Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Водорастворимые полисахариды растений Сибири в комплексной терапии первиваемых опухолей

На правах рукописи

ЛОПАТИНА КСЕНИЯ АЛЕКСАНДРОВНА 003055927

ВОДОРАСТВОРИМЫЕ ПОЛИСАХАРИДЫ РАСТЕНИЙ СИБИРИ В КОМПЛЕКСНОЙ ТЕРАПИИ ПЕРЕВИВАЕМЫХ ОПУХОЛЕЙ

14 00 25 - фармакология, клиническая фармакология 14 00 14 - онкология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Томск-2007

003055927

Работа выполнена в ГУ НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН, заслуженный деятель науки РФ

доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, заслуженный работник высшей школы РФ

доктор медицинских наук

Гольдберг Евгений Данилович Зуева Елена Петровна

Венгеровский Александр Исаакович Чурин Алексей Александрович

Ведущая организация: ГУ НИИ онкологии Томского научного центра СО РАМН

Защита состоится 2007 года в & часов на заседании диссер-

тационного совета Д 001 031 01 при ГУ НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН (634028, г Томск, пр Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН

Автореферат разослан 2006 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Амосова Е Н

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Онкологическая патология входит в число лидирующих по причине смертности, в связи с чем остается актуальной проблема поиска новых подходов к ее лечению Один из наиболее востребованных методов лечения больных со злокачественными новообразованиями - химиотерапевтический, в большинстве случаев является единственно эффективным способом воздействия на распространенный опухолевый процесс В последние годы в онкологии достигнут несомненный прогресс, связанный с внедрением новых схем медикаментозной терапии, что позволяет значительно повысить выживаемость пациентов, увеличить продолжительность их жизни и улучшить ее качество Однако цитостатическое лечение не дает полной гарантии на выздоровление, не исключает возникновения рецидивов и метастазов, а также имеет ряд других недостатков [Евтушенко Г В и др , 2000, Gramignano G et al, 2006] Особенностью химиотерапии опухолей является малый терапевтический интервал, поэтому цитостатики небезопасны для организма даже в рекомендованных для клинического применения дозировках Токсическое влияние большинства цитостатиков на активно пролиферирующие клетки организма существенно ограничивает их применение, приводя к снижению эффективности лечения или даже к его отмене Отсутствие строгой избирательности действия у противоопухолевых препаратов вызывает развитие целого комплекса нарушений отмечаются аплазия кроветворения, поражение слизистых оболочек, желудочно-кишечного тракта, вторичный иммунодефицит, снижение детоксикационной функции печени, возникновение вторичных злокачественных опухолей и т д [Блюмен-берг А Г и др, 2003, Константинова ММ и др , 2005, Belham М et al, 20Об, Nowak D et al, 2006]

В связи с этим становится очевидной проблема повышения эффективности антибластомной терапии и уменьшения ее побочных проявлений, разработки патогенетически обоснованных методов коррекции нарушений гомеостаза, обусловленных развитием опухолевого процесса и/или проводимым цитостатическим лечением. Особое место в ряду препаратов, обладающих способностью не только усиливать эффект цитостатиков, но и существенно снижать их токсичность, занимают созданные на основе лекарственных растений средства, спектр биологической активности которых определяется входящими в их состав веществами различных химических классов, подклассов и групп [Разина Т Г , Зуева Е.П и др , 2005] Именно от их количественного и качественного состава зависит доминирование и степень выраженности того или иного фармакологического эффекта конкретного растения и его выбор при назначении с лечебными и профилактическими целями Преимущество препаратов на основе биологически активных веществ растительного происхождения во многих случаях очевидно, так как, с одной стороны, при их использовании практически отсутствуют осложнения и нежелательные побочные эффекты, а с другой - существует возможность индивидуализации лечения Установлено, что в реализации эффектов комплексных препаратов растительного происхождения важная роль принадлежит флавоноидам, алкалоидам, гликозидам, витаминам, дубильным веществам и т д Менее изученными в этом плане остаются полисахариды Между тем, полисахариды растительного происхождения являются перспективными для создания на их основе корректоров химиотерапии злокачественных новообразований благодаря широкому спектру фармакологического действия

Известно, что биологически активным соединениям этого класса свойственны сорбция радионуклидов, тяжелых металлов, нормализация липидного обмена при гиперлипидемии различной этиологии, активация секреторной и моторной функции кишечника, регуляция иммунитета, модуляция эндокринной системы, противовоспалительная, антикоагулянтная и противоопухолевая активность [Лазарева Е Б, 1999, Furusawa Е et al, 2003, Нала F et al, 2005, Popov S V et al, 2005]. Полисахариды не токсичны и обладают высокой биодоступностью Вполне возможно, что биологически активные вещества с подобным набором фармакологичеасих свойств могут использоваться как средства дополнительной терапии онкологических заболеваний, в частности, при лечении цитостатическими препаратами. Таким образом, представлялось актуальным исследовать действие водорастворимых полисахаридов растений на развитие опухоли и метастазов при их изолированном введении и в сочетании с цитостатиками

Цель исследования Целью исследования явилось изучение действия водорастворимых полисахаридов растений флоры Сибири на рост и метастазирование перевиваемых опухолей в условиях цитостатической терапии

Задачи исследования

1 Проведение скринингового исследования влияния полисахаридных комплексов, выделенных из корневищ аира болотного, побегов багульника болотного, цветков липы сердцевидной, корней солодки голой, корней родиолы розовой, корней одуванчика лекарственного, цветков календулы лекарственной, листьев мать-и-мачехи обыкновенной, корней левзеи сафлоровидной, листьев подорожника большого, цветков эхинацеи пурпурной на рост и метастазирование карциномы легких Льюис у мышей и эффективность цитостатической терапии

2 Углубленное изучение влияния наиболее эффективных средств на рост и метастазирование перевиваемых опухолей животных при их изолированном введении и в сочетании с цитостатиками

3 Исследование возможных механизмов противоопухолевого, противометастати-ческого действия и повышения эффективности цитостатической терапии полисаха-ридными комплексами растительного происхождения

Научная новизна Впервые проведено исследование действия водорастворимых полисахаридов, выделенных из официнального сырья 11 растений флоры Сибири (корневищ аира болотного, побегов багульника болотного, цветков липы сердцевидной, корней солодки голой, корней родиолы розовой, корней одуванчика лекарственного, цветков календулы лекарственной, листьев мать-и-мачехи обыкновенной, корней левзеи сафлоровидной, листьев подорожника большого, цветков эхинацеи пурпурной), на развитие карциномы легких Льюис у мышей как при изолированном их применении, так и в условиях химиотерапии циклофосфаном. В экспериментах установлена принципиальная возможность использования водорастворимых полисахаридов растительного происхождения для повышения эффективности цитостатической терапии опухолей и проведена сравнительная оценка их фармакологической активности В качестве наиболее перспективных для создания

препарата-корректора цитостатической терапии определены водорастворимые полисахариды корневищ аира болотного

Показана способность водорастворимых полисахаридов корневищ аира болотного тормозить рост перевиваемых опухолей карциномы легких Льюис, мела-номы В-16 - у мышей и карциносаркомы Уокера 256 - у крыс, а также повышать эффективность циклофосфана и 5-фторурацила Вскрыты некоторые механизмы противоопухолевого действия полисахаридов аира болотного при изолированном применении у экспериментальных животных и на фоне химиотерапии Продемонстрирована иммуностимулирующая активность водорастворимых полисахаридов корневищ аира болотного у интактных животных Выявлено свойство полисахаридов корневищ аира болотного стимулировать функциональную активность клеток лимфоузлов по отношению к опухолевым клеткам при их изолированном введении и на фоне вызванной цитостатиком иммунодепрессии Показана способность полисахаридов корневищ аира болотного повышать количество Т- и В-лимфоцитов в периферической крови мышей на фоне выраженного опухолевого процесса Доказано, что у животных со злокачественным новообразованием полисахариды аира проявляют гиполипидемическое действие и потенцируют снижение концентрации липидов под действием циклофосфана

Практическая ценность работы На основании проведенных исследований выявлены водорастворимые полисахариды корневищ аира болотного, обладающие противоопухолевыми и антиметастатическими свойствами, повышающие эффективность цитостатической терапии перевиваемых опухолей, проявляющие иммуностимулирующее и гиполипидемическое действие Представленные данные могут служить основой для разработки нового препарата для использования в комплексной терапии больных со злокачественными новообразованиями Результаты диссертационного исследования оформлены заявками на изобретение № 2005139073 «Средство на основе полисахаридов аира болотного, обладающее противоопухолевой активностью, повышающее противоопухолевую и противометастатическую активность цитостатических препаратов» с приоритетом от 14 12 2005 г и № 2006113347 «Средство, обладающее иммуностимулирующей активностью» с приоритетом от 19,04.2006 г

Апробация работы Основные положения диссертационной работы докладывались и обсуждались на конференциях молодых ученых НИИ фармакологии «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2005) и НИИ онкологии «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2006), на 5 Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2006), на 4 Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (Сыктывкар, 2006)

Публикации По материалам диссертации опубликовано 8 работ, из них 4 - в журналах, рекомендованных перечнем ВАК

Объем и структура работы Диссертация изложена на 151 странице машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов, списка использованной литературы Работа иллюстрирована 10 рисунками и 40 таблицами Библиографический указатель включает 266 источников, из них 131 отечественных, 135 иностранных

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Эксперименты проведены на 664 мышах-самках и 12 самцах линии С57В1/6,24 мышах-самцах линии CBA/CaLac и 53 крысах-самцах линии Вистар Животные поступали из лаборатории экспериментального биомоделирования ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (сертификат имеется) Их содержание осуществлялось в соответствии с правилами, принятыми Европейской Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей [European Convention ,1986]

Трансплантацию карциномы легких Льюис и меланомы В-16 мышам линии С56В1/6 производили гомогенатом опухолевой ткани внутримышечно по 4-бхЮ6 опухолевых клеток в 0,1 мл физиологического раствора [Софьина З.П и др, 1980] Карциносаркому 256 Уокера крысам Вистар перевивали 20% взвесью опухолевых клеток в 0,2 мл физиологического раствора под кожу спины

Циклофосфан (ОАО «Биохимию), г Саранск) вводили мышам однократно внутрибрюшинно в дозе 125 мг/кг на 13-15 сут после трансплантации карциномы легких Льюис и на 19 сут после перевивки меланомы В-16 Крысы с карциносарко-мой 256 Уокер получали циклофосфан в дозе 40 мг/кг внутрибрюшинно на 10 сут развития опухоли. 5-фторурацил («Дарница», г. Киев) вводили мышам внутримышечно однократно в дозе 80 мг/кг на 14 сут после перевивки карциномы легких Льюис

Водорастворимые полисахариды получали из фармакопейного сырья фракционным методом [Методы химии углеводов ., 1980] Выделенные ВРПС и сведения об их количественном содержании в растительном сырье и качественном составе предоставлены кафедрой фармакогнозии с курсом ботаники ГОУ «Сибирский Государственный медицинский университет» (г. Томск)

Сухие ВРПС растворяли дистиллированной водой из ампул заводской фасовки В экспериментах на модели карциномы легких Льюис ВРПС растений вводили внутрибрюшинно ежедневно в дозе 10 и 25 мг/кг с 7 сут развития LLC (11-12 введений) Мышам с меланомой В-16 ВРПС корневищ аира болотного вводили с 13 сут развития опухоли в дозах 5, 10, 25 и 50 мг/кг (10 введений) Крыс с карцино-саркомой 256 Уокер лечили полисахаридами аира с 6 сут развития опухоли внутрибрюшинно в дозе 25 мг/кг, а дозу 75 мг/кг ВРПС аира вводили per os (10 введений)

По окончании экспериментов животных умерщвляли, соблюдая "Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных", проводили вскрытие, ревизию внутренних органов, выделение опухоли и метастазов Эффективность проведенных курсов лечения оценивали по противометастатическому и противоопухолевому действию препаратов у мышей с меланомой В-16 - на 24 сут, с карциномой легких Льюис - на 21-22 сут, у крыс с карциносаркомой 256 Уокер - на 17 сут после перевивки Вычисляли процент торможения роста опухоли ТРО [Софьина ЗП идр, 1980]

При оценке интенсивности процесса метастазирования использовали несколько критериев

- частоту метастазирования опухолей вычисляли в процентах (по отношению числа животных с метастазами к общему количеству животных в группе),

- подсчитывали среднее количество метастазов у одного животного в группе,

- определяли диаметр метастазов, а затем по формуле яг2 высчитывали их среднюю площадь [Dingemane К Р et al, 19&5],

- величину различия в метастазировании опухоли между контролем и опытом оценивали по индексу ингибирования метастазирования [Архипов С А, Юнкер В М, Грунтенко Е В , 1984]

Интенсивность лимфогенного метастазирования у крыс с карциносаркомой 256 Уокера оценивали, определяя массу лимфатических узлов В проведенных ранее экспериментах подозрительные на наличие метастазов лимфоузлы крыс с карциносаркомой 256 Уокера исследовали гистологически фиксировали в 10% формалине, заливали в парафин и через поверхность делали срезы, которые окрашивали гематоксилином по Караци Поскольку гистологическое исследование подтвердило, что подмышечные и паховые лимфоузлы массой 150 мг и более, парааор-тальные - 50 и более мг являются метастазами, в дальнейшем его производили только в сомнительных случаях.

Изучение иммунотропньгх свойств водорастворимых полисахаридов корневищ аира болотного проводилось согласно методическим рекомендациям "Экспериментальное изучение иммунотропной активности фармакологических препаратов" и "Методическим указаниям по оценке иммунотоксического действия фармакологических веществ"(2000), утвержденных ФК МЗ РФ

Иммунотропные свойства оценивались по влиянию препарата на следующие показатели у интактных мышей линии CBA/CaLac и С57В1/6

- гуморальный иммунный ответ Для этого мышей в конце 5-дневного курса введения ВРПС аира или воды для инъекций иммунизировали минимальными дозами эритроцитов барана (5х10б/мышь однократно внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл) [Хаитов Р М и др, 1999] На 4 и 7 сут после иммунизации определяли общепринятыми методами общую клеточность селезенки а также относительное (%) и абсолютное (х 106) количество антителообразующих клеток в селезенке мышей и титр антител IgM и IgG в сыворотке крови с помощью стандартной реакции гемагглю-тинации [Иммунологические методы. , 1987, Гольдберг БД и др , 1992],

- реакция гиперчувствительности замедленного типа [Экспериментальное изучение , 2000] Сенсибилизацию мышей эритроцитами барана проводили в конце 10-дневного курса введения полисахаридов аира болотного,

- фагоцитарная активность макрофагов перитонеального экссудата Оценивалась через 72 ч после окончания 5-дневного курса введения ВРПС аира или воды для инъекций по способности этих клеток поглощать суточную культуру St aureus, штамм 209.

Состояние иммунологической реактивности мышей линии С57В1/6 с опухолями оценивали, используя следующие показатели

- определение функциональной активности клеток лимфоузлов в тесте нейтрализации опухолевых клеток Винна [Winn Н J , 1961],

- идентификация популяций лимфоцитов (Т-, В-, "нуль") по характеру появления реакции на кислую фосфатазу на мазках крови [Глузман Д Ф и др , 1985]

Изучение показателей периферической крови (общее количество лейкоцитов, лейкоцитарная формула) производили общепринятыми гематологическими методами [Гольдберг Е Д и др, 1992]

s

Определение содержания липидов проводили в сыворотке крови крыс фос-форнованилиновым методом с помощью стандартного набора реактивов фирмы «Pliva - Lachema as» [Камышников В С., 2000].

Обработку полученных результатов проводили с использованием непараметрических критериев. U - Вилкоксона-Манна-Уитни и точного теста Фишера Различия считали достоверными при р<0,05 [Лакин Г Ф.,1980].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВ АНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Проведенный в настоящей работе скрининг позволяет условно разделить представленные растительные полисахариды по характеру влияния на карциному легких Льюис при их изолированном введении и/или в сочетании с химиотерапией на четыре группы

В первую группу вошли ВРПС, в большей степени повышающие эффективность циклофосфана в отношении основного опухолевого узла (левзея сафлоро-видная, одуванчик лекарственный, подорожник большой) (табл 1) Когда ВРПС левзеи в дозе 10 мг/кг сочетали с цитостатиком, наблюдалось усиление противоопухолевого эффекта последнего, что выражалось в достоверном увеличении процента торможения роста LLC Так, если под действием циклофосфана масса опухоли не снижалась, то применение комбинированной схемы лечения приводило к ее уменьшению на 26% относительно контроля Кроме того, полисахариды левзеи в дозе 25 мг/кг обладали самостоятельным противоопухолевым эффектом (табл 1).

При совместном назначении ВРПС одуванчика и цитостатика масса опухоли снижалась на 20% по сравнению с этим показателем у нелеченых мышей и была достоверно меньше, чем у получавших только химиотерапию животных (табл 1)

Добавление ВРПС подорожника в схему лечения циклофосфаном повышало противоопухолевый эффект цитостатика, что выражалось в достоверном уменьшении массы основного опухолевого узла у мышей на 20% относительно леченных только циклофосфаном животных (табл 1)

Считается, что основным механизмом действия полисахаридов растительного происхождения на канцерогенез является их способность влиять на иммунитет По литературным данным известно, что они могут увеличивать экспрессию молекул главного комплекса гистосовместимости на поверхности опухолевых клеток, что индуцирует активацию принимающих участие в противораковой защите лимфоцитов и приводит к торможению роста злокачественного образования. Известно и о непосредственном влиянии полисахаридных комплексов без участия клеток иммунной системы на пролиферацию опухолевых клеток [Kim Н et al, 1996, Iguchi С. et al, 2001, Li G etal,2004]

Во вторую группу вошли полисахариды из растений, преимущественно оказывающие воздействие на процесс диссеминации злокачественного новообразования и повышающие противометастатический эффект циклофосфана - из ро-диолы розовой и солодки голой Полисахариды родиолы розовой при назначении совместно с циклофосфаном достоверно снижали частоту метзстазирова-ния у мышей с опухолью до 80% относительно 100% в группе леченных только

Таблица 1 Влияние водорастворимых полисахаридов растений Сибири на развитие карциномы легких Льюис у

мышей и эффективность лечения циклофосфаном

ВРПС растений ТРО, % Частота метастазирования, % Количество метастазов на 1 мышь (Х±т) Площадь метастазов, мм2 (Х±т)

ВРПС ЦФ ЦФ+ ВРПС К ВРПС ЦФ ЦФ+ ВРПС К ВРПС ЦФ ЦФ+ ВРПС К ВРПС ЦФ ЦФ+ ВРПС

одуванчика, 10 мг/кг 6 8* 20** 100 100 100 90 48,27± 4,10 53,67± 24,59 17,67± 5,27* 8,00± 1,76 68,10± 15,72 103,4± 23,81 9,88± 3,73* 4,85± 2,01

7свзеи, 10 мг/кг -8 2 26** 100 90 40* 30 6,30± 1,11 8,80± 2,39 0,80± 0,42* 1,10± 0,72 б,33± 2,65 5,74± 2,17 0,23± 0,20* 0,3 0± 0,27

левзеи, 25 мг/кг 18* 38* 39 100 100 70* 56 31,70± 2,88 26,90± 2,82 4,40± 1,78 2,22± 1,09 66,10± 14,62 47,33± 11,87 1,39± 0,90 0,86± 1,40

подорожника, 10 мг/кг -4 2 22** 100 90 40* 50 6,30± 1,11 9,00± 1,87 0,80± 0,42* 1,90± 1,07 6,33± 2,65 7,01± 2,71 0,23± 0,20* 0,50± 0,44

подорожника, 25 мг/кг -5 38* 24 100 100 70* 60 31,70± 2,88 25,63± 2,47* 4,40± 1,78 2,30± 0,72 66,10± 14,22 40,25± 7,45 1,3 9± 0,90* 0,63± 0,30

родиолы, 10 мг/кг 4 8 9 100 100 100 80** 48,27± 4,1 42,4± 4,79 !7,67± 5,27* 12,50± 4,58 68,10± 15,72 90,15± 22,11 9,88± 3,73* 6,23± 3,35

солодки, 10 мг/кг -5 8 14* 100 100 75* 90 23,92± 3,37 17,33± 5,93* 4,25± 1,87* 5,50± 1,28 25,66± 7,46 17,46± 7,81 1,62± 0,99* 2,11± 0,76**

липы, 10 мг/кг 2 -3 19** 100 90 83* 60 18,00± 3,55 14,40± 3,10 5,83± 1,82* 3,00-Ь 1,00 16,36± 4,99 14,75± 5,76 1,14± 0,40* 1,17± 0,58

эхинацеи, 10 мг/кг 12 8 22** 100 100 89 86 19,20± 2,35 20,22± 2,80 8,33± 1,78* 5,86± 1,44 20,42± 4,19 32,30± 8,43 4,40± 1,00* 1,56± 0,54**

багульника, 10 мг/кг -8 -3 19** 100 100 83* 67 18,00± 3,55 12,10± 2,06 5,83± 1,82* 2,44± 1,02 16,36± 4,99 9,23± 4,43 1,14± 0,40* 0,33± 0,20

мать-и-мачехи, 10 мг/кг -5 8* 19** 100 100 100 75** 48,27± 4,10 41,80± 6,54 17,67± 5,27* 8,63± 2,74 68,10± 15,72 74,41± 23,84 9,88± 3,73 3,35± 1,29

аира, 10 мг/кг 15* 8 31** 100 100 89 70* 19,20± 2,35 21,90± 3,18 8,33± 1,78* 2,70± 1,25** 20,42± 4,19 33,48± 8,50 4,40± 1,00* 1,56± 0,95**

календулы, 10 мг/кг -9 8 12 100 100 75* 89 23,92± 3,37 22,90± 3,44 4,25± 1,87* 4,22± 1,88 25,66± 7,46 27,29± 7,35 1,62± 0,99* 2,91± 1,37

Примечание * - достоверная разница с контролем (Р <0,05), ** - достоверная разница с группой «ЦФ» (Р <0,05),

К - контрольная группа

цитостатиком животных (табл 1) При изолированном использовании полисахаридов солодки голой достоверно (в 1,4 раза) уменьшалось количество метастазов на 1 мышь по сравнению с контролем, однако в группе комбинированного лечения показатели, характеризующие процесс мегастазирования, оказались несколько выше, чем при лечении одним цитостатиком (табл 1). Механизм антиметастатического действия полисахаридов, помимо активизации клеточных эффекторов системы естественной резистентности организма, может быть связан с непосредственной блокадой выработки сосудистого эндотелиального фактора роста [Yang J et al, 2005]

Третью группу составили полисахариды из растений, повышающие эффективность действия циклофосфана в отношении основного опухолевого узла и метастазов - из аира болотного, мать-и-мачехи обыкновенной, эхинацеи пурпурной и багульника болотного

Применение полисахаридов аира болотного у мышей с карциномой легких Льюис приводило к достоверному снижению массы опухоли как при изолированном, так и при сочетанном с циклофосфаном назначении по сравнению с соответствующими контролями (табл 1) Частота, количество и площадь метастазов в легких экспериментальных животных при совместном применении полисахаридов аира и цитостатика были достоверно меньше таковых в группе изолированной химиотерапии

При комбинированном назначении с циклофосфаном полисахаридов мать-и-мачехи масса опухоли относительно группы, которой вводили только цитостатик, значимо уменьшалась Частота метастазирования у мышей с LLC, которым проводилась терапия циклофосфаном и полисахаридами мать-и-мачехи, достоверно снижалась и составляла 75% против 100%, наблюдавшихся у леченных только цитостатиком животных (табл I)

Применение полисахаридов багульника болотного на фоне циклофосфана вызывало достоверное снижение массы первичного опухолевого узла в 1,3 раза по отношению к этому показателю у животных, получавших один цитостатик Следует отметить, что интенсивность процесса диссеминации в легких мышей данной группы имела тенденцию к снижению относительно значений у леченных циклофосфаном

Сочетанное применение химиопрепарата и полисахаридов эхинацеи пурпурной вызывало торможение роста опухоли на 22% по сравнению с контролем, причем данный показатель достоверно разнился с таковым в группе леченных только циклофосфаном мышей Площадь метастатических узлов у животных, получавших комбинированную терапию полисахаридами эхинацеи и циклофосфаном, уменьшалась в 2,8 раза по сравнению с группой мышей, которым был назначен один цитостатик (табл 1)

Среди растительных полисахаридов, вошедших в скрининговое исследование, обнаружены неактивные в отношении карциномы легких Льюис - полисахариды календулы лекарственной (табл 1)

Многочисленные исследования свидетельствуют о наличии связи меяеду степенью активации иммунитета, структурой, молекулярной массой и степенью разве-етвленности углеродного скелета вводимого в организм полисахарида Химическая обработка полисахаридов, приводящая к изменению вторичной структуры, изменяет их биологические свойства Например, по мере очистки полисахаридных

фракций некоторых высших растений их биологическая активность повышается [Topo Т, 1977, Im S et al, 2005, Peng Y et al, 2005] Показано, что степень активации иммунной системы зависит и от дозы вводимого полисахарида, которая индивидуальна для каждого из них Существует так называемый эффект оптимальной дозы, выше которой их действие значительно ниже или вообще не проявляется [Бе-седнова Н Н и др, 2000, Kim G , Choi G. et al, 2004] В реализации биологического действия полисахаридов существенную роль играет также выбранный путь введения веществ [Park S et al, 2004]

Для дальнейшего углубленного исследования были выбраны полисахариды аира болотного, поскольку полученные в настоящей работе данные свидетельствуют об их способности влиять на развитие опухолевого процесса достаточно разносторонне и наиболее выраженно по сравнению с другими растениями Важное значение при выборе объекта для дальнейшего исследования имели и сведения об ареале его распространения и запасах Известно, что ресурсные запасы растительного сырья корневищ аира болотного на территории России достаточны для организации промышленного производства лекарственного средства [Растительные ресурсы , 1994] В настоящее время районом промышленной заготовки корневищ аира является преимущественно Украина и Белоруссия, ресурсный же потенциал данного вида в азиатском регионе практически не используется В традиционной и народной медицине самостоятельно и в составе сборов препараты аира болотного употребляют как местное антисептическое, отхаркивающее, тонизирующее, седа-тивное, противосудорожное, жаропонижающее, снотворное, болеутоляющее, спазмолитическое и противоопухолевое средство Официнальное сырье включено в отечественную фармакопею I - XI изданий и фармакопеи многих стран мира В современной клинической практике используются корневища аира болотного в виде отвара в качестве ароматической горечи, повышающей аппетит и улучшающей пищеварение [Растительные ресурсы России , 1994] Этим ограничивается применение аира болотного в медицине, несмотря на огромный лекарственный потенциал этого растения Анализ ассортимента препаратов показывает, что на сегодняшний день в арсенале отсутствует рациональная лекарственная форма на основе БАВ из аира болотного, а существующие в литературе данные об экспериментальном изучении извлечений из корневищ аира болотного и, тем более, его отдельных биологически активных субстанций, немногочисленны и фрагментарны

На начальном этапе углубленного изучения свойств ВРПС аира болотного были поставлены эксперименты, в одном из которых назначался цитостатик 5-фторурацил, относящийся к группе антиметаболитов и обладающий отличным от циклофосфана механизмом действия, в другом - использовалась иная модель опухолевого роста (меланома В-16) и разные дозы испытуемых БАВ, а в третьем - активность ВРПС аира проверялась на другом виде животных (крысы) с карциносар-комой 256 Уокера при различных путях введения

При монотерапии 5-фторурацилом масса опухоли у мышей с LLC снижалась на 14 % по сравнению с таковой в контрольной группе животных Добавление в схему лечения цитостатиком полисахаридов аира болотного достоверно увеличивало процент торможения опухоли до 29% (Р<0,05) относительно этого показателя в группе леченных только 5-ФУ мышей

В эксперименте с меланомой В-16 водорастворимые полисахариды корневищ аира болотного в дозах 10, 25 и 50 мг/кг, применяемые совместно с циклофосфа-ном, значительно повышали его антиметастатический эффект Наибольший терапевтический эффект наблюдался при введении полисахаридов в дозе 50 мг/кг совместно с циклофосфаном Кроме того, ВРПС корневищ аира проявляли самостоятельное противометастатическое действие в отношении данной модели опухолевого роста Наименьшая частота метастазирования (25%) зафиксирована в группе мышей, получавших ВРПС аира в дозе 50 мг/кг, что значительно ниже контрольного значения (100%), а также достоверно меньше такового в группе животных, получавших циклофосфан (70%)

В эксперименте, проведенном на крысах-самцах линии Вистар, показано, что вводимые как внутрижелудочно, так и внутрибрюшинно ВРПС корневищ аира болотного значительно усиливали терапевтический эффект циклофосфана Кроме того, исследуемые БАВ в дозе 25 мг/кг, применяемые внутрибрюшинно, достоверно тормозили рост карциносаркомы 256 Уокера у крыс Полисахариды аира в дозе 75 мг/кг при их изолированном назначении внутрижелудочно животным с опухолью наиболее выраженно повлияли на процесс диссеминации неоплазмы- частота лим-фогенного метастазирования составляла 13%, что достоверно ниже контрольного значения (67%)

Результаты данных экспериментов позволяют говорить о возможности использования ВРПС корневищ аира в сочетании цитостатическими агентами различного механизма действия с целью повышения их эффективности Чувствительными к действию данных БАВ оказались разные виды животных (мыши, крысы) и опухолевые штаммы с отличными друг от друга свойствами и путями метастазирования (карцинома легких Льюис, меланома В-16, карциносархома256 Уокер)

Как известно, полисахариды являются основным структурным звеном клеточных мембран и энергетическим материалом всякой живой клетки - от бактерий, простейших, грибов, растений до высших млекошггающих Не трудно предположить, что взаимоотношения между организмом и попадающим в него говне полимером данного класса будут специфичными В исследованиях последних лет доказано, что основной путь реализации биологической активности полисахаридов различной природы, в том числе, и растительной, заключается в модуляции иммунного ответа В связи с этим целесообразной была постановка в настоящей работе экспериментов, по изучению иммунотропных свойств ВРПС корневищ аира болотного

Для этого водорастворимые полисахариды, полученные из корневищ аира болотного, вводили высоко отвечающим здоровым мышам линии СВА/СаЬас, и мышам линии С57В1/6 со слабым иммунным ответом, а затем определяли показатели гуморального и клеточного иммунитета Обнаружено, что, вне зависимости от реактивности иммунной системы опытных животных, после курса инъекций изучаемых полисахаридов аира количество антителообразующих клеток и титр специфических гемагглютининов повышались (табл 2,3)

Таблица 2

Влияние водорастворимых полисахаридов корневищ аира болотного на гуморальный иммунный ответ мышей линии СВАУСа Lac (X±m)_

Группа наблюдения (количество животных) Показатели Сроки исследования

4 сут 7 сут

1 Контроль - эритроциты барана(6) ОКС, 106/орган 200,60±11,25 193,80±18,86

АОК, % 11,26±0,42 13,10±0,89

АОК, Ю'Уоргап 22,60±1,61 25,64dt3,69

IpM, log2T 3,00±0,00 3,40±0,24

IgG, lofeT 0,00±0,00 2,80±0,37

2 ВРПС аира 10 мг/кг х 5 + эритроциты барана (6) ОКС, Ю'7орган 196Д0±12,67 232,20±22,96

АОК, % 9,69±0,73 18,54±0,69*

АОК, 106/орган 18,78±1,27 42,S9±4,21*

IgM, 10g2T з,оо±о,о 3,00±0,0

IrG, loftT 5,00±0,91* 5,40±0,81*

Кроме того, под действием ВРПС аира происходила активация одного из важнейших звеньев неспецифической резистентности у здоровых мышей - фагоцитоза Отмечено повышение численности макрофагов, способных поглощать стафилококки (в 1,4 раза относительно контроля), и количества поглощенных каждой клеткой микроорганизмов (в 2,1 раза) Таким образом, эксперименты на интактных животных показали, что ВРПС аира болотного стимулируют функциональную активность гуморального и неспецифического звеньев иммунитета.

Таблица 3

Влияние водорастворимых полисахаридов корневищ аира болотного на гуморальный иммунный ответ мышей линии С57В1/6 (Х±т)_

Группа наблюдения (количество животных) Показатели Сроки исследования

4 сут 7 сут

1 Контроль - эритроциты барана (б) ОКС, 106/орган 186,60±5,П 146,60± 19,43

АОК, % 13Д6±0,94 11,93±0,36

АОК, 106/орган 24,56±3,25 17,49±2,76

2 ВРПС аира 10 мг/кг х 5 + эритроциты барана (6) ОКС, 10%рган 235,8±11,10* 280,25±30,28*

АОК, % 15,77±1,95 12 77±0,63

АОК, 10%рган 37,19±3,11* 35,78±1,86*

В дальнейших исследованиях устанавливалась роль иммунотропных свойств полисахаридов аира болотного в противоопухолевой защите организма в условиях цитостатической терапии Для решения поставленной задачи был проведен тест Винна, позволяющий определить функциональную активность клеток лимфоузлов - популяции, богатой клетками-эффекторами различных звеньев иммунитета, по их способности тормозить рост и метастазирование опухоли при перевивке мышам смеси лимфоидных и злокачественных клепж.

1 Полученные от интактных животных клетки лимфоузлов при совместной трансплантации с карциномой легких Льюис не повлияли на рост опухолевого узла его масса не отличалась от таковой в контрольной группе мышей Однако обнаружено, что клетки лимфоузлов интактных животных несколько снижали показа-

тели метастазирования перевитой вместе с ними опухоли по сравнению с контрольными значениями (табл 4)

Возможно, клетки лимфоузлов интактных животных, у которых не было опухоли, а значит, первичной антигенной стимуляции, оказались не готовы к нейтрализации злокачественного новообразования, как и показали результаты эксперимента

При добавлении клеток лимфоузлов от нелеченых животных с карциномой легких Льюис к перевиваемой опухоли количество метастазов достоверно увеличивалось относительно показателей в группе мышей, которым трансплантировали опухоль с лимфоидными клетками интактных животных, наблюдалась тенденция к увеличению площади метастатического поражения (табл 4) Все это свидетельствовало о снижении активности лимфоидных клеток по отношению к опухолевым в результате развития у мышей карциномы легких Льюис Как известно, одним из важных факторов опухолевого роста является дефектность иммунного ответа, что проявляется в его неадекватной инициации, и, как следствие, развитии иммуносу-прессии Результаты нашего исследования подтверждают, что опухоль в организме мышей-доноров действовала на клетки лимфоузлов таким образом, что они потеряли способность к эффекторной элиминации злокачественно измененных клеток Более того, они способствовали процессу метастазирования трасплантированной совместно с ними карциномы легких Льюис, что выражалось в достоверном увеличении количества метастатических колоний в легких животных-реципиентов

Таблица 4

Функциональная активность клеток лимфоузлов мышей-самок линии С57В1/6 после введения циклофосфана и водорастворимых полисахаридов корневищ аира болотного

Группа наблюдения (количество животных) Масса опухоли (X±m),r ТРО, % ЧМ,% Количество метастазов на 1 мышь (Х±ш) Площадь метастазов на 1 мышь (Х±т),мм2 НИМ, %

1 Контроль (9) 5,55±0,22 - 100 32,8±5,2 121,3*41,0 -

2 Опухоль + лимфоузлы интактных мышей (10) 5,70±0,15 -3 100 28,1*3,1 105,4±23,5 14

3 Опухоль + лимфоузлы нелеченых мышей с LLC (9) 5,70±0,36 -3 100 4б,8±8,2 2-ЗР<0,05 177,5±46,0 -43

4 Опухоль + лимфоузлы леченных ЦФ мышей (9) 6,47±0,30 3-4Р<0,05 -17 100 35,3*2,6 171,2±17,6 -8

5 Опухоль + лимфоузлы леченных BPIIC аира мышей (10) 4,50±0,51 3-5Р<0,05 19 100 28,7±4,7 3-5Р<0,05 113,9±26,0 13

6 Опухоль + лимфоузлы леченных ЦФ и ВРПС аира мышей (10) 4,03±0,40 4-6Р<0,01 27 100 27,3±2,6 3-6Р<0,05 52,6±12,6 4-6Р<0,01 17

Примечание Здесь и далее перед уровнем значимости Р указаны номера сравниваемых групп

В начале опухолевой агрессии в определенном регионе организма быстро развивается воспаление, в которое вовлекается регионарный лимфатический узел Это сопровождается временной задержкой в нем рециркулирующих лимфоцитов, преимущественно, Т-класса. Известно, что около 70% клеток лимфатических узлов

представлено Т-клетками, среди которых около 30% составляют Т-киллеры (CD8+) и около 40% - Т-хелперы (CD4+). В регионарном лимфатическом узле избирательно скапливаются Т-клетки тех клонов, которые распознают антиген и которым предстоит реагировать на него [Хаитов Р М, 1999] Полисахариды корневищ аира болотного, по-видимому, способствуют процессу формирования специфического иммунного ответа по Т-типу, что подтверждается в проведенном эксперименте При трансплантации опухоли совместно с клетками лимфоузлов мышей, леченных полисахаридами аира болотного, отмечалось снижение массы опухолевого узла относительно нелеченых мышей (табл 4) Активированные клетки лимфоузлов мышей, леченных полисахаридами аира, тормозили диссеминацию опухоли по сравнению с таковой в группе животных, которым опухоль перевивали совместно с клетками лимфоузлов нелеченых мышей

Циклофосфан имеет широкий спектр противоопухолевой активности, реализующийся за счет угнетения митоза интенсивно пролиферирующих тканей, как злокачественно перерожденных, так и здоровых, в том числе, и лимфоидной, что приводит к глубокой иммунодепрессии Под влиянием цитостатика в данном эксперименте наблюдалось снижение функциональной активности тестируемых клеток масса опухолевого узла у мышей, которым были введены клетки лимфоузлов от леченных циклофосфаном мышей, была достоверно больше, чем в группе животных, которым трансплантировали смесь лимфоидных и опухолевых клеток нелеченых мышей (табл 4)

При комбинированной терапии циклофосфаном и полисахаридами аира наблюдалась стимуляция активности клеток лимфатических узлов после их перевивки совместно с опухолью достоверно снижалась ее масса относительно группы животных, которым трансплантировали совместно с LLC лимфоидные клетки леченных циклофосфаном мышей Следует отметить, что после введения цитостатика клетки лимфоузлов не оказывали влияния на изменение такого показателя их активности, как количество метастатических узлов, тогда как после курсового лечения ВРПС на фоне циклофосфана тестируемые клетки обладали способностью ин-шбировать образование метастазов перевитой совместно с ними опухоли (табл 4).

Таким образом, одним из механизмов действия водорастворимых полисахаридов корневищ аира болотного при сочетанном применении с циклофосфаном для лечения перевиваемых опухолей является активация ими клеток лимфоузлов, в состав которых, как известно, на 70% входят Т-лимфоциты, участвующие в развитии специфического противоопухолевого иммунного ответа

В дальнейшем, при постановке теста, в котором распознавали лимфоциты периферической крови мышей по цитохимической реакции на кислую фосфатазу — маркер Т-лимфоцитов [Глузман Д Ф и др., 1985], обнаружено, что у интактных мышей в периферической крови лимфоциты по субклассам распределялись равномерно, без преобладания отдельных из них (рис) Развитие опухолевого процесса приводило к значительным сдвигам равновесия Так, повышение общего количества лейкоцитов в ответ на злокачественный рост сопровождалось увеличением численности О-лимфоцитов в 2,6 раза по сравнению с интактной группой и некоторым снижением В-клеток (рис) Такая картина крови при опухолевых заболеваниях вполне объяснима Известно, что при «ускользании» от иммунного надзора злокачественно измененная клетка практически не экспрессирует на своей поверхности

антигенных маркеров, по которым идет распознавание иммунной системой и дальнейшая дифференцировка О-лимфоцитов, так называемых «наивных» клеток, в Тили В-лимфоциты Таким образом, реакция со стороны «белой» крови на неопластический процесс сопровождалась пролиферацией неспособных полноценно осуществить элиминацию чужеродного агента незрелых О-лимфоцитов

Следует отметить, что после проведения курса терапии полисахаридами корневищ аира болотного распределение лимфоцитов в крови мышей с LLC изменялось На рисунке показано, что количество Т-клеток увеличивалось в 1,4 раза, В-клеток — в 2,5 раза относительно таковых у нелеченых животных за счет значительного снижения О-лимфоцитов (в 2,6 раза). Полисахариды аира болотного стимулируют трансформацию незрелых лимфоцитов в Т- и В-клетки, которые в дальнейшем способны обеспечить полноценный иммунный ответ организма на опухоль

—в,в*-

4,9"

Щ! 3.8" s ША Ж щ ,//.:,у'/ -

2.8 2>5 2. 1 :- 275"

гщ2,5 гпга IPS 2*

щц зш ШМ о .

==

здоровые животные опухоль опухоль+ВРПС аира

Рисунок Распределение лимфоцитов периферической крови мышей линии С57В1/6 на субпопуляции (Т, В, О) при развитии карциномы легких Льюис и лечении водорастворимыми полисахаридами корневищ аира болотного

Примечание * - значимое (Р <0,05) различие с интактной группой, ** - значимое (Р SO,05) различие с группой нелеченых мышей с LLC

Проведенные эксперименты доказывают, что полисахариды корневищ аира способствуют нормализации функций клеток иммунной системы, измененных влиянием опухоли Использование ВРПС аира на фоне химиотерапии может обеспечить дополнительное разрушающее воздействие на злокачественное новообразование путем влияния на иное, чем у цитостатика, звено канцерогенеза

Развитие опухоли вызывает глубокую дезориентацию гомеосгаза организма, выражающуюся нейроэндокринными, гематологическими, сосудистыми, биохимическими сдвигами, а также изменениями в углеводном, жировом, белковом и водно-солевом балансе В основе нарушения обмена липидов, которое сопровождается снижением резистентности организма к опухолевому процессу, лежит их мобилизация из жировой ткани, уменьшение использования поступающих с пищей триг-

лицеридов и повышение окисления свободных жирных кислот [Torelli G F. et al, 1997]. По литературным данным известно, что развитие опухолей различного гене-за происходит на фоне повышения уровня сывороточных триглицеридов и холестерина, который является одним из пластических элементов обеспечения клеточного роста и деления [Дильман В М, 1987, Wuermli L et al., 2005] Кроме того, обнаружена корреляция между повышенным содержанием липидов в крови больных со злокачественными новообразованиями и интенсивностью их метастазирования в лимфатические узлы [Kitayama J et al, 2004, Sako A et al, 2004] Гиперлипидемия сопровождается подавлением иммунологической реактивности, благоприятно влияет на процесс неоангиогенеза, а за счет снижения концентрации липидов крови ухудшаются условия для развития новых сосудов [Дильман В М, 1983, Wiley Е, Meclain Р, 1988] В настоящее время доказано, что при образовании многих неоплазм человека и животных в организме происходит инволюция тимуса, нарушается нормальное созревание Т-лимфоцитов При опухолевом росте наблюдается усиленный апоптоз тимоцитов Гиперлипопротеидемия, сопутствующая развитию опухолей, может являться одним из индукторов внутритимусной гибели иммуно-цитов [Киселева Е П и др, 2003] Для полисахаридов различной природы характерен гиполипидемический эффект [Luoa Q et al, 2004] Например, пектиновые вещества снижают уровень липидов за счет адсорбции в просвете кишечника [Виноградова Т.А. и др , 2001] Фруктоолигосахариды снижают уровень триацилглице-ридов у крыс за счет угнетения синтеза де-ново в печени жирных кислот Полагают, что олигосахариды модифицируют генную экспрессию липогенных энзимов К тому же, под действием этих полимеров снижается уровень инсулина и глюкозы в сыворотке крови, которые, как известно, принимают активное участие в липогенезе [Delzenne NM et al, 1999], Липиды сыворотки крови у онкологических больных, основную часть которых составляют триглицериды и холестерин, могут стимулировать рост и пролиферацию опухолевых клеток, являясь строительным материалом как для раковых клеток, так и обеспечивающих существование опухоли сосудов Кроме того, повышенный уровень жиров может приводить к иммунодепрес-сии, ослабляя защитные ресурсы организма

Получены данные о связи между массой опухоли животного и уровнем общих липидов сыворотки крови (табл. 5) Корреляция между этими показателями зафиксирована в контрольной группе и у крыс с карциносаркомой 256 Уокера после курса лечения полисахаридами аира болотного (25 мг/кг, внутрибрюшинно) Достоверное снижение уровня липидов у крыс с опухолью относительно контроля наблюдалось как в результате лечения цитостатиком, так и при назначении ВРПС аира внутрибрюшинно и внутрижелудочно, при этом внутрибрюшинное введение полисахаридов усиливало гиполипидемический эффект циклофосфана

Таким образом, в настоящем исследовании доказана принципиальная возможность использования растительных полисахаридов в комплексном лечении онко-патологии Наиболее перспективными для создания на их основе препаратов-корректоров химиотерапии оказались ВРПС корневищ аира болотного Доказана их способность тормозить рост и метастазирование перевиваемых опухолей у животных, повышать эффективность проводимой химиотерапии путем воздействия на защитные силы организма

Таблица 5

Содержание общих липидов в сыворотке крови крыс-самцов линии Вистар с карциносаркомой 256 Уокер после лечения водорастворимыми полисахаридами

Группа наблюдения, доза препарата х число и путь введений (количество животных) Общие липиды (Х±т), г/л Масса опухоли (Х+т), г Коэффициент корреляции, г

1 Контроль (6) 5,711,4 70,06±2,79 0,94 Р=0,005

2 ВРПС аира 25 мг/кг х 10, в/б (6) 2,7±0,6 1-2Р<0,05 63,07±6,66 1-2Р<0,05 0,83 Р=0,04

3 ВРПС аира 75 мг/кг х 10, п/о (6) 2,7±1,2 1-ЗР<0,05 72,70±4,68 0,21 Р=0,69

4 ЦФ 125 мг/кг х 1, в/б (6) 3,3±0,2 1-4Р<0,01 23,70^2,14 1-4Р<0,01 0,29 Р=0,58

5 ВРПС аира 25 мг/кг х 10, в/б + ЦФ 125 мг/кг х 1,в/б(6) 2,0±0,1 4-5Р<0,01 19,31±2,60 -0,14 Р=0,79

6 ВРПС аира 75 мг/кг х 10, п/о + ЦФ 125 мг/кг \1, в/б (6) 3,5±0,02 1-6<0,05 20,18±1,90 -0,20 Р=0,70

Примечание В/б - внутрибрюшинный, п/о - пероральный путь введения препаратов

Стимулируя функциональную активность клеток-эффекторов клеточного и гуморального иммунитета, уменьшая явление гиперлипидемии, характерной для он-копатологии, полисахариды аира могут применяться в качестве дополнительных, вспомогательных средств, снижающих токсическое влияние традиционной терапии цитостатическими препаратами Можно полагать, что лечение больных со злокачественными опухолями с помощью средств, созданных на основе биологически активных полисахаридных компонентов корневищ аира болотного, позволит снизит риск возникновения осложнений, необходимости прекращения химиотерапии, повысит качество жизни пациентов и ее продолжительность Используя полученные новые данные о фармакологических свойствах и механизмах действия полисахаридов корневищ аира болотного, в дальнейшем возможно расширить спектр применения этого растения

ВЫВОДЫ

1. Скрининговое изучение влияния водорастворимых полисахаридов корневищ аира болотного, побегов багульника болотного, цветков липы сердцевидной, корней солодки голой, корней родиолы розовой, корней одуванчика лекарственного, цветков календулы лекарственной, листьев мать-и-мачехи обыкновенной, корней левзеи сафлоровидной, листьев подорожника большого, цветков эхинацеи пурпурной на развитие карциномы легких Льюис у мышей и эффективность лечения циклофосфаном позволило выявить наиболее перспективные для дальнейшего исследования водорастворимые полисахариды аира болотного с целью создания на их основе препаратов-корректоров цитостатической терапии опухолей

2 Водорастворимые полисахариды корневищ аира болотного повышают эффективность терапии карциномы легких Льюис циклофосфаном и 5-фторурацилом у мышей, ингибируют развитие других опухолевых штаммов (меланома В-16, карциносаркома 256 Уокера) у разных видов животных (мыши и крысы) как при изолированном применении, так и в сочетании с цитостатиком

3 Водорастворимые полисахариды корневищ аира болотного проявляют иммуностимулирующее действие у интактных животных, что выражается в повышении количества антителообразующих клеток, титра специфических гемагглютини-нов и фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов

4 Водорастворимые полисахариды корневищ аира болотного повышают активность клеток лимфоузлов по отношению к опухолевым клеткам, в том числе, на фоне вызванной циклофосфаном иммунодепрессии, увеличивают количество Т- и В-лимфоцитов в периферической крови мышей

5 Водорастворимые полисахариды аира болотного проявляют гиполипидеми-ческий эффект у крыс с опухолью, а также потенцируют снижение концентрации липидов под действием циклофосфана

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Роль биологически активных веществ лекарственных растений в повышении эффективности цитостатической терапии перевиваемых опухолей // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - Прил 1 - 2005 - С. 35 - 41 (соавт Разина Т Г, Зуева Е П , Амосова Е Н., Крылова С Г.)

2 Влияние водорастворимых полисахаридных комплексов растительного происхождения на эффективность цитостатической терапии перевиваемых опухолей // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии Материалы конференции - Томск, 2005 - С 23-25 (соавт Гурьев AM)

3 Способность полисахаридов из подорожника большого и липы сердцевидной повышать эффективность цитостатической терапии перевиваемой опухоли // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии' Материалы конференции -Томск, 2005 - С 26-28 (соавт Гурьев AM)

4 The influence of preparation Echinacea purpurea L and its polisaccharide complex on efficacy of cytostatic therapy of transplanted tumors // China-Russia International Conference on Farmacology - Harbin, China 1-4 July, 2005, Harbin Medical University - P 26 - 27 (соавт Разина T Г, Гурьев А М)

5 Некрахмальные полисахариды как корректоры цитостатической терапии экспериментальных опухолей // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины -2006 - Т 142 - № 9 - С 323 - 328 (соавт Разина Т Г, Хотимченко Ю С., Зуева ЕП идр)

6 Фармакогностическое исследование аира болотного и перспективы создания на его основе новых лекарственных средств // Тезисы докладов 4 всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» - Сыктывкар, 2006 - С 242 (соавт Гурьев А М , Юсубов М С , Белоусов М В , Кармалов П А)

7 Растительные полисахариды в экспериментальной онкологии II Российский биотерапевтический журнал -2006 -Т 5 - № 1, - С 17 (соавт РазинаТГ., Шилова Н В , Гурьев А М)

8 Действие водорастворимых полисахаридов корневищ аира болотного на функциональную активность клеток лимфоузлов в условиях цитостатической терапии перевиваемой опухоли // Сибирский онкологический журнал - 2006 - Т 19 - № 3 - С 59-63 (соавт Гурьев А М , Разина Т Г, Амосова Е Н и др)

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АОК - антителообразующие клетки

БАВ - биологически активные вещества

ВРПС - водорастворимые полисахариды

ИИМ - индекс ингибирования метастазирования

ОКС - общая клеточность селезенки

ТРО - торможение роста опухоли

ЦФ - циклофосфан

4M - частота метастазирования

LLC - карцинома легких Льюис, Lung Lewis Carcinoma

5-ФУ -5-фторурацил

Тираж 100 Заказ № 1197 Томский государственный университет систем управления и радиоэлектроники 634050, г Томск, пр Ленина, 40

Актуальность проблемы. По данным мировой статистики, онкологическая патология входит в число лидирующих по причине смертности, в связи с чем остается актуальной проблема поиска новых подходов к ее лечению. Одни из наиболее востребованных методов лечения Сольных со злокачественными новообразованиями - хим и отерапе вткч ее к и ft, в большинстве случае» является единственно эффективным способом воздействия на распространенный опухолевый процесс. В последние годы в онкологии достигнут несомненный прогресс, связанный с внедрением новых схем медикаментозной терапии, что позволяет значительно повысить выживаемость пациентов, увеличить продолжительность их жизни и улучшить се качество. Однако щгтостатнческое лечение не дает полной гарантии на выздоровление, не исключает возникновения рецидивов и метастазов, а также имеет ряд других недостатков [Евтушенко Г-В. и др., 2000; Gramignarto G. et al. 2006]. Особенностью химиотерапии опухолей является малый терапевтический интервал, поэтому цитоста-тнкн небезопасны Д-'i* организма даже в рекомендованных для клинического применения дозировках, Токсическое влияние большинства цитостатнков на активно нролиферируюшие клетки организма существенно ограничивает их применение, приводя к снижению эффективности лечения или лаже к его отмене. Отсутствие строгой избирательности действия у противоопухолевых препаратов вызывает развитие целого комплекса нарушений: отмечаются аплазия кроветворения, поражение слизистых оболочек, желудочно-кишечного тракта, вторичный иммунодефицит, снижение детоксикаиионной функции печени, возникновение вторичных злокачественных опухолей н тл. [Нашинский В Г и др., 1994; Блюменберг А,Г. и др., 2003; Константинова ММ и др., 2005; Bel ham М, et а|. 2006; Nowak D. et al„ 2006].

В связи с этим становится очевидной проблема повышения эффективное™ акгтнбластомиой терапии и уменьшения ее побочных проявлений, разработки патогенетически обоснованных методов коррекции нарушений го* мсостаза, обусловленных развитием опухолевого процесса н/нли проводимым цигостатическим лечением- Особое место в ряду препаратов, обладающих способностью не только усиливать эффект иитостатнков, но и сушсст-оенно снижать их токсичность, занимают созданные на основе лекарственных растений сродства, спектр биологической активности которых определяется, входящими в их состав веществам и различных химических классов, подклассов и групп [Разина Т.Г„ Зуева Е.П- и др„ 2005]- Именно от их количественного н качественного состава зависит доминирование и степень выраженности того или иного фармакологического эффекта конкретного растения н его выбор при назначении с лечебными и профилактическими целями. Преимущество препаратов на основе биологически активных веществ растительного происхождения во многих случаях очевидно, так как, с одной стороны, при их использовании практически отсутствуют осложнения и нежелательные побочные эффекты, а с другой - существует возможность индивидуализации лечения. Установлено, »по в реализации комплексных препаратов растительного происхождения важная роль принадлежит флаво-ноидам, алкалоидам, гликозндам, витаминам, дубильным веществам и т.д. Менее изученными в этом плане остаются полисахариды. Между тем, полисахариды растительного происхождения являются перспективными для создания на их основе корректоров химиотерапии злокачественных новообраэо-илний благодаря широкому спектру фармакологического дейсг&ия. Известно, что биологически активным соединениям этого класса свойственны сорбция радионуклидов, тяжелых металлов, нормализация лнпилного обмена при ги-перлипндемнн различной этнологии, акгиваиня секреторной и моторной функции кишечника, регуляция иммунитета, модуляция эндокринной системы. противовоспалительная, антнкоагулянтная и противоопухолевая активность {Лазарева ЕЛ>., 1909; Futvsawa Е. el at, 2003; Hana F. et aK, 2005; Popov S.V. cl al,, 2005]. Полисахариды не токсичны и обладают высокой бнодос-тулностью. Вполне возможно, что биологически активные вещества с подобным набором фармакологических свойств могут использоваться как средства дополнительной терапии онкологических заболеваний, в частности, при л ечетен цитостатнческими препаратами. Таким образом, представлялось акту» ильным исследовать действие ыодорастворнмых полисахаридов растений на развтие опухоли н метастазов при их изолированном введении и в сочетании с щпоетатнками. растворимых полисахаридов растений флоры Сибири на рост и метастазиро» панне перевиваемых опухолей в условиях ннтостатнческой терапии,

Задач» исследования

1 Проведение схришшгово! о исследования влияния иолнеахарндных комплексов. выделенных нз корне вши аира болотного, побегов багульника болотного, цветков лнпы сердцевидной, корней солодки голой, корней роднолы розовой, корней одуванчика лекарственного, цветков календулы лекарственной, листьев мать-и-мачехи обыкновенной, корней левзеи сафлоровидной, листьев подорожника большого, цветков эхинаиеи пурпурной на рост н мета-стазиро ванне карциномы легких Льюис у мышей и эффективность цитоста-тической терапии,

2. Углубленное изучение влиянии наиболее эффективных средств на рост и метастаэироваинс перевиваемых опухолей животные прм их изолированном введении и в сочетании с цнтостатнкамн.

3, Исследование возможных механизмов противоопухолевого, противомста-статического действия и повышения эффективное™ ннтостатнчсской терапии полисахариды ьшн комплексами растительного происхождения.

Научная новизна. Впервые проведено исследование действия водорастворимых полисахаридов, выделенных нэ официального сырья 11 растений флоры Сибири (корневнш аира болотного, побегов багульника болотного, пест-ков лнны сердцевидной, корней солодки голой, корней, родиолы розовой, корней одуванчика лекарственного, цветков календулы лекарственной, ли

Целыо исследования явилось изучение действия водастьев мать-и-мачехи обыкновенной, корней левзеи сафлоровидной., листьев подорожника большого» цветков эхннацен пурпурной), на развитие карциномы легких Льюис у мышей как при изолированном их применении, так и в условиях химиотерапии ннклофосфаном. В экспериментах установлена принципиальная возможность использования водорастворимых полисахаридов растительного происхождения для повышения эффективности питоета-тичсской терапии онколей и проведена сравнительная опенка нх фармакологической активности, В качестве наиболее перспективных для создания препарата-корректора цихостатичеекой терапии определены водорастворимые полисахариды корневищ аира болотного.

Показана способность водорастворимых полисахаридов корневищ аира болотного тормозить рост перевиваемых опухолей; карциномы легких Лыонс, меланомы В-16 - у мышей н каринносаркомы Уокера 256 - у крыс, а также повышать эффективность инклофосфана и 5-фторурацнла, Вскрыты некоторые механизмы противоопухолевого действия полисахаридов аира болотного при изолированном применении у экспериментальных живот ныл и на фоне химиотерапии, Продемонстрирована иммуностимулирующая активность водорастворимых полисахаридов корневищ аира болотного у и шахтных животных. Выявлено свойство полисахаридов корневищ аира болотного стимулировать функциональную активность клеток лимфоузлов по отношению к опухолевым клеткам при их изолированном введении н на фоне вызванной интостатиком нммуноденрессии. Показана способность полисахаридов корневищ аира болотного повышать количество Т- н В-лнмфопитов в периферической крови мышеи на фоне выраженного опухолевого процесса. Докатано, что у животных со злокачественным новообразованием полисахариды аира проявляют гн полип ил смичес кос действие и потенцируют снижение концентрации липндов под действием инклофосфана. Практическая ценность работы, На основании проведенных исследований выявлены водорастворимые полисахариды корневищ аира болотного, обладающие противоопухолевыми н антиметаетатнческнмн свойствами, повышающке эффективность цнтостатнческой терапии перевиваемых опухолей, проявляющие нммуиомодулнрующее и гнполнпндемнческое действие. Представленные данные могут служить основой для разработки нового препарата для использования в комплексной терапии больных со злокачественными новообразованиями. Результаты диссертационного исследования оформлены заявками на изобретение № 2005139073 «Средство, на основе полисахаридов аира бологного, обладающее противоопухолевой активностью, повышающее противоопухолевую н протнвомешетати ческу jo активность цитостатнческнх препаратов» с приоритетом от 14.12,2005 и № 2006113347 «Средство, обладающее иммуностимулирующей активностью» с приоритетом от 19.04.2006. Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докладывались и обсуждались на конференциях молодых ученых НИИ фармакологии «Актуальные проблемы экспериментальной н клинической фармакологии» (Томск, 2005) и НИИ онкологии «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2006), на 5 Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2006), на 4 Всероссийской научной конференции «Химия и технологи растительных веществ» (Сыктывкар, 2006).

Публикации. Г1о материалам диссертации опубликовано 8 работ, нэ них 4 - в журналах, рекомендованных перечнем ВАК.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 151 странице машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов, списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 10 рисунками и 40 таблицами. Библиографический указатель включает 266 источника, из них 131 отечественных, 135 иностранных.

124 ВЫВОДЫ

I Скрининговое изучение влияния водорастворимых полисахаридов корневищ аира болотного, побегов багульника болотного, цветков лнпы сердцевидной, корней солодки голой, корней радиолы розовой, корней одуванчика лекарственного, цветков календулы лекарственной, листьев мать-И-мачехи обыкновенной, корней левзеи сафлоровндной. листьев подорожника большого, цветков эхинацен пурпурной на развитие карциномы легких Льюис у мышей и эффективность лечения цнклофосфаном позволило выявить наиболее перспективные для дальнейшего исследования водорасгворимые полисахариды аира болотного с целью создания на нх основе препаратов» корректорон цнтостатнческой терапии опухолей.

2. Водорастворимые полисахариды корневищ аира болотного повышают эффективность терапии карциномы легких Льюис цнклофосфаном и фторурацнлом у мышей, ингнбнруют развитие других опухолевых штаммов (меланомз В-16, карциносаркома 256 Уоксра) у разных видов животных (мышн н крысы) как при изолированном применении, так н в сочетании с цн-тостатнком.

3. Водорастворимые полисахариды корневищ аира болотного проявляют иммуностимулирующее действие у ннтактных животных, что выражается в повышении количества антитслообразующнх клеток, титра специфических ге-магглютинннов и фагоцитарной активности пернтонеадькых макрофагов.

4. Водорастворимые полисахариды корневищ аира болотного повышают активность клеток лимфоузлов по отношению к опухолевым клеткам, в том числе, на фоне вызванной цнклофосфаном иммуиодепрссснн, увеличивают количество Т- и В-лимфоцитов в периферической крови мышей.

5. Водорастворимые полисахариды аира болотного проявляют гиполипиде-мнческиЙ эффект у крыс с опухолью, а также потенцируют снижение концентрации лнпидов под действием цнклофосфана.