просвета бронхов мелкого калибра за счет спазма, гипертрофии мышечного слоя), в отличии от аутогемохимиотерапии, при которой обнаружены слабо выраженные дистрофические и дисциркуляторные изменения в печени, полнокровие в легких, мелкие участки дистелектазов без очагов эмфизематозного вздутия, что свидетельствует о существенном снижении токсического действия на печень и легкие циклофосфана при введении его на аутокрови.

Таким образом, на 3-й сутки после внутривенной химиотерапии, когда циклофосфан уже полностью выведен из организма, наблюдается депрессия ["еМоИоэЗа с умеренной аШазиёй Костного Мозга на фоне Шраэ&еННоГо аллергического компонента, морфологические изменения селезенки и тимуса, которые могут свидетельствовать об угнетении В- и Т- зависимых зон лимфоидной ткани этих органов химиопрепаратом, морфологические признаки повреждения печени и легких. В те же сроки после аутогемохимиотерапии, когда в органах и циркулирующих б общем кровотоке эритроцитах наблюдается достаточно высокая концентрация производных циклофосфана, обнаруживаются слабо выраженные дистрофические и дисциркуляторные изменения печени и легких, на фоне умеренной аплазии костного мозга обнаруживается его очаговая гиперплазия с начальными прюнаками физиологической регенерации за счет ретикулярных клеток, морфологические изменения селезенки и тимуса, которые могут свидетельствовать о некотором повышешш функциональной активности Т- зависимых зон лимфоидной ткани.

Анализ данных литературы указывает на изменения различных компонентов клеточной мембраны эритроцитов, связавших химиопрепарат (Попова И.Л., 1999; Скороход A.A. и соавт., 1999; Run S. ei а]., 1998), что может сопровождаться освобождением секвестрированных антигенов, возникновением конформационных изменений белковых молекул, образованием комплексных антигенов и другими процессами, которые в органах кроветворения и иммунологической зашиты могут вызывать процессы иммуностимуляции (Коен С., 1983; Петров Р.В., 1984). Этот механизм, ! вероятно, и обеспечивает иммуностимулирующий эффект аутогемохимиотерапии, описанный в клинике (Долматова O.K., 1995; Маяейко М.Л., 1998), и,

вероятно, обнаруженный нами по увеличению общего количества лейкоцитов, процентного содержания лимфоцитов периферической крови в отсроченный период после аутогемохимиотерапни, некоторому повышению функциональной активности Т- зависимых зон лимфоидной ткани.

Таким образом, суммируя полученные в результате исследования сведения, можно прийти к заключению, что образование комплекса химиопрепарат- эритроцит во время инкубации химиопрепарата с кровью приводит к его депонированию в селезенке с последующим его постепенным выходом и длительным поддержанием концентрации химиопрепарата в кровеносном русле и в опухоли. Пролонгированный характер поступления депонированного в селезенке химиопрепарата «захватывает» разные стадии деления опухолевых клеток, что увеличивает эффективность терапии. Прочно связанный с эритроцитами химиопрепарат оказывает отсроченное действие на опухоль, многократно усиливающееся при повторном введении химиопрепарата Комплекс химиопрепарат- эритроцит, возможно, приобретает новые свойства, повышающие эффективность химиотерапевтического воздействия на опухоль.

Изменения эритроцитов, связавших химиопрепарат, приводят к их задержке и в других органах р етикул оэндотелиаль ной системы и неспецифической стимуляции Т- зависимых зон лимфоидной ткани. Вероятно, этот механизм и обеспечивает иммуномодулирующий эффект и объясняет низкую гематологическую токсичность аутогемохимиотерапни. Меньшая тропность химиопрепарата, связанного с эритроцитами, к легким и печени, в отличие от внутривенной химиотерапии, снижает вероятность токсического повреждения этих органов.

Образование комплекса химиопрепарат- альбумин во время МНкубацИй с кровью обеспечивает быстрое накопление и длительное пребывание химиопрепарата в высокой концентрации в быстропролиферирующих органах-опухоль, лимфоидные органы. Это способствует большей эффективности химиотерапевтического воздействия на опухоль и лимфогеиные метастазы, но также способствует увеличению токсичности лечения по сравнению с аутогемохимиотерапией, но меньшей, чем при внутривенной химиотерапии.

Аутогемотрансфузии, присутствующие в методике аутогемохимиотерагаш, снижают гематологическую токсичность химиотерапии, оказывают иммуностимулирующий эффект и, кроме этого, могут сами вызывать торможение роста опухоли и вносить вклад в противоопухолевый эффект аутогемохимиотерапни.

В отличие от внутривенной химиотерапии, усугубляющей нарушения свободно-радикальных процессов перекисного окисления липидов крови, приводящей к резкой активации секреции коры надпочечников, усугубляющей стрессовое состояние организма и снижающей резистентность организма, аутогемохимиотерапня нормализует интенсивность свободно-радикальных процессов перекисного окисления липидов в крови, приводит к меньшему напряжению глюкокортикоидной функции коры надпочечников, вызывает

развитие неспецифических адаптационных реакций антистрессорного типа, повышает резистентность организма. Такой характер общего воздействия на организм аутогемохимиотерапии может оказывать влияние на конечный результат лечения, частоту метастазирования и рецидивирования опухолевого процесса.

Возможные механизмы аутогемохимиотерапии мы представили на рис.4.

повышение эффективности химиотерапии

ппппбпе-

тенне

новых

свойств

ВОЗМОЖНОСТЬ введения высоких доз хи-миопрепарата

депонирование в селезенке с постепенным выходом в длительной циркуляцией

образование комплекса хи-миопрепарат-эритроцпт

повышение функциональной активности органов кроветворения и иммунологической защиты

I

ЛГХТ

аутогемо-трансфузнн

повышение туморо-грошгоетн

образование комплекса хи-мнопрепарат-альбумии

некоторое снижение токсичности

благотворное влияние на гомеосгаз

снижение токсичности химиотерапии

Рисунок 4. Возможные механизмы аутогемохимиотерапии

ВЫВОДЫ

1. Разработана экспериментальная модель аутогемохимиотерапии на крысах с- перевивными опухолями- асцитной (опухоль яичников) и солидной (саркома 45), демонстрирующая большую эффективность и меньшую токсичность введения химиопрепарата на аутокрови по сравнению с внутривенной химиотерапией. Процент торможения роста солидной опухоли при экспериментальной внутривенной химиотерапии составил 73,43%, при экспериментальной внутривенной химиотерапии с аутогемотрансфузиями-85,71%, при экспериментальной аутогемохимиотерапии- 97,14%.

2. Связывание химиопрепарата с клетками крови во время инкубации повышает противоопухолевый эффект аутогемохимиотерапии. Процент торможения роста солидной опухоли при экспериментальной аутоплазмохи-миотерапии составил 91,43%, при экспериментальной аутоЭритротромбо-лейкохимиотерашш- 96,29%.

3. Экспериментальная аутогемохимиотерапия вызывает отчетливые дистрофические изменения опухолевых клеток саркомы 45 и, по данным морфометрического, исследования достоверное уменьшение площади паренхимы опухоли до 45,9%, достоверное увеличение площади стромы опухоли до 50,2%, по сравнению с экспериментальной внутривенной химиотерапией, площадь паренхимы опухоли при которой 65,9% (Р<0,05), площадь стромы опухоли 33,4% (Р<0,05).

4. Связывание химиопрепарата с клетками крови во время инкубации снижает токсическое влияние на лейкопоэз аутогемохимиотерапии. При экспериментальной внутривенной химиотерапии количество лейкоцитов снижается до 19,17% от исходного (Р<0,05) и приводит к гибели животных. При экспериментальной аутоплазмохимиотерапии количество лейкоцитов снижается до 21,01% от исходного (Р<0,05). При экспериментальной аутогемохимиотерапии количество лейкоцитов снижается до 29,51% от исходного (Р<0,05). При экспериментальной аутоэршротромболейкохимш-терапии количество лейкоцитов периферической крови крыс снижается до 51,09% от исходного (Р<0,05).

5. Экспериментальная аутогемохимиотерапия, в отличие от экспериментальной внутривенной химиотерапии, нормализует интенсивность свободно-радикальных процессов перекисного окисления липидов в крови, приводит к меньшему напряжению глюкокортикоидной функции коры надпочечников животных, вызывает развитие неспецифических адаптационных реакций антнстрессоркого типа.

6. Введение химиопрепарата на аутокрови позволяет уменьшить миелотоксичность химиотерапии: после проведения экспериментальной в[1угривенной химиотерапии наблюдается депрессия гемопоэза и умеренная аплазия костного мозга на фоне выраженного аллергического компонента (количество эозинофилов достигает 10,2%о от общего числа миелокариоцитов, Р<0,05); после проведения экспериментальной аутогемохимиотерапии на фоне умеренной аплазии костного мозга наблюдается его очаговая гиперплазия с

признаками более ранней физиологической регенерации за счет ретикулярных клеток, количество которых достигает 68,5%о от общего числа миелокариоцигов (Р<0,05).

7. Экспериментальная аутогемохимиотерапия, в отличие от экспериментальной внутривенной химиотерапии, вызывает не только угнетение В-зависимых зон лимфоидной ткани селезенки, но и некоторое повышение функциональной активности Т- зависимых зон лимфоидной ткани селезенки и тимуса: в селезенке увеличиваются в размерах периартериальная, мантийная и краевая зоны фолликулов с выраженной плазматизацией, обнаруживается гиперплазия ретикулярных и миелоидных элементов красной пульпы и фолликулов, герминативный центр не определяется; в тимусе наблюдается интенсивная пролиферация малых лимфоцитов с увеличением количества плазматических клеток, гиперплазия ретикулярных элементов.

8. Связывание химиопрепарата преимущественно с эритроцитами во время инкубации с кровью приводит к накоплению их в органах ретикулоэндотелиачьной системы, депонированию в селезенке с последующим постепенным выходом и длительным поддержанием концентрации химиопрепарата в кровеносном русле и в опухоли. Связывание химиопрепарата с альбумином во время инкубации с кровью обеспечивает быстрое накопление и длительное пребывание химиопрепарата в высокой концентрации в быстропролиферирующих органах- опухоль, лимфоидные органы.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В экспериментах на крысах с введением химиопрепарата на естественных средах организма использовать разработанную нами модель,

2. В качестве неоадьювангной химиотерапии быстро растущих оПухоЛей, особенно метайазирующих ЛКмфоГеННыМ ГГутем, лучше использовать аутоплазмохимиотерапию, обеспечивающую быстрый эффект за счет быстрого накопления химиопрепарата в опухоли и лимфогенных метастазах.

3. В качестве неоадьювангной химиотерапии медленно растущих опухолей, лучше использовать аутогемохимиотерапшо и аутоэритротромбо-лейкохимиотерапию, обеспечивающих длительное пребывание химиопрепарата в организме.

4. В качестве адьювантной химиотерапии опухолей лучше использовать аутогемохимиотерапшо и аутоэритротромбрлейкохимиотерапию, обеспечивающих длительное пребывание химиопрепарата в организме.

5. У больных с риском возникновения лейкопении при проведении химиотератш лучше использовать более щадящие методики- аутоэритро-

| тромболейкохимиотерапию и аутогемохимиотерапшо.

6. Для лечения лейкопении, возшшпей в результате химиотерапии, рекомендуем использование аутогемотрансфузий.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Некоторые аспекты механизма аутогемохимиотерапии в эксперименте на животных // 54-я Итоговая научная конференция студентов, молодых ученых и специалистов. Аннотации докладов и материалов Дня науки студентов, молодых ученых и специалистов, поев. 70-летию РГМУ. Ростов н/Д, 2000. С. 149 (соавт. Т. А. Ровда, Л.К. Трепитаки).

2. Особенности кроветворения у экспериментальных животных при различных методах химиотерапии // Итоговые научные изыскания последнего года XX века Ростов н/Д., 2000. С.313*318 (соавт. Ю.С. Сидоренко, Н.К. Гуськова, Ю.Н. Бордюшков, Л.Д. Кирсанова).

3. Особенности распределения циклофосфана при аутогемохимиотерапии // Итоговые научные изыскания последнего года XX века. Ростов н/Д.! 2000, С.318-321 (соавт. Ю.С. Сидоренко, Е.М. Франциянц, Ю.Н. Бордюшков, Л.А. Орловская, Л.Д. Кирсанова).

4. Влияние экспериментальной химиотерапии на интенсивность свободно-радикальных процессов переписного окисления липидов в крови крыс // Итоговые научные изыскания последнего года XX века. Ростов н/Д., 2000. С.281-284 (соавт. И.А. Горошинская, Ю.Н. Бордюшков, Т.А. Ровда, Л.Д. Кирсанова).

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГХТ - аутогемохимиотерапия

АЭТЛХТ - аугоэритротромболейкохимиотерапия

АЭТЛХТ СХ - аутоэритротромболейкохимиотерапия связавшимся с клетками

крови химиопрепаратом АПХТ - аутоплазмохимиотерапия АГТ - аутогемотрансфузии ВХТ - внутривенная химиотерапия

ВХТ ТД - внутривенная химиотерапия терапевтической дозой химиопрепарата

АНС- 1-анилинонафталин-8-сульфонат

СОД - супероксшшисмутаза

С-45 - саркома 45

ОЯ - опухоль яичников

ПТРО - процент торможения роста опухоли

ХЛ - хемилюминесценция