Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Полисахариды растений как корректоры цитостатической терапии экспериментальных опухолей

I На правах рукописи

4848404

т

САФОНОВА ЕЛЕНА АНДРЕЕВНА

ПОЛИСАХАРИДЫ РАСТЕНИЙ КАК КОРРЕКТОРЫ ЦИТОСТАТИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ОПУХОЛЕЙ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология 14.01.12 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 И ЮН 2011

Томск-2011

4848404

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН,

заслуженный деятель науки РФ Дыгай Александр Михайлович

доктор биологических наук Разина Татьяна Георгиевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Першина Ольга Викторовна

доктор медицинских наук, профессор, заслуженный

деятель науки РФ Гольдберг Виктор Евгеньевич

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образованиД«Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Я

Защита состоится "_"_2011 года в_часов на заседании диссертационного совета Д 001.031.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Амосова Е.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Наряду с лучевой терапией и хирургическим вмешательством химиотерапия является одним из основных методов лечения злокачественных новообразований [Переводчикова Н.И., 2005]. Известно, что применение противоопухолевых средств в высоких дозах приводит к адекватному ответу на терапию, увеличению вероятности наступления ремиссии и, как следствие, повышению эффективности проводимого лечения. В то же время, цитостатические препараты помимо опухолевых клеток поражают здоровые ткани организма. Наиболее распространены гематологическая, гастроинтестинальная и гепатотоксич-ность химиотерапевтических средств [Богуш Т.А. и др., 2000; Гершанович M.JI., 2004; Птушкин В.В., 2004]. Побочное действие большинства цитостатиков ограничивает их применение и служит показанием к снижению дозы лекарства, прерыванию и даже прекращению лечения.

В настоящее время в клинической практике используются достаточно эффективные препараты, предназначенные для снижения токсических проявлений химиотерапии, однако большинство из них обладают рядом недостатков. В частности, применяемый для коррекции гематологических нарушений Г-КСФ, может способствовать прогрессированию роста опухоли путем стимуляции в ней ангио-генеза [Okazaki T. et al., 2006]. Показано, что этот препарат может провоцировать рост рака яичников [Ninci Е.В. et al., 2000], поскольку, как оказалось, рецепторы для него часто экспрессируются в клетках данного вида опухоли. Установлено, что Г-КСФ в ряде случаев индуцирует иммуносупрессию и ослабление регуляции иммунного ответа Т-хелперами как in vivo, так и in vitro [Ohta Y. et al., 2004]. Кроме того, y препарата выявлены местные реакции на введение - костно-мышечные боли и аллергические реакции. Стоит отметить, что стоимость рекомбинантных гемоцитокинов достаточно высока, что ограничивает их применение [Kanbayashi Y. et al., 2006]. Перечень гепатопротекторов используемых в клинике невелик, на сегодняшний день наиболее часто применяются гептрал и препараты, содержащие эссенциальные фосфолипиды [Оковитый C.B., 2002; Ларионова В.Б., 2004]. Коррекция гастроинтестинальной токсичности довольно сложна. Для получения оптимальных результатов требуется согласованность мер по профилактике и лечению основных желудочно-кишечных осложнений в комплексе. Преимущественно с этой целью применяются средства лишь для снижения симптоматики диспепти-ческого синдрома: тошноты, рвоты, диареи, задержки стула и стоматитов [Гершанович MJL, 1999; Орлова Р.В., 2001; Птушкин В.В., 2005], однако не существует препаратов, которые бы патогенетически воздействовали на пораженный в результате химиотерапии эпителий желудочно-кишечного тракта. Следует подчеркнуть, что средства, предназначенные для использования в схемах лечения онкологических больных, не должны стимулировать развитие опухолевого процесса и препятствовать лечебному действию цитостатиков.

Таким образом, проблема повышения эффективности цитостатической терапии является актуальной в современной медицине. Важным является разработка новых средств, способных одновременно уменьшать проявления побочного действия цитостатиков на систему крови, печень и тонкий кишечник без снижения их терапевтической эффективности. Перспективными в этом плане являются полиса-

хариды растительного происхождения. Они нетоксичны, легко усваиваются организмом и обладают широким спектром фармакологических эффектов. Растительным полисахаридам присущи иммуномодулирующие [Васфилова Е.С., Багаутди-нова Р.И., 2005; Лигачева А.А., 2010; Xie G. et al., 2007; Diao H. et al., 2008], противовоспалительные [Дергунова M.A. и др., 2007], гемостимулирующие [Сычева И.А., 2008; Song Y.H. et al., 2008; Wei S.Y. et al., 2009] свойства. Эти вещества способны уменьшать рост и метастазирование бластом, подавляя ангиогенез и индуцируя процесс апоптоза в опухолевой ткани [Лопатина К. А., 2007; Vinall R.L. et al., 2007; Kim H.M. et al., 2008; Wang L„ Li X., Chen Z„ 2009; Ghosh К. et al., 2009]. Кроме того, богатая сырьевая база и низкая стоимость растительного сырья делают препараты на основе этих соединений экономически доступными для большинства пациентов. Учитывая вышесказанное, актуальным является изучение этих веществ в онкологическом эксперименте с целью создания на их основе препаратов, повышающих эффективность химиотерапии злокачественных заболеваний.

Цель исследования. Изучить влияние водорастворимых полисахаридов мать-и-мачехи обыкновенной, аира болотного и эхинацеи пурпурной на эффективность химиотерапии перевиваемых опухолей и оценить возможность снижения с их помощью токсичности цитостатиков на систему крови, печень и тонкий кишечник животных.

Задачи исследования.

1. Изучить влияние водорастворимых полисахаридов мать-и-мачехи обыкновенной, аира болотного и эхинацеи пурпурной на развитие перевиваемых опухолей мышей и крыс в условиях цитостатической терапии.

2. Исследовать функциональную активность клеток лимфоузлов мышей с карциномой легких Льюис после введения паклитаксела и водорастворимых полисахаридов мать-и-мачехи обыкновенной.

3. Оценить влияние водорастворимых полисахаридов мать-и-мачехи обыкновенной, аира болотного и эхинацеи пурпурной на состояние кроветворной системы (периферическая кровь и костный мозг) мышей с карциномой легких Льюис на фоне лечения паклитакселом.

4. Изучить состояние слизистой оболочки тонкого кишечника мышей с карциномой легких Льюис, леченных полисахаридами мать-и-мачехи обыкновенной, аира болотного и эхинацеи пурпурной в сочетании с паклитаксаелом и 5-фторурацилом.

5. Исследовать влияние водорастворимых полисахаридов мать-и-мачехи обыкновенной и аира болотного на функциональное состояние печени крыс с карцино-саркомой Уокер-256 на фоне терапии циклофосфаном.

Научная новизна. Впервые на моделях экспериментальных опухолей мышей и крыс в условиях химиотерапии цитостатиками различного механизма действия (паклитаксел, циклофосфан, 5-фторурацил) выявлено повышение эффективности лечения водорастворимыми полисахаридами корневищ аира болотного, листьев мать-и-мачехи обыкновенной, цветков эхинацеи пурпурной. В тесте нейтрализации опухолевых клеток Винна установлено свойство водорастворимых полисахаридов мать-и-мачехи обыкновенной стимулировать функциональную активность

клеток лимфоузлов по отношению к опухолевым клеткам при их изолированном введении и на фоне вызванной паклитакселом иммунодепрессии.

Впервые показана коррекция водорастворимыми полисахаридами аира болотного, мать-и-мачехи обыкновенной и эхинацеи пурпурной токсического действия цитостатиков на систему крови, эпителий тонкого кишечника и печень животных с перевиваемыми опухолями. Выявлено защитное и стимулирующее действие растительных полисахаридов на систему крови (периферическая кровь, костный мозг) мышей с карциномой легких Льюис в условиях терапии паклитакселом. Установлено, что гемостимулирующий эффект полисахаридов сравним с таковым у препарата рекомбинантного колониестимулирующего фактора - нейпогена. Обнаружено защитное действие водорастворимых полисахаридов аира болотного, мать-и-мачехи обыкновенной и эхинацеи пурпурной на эпителий тонкого кишечника мышей с карциномой легких Льюис в условиях терапии паклитакселом. Установлена способность полисахаридов аира и мать-и-мачехи уменьшать активность аминотрансфераз и щелочной фосфатазы в сыворотке крови крыс с карци-носаркомой Уокер-256, повышенную в результате введения циклофосфана. Выявленный эффект полисахаридов аира на функциональное состояние печени превосходит таковой у фосфолипидного препарата эссенциале Н.

Практическая значимость работы. На основании исследований установлено, что водорастворимые полисахариды аира болотного, мать-и-мачехи обыкновенной и эхинацеи пурпурной уменьшают токсическое влияние цитостатиков на систему крови, печень и тонкий кишечник, повышая их антиметастатическое действие. Представленные данные могут служить основой для разработки новых препаратов-корректоров цитостатической терапии и их использования в комплексной терапии больных со злокачественными новообразованиями. По результатам диссертационного исследования оформлен патент РФ на изобретение № 2397774 «Средство, снижающее гематотоксичность цитостатических препаратов».

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докладывались, обсуждались и представлялись на конференциях молодых ученых НИИ онкологии СО РАМН «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2009, 2011) и НИИ фармакологии СО РАМН «Лабораторные животные как основа экспериментальной медицины» (Томск, 2009), на конференциях молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2009, 2010), «VIII Всероссийской университетской научно-практической конференции молодых ученых по медицине» (Тула, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, из них 5 - в журналах, рекомендованных перечнем ВАК. Получен 1 патент РФ на изобретение.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 188 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов, списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 24 рисунками и 21 таблицей. Библиографический указатель включает 331 источник, из них 150 отечественных, 181 иностранный.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты выполнены на 375 мышах-самках линии C57BL/6 и 80 беспородных крысах-самцах. Дизайн экспериментального исследования одобрен Этическим комитетом при НИИ фармакологии СО РАМН. Животные 1 категории качества поступали из питомника и клиники лабораторных животных НИИ фармакологии СО РАМН (сертификат имеется). Их содержание осуществлялось в соответствии с правилами, принятыми Европейской Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей [European Convention..., 1986]. Трансплантацию карциномы легких Льюис, мела-номы В-16 и рака легкого-67 мышам производили гомогенатом опухолевой ткани внутримышечно по 5-6x106 опухолевых клеток в 0,1 мл физиологического раствора [Софьина З.П. и др., 1980]. Карциносаркому Уокер-256 крысам перевивали 20% взвесью опухолевых клеток в 0,2 мл физиологического раствора под кожу спины.

Паклитаксел (митотакс, Д-р Редци'с Лабораторис Лтд, Индия) вводили мышам с карциномой легких Льюис внутрибрюшинно однократно в дозе 20 мг/кг на 10 сут после трансплантации, либо в дозе 32 мг/кг на 14 сут после перевивки; мышам с меланомой В-16 - в дозе 32 мг/кг на 12 сут развития опухоли. Циклофосфан (ОАО «Биохимик», г. Саранск) крысы с карциносаркомой Уокер-256 получали однократно в дозе 50 мг/кг внутрибрюшинно на 16 сут развития опухоли; мыши с солидным раком легкого-67 - однократно внутрибрюшинно в дозе 125 мг/кг на 10 сут после перевивки. 5-фторурацил («Дарница», г. Киев) вводили мышам внутрибрюшинно однократно в дозе 110 мг/кг на 10 сут после перевивки карциномы легких Льюис. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор - нейпоген (фил-грастим, Ф. Хоффманн-Ля Рош Лтд., Швейцария) вводили подкожно мышам с карциномой легких Льюис в дозе 30 мкг/кг через 24 ч после инъекции паклитаксе-ла ежедневно в течение 5 сут. Гепатопротектор эссенциале Н (А. Наттерманн & Сие. ГмбХ, Германия) крысы получали ежедневно per os в дозе 100 мг/кг через 24 ч после введения циклофосфана в течение 6 сут.

Водорастворимые полисахариды получали из фармакопейного сырья фракционным методом [Методы химии углеводов..., 1980]. Полученные образцы полисахаридов были стандартизованы по содержанию углеводов спектрофотометриче-ским методом [Dubois М. et al.,1956], содержанию белка по методу Брэдфорда [Bradford М.М., 1976] и нуклеиновых кислот [Спирин А.С., 1958]. Выделенные ВРПС, сведения об их количественном содержании в растительном сырье и качественном составе предоставлены кафедрой химии ГОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (г. Томск). Сухие ВРПС растворяли физиологическим раствором либо дистиллированной водой из ампул заводской фасовки. ВРПС растений вводили внутрибрюшинно с 7 сут после перевивки опухолей: мышам с карциномой легких Льюис в дозах 10 или 20 мг/кг в течение 11-12 сут; с меланомой В-16 и солидным раком легкого-67 - в дозе 20 мг/кг в течение 9 сут. Крысам с карциносаркомой Уокер-256 ВРПС вводили внутрижелудочно в дозе 50 мг/кг с 6 сут развития опухоли в течение 15 сут.

Показатели периферической крови мышей (концентрация гемоглобина, показатель гематокрита, количество эритроцитов, тромбоцитов, общее число лейкоцитов)

определяли на гематологическом анализаторе «Abacus» (Diatron, Austria). Подсчет лейкоцитарной формулы в периферической крови и миелограмм костного мозга производили стандартными гематологическими методами [Гольдберг Е.Д. и др., 1992]. Для гистологического исследования кусочек тонкой кишки фиксировали в жидкости Карнуа. Депарафинированные срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилин -эозином по Караци. На продольных срезах подсчитывали среднее количество эпителиальных клеток в криптах (не менее чем в 10). В этих же криптах подсчитывали количество митозов и вычисляли митотический индекс как процент клеток в митозе от общего количества просмотренных клеток. Количество клеток на ворсинках подсчитывали от основания до вершины, выбирая 10 ворсинок на каждом препарате [Зуфа-ров КА. и др. 1974]. В сыворотке крови крыс определяли активность АлАт, АсАт и ЩФ на полуавтоматическом биохимическом анализаторе фирмы «Сопгау» с помощью наборов фирм «Вектор-Бест» и «Согтау» [Камышников B.C., 2003]. Для оценки функциональной активности клеток лимфатических узлов использовали тест нейтрализации опухолевых клеток Винна [Гольдберг Е.Д. и др., 2008]. По окончании экспериментов животных умерщвляли, соблюдая "Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных", проводили вскрытие, ревизию внутренних органов, выделение опухоли и метастазов. При этом оценивали возможность повышения противоопухолевого и антиметастатического действия ци-тостатиков с помощью ВРПС. Для этого вычисляли процент торможения роста опухоли - ТРО [Софьина З.П. и др., 1980], частоту метастазирования опухолей вычисляли в процентах (по отношению числа животных с метастазами к общему количеству животных в группе). Подсчитывали среднее количество метастазов у одного животного в группе, определяли диаметр метастазов, высчитывали их среднюю площадь [Dingemane К.Р. et al., 1985]. Величину различия в метастазирова-нии опухоли между контролем и опытом оценивали по индексу ингибирования метастазирования [Архипов С.А., Юнкер В.М., Грунтенко Е.В., 1984].

Для определения достоверности различий полученных данных в группах применяли непараметрические критерии Вилкоксона-Манна-Уитни и углового преобразования Фишера. Различия считали достоверными при Р<0,05 [Лакин Г.Ф.,1980].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние водорастворимых полисахаридов мать-и-мачехи обыкновенной, аира болотного и эхинацеи пурпурной на развитие перевиваемых опухолей животных и эффективность цитостатической терапии

Успешность антибластомной терапии зависит от выбранной схемы цитостати-ческого лечения, а так же включения в нее средств, повышающих эффективность и/или снижающих выраженность побочных эффектов химиотерапии. Необходимым условием при создании такого рода препаратов является отсутствие стимуляции ими основного опухолевого процесса и метастазов. Поскольку в задачи настоящей работы входило изучение возможности использования водорастворимых полисахаридов для коррекции токсических эффектов цитостатической терапии на систему крови, печень и тонкий кишечник, представлялось логичным оценить их влияние на развитие перевиваемых опухолей мышей и крыс. В экспериментах использовались

различные по механизму действия цитостатики: паклитаксел - препарат растительного происхождения из группы таксанов, алкилирующий агент циклофосфан из группы хлорэтиламинов и антиметаболит 5-фторурацил - антагонист пиримидина. При оценке миело- и гепатотоксичности в качестве препаратов сравнения применяли нейпоген - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор и гепатопротектор эссенциале Н.

В экспериментах на животных с перевиваемыми опухолями обнаружено, что в том случае, когда применение цитостатиков не оказывало достоверного влияния на показатели развития процесса диссеминации опухолей, при добавлении в схему лечения ВРПС проявлялось их антиметастатическое действие. Так, назначение ВРПС мать-и-мачехи и аира совместно с паклитакселом в дозе 32 мг/кг приводило к уменьшению количества метастазов в легких мышей с LLC относительно контроля (рис. 1а). Следует подчеркнуть, что эффективность комбинированного лечения в отношении процесса метастазирования не изменялась при снижении дозы паклитаксела до 20 мг/кг, что говорит о возможности включения в схему химиотерапии ВРПС с целью снижения дозы цитостатика и, как следствие, уменьшения его повреждающего влияния на здоровые органы и ткани, которое, как известно, более выражено при проведении высокодозовой химиотерапии. Введение в схему химиотерапии нейпогена не влияло на эффективность лечения паклитакселом (рис. 1а).

Аналогичные данные выявлены в эксперименте на мышах с меланомой В-16. Так, назначение паклитаксела с изучаемыми полисахаридами приводило к снижению частоты метастазирования опухоли. При введении в схему химиотерапии ВРПС мать-и-мачехи и эхинацеи уменьшилось количество метастазов (рис. 16), а под влиянием ВРПС мать-и-мачехи снизилась также площадь метастатического поражения легких, тогда как при введении одного цитостатика эти показатели не отличались от контрольных. В случае использования ВРПС в сочетании с цито-статиком другого механизма действия - антиметаболитом 5-фторурацилом для лечения мышей с LLC установлено, что при отсутствии его достоверного влияния на количество метастазов в легких, добавление в схему химиотерапии ВРПС мать-и-мачехи и аира приводило к уменьшению этого показателя в 2,8 и 2,4 раза (Р<0,01) соответственно (рис. 1в). Кроме того, на мышах с меланомой В-16 и раком легко-го-67 отмечено повышение ингибирующего влияния паклитаксела и циклофосфа-на на первичную опухоль при добавлении в схему лечения ВРПС эхинацеи и аира.

Учитывая данные литературы, можно предположить, что механизм действия растительных полисахаридов на процесс опухолевого роста и метастазирования связан с их способностью влиять на функциональную активность иммунной системы [Jung Y.S. et al., 2008; Kim J.Y. et al., 2008; Gonzaga M.L. et al., 2009]. При контакте с антигенпрезентирующими клетками (макрофагами, дендритными клетками, B-лимфоцитами) полисахариды взаимодействуют со специфическими рецепторами (TLR, NOD, маннозный рецептор, скванжер рецептор, CD14, CR3), что приводит к активации этих клеток [Kim G.Y. et al., 2005; Kim J.Y. et al., 2007]. Полисахариды повышают цитотоксичность и фагоцитарную активность макрофагов по отношению к патогенам, усиливают продукцию активных форм кислорода, экспрессию молекул адгезии и различных цитокинов, участвующих в противоопухолевой защите. Существуют сведения о возможности усиления полисахаридами

контроль ПЛ ПЛ+ВРПС ПЛ+ВРПС ПЛ+

мать-и-мачехи аира нейпоген

контроль 5-фу 5-фу+врпс 5-фу+врпс 5-фу+врпс мать-и-мачехи аира эхинацеи

контроль ПЛ

пл+врпс ш+врпс пл+врпс

мать-и-мачехи аира эхинацеи

контроль

цф

цф+врпс цф+врпс цф+врпс мать-и-мачехи аира эхинацеи

Рис 1. Количество метастазов в легких: (а) - мышей с LLC после лечения ПЛ совместно с ВРПС мать-и-мачехи, аира и нейпогеном; (б) - мышей с меланомой В-16 после лечения ПЛ и ВРПС мать-и-мачехи, аира и эхинацеи; (в) - мышей с LLC после лечения 5-ФУ и ВРПС мать-и-мачехи, аира и эхинацеи; (г) - крыс с карциносаркомой W-256 после лечения ЦФ в сочетании с ВРПС мать-и-мачехи, аира и эссенциале Н. Примечание. Здесь и в рис. 2,3 * - значимое различие с контролем, ** - с группой животных, получавших цитостатик.

синтеза макрофагального TNF-a, который способен вызывать некроз опухолевых клеток, не повреждая при этом здоровые. Так, на животных с экспериментальными опухолями выявлен антибластомный эффект полисахаридов из гриба Agaricus blazei, механизм действия которых связан усилением выработки IFN-y и TNF-a моноцитами и макрофагами [Gonzaga M.L. et al., 2009; Gu Y. et al., 2009; Ют C.F. et al., 2009; Niu Y.C. et al., 2009].Антиметастатическое действие полисахаридов может быть связано с уменьшением ангиогенеза в опухолевой ткани. Полисахариды природного происхождения способны блокировать проангиогенные факторы: трансформирующий фактор роста-ß (TGF-ß), TNF-a, фактор роста фибробластов и тромбоцитов, а также эндотелия сосудов (VEGF-1,2), которые непрерывно в большом количестве продуцируют опухолевые и эндотелиальные клетки [Степанова Е.В., 2007; Jain R., Carmeliet P., 2001]. Так, полисахариды растения Bletilla striata уменьшают экспрессию VEGF эндотелием сосудов мышей и тем самым тормозят пролиферацию эндотелиальных клеток. Некоторые полисахариды ингибируют трансформирующий фактор роста ß (TGF-ß), который, в свою очередь, блокирует матриксную металлопротеиназу-9, что в конечном итоге препятствует образованию новых сосудов в ткани опухоли [Bandyopadhyay А. et al., 2005]. Не исключено, что повышение эффективности цитостатической терапии растительными полисахаридами в отношении метастазов связано с уменьшением образования новых сосудов.

Кроме того, в литературных источниках встречаются сведения о возможности индукции процесса апоптоза опухолевых клеток под влиянием полисахаридов биологического происхождения. Торможение опухолевого роста и метастазов может быть связано с изменением уровня опухолевых супрессоров и протоонкоге-нов. Так, полисахариды из водоросли Capsosiphon fulvescens индуцируют апоптоз раковых клеток желудка человека за счет уменьшения количества антиапоптоти-ческого белка Bcl-2 [Kwon M.J., Nam T.J., 2007]. Полисахарид из Sargassum confii-sum увеличивает выработку апоптотического белка Р-53 и тем самым тормозит рост саркомы 180 мышей [Liu Q.Y., Meng Q.Y., 2008].

В эксперименте на крысах с W-256 выявлено уменьшение количества (рис. 1г) и площади метастазов в легких животных, получавших циклофосфан совместно с ВРПС мать-и-мачехи (в 7,5 и 6,5 раза соответственно), зафиксировано полное подавление гематогенных метастазов в группе комбинированного лечения с добавлением ВРПС аира (рис. 1г), в то время как введение одного цитостатика достоверно не влияло на эти показатели. Совместное применение циклофосфана с эс-сенциале Н не изменяло эффективности противоопухолевой терапии. Введение циклофосфана крысам изолированно, а также в комбинации с ВРПС не влияло на процесс лимфогенного метастазирования карциносаркомы.

В исследованиях последних лет доказано, что основной путь реализации биологической активности полисахаридов различной природы, в том числе, и растительной, заключается в модуляции иммунного ответа [Учасова Е.Г., 2009; Лигачева A.A., 2010]. С целью изучения возможного механизма действия на процесс метастазирования, а также оценки иммуномодулирующих свойств в условиях цитостатической терапии были выбраны полисахариды мать-и-мачехи обыкновенной, поскольку полученные данные свидетельствуют об их способности влиять на развитие метастатического процесса достаточно разносторонне и наиболее выра-

женно по сравнению с другими полисахаридами. Для решения поставленной задачи был проведен тест нейтрализации опухолевых клеток Винна, в котором оценивалась функциональная активность клеток лимфоузлов после лечения мышей с карциномой легких Льюис полисахаридами мать-и-мачехи в сочетании с пакли-такселом. Тест нейтрализации опухолевых клеток Винна дает возможность интегральной оценки состояния противоопухолевой резистентности организма. В качестве критерия активности тестируемых клеток служила их способность ингиби-ровать рост и метастазирование бластомы при перевивке животным смеси лимфо-идных и опухолевых клеток.

При совместной трансплантации клеток лимфоузлов интактных животных с карциномой легких Льюис масса опухоли, количество и площадь метастазов достоверно не изменялись относительно данных показателей у мышей контрольной группы, которым вводилась только взвесь опухолевых клеток (табл. 1). Возможно, лимфоциты интактных животных, у которых не было опухоли, а значит, первичной антигенной стимуляции, оказались не готовы к нейтрализации злокачественного новообразования, что и показали результаты эксперимента. У животных, которым вместе со взвесью опухолевых были введены клетки лимфоузлов от нелеченых мышей с LLC, количество метастазов и площадь метастатического поражения в легких достоверно увеличились по сравнению с этими показателями в контрольной группе (табл. 1). Все это свидетельствует о снижении активности лим-фоидных клеток по отношению к опухолевым в результате развития у мышей карциномы легких Льюис. Результаты нашего исследования подтверждают, что опухоль в организме мышей-доноров действовала на лимфоциты таким образом, что они потеряли способность к эффективной элиминации злокачественно измененных клеток, более того, они способствовали процессу метастазирования трансплантированной совместно с ними карциномы легких Льюис, что выражалось в достоверном увеличении количества метастатических колоний в легких животных-реципиентов.

На следующем этапе эксперимента оценивалась способность лимфоидных клеток влиять на развитие опухоли и метастазов после лечения животных пакли-такселом совместно с ВРПС мать-и-мачехи обыкновенной. Паклитаксел - противоопухолевый препарат, относящийся к классу таксановых соединений, механизм цитостатического действия которого реализуется за счет стабилизации микротрубочек веретена деления как злокачественно перерожденных, так и здоровых клеток, в том числе, и клеток иммунной системы, что приводит к иммунодепрессии. Под влиянием паклитаксела наблюдалось снижение функциональной активности клеток лимфоузлов, что выражалось в увеличении количества и площади метастазов относительно этих значений у животных, которым была перевита смесь опухолевых и клеток лимфоузлов нелеченых мышей с LLC (табл. 1).

Лечение животных с карциномой легких Льюис паклитакселом в комбинации с ВРПС мать-и-мачехи обыкновенной приводило к стимуляции активности клеток лимфатических узлов, о чем свидетельствовало достоверное уменьшение количества и площади метастазов в легких относительно этих показателей у животных, которым трансплантировали совместно с LLC лимфоидные клетки леченных паклитакселом мышей (табл. 1). Таким образом, одним из механизмов анти-

метастатического действия водорастворимых полисахаридов мать-и-мачехи обыкновенной при сочетанном применении с цитостатиком может быть активация ими клеток лимфоузлов, в состав которых, как известно, на 70% входят Т-лимфоциты, участвующие в развитии специфического противоопухолевого иммунного ответа.

Таблица 1

Функциональная активность клеток лимфоузлов мышей-самок линии С57В1У6, леченных паклитакселом и ВРПС мать-и-мачехи обыкновенной

Группа наблюдения (количество животных) Масса опухоли (Х±т), г ТРО, % Частота мета-стази-рова-ния, % Количество метастазов на 1 мышь (Х±т) Площадь метастазов на 1 мышь (Х±т), мм2 НИМ, %

1.Контроль (10) 4,75±0,16 - 100 6,90±1,04 2,20±0,40 -

2. Опухоль + лимфоузлы интактных мышей (10) 4,88±0,21 -3 100 9,10±1,80 5,09±1,46 -32

З.Опухоль + лимфоузлы нелеченых мышей с LLC (10) 4,74±0,12 0 100 10,70±1,25 1-ЗР<0,05 7,33±1,86 1-ЗР<0,01 -55

4. Опухоль + лимфоузлы леченных паклитакселом мышей (10) 4,79±0,19 -1 100 1б,70±1,5б 3-4Р<0,01 10,53±3,28 3-4Р<0,05 -142

5. Опухоль +■ лимфоузлы леченных паклитакселом и ВРПС мать-и-мачехи мышей (10) 4,б5±0,27 2 100 8,10+1,49 4-5Р<0,01 4,32+1,39 4-5Р<0,05 -17

Примечание. Здесь и далее перед уровнем значимости Р указаны номера сравниваемых групп.

Влияние полисахаридов мать-и-мачехи обыкновенной, аира болотного и эхинацеи пурпурной на гематотоксичность цитостатических препаратов

Токсическое действие противоопухолевых препаратов на систему крови является наиболее частым побочным эффектом химиотерапии и проявляется угнетением всех ростков кроветворения. В наибольшей степени повреждаются клетки -родоначальники лейкоцитов, тромбоцитов и реже - клетки, ответственные за развитие эритроцитов [Дыгай A.M., Удут Е.В., Жданов В.В., 2001; Гурьянцева JI.A. и др., 2006]. Нейтропения - наиболее опасное проявление миелодепрессии [Lyman H.G., Lyman Н.С., Agboola О., 2005; Gaidamaka N.V. et al., 2010]. Развитие инфекции на фоне нейтропении требует госпитализации пациента и проведения массивной антибактериальной терапии препаратами широкого спектра действия [Sharma A., Lokeshwar N., 2006]. Анемия и тромбоцитопения, представляющие собой клиническую проблему у онкологических пациентов, также снижают качество жизни больных и ухудшают результаты химиотерапии. В связи с этим в настоящее время при проведении химиотерапии назначают средства, обладающие гемостимули-рующим действием. Наиболее эффективными для клинического применения можно считать препараты качественно нового типа, созданные на основе эндогенных регуляторов гемопоэза (колониестимулирующие факторы, интерлейкины, эритро-поэтин) [Дыгай A.M., Жданов В.В., Удут Е.В., 2009; Lida S. et al., 2005; Kanbayashi

Y. et al., 2006]. Применение рекомбинантных гемоцитокинов вызывает быструю пролиферацию клеток-предшественников и ускоряет их дифференцировку, стимулируя определенные ростки кроветворения [De Jong М.Е. et al., 2006]. Несмотря на выраженную эффективность этих препаратов, их использование с профилактической или терапевтической целью часто ограничено развитием побочных эффектов, а также высокой стоимостью [Singbartl G., 1994; Nguyen Y.K., 1994; Ohta Y. et al., 2004; Kanbayashi Y. et al., 2006]. В связи с вышесказанным актуальным является поиск новых препаратов-корректоров для включения их в схемы химиотерапии с целью уменьшения побочного действия цитостатиков на систему крови. Для оценки возможности снижения гематотоксичности противоопухолевой терапии с помощью ВРПС был выбран паклитаксел, который наряду с высокой эффективностью обладает выраженной миелотоксичностью [Фомина Т.И. и др., 2007; Чурин А.А., 2008]. Обнаружено, что использование цитостатика в дозе 20 мг/кг привело к угнетению всех ростков кроветворения. Так, в периферической крови мышей с LLC как на 4, так и на 7 сут после введения паклигаксела наблюдалась выраженная нейтропения (табл. 2).

Достоверное снижение числа сегментоядерных нейтрофилов, возможно, явилось результатом прямого повреждающего действия цитостатического препарата на активно пролиферирующие клетки костного мозга [Переводчикова Н.И., 2005]. Если на 4 сут после инъекции цитостатика применение изучаемых полисахаридов в схеме химиотерапии не отменяло нейтрофильную лейкопению, то к 7 сут регистрировалось восстановление числа сегментоядерных лейкоцитов (табл. 2). Со стороны красной крови на 4 сут после инъекции мышам паклитаксела обнаружено значимое уменьшение количества эритроцитов и концентрации гемоглобина по сравнению с этими данными у нелеченых животных. У мышей, получавших дополнительно полисахариды мать-и-мачехи и аира, эти показатели превосходили таковые в группе монохимиотерапии (табл. 2). Вероятно, способность к пролиферации клеток эритроидного ростка кроветворения при введении ВРПС сохраняется, несмотря на цитостатическое воздействие, что обеспечивает повышенное содержание эритроцитов в периферической крови уже к 4 сут после инъекции паклитаксела, свидетельствуя о защитном эффекте ВРПС на клетки эритроидного ряда. К 7 сут после введения цитостатика у мышей, леченных паклитакселом изолированно, а также в комбинации с ВРПС отмечено восстановление показателей красной крови, а у получавших ВРПС мать-и-мачехи и превышение этих значений выше контрольного уровня, что может являться следствием стимуляции процессов регенерации эритроидного ростка кроветворения.

На основе полученных и литературных данных можно предположить, что механизм увеличения числа клеток в периферической крови под влиянием ВРПС связан с усилением процессов созревания и деления миелокариоцитов в костном мозге, что, в свою очередь, приводит к выходу зрелых клеток в периферическую кровь [Сычев И.А., 2004, 2006]. Для подтверждения этой гипотезы был проведен следующий эксперимент, в котором исследовалось влияние ВРПС на показатели костномозгового и периферического кроветворения в условиях терапии паклитакселом. Доза цитостатика была увеличена с 20 мг/кг до 32 мг/кг с целью изучения возможности коррекции его миелотоксичности. Принимая во внимание то, что

наиболее значимый стимулирующий эффект после совместного введения пакли-таксела и растительных полисахаридов был выявлен в отношении сегментоядер-ных нейтрофилов, в качестве препарата сравнения был выбран нейпоген - реком-бинантный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ).

Таблица 2

Изменение показателей периферической крови у мышей с LLC под влиянием ВРПС мать-и-мачехи обыкновенной, аира болотного и эхинацеи пурпурной _на фоне терапии паклитакселом (Х±ш)__

Группа наблюдения х количество введений Общее количество лейкоцитов, 109/л Нейтрофилы Эритроциты, 1012/л Гемоглобин, г/л Гемато- крит, %

Палочко-ядерные, 109/л Сегмен-тоядер-ные, 109/л

4 сут после введения паклитаксела

1. Контроль 12,66+0,85 0,06±0,04 4,38+0,24 8,32±0,78 145,2± 14,21 33,90±3,28

2. Паклитаксел х 1 12,58±0,32 0,10±0,04 0,82±0,10 1-2Р<0,01 6,57±0,31 1-2Р<0,05 113,4± 4,04 1-2Р<0,05 27,34±1,49

3. Паклитаксел + ВРПС мать-и-мачехи х 9 13,74±0,57 0 0,72±0,16 8,99±0,89 2-ЗР<0,05 149,0± 11,96 2-ЗР<0,05 36,64+3,65 2-ЗР<0,05

4. Паклитаксел + ВРПС аира х 9 11,42±0,91 0,10+0,04 0,59+0,08 2-4Р<0,05 8,70+0,82 2-4Р<0,05 145,2± 11,47 2-4Р<0,05 35,16+3,27 2-4Р<0,05

5. Паклитаксел + ВРПС эхинацеи х 9 12,00±1,14 0,02±0,02 1,26±0,25 8,23±0,82 135,25± 12,78 33,23+3,33

7 сут после введения паклитаксела

1. Контроль 14,86±1,34 0,02±0,02 2,90±0,27 7,73±0,87 128,0± 13,77 32,40+3,62

2. Паклитаксел х 1 18,82±2,30 0,14±0,07 2,20±0,30 1-2Р<0,05 10,16+1,04 1-2Р<0,05 163,2± 15,20 1-2Р<0,05 43,36±4,52 1-2Р<0,05

3. Паклитаксел + ВРПС мать-и-мачехи х 12 22,46+1,22 0,13±0,05 5,90±0,37 2-ЗР<0,01 12,11±1,10 1-ЗР<0,05 190,6± 16,81 50,70+4,60 1-ЗР<0,05

4. Паклитаксел + ВРПС аирах 12 19,78±2,90 0,12±0,08 6,04±0,62 2-4Р<0,01 8,70±1,36 147,2± 21,62 37,30+5,92

5. Паклитаксел + ВРПС эхинацеи х 12 23,20±2,97 0,10±0,06 6,36+0,91 2-5Р<0,01 8,74±0,69 150,2± 13,13 37,14±3,50

Примечание. Здесь и в табл. 3,4,5 подсчет показателей производили у 5 животных в группе.

При более выраженной гемодепрессии получены аналогичные результаты со стороны показателей периферической крови. Кроме того, при добавлении в схему химиотерапии ВРПС мать-и-мачехи обыкновенной на 4 сут после инъекции цито-статика отмечено их защитное действие на нейтрофильные гранулоциты, чего не наблюдалось в предыдущем эксперименте. Картине периферической крови соот-

ветствовало состояние костномозгового кроветворения. Так, на 4 сут после введения паклитаксела наблюдалось угнетение гранулоцитарного ростка кроветворения, о чем свидетельствовало достоверное снижение числа зрелых и незрелых нейтрофильных гранулоцитов относительно таковых в контроле, содержание которых не восстанавливалось и к 7 сут после химиотерапевтического воздействия (рис. 2, 3). Полученные результаты согласуются с данными литературы: известно, что нейтрофильные гранулоциты наиболее подвержены токсическому действию паклитаксела, что обуславливает развитие выраженной нейтропении [Карпова Г.В. и др., 2007; Колотова О.В. и др., 2009].

Анализ миелограмм животных, получавших ВРПС мать-и-мачехи и аира совместно с паклитакселом, показал, что как на 4, так и на 7 сут после введения ци-тостатика общее количество миелокариоцитов было достоверно выше такового у мышей группы монохимиотерапии за счет повышенного содержания числа незрелых и зрелых гранулоцитов, а также эритрокариоцитов в костном мозге (рис. 2, 3). Стоит отметить, что значения показателей костномозгового кроветворения у мышей, получавших нейпоген, находились на уровне таковых у животных, леченных ВРПС аира и мать-и-мачехи. Кроме того, зафиксировано достоверное увеличение эритрокариоцитов под влиянием ВРПС, чего не наблюдалось при применении нейпогена.

Таким образом, результаты исследования позволили установить, что применение в схеме химиотерапии ВРПС мать-и-мачехи обыкновенной или аира болотного препятствует опустошению костного мозга и приводит к стимуляции процесса восстановления гранулоцитарного и эритроидного ростков гемопоэза, пораженных цитостатическим воздействием. Наиболее эффективными в плане коррекции гематологических нарушений оказались ВРПС мать-и-мачехи обыкновенной, под воздействием которых происходило ускорение восстановления основных показателей костномозгового и периферического звена кроветворения, кроме того, гемо-стимулирующий эффект ВРПС мать-и-мачехи на гранулоциты оказался сравним с таковым у нейпогена.

Можно предположить, что в основе гемостимулирующего действия растительных полисахаридов лежит их способность стимулировать функциональную активность клеток стромы костного мозга, приводя к усилению продукции эндогенных ге-мопоэтическнх факторов роста, молекул-регуляторов гемопоэза - гликозаминоглика-нов и протеогликанов. Кроме того, полисахариды активируют макрофаги, которые секретируют цитокины, в том числе, ответственные за пролиферацию и дифференци-ровку клеток предшественников в направлении определенной клеточной линии -эритроидной, моноцитарной, нейтрофильной и т. д. [Щепеткин ИЛ., 2004]. Установлено, что водорастворимые полисахариды, выделенные из Angelica sinensis, стимулируют гемопоэз через синтез ГМ-КСФ макрофагами мышей [Liu P.J. et al., 2010]. Показано, что Р-(1-3), (1-6)-0-гликаны, выделенные из гриба Grifóla frondosa, ускоряют процесс созревания клеток гранулоцитарного ростка кроветворения за счет увеличения синтеза ГМ-КСФ мононуклеарными фагоцитами костного мозга мышей и способствуют выходу зрелых лейкоцитов в периферическую кровь при вызванной паклитакселом миелодепрессии [Kathiyn D. Rodgers et al., 2008; Harnack U. et al., 2010].

20,00 18,00 16,00 14,00 12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00

йгй 17,29

-j&ifc_skrf:

15,21

9,67

-16,79

15,29

5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1

0,5 0

4,62 4,58 йгй:-

3,92 4,08

1,6/

— - I - - -

1

4

4,50 4,00 3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00

4,00

4,08

3,46

2,75

Рис. 2. Показатели костномозгового кроветворения мышей линии C57BL/6 с LLC на 4 сут после введения ПЛ (32 мг/кг) на фоне терапии ВРПС мать-и-мачехи обыкновенной, аира болотного, эхинацеи пурпурной (20 мг/кг) и нейпогеном (30 мкг/кг). (А) - изменение общей клеточности костного мозга, (Б) - незрелых нейтрофильных гранулоцитов, (В) - зрелых нейтрофильных гранулоцитов, (Г) - эритрокариоцитов. По оси абсцисс - группы наблюдения (1 - контроль; 2 - ПЛ; 3 -ПЛ+ВРПС мать-и-мачехи; 4 - ПЛ+ВРПС аира; 5 - ПЛ+нейпоген), по оси ординат - показатели миелограммы (106/бедро)

25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00

4,50 4,00 3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00

6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00

Рис. 3. Показатели костномозгового кроветворения мышей линии C57BL/6 с LLC на 7 сут после введения ПЛ (32 мг/кг) на фоне терапии ВРПС мать-и-мачехи обыкновенной, аира болотного, эхинацеи пурпурной (20 мг/кг) и нейпогеном (30 мкг/кг). (А) - изменение общей клеточности костного мозга, (Б) - незрелых нейтрофильных гранулоцитов, (В) - зрелых нейтрофильных гранулоцитов, (Г) - эритрокариоцитов. По оси абсцисс - группы наблюдения (I - контроль; 2 - П; 3 -ПЛ+ВРПС мать-и-мачехи; 4 - ПЛ+ВРПС аира; 5 - ПЛ+нейпоген), по оси ординат - показатели миелограммы (Ю6/бедро)

Влияние водорастворимых полисахаридов мать-и-мачехи обыкновенной, аира болотного и эхинацеи пурпурной на слизистую оболочку тонкого кишечника мышей в условиях цитостатической терапии

Гастроинтестинальная токсичность противоопухолевых препаратов, наряду с угнетением кроветворения, лимитирует их применение [Köster W„ Wilke Н. et al., 2004; Казюлин А.Н., и др. 2007]. Известно, что эпителий тонкого кишечника относится к тканям, скорость пролиферации в которых является одной из самых высоких в организме, что является причиной повышенной чувствительности кишечного эпителия к действию противоопухолевых препаратов.

Повреждение слизистой оболочки ЖКТ в процессе химиотерапии сопровождается развитием диспептического синдрома, который включает в себя в различных комбинациях тошноту, рвоту, диарею, стоматит, анорексию, эзофагит, симптом «раздраженного желудка», а в тяжелых случаях - атонию кишечника и язвенные поражения желудочно-кишечного тракта [Гершанович M.JL, 1999; Пере-водчикова Н.И., 2005; Sonis S.T. et al., 2004]. Побочные проявления химиотерапии не только ухудшают качество жизни больных, но зачастую представляют прямую угрозу для их жизни [Орлова Р.В., 2001]. В настоящее время в клинической практике используются препараты только для снижения выраженности диспептического синдрома, и практически не существует средств, которые бы оказывали защитное действие и одновременно повышали интенсивность процесса репаративной регенерации в тонком кишечнике, поврежденном в результате проведения химиотерапии. Это в свою очередь требует поиска новых препаратов - корректоров, применение которых в комплексе с цитостатиками уменьшало бы повреждающее влияние последних на эпителий тонкого кишечника.

Для оценки возможности снижения токсического проявления химиотерапии на слизистую оболочку тонкого кишечника мышей с LLC с помощью ВРПС использовался паклитаксел. Гастроинтестинальная токсичность этого препарата не является лимитирующей, однако, как и многие антибластомные средства, он поражает эпителий ЖКТ, что приводит к развитию диспептического синдрома [Daniels J.A. et al., 2008; Koroleva I.A. et al., 2010]. Таким образом, исследование начинали на более «мягкой» модели повреждающего действия, причем оценка ре-паративных свойств ВРПС производилась на стадии восстановления слизистой оболочки тонкой кишки мышей. На 10 сут после введения паклитаксела число клеток на ворсинках было достоверно ниже такового в контроле, митотическая активность в криптах при этом снизилась в 2,7 раза по сравнению с этим показателем у нелеченых мышей (табл. 3), на основании чего можно заключить, что даже в столь поздние сроки после инъекции цитостатика выявляются признаки повреждения в эпителии тонкого кишечника. Очевидно, уменьшение количества клеток на ворсинках связано с прямым повреждающим влиянием паклитаксела на клетки крипт, обладающие высокой пролиферативной активностью, что вполне закономерно, поскольку механизм цитостатического действия паклитаксела основан на стимуляции сборки микротрубочек веретена деления и стабилизации их структуры, приводящей к нарушению процесса деления клетки [Бессмельцев С. С., 2003]. При добавлении в схему лечения полисахаридов мать-и-мачехи и эхинацеи выявлена стимуляция процесса пролиферации в криптах, о чем свидетельствует увели-

чение в них числа клеток и митотического индекса. Под воздействием полисахаридов аира увеличивалась численность клеточных популяций не только в криптах, но и на ворсинках, что способствовало более быстрому восстановлению стационарного состояния кишечного эпителия, нарушенного в результате применения цитостатика (табл. 3).

Чтобы оценить репаративные свойства водорастворимых полисахаридов на более «жесткой» модели повреждающего действия химиотерапии на эпителий тонкого кишечника, следующий эксперимент был проведен с использованием другого по механизму действия цитостатика 5-фторурацила. Этот препарат относится к группе антиметаболитов, механизм цитостатического действия которого обусловлен превращением его в тканях в активный метаболит 5-фтор-2-дезоксиуридин-5-монофосфат - конкурентный ингибитор фермента тимидилат-синтетазы, принимающей участие в синтезе нуклеиновых кислот. 5-ФУ нарушает синтез ДНК и вызывает образование структурно несовершенной РНК, угнетая деление клеток. При выраженной противоопухолевой эффективности этот цитоста-тик обладает высокой гастроинтестинальной токсичностью, которая лимитирует его использование [Машковский М.Д., 2008; Soares P.M. et al., 2008].

Таблица 3

Численность клеточных популяций эпителия тонкой кишки мышей линии C57BL/6 с LLC при введении 5-фторурацила в сочетании с ВРПС аира болотного,

мать-и-мачехи обыкновенной и эхинацеи пурпурной (Х±т)

Группа наблюдения Количество клеток в криптах Количество клеток на ворсинках Митотический индекс, %

1. Контроль 31,98+0,35 145,04±1,28 4,40±0,17

2. Паклитаксел 31,52±0,15 137,58+0,59 1-2Р<0,01 1,65±0,14 1-2Р<0,01

3. Паклитаксел + ВРПС мать-и-мачехи 34,10±0,13 2-3 Р=0,05 127,46±0,96 2,51+0,11 2-ЗР<0,01

4. Паклитаксел + ВРПС аира 34,72±0,38 2-4Р<0,01 141,50±0,91 2-4Р<0,01 3,51 ±0,09 2-4Р<0,01

5. Паклитаксел + ВРПС эхинацеи 39,44+0,98 2-5Р<0,01 123,04±0,79 3,03±0,15 2-5Р<0,01

Морфометрический анализ тонкого кишечника, проведенный через 3 сут после введения 5-фторурацила, показал, что численность клеточной популяции крипт и клеток на ворсинках достоверно сократилась, митотический индекс снизился в 3,2 раза по сравнению с таковыми в контроле (табл. 4). Угнетение процессов пролиферации в криптах при введении цитостатика связано с основным механизмом его действия - нарушением синтеза ДНК. Переход на ворсинки поврежденных клеток, несущих хромосомные аберрации, а также незрелых в функциональном отношении энтероцитов сказывается на продолжительности жизни эпи-телиоцитов ворсинок, и они быстро слущиваются. В то же время, если цитостатик вводили на фоне применения ВРПС мать-и-мачехи, аира и эхинацеи, уже на 3 сут после его использования обнаружено сохранение большего количества клеток в криптах и на ворсинках. Митотический индекс в этих группах животных оказался достоверно выше (в 4,5; 5,2 и 3,2 раза) относительно такового у леченных только цитостатиком мышей (табл. 4). Таким образом, увеличенное количество клеток в

криптах и на ворсинках тонкого кишечника мышей в группах комбинированного лечения на этот срок наблюдения может свидетельствовать о защитном эффекте ВРПС по отношению к слизистой оболочке тонкого кишечника, а увеличение ми-тотической активности - об активации процесса репаративной регенерации.

К 8 сут после инъекции 5-фторурацила выявлено, что количество клеток в криптах и на ворсинках к этому сроку наблюдения еще не достигает уровня контроля, однако митотическая активность в криптах начинает восстанавливаться, что свидетельствует об усилении процесса репаративной регенерации (табл. 4). На фоне введения ВРПС количество клеток, как в криптах, так и на ворсинках значимо возрастало (табл. 4). Возможно, более быстрое восстановление слизистой оболочки тонкого кишечника при включении в схему терапии ВРПС связано с повреждением меньшего количества эпителиоцитов на ворсинках, защитным действием на клетки крипт, а также с увеличением их митотической активности.

Таблица 4

Численность клеточных популяций эпителия тонкой кишки мышей линии C57BL/6 с LLC при введении 5-фторурацила в сочетании с ВРПС аира болотного, мать-и-мачехи обыкновенной и эхинацеи пурпурной, (Х±т)

Группа Количество клеток Количество клеток Митотический

наблюдения в криптах на ворсинках индекс, %

3 суг после введения 5-ФУ

1. контроль 29,75+0,84 98,39±3,38 3,30±0,40

2.5-ФУ 13,86+1,03 29,18+1,43 1,03+0,33

1-2Р<0,01 1-2Р<0,01 1-2Р<0,01

3.5-ФУ + ВРПС 27,44±1,01 64,98±2,04 4,60±0,56

мать-и-мачехи 2-ЗР<0,01 2-ЗР<0,01 2-ЗР<0,01

4.5-ФУ + ВРПС 17,22±0,69 32,50+1,05 5,33+0,40

аира 2-4Р<0,01 2-4Р<0,05 2-4Р<0,01

5.5-ФУ+ ВРПС 19,02±0,40 69,34±2,21 3,29±0,55

эхинацеи 2-5Р<0,01 2-5Р<0,01 2-5 Р<0,05

8 сут после введения 5-ФУ

1. контроль 23,08±1,09 92,00±4,05 4,37±0,42

2.5-ФУ 11,66+0,32 30,38±0,95 3,48+0,65

1-2Р<0,01 1-2Р<0,01

3.5-ФУ + ВРПС 23,12+0,93 109,56+3,14 6,20+0,58

мать-и-мачехи 2-ЗР<0,01 2-ЗР<0,01 2-ЗР<0,01

4.5-ФУ + ВРПС 17,06+0,44 64,78±2,19 5,99+0,73

аира 2-4Р<0,01 2-4Р<0,01

5.5-ФУ+ ВРПС 15,86+0,29 73,70±1,75 4,27±0,62

эхинацеи 1-5Р<0,01 2-5Р<0,01

Влияние водорастворимых полисахаридов мать-и-мачехи обыкновенной и аира болотного на гепатотоксичность цитостатических препаратов

С появлением новых эффективных противоопухолевых препаратов и введением в клиническую практику высокодозовой химиотерапии возрастает и частота возникновения гепатотоксических осложнений [Гершанович М.Л., 1999; Ларионова В .Б. и др., 2004; Степанов Ю.М., Филиппова А.Ю., Кононов И.Н., 2005]. Клинические признаки цитостатического поражения печени разнообразны и могут

проявляться как в виде бессимптомной гиперферментемии, так и развития гепатита и цирроза [Скрипник И. Н., Невойт А.В., Ворошилова Г.А., 2007]. Однако перечень гепатопротекторов, используемых на сегодняшний день в клинике, невелик, наиболее часто используются гептрал и препараты содержащие эссенциальные фосфолипиды [Оковитый С.В., 2002; Ларионова В.Б., 2004]. В настоящей работе изучены гепатопротекторные свойства ВРПС мать-и-мачехи обыкновенной и аира болотного в условиях терапии циклофосфаном крыс с карциносаркомой Уокер-256. Циклофосфан относится к лекарственным формам, фармакологическая активность которых обусловлена исключительно их биологически активными метаболитами. Цитостатический эффект алкилирующих соединений обусловлен в первую очередь алкилированием структурных элементов ДНК (пуринов, пиримиди-нов), в результате чего нарушается жизнедеятельность клеток и блокируется их митотическое деление [Лушникова Е.Л. и др., 2009]. По данным литературы, ди-хлорэтилциклофосфамид и акролеин относятся к наиболее токсичным метаболитам циклофосфана [Полунина Т.Е., 1999; Honjo I. et al., 1988; Farrell G., 1997; Shanholtz C., 2001]. Установлено, что акролеин, включаясь в свободнорадикаль-ную реакцию, индуцирует ПОЛ клеточных мембран, продукты которого - диеновые коньюгаты и малоновый диальдегид оказывают многостороннее отрицательное воздействие на структуру и функцию различных органов, в частности, печени [Cleland B.D., Рокоту C.S., 1993; Ma В. et al., 2002]. Под воздействием этого метаболита нарушается проницаемость клеточных мембран гепатоцитов, вследствие чего происходит выход внутриклеточных ферментов в кровеносное русло [Сара-тиков А.С., 2004]. В качестве препарата сравнения был выбран фосфолипидный препарат - эссенциале Н, обладающий антиоксидантными свойствами. В эксперименте установлено, что если на 3 сут после однократного введения циклофосфана крысам активность ферментов АлАТ, АсАТ и ЩФ в сыворотке крови возросла незначительно, то к 6 сут отмечено достоверное повышение активности всех печеночных ферментов, что говорит о выраженном токсическом действии метаболитов циклофосфана (табл. 5). Повышение активности АлАТ и АсАТ является показателем нарушения целостности мембран гепатоцитов и свидетельствует об интенсивном цитолизе. Увеличение в крови содержания ЩФ (фермента, локализующегося в клетках, выстилающих желчные протоки) связано с нарастанием холесгатиче-ского синдрома [Камышников B.C., 2003].

Применение ВРПС аира болотного на фоне алкилирующего агента эффективно предупреждало развитие цитолитическош синдрома у животных: достоверно сниженным оказался уровень всех ферментов как на 3, так и на 6 сут после введения циклофосфана. При использовании полисахаридов мать-и-мачехи в схеме химиотерапии выявлено, что на 3 и 6 сут значимо уменьшалась активность АсАТ, на 6 сут пониженным оказался и уровень ЩФ относительно этих значений у получавших только цитостатик животных. Препарат сравнения эссенциале Н на 3 сут после инъекции циклофосфана статистически значимо не влиял на уровень печеночных ферментов, однако к 6 сут после введения цитостатика под его воздействием происходило восстановление активности АлАТ и ЩФ в сыворотке крови крыс (табл. 5). Результаты проведенного исследования показали, что курсовое введение ВРПС аира болотного и мать-и-мачехи обыкновенной крысам с W-256

ослабляет повреждающее действие циклофосфана на печень. Выявленный эффект полисахаридов аира болотного на функциональное состояние печени крыс превосходит таковой у фосфолипидного препарата эссенциале Н.

Таблица 5

Влияние ВРПС мать-и-мачехи обыкновенной, аира болотного и эссенциале Н на активность печеночных ферментов в сыворотке крови беспородных крыс _с карциносаркомой \У-256 на фоне терапии циклофосфаном (Х±т)

Группа наблюдения х

количество АлАТ, Е/л АсАТ, Е/л ЩФ, Е/л

введений

3 сут после введения циклофосфана

1. Контроль 0,77+0,05 0,67±0,01 194,58± 30,65

2. ЦФ х 1 0,85±0,01 0,68±0,11 201,88±28,34

3. ЦФ + ВРПС мать-и-мачехи х 9 0,81±0,05 0,53±0,02 208,44 ±14,13

2-ЗР<0,05

4. ЦФ + ВРПС аирах 9 0,75±0,03 0,43±0,07 138,88+10,51

2-4Р<0,05 2-4Р<0,05 2-4Р<0,05

5. ЦФ + эссенциале Н х 3 0,80±0,01 0,60±0,03 151,26 + 12,06

6 сут после введения циклофосфана

1. Контроль 0,38±0,06 0,63+0,02 224,74±21,01

2. ЦФ х 1 0,73±0,03 0,74±0,04 288,08±35,17

1-2Р<0,01 1-2Р<0,05 1-2Р<0,05

3. ЦФ + ВРПС мать-и-мачехи х 12 0,59+0,04 0,64±0,05 208,46+19,67

2-ЗР<0,05 2-ЗР<0,05

4. ЦФ +ВРПС аирах 12 0,54±0,03 0,51+0,03 189,50+16,74

2-4Р<0,01 2-4Р<0,05 2-4Р<0,05

5. ЦФ + эссенциале Н х 6 0,55±0,06 0,64±0,024 204,76+23,92

2-5Р<0,05 2-5Р<0,05

В повреждении мембран клеток при цитостатическом воздействии важная роль отводится усилению процессов перекисного окисления липидов, которое приводит к накоплению избыточного количества перекисных радикалов, повреждающих фосфолипиды мембран. Вероятно механизм выявленного защитного действия на клетки системы крови, печени и эпителия тонкого кишечника изучаемых полисахаридов связан с их мембраностабилизирующими и антиоксидантными свойствами. Это предположение согласуется с литературными данными. Так, под воздействием полисахаридов биологического происхождения снижается интенсивность ПОЛ мембран гепатоцитов и эритроцитов [Хасина Э.И. и др., 2005; Гуцол Л.О. и др., 2006; Сычев И.А., Порядин Г.В., Смирнов В.М., 2006; Хотимченко М.Ю., Сонина Л.Н, 2006].

Таким образом, результаты полученных экспериментальных наблюдений доказывают целесообразность включения в схемы химиотерапии водорастворимых полисахаридов, которые не только снижают токсическое действие цитостати-ков на систему крови, печень и слизистую оболочку тонкого кишечника, но и повышают эффективность специфического лечения. Отсутствие токсичности у этой группы соединений выгодно отличает их от существующих препаратов и позволит использовать эти средства длительно с целью повышения эффективности лечения

и качества жизни пациентов с онкологической патологией в процессе химиотерапии. Учитывая наличие большой сырьевой базы для выделения полисахаридов и низкую себестоимость производства, полученные в работе данные, могут служить основой для углубленного изучения этих веществ с целью создания новых препаратов-корректоров цитостатической терапии.

ВЫВОДЫ

1. Водорастворимые полисахариды мать-и-мачехи обыкновенной, аира болотного и эхинацеи пурпурной повышают антиметастатическое действие паклитаксела, циклофосфана и 5-фторурацила у животных с перевиваемыми опухолями (карциномой легких Льюис, меланомой В-16, раком легкого-67, карцино-саркомой Уокер-256). Полисахариды мать-и-мачехи обыкновенной, аира болотного усиливают антибластомное действие цитостатиков на первичный опухолевый узел меланомы В-16 и рака легкого-67.

2. Функциональную активность клеток лимфоузлов мышей с карциномой легких Льюис по отношению к опухолевым клеткам на фоне вызванной паклитаксе-лом иммунодепрессии повышают водорастворимые полисахариды мать-и-мачехи обыкновенной.

3. Полисахариды мать-и-мачехи обыкновенной, аира болотного и эхинацеи пурпурной снижают токсическое влияние паклитаксела на систему крови мышей с карциномой легких Льюис, препятствуя опустошению костного мозга и стимулируя процесс восстановления гранулоцитарного и эритроидного ростков гемопоэза, пораженных цитостатическим воздействием.

4. Полисахариды мать-и-мачехи обыкновенной, аира болотного и эхинацеи пурпурной оказывают защитное действие на слизистую оболочку тонкого кишечника мышей с карциномой легких Льюис при ее повреждении паклитак-селом и 5-фторурацилом, стимулируя пролиферацию в криптах и нормализуя процессы клеточного обновления.

5. Активность аминотрансфераз и щелочной фосфатазы в сыворотке крови крыс с кациносаркомой Уокер-256, повышенной в результате введения циклофосфана снижают полисахариды мать-и-мачехи обыкновенной и аира болотного.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Коррекция показателей периферической крови мышей водорастворимыми полисахаридами мать-и-мачехи обыкновенной и аира болотного на фоне применения паклитаксела // Вестник новых медицинских технологий. - 2009. - Т. 16. - № 2. - Прил. - VIII Всероссийская университетская научно-практическая конференция молодых ученых по медицине. Сборник материалов. - Тула-2009. - С. 148-150 (соавторы Лопатина К.А., Федорова Е.П).

2. Влияние гранулоцитарного колониестимулирующего фактора на противоопухолевую активность паклитаксела // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины. - СПб., 2009. - С. 23-24 (соавтор Румпель O.A.).

3. Водорастворимые полисахариды мать-и-мачехи обыкновенной и аира болотного как корректоры гематотоксического эффекта паклитаксела // Сибирский

онкологический журнал. - 2009. - Прил.1. - С. 172-173 (соавторы Лопатина К.А., Федорова Е.П.).

4. Полисахариды аира болотного и мать-и-мачехи обыкновенной в комплексной терапии экспериментальных опухолей // Вестник новых медицинских технологий. - 2009. - Т. 16. - № 1. - С.83-84 (соавторы Лопатина К.А., Разина Т.Г., Зуева Е.П., Федорова Е.П.).

5. Экспериментальная модель для исследования средств, повышающих эффективность противоопухолевой терапии // Лабораторные животные как основа экспериментальной медицины. - Томск, 2009. - С. 90-91 (соавтор Лопатина К.А.).

6. Коррекция нейтропенического эффекта паклитаксела у животных // Материалы юбилейной конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины». - СПб., 2010. - С. 71-72 (соавторы Лопатина К.А, Гурьев A.M.).

7. Снижение токсического эффекта паклитаксела на систему крови водорастворимыми полисахаридами мать-и-мачехи обыкновенной и аира болотного // Сибирский онкологический журнал. - 2010. - № 2. - Т 9. - С. 42-46 (соавторы Разина Т.Г., Лопатина К.А., Федорова Е.П., Зуева Е.П., Гурьев А.М.).

8. Коррекция токсического эффекта паклитаксела на систему крови и эпителий тонкой кишки водорастворимыми полисахаридами мать-и-мачехи обыкновенной, аира болотного и эхинацеи пурпурной // Российский биотерапевтический журнал. - 2010. - № 2 (9). - С. 19-23 (соавторы Лопатина К.А., Разина Т.Г., Федорова Е.П., Пахомова A.B., Вычужанина A.B., Зуева Е.П., Ефимова Л.А.).

9. Система отбора природных соединений для использования в онкологической практике. Опыт работы института фармакологии СО РАМН // Тихоокеанский медицинский журнал.-2010. - №2.-С. 10-15 (соавторы Дыгай A.M., Зуева Е.П., Разина Т.Г., Амосова E.H., Крылова С.Г., Лопатина К.А., Ефимова Л.А., Ры-бапкина О.Ю.).

10. Коррекция гепатотоксичности циклофосфана водорастворимыми полисахаридами мать-и-мачехи обыкновенной и аира болотного // Бюллетень сибирской медицины. - 2011. - № 1.- С. 70-75 (соавторы Лопатина К.А., Ветошкина Т.В., Разина Т.Г., Зуева Е.П., Гурьев A.M.).

11. Возможность использования водорастворимых полисахаридов растений как корректоров цитостатической терапии экспериментальных опухолей // Сибирский онкологический журнал. - 2011. - Прил.1. - С. 103-104 (соавтор Лопатина К.А.).

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АлАТ - аланинаминотрансфераза

АсАТ - аспартатаминотрансфераза

ВРПС - водорастворимые полисахариды

Г-КСФ - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор

ПЛ - паклитаксел

ПОЛ - перекисиое окисление липидов

РЛ-67 - рак легкого-67

ЦФ - циклофосфан

ЩФ - щелочная фосфатаза

5-ФУ - 5-фторурацил

В-16 -мелаиомаВ-16

LLC - Lung Lewis Carcinoma, карцинома легких Льюис

TNF - Tumor Necrosis Factor, фактор некроза опухоли

W-256 - карциносаркома Уокер-256

Тираж 100. Заказ № 536. Томский государственный университет систем управления и радиоэлектроники 634050, г. Томск, пр. Ленина, 40

Актуальность проблемы. Онкологическая патология занимает второе место после заболеваний сердечно-сосудистой системы в структуре причин смертности населения. Ежегодно в России выявляется около 500 тыс. человек с впервые установленным онкологическим диагнозом и в 60% случаев выявляются опухоли третьей — четвертой стадии [Чиссов В.И., 2010]. Наряду с лучевой терапией и хирургическим вмешательством химиотерапия является одним из основных методов лечения злокачественных новообразований [Пе-реводчикова Н.И., 2005; Машковский М.Д., 2008]. Использование существующих антибластомных препаратов в клинике позволяет увеличить продолжительность жизни больных, а в некоторых случаях и полностью излечить заболевание [Богданова Н.В., 2001; Моисеенко В.М., 2004]. Известно, что химиотерапевтические средства обладают дозозависимым эффектом: применение цитостатиков в высоких дозах приводит к адекватному ответу на терапию, увеличению вероятности наступления ремиссии и, как следствие, повышению эффективности проводимого лечения. В то же время, цитостати-ческие препараты помимо опухолевых клеток поражают здоровые ткани организма с высокой фракцией роста. Наиболее распространены гематологическая, гастроинтестинальная и гепатотоксичность противоопухолевых средств [Богуш Т.А. и др., 2000; Гершанович М.Л., 2004; Птушкин В.В., 2004]. Побочное действие большинства цитостатиков ограничивает их применение и служит показанием к снижению дозы лекарства, прерыванию и даже прекращению лечения.

В настоящее время наиболее эффективными средствами для снижения токсического проявления цитостатиков на систему крови считаются препараты качественно нового типа, созданные на основе эндогенных регуляторов гемопоэза (колониестимулирующие факторы, интерлейкины, эритропоэтин). Применение рекомбинантных гемоцитокинов вызывает быструю пролиферацию клеток-предшественников в зрелые дифференцированные клетки крови, стимулируя определенные ростки кроветворения [Дыгай А. М., Жданов В. В.,

Удут Е. В., 2009; De Jong М.Е. et al., 2006]. К сожалению, существуют данные о том, что введение Г-КСФ может способствовать прогрессированию роста опухоли путем стимуляции в ней ангиогенеза (в частности, через.увеличение количества циркулирующих эндотелиальных стволовых клеток) [Okazaki Т. et al., 2006]. Кроме того, in vitro показано, что Г-КСФ может провоцировать рост рака яичников [Ninci Е.В. et al., 2000], поскольку, как оказалось, рецепторы Г-КСФ часто экспрессируются в клетках данного вида опухолей. Установлено, что Г-КСФ в ряде случаев индуцирует иммуносупрессию и ослабление регуляции иммунного ответа Т-хелперами как in vivo, так и in vitro [Ohta Y. et al., 2004]. У препарата выявлены местные реакции на введение, костно-мышечные боли и аллергические реакции. Стоит отметить высокую стоимость рекомбинантных гемоцитокинов, что ограничивает их применение [Singbartl G., 1994; Nguyen Y. К., 1994; Ohta Y. et al., 2004; Kanbayashi Y. et al., 2006].

Для профилактики лекарственных поражений печени используют гепа-топротекторы. В настоящее время, в клинике применяются следующие препараты: гептрал, Гепа-Мерц, эссенциале. Широко известны печеночные средства на основе флавоноидов расторопши пятнистой (силибор, легалон, карсил, гепабене, гепатофальк-планта), фенольных соединений в сочетании с инулином артишока (хофитол), комплекса биологически активных веществ семян тыквы (тыквеол) [Оковитый C.B., 2002; Ларионова В.Б., 2004].

Система коррекции гастроинтестинальной токсичности довольно сложна. Для получения оптимальных результатов требуется согласованность мер по профилактике и лечению основных желудочно-кишечных осложнений в комплексе. В настоящее время применяются средства лишь для снижения симптоматики диспептического синдрома: тошноты, рвоты, диареи, задержки стула и стоматитов [Гершанович M.JL, 1999; Орлова Р.В., 2001; Птушкин В.В., 2005], однако не существует препаратов, которые бы патогенетически воздействовали на пораженный в результате химиотерапии эпителий желудочно-кишечного тракта.

Таким образом, проблема повышения эффективности цитостатической терапии является актуальной в современной медицине. В связи с этим, важным является разработка новых средств, способных одновременно уменьшать проявления побочного действия цитостатиков на систему крови, печень и тонкий кишечник, без снижения их терапевтической эффективности. Перспективными в этом плане являются препараты из растительного сырья, обладающие целым рядом преимуществ перед синтетическими: они легко усваиваются организмом человека, не обладают побочными эффектами, очень редко проявляют токсичность. Растительные полисахариды способны стимулировать иммунную систему организма: увеличивать функциональную активность нейтрофилов, выработку интерферонов и TNF-альфа макрофагами, повышать количество лейкоцитов в крови, активировать процесс фагоцитоза, увеличивать количество антителообразующих клеток и продукцию ими антител [Васфилова Е.С., Багаутдинова Р.И., 2005; Учасова Е.Г., 2009; Лигачева А.А., 2010; Pillai S. et al., 2007; Xie G. et al., 2007; Diao H. et al., 2008]. Полисахариды оказывают защитное действие на печень, проявляя противовоспалительные свойства [Дергунова М.А. и др., 2007]. Установлена способность этих веществ стимулировать гемопоэз при облучении [Сычева И.А., 2008; Song Y.H. et al., 2008; Jettanacheawchankit S. et al., 2009; Wei S;Y. et al., 2009]. Выявлено, что растительные полисахариды уменьшают рост и метастазиро-вание бластом, подавляя ангиогенез и индуцируя процесс апоптоза в опухолевой ткани [Лопатина К.А., 2007; Vinall R.L. et al., 2007; Badr El-Din N.K., Noaman E., Ghoneum M., 2008; Feregrino-Pérez A.A. et al., 2008; Kim H.M. et al., 2008; Wang L., Li X., Chen Z., 2009; Ghosh К. et al., 2009]. Кроме того, богатая сырьевая база и низкая стоимость растительного сырья выгодно отличают их от существующих на сегодняшний день препаратов-корректоров цитостатической терапии. Учитывая вышесказанное, актуальным является изучение растительных полисахаридов в онкологическом эксперименте с целью создания на их основе препаратов, повышающих эффективность химиотерапии злокачественных заболеваний.

Цель исследования. Изучить влияние водорастворимых полисахаридов мать-и-мачехи обыкновенной, аира болотного и эхинацеи пурпурной на эффективность химиотерапии, перевиваемых опухолей и оценить возможность снижения с их помощью токсичности цитостатиков на систему крови, печень и тонкий кишечник животных.

Задачи исследования.

1. Изучить влияние водорастворимых полисахаридов мать-и-мачехи обыкновенной, аира болотного и эхинацеи пурпурной на развитие перевиваемых опухолей мышей и крыс в условиях цитостатической терапии.

2. Исследовать функциональную активность клеток лимфоузлов мышей с карциномой легких Льюис после введения паклитаксела и водорастворимых полисахаридов мать-и-мачехи обыкновенной.

3. Оценить влияние водорастворимых полисахаридов мать-и-мачехи обыкновенной, аира болотного и эхинацеи пурпурной на состояние кроветворной системы (периферическая кровь и костный мозг) мышей с карциномой легких Льюис на фоне лечения паклитакселом.

4. Изучить состояние слизистой оболочки- тонкого кишечника мышей с карциномой легких Льюис, леченных полисахаридами мать-и-мачехи обыкновенной, аира болотного и эхинацеи пурпурной в сочетании с паклитаксаелом И' 5-фторурацилом.

5. Исследовать влияние водорастворимых полисахаридов мать-и-мачехи обыкновенной* и аира болотного на функциональное состояние печени крыс с карциносаркомой Уокер-256 на фоне терапии циклофосфаном.

Научная новизна. Впервые на моделях экспериментальных опухолей мышей и крыс в условиях химиотерапии цитостатиками различного механизма действия (паклитаксел, циклофосфан, 5-фторурацил) выявлено повышение эффективности лечения водорастворимыми полисахаридами корневищ аира болотного, листьев мать-и-мачехи обыкновенной, цветков эхинацеи пурпурной. В тесте нейтрализации опухолевых клеток Винна установленосвойство водорастворимых полисахаридов мать-и-мачехи обыкновенной стимулировать функциональную активность, клеток лимфоузлов по отношению- к опухолевым клеткам при- их изолированном введении и на фоне вызванной паклитакселом иммунодепрессии.

Впервые показана коррекция водорастворимыми полисахаридами аира болотного, мать-и-мачехи обыкновенной и эхинацеи пурпурной токсического действия цитостатиков на систему крови, эпителий тонкого кишечника и печень животных с перевиваемыми опухолями. Выявлено защитное и стимулирующее действие растительных полисахаридов на систему крови (периферическая кровь, костный мозг) мышей с карциномой легких Льюис в условиях терапии паклитакселом. Установлено, что гемостимулирующий эффект полисахаридов сравним с таковым у препарата рекомбинантного колоние-стимулирующего фактора - нейпогена. Обнаружено защитное действие водорастворимых полисахаридов аира болотного, мать-и-мачехи обыкновенной и эхинацеи пурпурной на эпителий тонкого кишечника мышей с карциномой легких Льюис в условиях терапии паклитакселом. Установлена способность полисахаридов аира и мать-и-мачехи уменьшать активность аминотрансфе-раз и щелочной фосфатазы в сыворотке крови крыс с карциносаркомой Уо-кер-256, повышенную в результате введения циклофосфана. Выявленный эффект полисахаридов, аира на функциональное состояние печени превосходит таковой у фосфолипидного препарата эссенциале Н.

Практическая значимость работы. На основании исследований установлено, что водорастворимые полисахариды аира .болотного, мать-и-мачехи обыкновенной и эхинацеи пурпурной уменьшают токсическое влияние цитостатиков на систему крови, печень и тонкий кишечник, повышая - их антиметастатическое действие. Представленные данные могут служить основой для разработки новых препаратов-корректоров цитостатической терапии и их использования в комплексной терапии больных со злокачественными новообразованиями. По результатам диссертационного исследования оформлен патент РФ на изобретение № 2397774 «Средство, снижающее гематотоксич-ность цитостатических препаратов».

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докладывались, обсуждались и представлялись на конференциях молодых ученых НИИ онкологии СО РАМН «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2009 и 2011) и НИИ фармакологии СО РАМН «Лабораторные животные как основа экспериментальной медицины» (Томск, 2009), на конференциях молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2009 и 2010), «VIII Всероссийской университетской научно-практической конференции молодых ученых по медицине» (Тула, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, из них 5 - в журналах, рекомендованных перечнем ВАК. Получен 1 патент РФ на изобретение.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 188 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов, списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 24 рисунками и 21 таблицей. Библиографический указатель включает 331 источник, из них 150 отечественных, 181 иностранный.

выводы

1. Водорастворимые полисахариды мать-и-мачехи обыкновенной, аира, болотного и эхинацеи пурпурной повышают антиметастатическое действие паклитаксела, циклофосфана и 5-фторурацила у животных с перевиваемыми опухолями (карциномой легких Льюис, меланомой В-16, раком легкого-67, карциносаркомой Уокер-256). Полисахариды мать-и-мачехи обыкновенной, аира болотного усиливают антибластомное действие ци-тостатиков на первичный опухолевый узел меланомы В-16 и рака легкого-67.

2. Функциональную активность клеток лимфоузлов мышей с карциномой легких Льюис по отношению к опухолевым клеткам на фоне вызванной паклитакселом иммунодепрессии повышают водорастворимые полисахариды мать-и-мачехи обыкновенной.

3. Полисахариды мать-и-мачехи обыкновенной, аира болотного и эхинацеи пурпурной снижают токсическое влияние паклитаксела на систему крови мышей с карциномой легких Льюис, препятствуя опустошению костного мозга и стимулируя процесс восстановления гранулоцитарного и эритроидного ростков гемопоэза, пораженных цитостатическим воздействием.

4. Полисахариды мать-и-мачехи обыкновенной, аира болотного и эхинацеи пурпурной оказывают защитное действие на слизистую оболочку тонкого кишечника мышей с карциномой легких Льюис при ее повреждении паклитакселом и 5-фторурацилом, стимулируя пролиферацию, в криптах и нормализуя процессы клеточного обновления.

5. Активность аминотрансфераз и щелочной фосфатазы в сыворотке крови крыс с кациносаркомой Уокер-256, повышенную в результате введения циклофосфана, снижают полисахариды мать-и-мачехи обыкновенной и аира болотного.