Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Разработка стандартного образца полисахаридного состава для оценки качества липы сердцевидной листьев, цетрарии исландской слоевиц и лекарственных средств на их основе

На правах рукописи

КРИШТАНОВА Надежда Александровна

Разработка стандартного образца полисахаридного состава для оценки качества липы сердцевидной листьев, цетрарии исландской слоевищ и лекарственных средств на их основе

15 00 02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

003162838

Санкт-Петербург 2007

003162838

Диссертационная работа выполнена в ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации» на кафедре фармацевтической химии

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук, профессор Саканян Елена Ивановна

Официальные оппоненты:

- доктор фармацевтических наук, профессор Иозеп Анатолий Альбертович

- кандидат фармацевтических наук, начальник испытательной лаборатории Северо-Западного центра контроля качества лекарственных средств Смирнова Ирина Геннадьевна

Ведущая организация: Государственное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений

Защита состоится 13 ноября 2007 г в 15 00 на заседании Диссертационного Совета Д 208 088 01 при Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии по адресу 197376, г Санкт-Петербург, ул Профессора Попова, д 14

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии по адресу г Санкт-Петербург, ул Профессора Попова, д 4/6

Автореферат разослан 12 октября 2007 г

Ученый секретарь Диссертационного Совета,

кандидат фармацевтических наук

Марченко Н В

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. В последние годы среди населения Российской Федерации наблюдается увеличение числа заболеваний органов дыхания, в том числе инфекционного характера Существующие лекарственные средства (ри-фампицин, производные изоникотиновой, п-аминобензойной кислот и другие препараты) не всегда эффективны в этой ситуации, поэтому расширение их номенклатуры является актуальной задачей отечественного здравоохранения

С этой точки зрения большой практический интерес представляют полисахариды растительного и микробного происхождения Среди растительных объектов, содержащих данную группу биологически активных веществ (БАВ) и широко используемых в медицинской практике для профилактики и лечения заболеваний легких, следует отметить липу сердцевидную Tilia cordata Mill, сем Липовые - Tiliaceae L и цетрарию исландскую Cetraria islándica (L.) Ach, сем Пармелиевые - Parmeliaceae L Листья липы сердцевидной и слоевища цет-рарии исландской находили и находят применение в традиционной и народной медицине разных стран при лечении заболеваний органов дыхания, вплоть до туберкулеза Созданные в СПХФА на основе этого сырья эффективные препараты серии Тилиафол и Ислацет обладают антимикробной, антигипоксиче-ской, жаропонижающей, противовоспалительной, иммунотропной и другими видами фармакологической активности, а в ряде случаев могут применяться и при лечении туберкулеза

В связи с имеющейся перспективой их внедрения в официнальную медицинскую практику существует необходимость в разработке адекватных методов анализа Согласно современным требованиям, предъявляемым к стандартизации лекарственного растительного сырья (ЛРС) и фитопрепаратов необходимо наличие стандартных образцов, обеспечивающих специфичность проводимых анализов качества

Так как для стандартизации липы сердцевидной листьев и препаратов серии Тилиафол, а также цетрарии исландской слоевищ и препаратов серии Ислацет, следует использовать полисахариды, как основную группу БАВ этих объектов, то для этого необходим соответствующий полисахаридный стандартный образец До настоящего времени, ввиду недостаточной изученности составов полисахаридных комплексов этих растений, было предложено использовать в качестве стандартного образца глюкозу, что не обеспечивало специфичность проводимых методов анализа

Целью настоящей диссертационной работы явилась разработка стандартного образца на основе полисахаридных комплексов цетрарии исландской слоевищ и липы сердцевидной листьев и методов стандартизации этих растительных объектов, а также их лекаре! венных средств с применением полученного образца

Задачи исследования: 1) Выделение и изучение полисахаридных комплексов липы сердцевидной листьев и цетрарии исландской слоевищ, предварительная оценка их фармакологической активности

2) Очистка полисахаридных фракций липы сердцевидной листьев и цетрарии исландской слоевищ и получение на их основе стандартного образца

3) Определение основных показателей качества стандартного образца и составление на него необходимой нормативной документации в виде проекта ФС

4) Разработка методов стандартизации липы сердцевидной листьев и цетрарии исландской слоевищ и препаратов на их основе с применением стандартного образца полисахаридного состава и включение установленных показателей в нормативную документацию

Научная новизна. Впервые выделены и изучены полисахаридные фракции липы сердцевидной листьев и цетрарии исландской слоевищ, которые представлены водорастворимыми полисахаридами, пектиновыми веществами, гемицеллюлозой-А и гемицеллюлозой-Б

С помощью методов химического и физико-химического анализа (бумажной и тонкослойной хроматографии, ГЖХ, ВЭЖХ, ИК-, УФ-, ЯМР-спектроскопии) определен мономерный состав выделенных полисахаридных фракций и установлена гомогенность качественного состава фракции гемицел-люлозы-А, выделенной из двух растительных объектов

Впервые исследована фармакологическая, в том числе, микробиологическая активность различных фракций полисахаридов и суммарного полисахаридного комплекса липы сердцевидной листьев и цетрарии исландской слоевищ Установлено наличие антигипоксического, противовоспалительного, им-мунотропного, противомикробного действия выделенных полисахаридных фракций и доказан их вклад в общий фармакологический эффект, проявляемый лекарственными средствами липы сердцевидной листьев и цетрарии исландской слоевищ

Впервые доказана целесообразность использования стандартного образца полисахаридного состава, полученного на основе полисахаридной фракции ге-мицеллюлозы-А, для стандартизации липы сердцевидной листьев, цетрарии исландской слоевищ и препаратов на их основе

Предложена схема выделения и очистки стандартного образца полисахаридного состава, определен перечень показателей его качества

Практическая значимость полученных результатов заключается в разработке технологии получения и очистки стандартного образца гемицеллюло-зы-А, которая может быть использована предприятиями, специализирующимися в производстве фитопрепаратов и стандартных образцов, а проект ФС на стандартный образец гемицеллюлозы-А следует использовать соответствующими контрольно-аналитическими лабораториями при оценке его качества

Предложены методы стандартизации липы сердцевидной листьев, цетрарии исландской слоевищ, липы сердцевидной листьев экстракта сухого, цетрарии исландской слоевищ экстракта сухого, таблеток и сиропа Ислацет по показателям "Подлинность" и "Количественное определение полисахаридов" с использованием стандартного образца гемицеллюлозы-А Составлены «Измене-

ния и дополнения» к проектам нормативной документации - ФСП на липы сердцевидной листья, цетрарии исландской слоевища, липы сердцевидной листьев экстракт сухой Тилиафол, цетрарии исландской слоевищ экстракт сухой Ислацет, таблетки и сироп Ислацет

Разработанные методики анализа полисахаридных комплексов используются в учебном процессе на кафедре фармацевтической химии СПХФА, а также в Центре аналитических исследований СПХФА, ФГУП СПбНИИВС ФМБА РФ, ООО ЭКОС

Работа выполнена на кафедре фармацевтической химии ГОУ ВПО СПХФА Росздрава в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ СПХФА по теме «Изыскание и изучение биологически активных веществ синтетического, микробного и растительного происхождения» Фармакологические и микробиологические исследования проводились на кафедрах фармакологии и микробиологии СПХФА соответственно Исследования с использованием приборных хроматографических и спектроскопических методов выполнены в лаборатории аналитических методов НИУ академии

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Результаты исследования полисахаридных комплексов цетрарии исландской слоевищ и липы сердцевидной листьев методы их выделения, определение фракционного и мономерного состава

2 Результаты фармакологических и микробиологических исследований полисахаридных комплексов, выделенных из липы сердцевидной листьев и цетрарии исландской слоевищ

3 Результаты исследований по получению стандартного образца полисаха-ридного состава, определению показателей его качества

4 Материалы нормативных документов в виде проекта ФС «Гемицеллюло-за-А - стандартный образец», «Изменений и дополнений» к проектам ФСП на «Липы сердцевидной листья», «Цетрарии исландской слоевища», «Липы сердцевидной листьев экстракт сухой», «Цетрарии исландской слоевищ экстракт сухой», таблетки и сироп «Ислацет»

Публикации: Основное содержание диссертации отражено в 14 научных статьях и тезисах докладов

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на VI, VII, VIII Международных съездах «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» Фитофарм 2002, 2003, 2004 (СПб, СПб , Миккели), IV Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» (М, 2003), I Международной межвузовской научно-практической конференции аспирантов и соискателей «Предпосылки и эксперимент в науке» (СПб, 2003), XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (М, 2004), Научно-методической конференции «Состояние и перспективы подготовки специалистов для фарма-

цевтической отрасли» (СПб, 2004); Международной научно-практической конференции, посвященной 85-летию СПХФА (СПб , 2004), Межрегиональной конференции «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2006), Конгрессе «Традиционная медицина - 2007» (М, 2007)

Объем и структура диссертации. Работа изложена ла^ЗРстраницах машинописного текста, иллюстрирована рисунками и /<?табчицами Диссертация состоит из введения, 5 глав (обзор литературы, материалы и методы и 3 глав, содержащих результаты экспериментальных исследований), обсуждения результатов, выводов, списка литературы, включающега®?источника, из от них иностранных языках, и € приложений

2 ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении отражены актуальность, научная новизна и практическая значимость работы, определена цель и сформулированы задачи исследования

Глава 1 - Обзор литературы Рассмотрены классификация полисахаридов, их биологическая активность, методы анализа, а также представлены сведения по номенклатуре и применению стандартных образцов в анализе лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов

Глава 2 - Материалы и методы Объектами для исследования служили листья листопадного дерева липы сердцевидной - Tilia cordata Mill, семейства липовых - Tiliaceae Juss , собранные с момента распускания почек до созревания плодов в 2002-2004 гг в Санкт-Петербурге и пп Суйда, Тайцы Ленинградской области Слоевища лишайника цетрарии исландской - Cetraria islándica (L) Ach, семейства Пармелиевые - Parmeliaceae, собранные в августе в 20022004 гг около о Сяберо (Ленинградская обл) Товароведческий анализ сырья «Цетрарии исландской слоевища» и «Липы сердцевидной листья» проводили в соответствии с требованиями разработанных ранее проектов ФСП и другими нормативными документами

Качественное и количественное изучение полисахаридов проводили с помощью общепринятых химических реакций и методов физико-химического анализа, включая хроматографические (ГЖХ, ВЭЖХ, ТСХ, на бумаге) и спектральные (ИК-, УФ-, ЯМР-спектроскопия)

Для проведения фармакологических исследований использовали водные растворы полисахаридных фракций и суммарного полисахаридного комплекса в дозах 1/10 и 1/100 от ЛД50 Эксперименты проводили на беспородных белых нелинейных мышах-самцах массой тела 14-20 г, крысах-самцах массой тела 150-200 г Исследовали влияние однократного и курсового введения изучаемых веществ на показатели жизнедеятельности подопытных животных

Антимикробную активность оценивали по методикам ГФ XI, а также Изменениям к ней № 1-3

Разработку показателей качества стандартного образца полисахарида проводили в соответствии с требованиями ОСТ 91500 05 001-00 «Стандарты качества лекарственных средств Основные положения»

ИК-спектры регистрировали в таблетках калия бромида на приборе ФСМ 1201 (Россия)

ЯМР-спектры регистрировали на спектроскопе АС-200 фирмы «Вшкег» (Германия) при частоте 50 МГц в растворах ДМСО-ё6 и D20+Na0D (10%) Внутренними стандартами являлись дейтерированные растворители УФ-спектры снимали на спектрофотометре СФ-2000 ГЖХ проводили на газовом хроматографе «Кристалл-200М» (детектор ДИП, колонка НР-5 (30м 0,25мм 0,25мкм), газ-носитель - азот, скорость потока -21 мл/мин

ВЭЖХ выполняли на хроматографе Gold System (Beckman,CIIIA), снабженном двойным насосом (мод 126), УФ-детектором с диодной матрицей (мод 168) и компьютером Pentium I Разделение компонентов проб проводили на колонке размером 250x4,6мм, заполненной сорбентом TSK-gel ДЕАЕ-28/У зернением 5мкм в изократическом режиме элюирования, используя в качестве подвижной фазы 0,05моль/л раствор натрия перхлората

Статистическую обработку результатов эксперимента проводили в соответствии с требованиями ГФ XI (вып 1, стр 199)

Изучение химического состава и фармакологической активности по-лисахаридных фракций липы сердцевидной листьев и цетрарии исландской слоевищ (глава 3)

Оценку качества используемых партий растительного сырья, сухих экстрактов и препаратов осуществляли по показателям, представленным в соответствующей нормативной документации на них При этом во всех исследуемых образцах обнаружены полисахариды

Полисахаридные фракции из растительного сырья выделяли

а) водой очищенной при 20-25°С в течение 1,5 ч и осаждением из экстракта фракции водорастворимых полисахаридов (ВРПС) двукратным объемом 95% спирта этилового,

б) кипящим 10 моль/л раствором кислоты хлористоводородной из шрота от первой экстракции и осаждением из экстракта пектиновых веществ (ПВ) двукратным объемом 95% спирта этилового,

в) раствором гидроксида натрия 10%-ным из шрота от второй экстракции и осаждением гемицеллюлозы-А (ГЦ-А) из экстракта кислотой уксусной 30%,

г) из фильтрата, после отделения осадка ГД-А, осаждением фракции I е-мицеллюлозы-Б (ГЦ-Б) двукратным объемом 95% спирта этилового

Аналогично выделяли полисахаридные фракции из экстрактов Очистку всех полученных фракций от сопутствующих веществ осуществляли путем переосаждения Оценку чистоты проводили общепринятыми методами химического и физико-химического анализа Для количественного определения Сахаров использовали методы спектрофотометрии (с антронсерным реактивом) и гравиметрии (ГФ XI) (табл 1)

Таблица 1 - Количественное содержание полисахаридных фракций в растительном сырье и экстрактах

Объект исследования ВРПС ПВ ГЦ-А ги -Б

% от общей массы полисахаридов % от общей массы сырья % от общей массы полисахаридов % от общей массы сырья % от общей массы полисахаридов % от общей массы сырья % от общей массы полисахаридов % от общей массы сырья

Липы сердцевидной листья 7,5 0,7 3,0 0,6 71,6 6,9 17,9 1,8

Цетрарии исландской слоевища 4,7 1,1 8,7 2,1 84,0 23,2 2,6 0,4

Липы сердцевидной листьев экстракт 9,5 - 3,5 - 75,0 - 12,0 -

Цетрарии исландской слоевищ экстракт 17,0 - 13,0 - 61,0 - 9,0 -

Представленные данные свидетельствуют о том, что биологически активные полисахаридные комплексы липы сердцевидной листьев, цетрарии исландской слоевищ и их экстрактов представлены водорастворимыми полисахаридами, пектиновыми веществами, гемицеллюлозами - А и Б Преобладающей фракцией является гемицеллюлоза-А, составляя 71,6 и 84,0% в сырье и 75,0 и 61,0% в экстрактах, соответственно

Для определения моносахаридного состава выделенных полисахаридов была изучена динамика гидролиза полимеров Полисахариды гидролизовали 0,5 моль/л серной кислотой в запаянных ампулах при 100°С Через каждый час отбирали пробу, и количество моносахаридов в гидролизате определяли спек-трофотометрическим методом Файербриджа, Уиллиса и Бута (табл 2,3)

Волнообразный характер изменения концентрации моносахаридов в процессе гидролиза позволяет предположить, что исследуемые полисахариды имеют сложную структуру и содержат гликозидные связи, в разной степени чувствительные к кислотному гидролизу, время гидролиза от 5 до 8 часов,

Таблица 2 - Количественное содержание моносахаридов в гидролизате _полисахаридов липы сердцевидной листьев_

Время гидролиза (ч) Содержание моносахаридов в гидролизатах полисахаридных фракций, %

ВР11С пв ГЦ А ГЦБ

0 0 0 0 0

1 19,2 24,0 20,4 0,72

2 14,4 14,4 33,8 1,08

3 20,16 18,72 36,0 2,82

4 24,48 20,16 36,6 1,92

5 15,84 23,04 40,8 2,4

6 25,8 52,8 38,8 2,54

7 29,1 30,6 42,6 3,76

8 30,0 12,6 22,2 1,26

9 15,6 24,0 13,6 1,56

Таблица 3 - Количественное содержание моносахаридов в гидролизате по_лисахаридов цетрарии исландской слоевищ_

Время Содержание моносахаридов в гидролизатах полисаха-

гидролиза(ч) ридных фракций, %

ВРПС ПВ ГЦА ГЦБ

0 0 0 0 0

1 36 67,2 15,6 18,0

2 45,6 58,8 27,6 48,0

3 36,9 61,2 34,8 57,6

4 30,0 60,0 22,8 52,8

5 45,6 62,4 46,8 63,6

6 36,0 68,4 45,6 64,6

7 42,2 72,2 39,6 " " 75,6

8 52,8 - 73,6 31,5 55,2

9 45,0 69,6 25,3 33,6

Моносахаридный состав полисахаридных фракций определяли с помощью нисходящей бумажной хроматографии (бутанол - пиридин - вода 4 6 3) и ГЖХ На хроматограммы (Шйгак 1?Ш1) наносили гидролизаты полисахаридов и стандартные образцы веществ-свидетелей В случае ГЖХ моносахариды переводили в триметилсилильные производные Типичная ГЖ хроматограмма представлена на рис 1

я Й

я? |

7 т § 3 1 I ? & 5 4 ¡1 ¡; щ

§4 | "У® |)( Тн ( ' (1 1 11 1! и ж Г щ и су

V ,11 Н ] П 1* ¡1 &

>ччЛЩ_. •1 г. V 1 !\ ч /1 __! V__ ¡ч\ _ш ^_____ _^__ 1 \ А -1

Рисунок 1 - Хроматограмма ГЦ-А при анализе методом ГЖХ

Результаты исследования мономерного состава полисахаридных фракций методами бумажной хроматографии и ГЖХ представлены в таблице 4.

Таблица 4 - Мономерный состав полисахаридных фракций

липы сердцевидной листьев и цеграрни исландской слоевищ

Анализируемая фракция полисахаридов Моносахариды, обнаруженные в гидролизатах полисахаридных фракций

Липы сердцевидной листья Цетрарии исландской слоевища

ВРПС Глюкоза Галактуроновая кислота Глюкоза Галактуроновая кислота Фруктоза (следы)

пв Глюкоза Галактуроновая кислота Глюкоза Галактуроновая кислота Арабиноза (следы)

ГЦ-А Глюкоза Ксилоза Галактуроновая кислота Арабиноза (следы) Рамноза (следы) Глюкоза Ксилоза Галактуроновая кислота Арабиноза (следы) Рамноза (следы)

ГЦ-Ь Глюкоза Арабиноза Ксилоза Галактуроновая кислота Рамноза (следы) Глюкоза Арабиноза Галактоза Галактуроновая кислота

Было установлено, что в гидролизатах всех фракций присутствуют глюкоза и галактуроновая кислота. Гемицеллюлозы-А липы сердцевидной листьев и цетрарии исландской слоевищ имеют одинаковый набор Сахаров, представленный глюкозой, ксилозой, арабинозой, рамнозой, галактуроновой кислотой, что согласуется с данными литературы. Аналогичные результаты были получены при анализе гидролизатов полисахаридных фракций из сухих экстрактов.

Таким образом, полисахаридные фракции исследуемых растительных объектов и их экстрактов обладают разной чувствительностью к кислотному

|

т

гидролизу и характеризуются различным моносахаридным составом, который представлен преимущественно глюкозой и галактуроновой кислотой Одинаков лишь состав фракций гемицеллюлоз-А изучаемых образцов

Выбор стандартного образца и метода анализа ЛРС и фитопрепаратов определяется природой биологически активных веществ, ответственных за фармакологическое действие (Сокольская, Даргаева и др , 2003), поэтому нами был определен вклад полисахаридных фракций в фармакологическую активность лекарственных средств липы сердцевидной листьев и цетрарии исландской слоевищ

Оценка острой токсичности анализируемых полисахаридов показала, что при однократном внутрибрюшинном введении фракций липы сердцевидной для ВРПС ЛД50 составила 1,96 г/кг, ПВ - 4,06 г/кг, ГЦ-А - 3,66 г/кг, ГЦ-Б - 4,74 г/кг, суммарного полисахаридного комплекса (СПСК) - 1,28 г/кг массы тела животного Для фракций цетрарии исландской установлено, что ДД50 ВРПС составила 1,38 г/кг, ПВ - 5,18 г/кг, ГЦ-А - 4,0 г/кг, СПСК - 2,10 г/кг массы тела животного

Исследование антигипоксической активности полисахаридных фракций проводили на нескольких моделях гипоксических состояний

На модели острой гипоксической гипобарической гипоксии было установлено, что изучаемые объекты липы сердцевидной в дозе 1/10 от ЛД50 увеличивают продолжительность жизни животных в 5,2-9,7 раз, выживаемость - в пределах 40-100% по сравнению с контролем Изучаемые фракции ВРПС, ПВ и ГЦ-А в данной дозе обладают антигипоксической активностью, сопоставимой с активностью гутимина и превышающей активность настойки корня женьшеня Несколько ниже активность у фракции ГЦ-Б и СПСК (рис 2а)

Все выделенные из цетрарии исландской фракции и СПСК в дозе 1/10 от ЛД50 увеличивают продолжительность жизни животных в 1,2-7,3 раза по сравнению с контролем, а выживаемость при этом составила - 50 % от всех животных, при этом ГЦ-А оказалась наиболее активной и сравнима с активностью гутимина Фракции ВРПС цетрарии исландской и СПСК обладают антигипоксической активностью, сопоставимой с действием настойки корня женьшеня Несколько ниже активность у фракции ПВ (рис За)

На модели гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме установлено, что исследуемые полисахариды также проявляют антигипоксическое действие На данной модели наиболее эффективным у объектов липы сердцевидной оказался СПСК Прирост продолжительности жизни при его введении составил 72,52% по сравнению с контрольной группой ПВ обеспечивали прирост длительности жизни животных на 56,59%, ГЦ-А - 46,47%, а ГЦ-Б - 64,33% Следует отметить, что на данной модели гипоксических состояний наименее эффективной оказалась фракция ВРПС, т к прирост продолжительности жизни в этом случае составил 26,23% Активность объектов липы была сопоставима с действием препарата сравнения - женьшеня и уступала гутимину (рис 26)

□ продолжительность жизни £2 выживаемость

□ Длительность жизни

Контропь Гутамин. 100 Жеиыигиь. ВРПС.1Л0 ГШ,1Л0ЛД5й ГЦ-А.1Л0 Щ-Б. 1/10 мгЛт ЮОиг.'й" ЛД60 ЛД50 ЛД50

60 40 20

Й

64

Л

ПВ, 1/10 ЛД50 ГЦ-А. 1/10 ГЦБ. 1/10 ЛД50 ЛД50

а) острая гипобарическая гипоксическая гипоксия

б) гипоксия с гиперкапнией в гермообъеме

Рисунок 2 - Влияние полисахаридных фракций липы сердцевидной листьев на переносимость мышами-самцами гипоксии на моделях гипоксических состояний

□ продолжительность жизни СЭвы живаем ость

800 700 I 600 | 600 | 400 К 300 * 200 100

пЬ

I £ Л

Ж

а) острая гипобарическая гипоксическая гипоксия

[Длительность жизни

30 20 |

с 10 I

5-' 0

о !------

б) гипоксия с гиперкапнией в гермообъеме

Рисунок 3 - Влияние полисахаридных фракций цетрарии исландской слоевищ на переносимость мышами-

самцами гипоксии на моделях гипоксических состояний

Примечание: отличия от контроля статистически значимы (Р<0,05)

Таблица 5 - Влияние полисахаридных фракций из липы сердцевидной листьев и цетрарии исландской слоевищ на развитие острой бутадиеновой язвы желудка у крыс (в группе по 10 животных)

ЛРС Объект исследования Доза, мг/кг Кол-во животных с язвами в группе, % Среднее число деструкций на 1 животное ИП ПА

крупных средних мелких всего

Цетрарии исландской слоевища Вода (контроль) 10 мл/кг 100 3,0±0,3 5,75±0,5 14,25±2,5 23,0 23,0 -

Масло облепихи 5 100 1,5±0,1* 3,0±0,2* 7,5±1,5* 12,0 12,0 1,9

ВРПС 1/100 ДД5(, 100 1,0±0,2 1,5±0,4 16,3±3,0* 18,8 18,8 1,2

ПВ 1/100 ДЦ50 100 1,5±0,2* 2,5±0,3* 6,5±1,5 10,5 10,5 2,2

ГЦ-А 1/Ю0 ЛД5„ 100 0,5±0,08* 1,25±0,1* 8,75±2,0* 10,5 10,5 2,2

СПСК 1/100 ЛД50 100 1,0±0,1 4,0±0,2* 6,0±1,0* 11,0 11,0 2,1

Липы сердцевидной листья Вода (контроль) 10 мл/кг 100 2,5+0,1 3,5±0,6 9,3+1,0 15,3 15,3 -

Масло облепихи 5 100 0,8±0,3* 1,8±0,4* 5,0±0,9* 7,5 7,5 2,0

ВРПС 1/100 ЛД50 100 1,0±0,3* 1,0+0,2 5,5+1,5* 7,5 7,5 2,0

ПВ 1/100 ЛД50 100 3,3+0,5* 2,5±0,3* 1,3+0,5* 7,0 7,0 2,2

ГЦ-А 1/100 ЛДзо 100 1,0+0,1 0,8+0,1 4,8+0,6* 6,0 6,5 2,4

ГЦ-Б 1/100 ЛД50 100 1,3+0,2* 2,5+0,6* 4,5+1,0* 10,8 10,8 1,4

СПСК 1/100 ЛД50 100 1,5±0,1* 2,0+0,4* 2,8+0,4* 6,3 6,3 2,4

Примечание ИП - индекс Паулса (индекс изъязвления),

ПА - противоязвенная активность * - отличия от контроля статистически значимы (Р<0,05)

У цетрарии исландской наиболее эффективными на данной модели оказались ВРПС и СПСК, активность которых сопоставима с гутимином Прирост продолжительности жизни составил 35,62% и 50,42% соответственно по сравнению с контрольной группой На данной модели гипоксических состояний менее эффективными оказались фракции ПВ и ГЦ-А, которые оказались сопоставимы по действию с настойкой женьшеня Прирост продолжительности жизни в данном случае составил 24,58% и 25,06%, соответственно (рис 36)

При изучении противовоспалительного действия на модели бутадионовой язвы желудка было установлено, что изучаемые фракции полисахаридов липы сердцевидной угнетают фазу альтерации процесса воспаления Наибольший эффект был обнаружен у СПСК и ГЦ-А Общее количество деструкций по сравнению с контролем снизилось на 75,0% и 74,0%, соответственно При этом наблюдались изменения качественного состава язвенных дефектов по сравнению с контролем крупных - на 36%, средних - на 30%, а мелких - на 50% (средние значения) Полученные результаты убедительно свидетельствуют о том, что противовоспалительной (антиальтерирующей) активностью обладают фракции ВРПС, ПВ и IЦ-А листьев липы, имеющие значение индекса ПА (противоязвенная активность) от 2,0 до 2,4 Величина ПА фракции ГЦ-Б равна 1,4, что свидетельствует об отсутствии изучаемого вида действия (табл 5)

Изучаемые фракции полисахаридов цетрарии исландской также угнетают фазу альтерации процесса воспаления Наибольший эффект был обнаружен у фракций ПВ и ГЦ-А, при этом общее количество деструкций по сравнению с контролем снизилось на 54,35% Наблюдалось изменение качественного состава язвенных дефектов по сравнению с контролем крупных - на 67%, средних -на 70%, а мелких - на 36% (средние значения) Таким образом, установлено,что противовоспалительной (антиальтерирующей) активностью обладают фракции ПВ, ГЦ-А и СПСК, имеющие значение индекса ПА от 2,1 до 2,2 Величина ПА фракции ВРПС равна 1,2, что свидетельствует об отсутствии изучаемого вида действия (табл 5)

Противомикробную активность оценивали в опытах с использованием грамположительных бактерий Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, грамот-рицательных бактерий Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli и грибов Candida albicans по известным методикам, при этом у всех полисахаридных фракций и СПСК было обнаружено наличие антимикробного действия

Таким образом, определено, что все анализируемые полисахаридные объекты обладают антигипоксической, противовоспалительной и антимикробной активностью, однако степень ее выраженности различна

Результаты изучения качественного и количественного состава, фармакологической активности полисахаридных фракций позволяют сделать вывод о том, что наиболее перспективными объектами для разработки стандартного образца полисахаридного состава являются фракции ГЦ-А из обоих растительных объектов

Для сравнения эти фракции были изучены методами ИК- и ЯМР-спектроскопии

Полученные результаты свидетельствуют о том, что эти образцы имеют схожие ИК-спектры, так в области 3600 - 3300 см"1 у них наблюдается широкая полоса поглощения с максимумом поглощения при 3450 см"1, которая характеризует наличие гидроксильных групп, связанных водородными связями Полоса поглощения с частотой 1710 см"1 соответствует С=0 группе уроновых кислот Полосы поглощения с частотами 1580 и 1410 см"1 относятся к асимметрическим и симметрическим валентным колебаниям карбоксилат-иона В области 1050 - 1010 см"1 есть две полосы поглощения, отвечающие колебаниям связи С-О

Отличие а- и Р-связей моносахаров определяются по полосам 920±10 см'1 (а и (3), 840±10 см"1 (а) и 890±10 см"1 (р) Однако, в этой области спектра наблюдаются и другие полосы поглощения, что затрудняет установление конфигурации полуацетального асимметрического центра в полисахаридах

Спектры "С-ЯМР рассматриваемых образцов ГЦ-А, за исключением небольших различий в химических сдвигах и интенсивностях сигналов, также очень схожи

В области резонанса аномерных углеводов Q наиболее интенсивными являются сигналы с химическими сдвигами 103,7 мд и 102,7 мд Такие значения химических сдвигов близки к сигналам Ci гликозилированных |3-глюкопиранозы, (3-ксилопиранозы, (З-(галактопиранозид)-уронида и (3-L-арабинофуранозида В обоих спектрах также наблюдаются сигналы при 86-87 м д Появление сигналов в этой области, вероятнее всего, связано с наличием межзвенной связи по третьему углеродному атому в пиранозах Учитывая, что содержание глюкозы наибольшее, можно предположить, что основная цепь представляет собой глюкан с Р-(1—>3) связями. Поскольку содержание ксилозы также значительно, возможно присутствие ксилана с заместителями по С3

В области резонанса аномерных углеродов наблюдаются сигналы небольшой интенсивности, которые можно отнести к звеньям a-L-арабинофуранозида (при 109-110 мд), a-D-ксилопиранозы и a-D-галактуроновой кислоты (при 99-101 мд) В спектрах растворов исследуемых гемицеллюлоз-А в щелочи наблюдаются также сигналы в области 174 мд и 168 м д, что указывает на наличие звеньев галактуроновой кислоты

Таким образом, результаты выполненных исследований свидетельствуют о схожести химических составов фракций ГЦ-А, выделенных из разных объектов.

Для определения гомогенности исстедуемых фракций ГЦ-А использовали метод ВЭЖХ и установили, что фракции ГЦ-А исследуемых растительных объектов содержат не менее 97,0% основного вещества (рис 4) На хромато-граммах имеется пик с временем удерживания 5,9 мин, характерный для ГЦ-А и пик примеси ГЦ-Б с временем удерживания 4,7 мин , содержание которой не превышает 3% Аналогичная хроматограмма была получена для фракции ГЦ-А цетрарии исландской слоевищ

Рисунок 4 - Хроматограмма ГЦ-А, выделенной из липы сердцевидной

листьев

Таким образом, полиеахаридные фракции ГЦ-А из липы сердцевидной листьев и цетрарии исландской слоевшц составляют основную массу биологически активного полисахаридного комплекса растений, отвечают за биологическую активность выделенных из растений ЛС, наиболее однородные по составу и могут быть использованы в качестве стандартного полисахаридного образца для оценки качества ЛРС и ЛС.

Разработка метода выделения, очистки и определение показателей качества стандартного образца полисахаридного состава (глава 4)

По схеме, представленной на рис.5, из каждого вида исследуемого сырья были выделены 5 партий ГЦ-А. Полиеахаридные фракции очищали от примесей трехкратным переосаждением из водного раствора гидроксида натрия 30% уксусной кислотой. Как оказалось выход гемицеллюлозы-А из цетрарии исландской слоевищ (не менее 20%) более чем в 3 раза выше, чем из липы сердцевидной листьев (табл. 6), поэтому в дальнейшем предпочтительнее получать стандартный образец из этого вида сырья.

Таблица 6 - Количественная характеристика партий ГЦ-А, полученных из

липы сердцевидной листьев и цетрарии исландской слоевищ

№ партии Выход ГЦ-А из Выход ГЦ-А из

липы сердцевидной листьев, цетрарии исландскои слоевищ,

%* о/ • /о

1 6,9±0,9 24,3±1,5

2 6,7±1,0 22,1 ±2,0

3 7,3±1,1 23,0±1,9

4 6,5±1,0 22,8±2,0

5 7,Oil,5 24,1±2,0

Примечание: * - процент от массы сырья

Рисунок 5 - Схема выделения гемицеллюлозы-А

Следующим этапом исследования явилось определение основных показателей качества стандартного образца ГЦ-А и разработка соответствующих ме-

тодов анализа Полученные результаты представлены в табл 7 Таблица 7 - Спецификация на стандартный образец Гемицеллюлозы-А

Показатели Методы Норматив

Описание Визуально Белый с серовато-коричневым оттенком аморфный порошок

Растворимость ГФ XI, вып 1, с 175 Очень мало растворим в воде, очень мало растворим в кислоте хлористоводородной, растворим в растворе натра едкого

Подлинность ИК-спектроскопия в дисках калия бромида ИК-спектр в области от 4500 до 400 см 1 должен иметь полное совпадение полос поглощения с полосами поглощения на прилагаемом рисунке спектра

ГЖХ Наличие пиков, соответствующих глюкозе, арабинозе, ксилозе, рамнозе и га-лактуроновой кислоте

ВЭЖХ На хроматограмме должен регистрироваться пик со временем удерживания около 6 мин

Хим реакции А) с 3,5- диметилфенолом, Б) с антронсерным реактивом Желтое окрашивание (уроновые кислоты), Зеленое окрашивание (моносахариды)

Чистота ВЭЖХ На хроматограмме кроме пика ГЦ-А допускается наличие дополнительного пика со временем удерживания около 4,5мин (ГЦ-Б) Содержание примеси ГЦ-Б не должно превышать 3%

Остаточные органические растворители ГЖХ Хлороформа не более 3,0 ррт Спирта этилового не более 30,5 ррт Кислоты уксусной не ботее 400 ррт

Количественное определение ВЭЖХ Содержание ГЦ-А должно быть не менее 97%

Упаковка По 0,5 г во флаконе вместимостью 10 мл, укупоренном резиновой пробкой с обкаткой алюминиевым колпачком

Маркировка В соответствии с ФС

Хранение В укупоренной таре оранжевого стекла, защищенном от света месте, при температуре 15-25°С

Срок годности 3 года

На основании этих результатов можно сделать заключение, что для определения подлинности стандартного образца следует использовать методы ИК-спектроскопии, газо-жидкостной и высоко-эффективной хроматографии, а так-

же химические реакции, позволяющие подтвердить наличие уроновых кислот (с 3,5-диметилфенолом), и моносахаридов (с антронсерным реактивом) Для оценки чистоты и количественного содержания следует использовать метод ВЭЖХ Содержание ГЦ-А должно составлять не менее 97%, а допустимой примеси ГЦ-Б не более 3 % Содержание остаточных органических растворителей должно составлять для хлороформа до 3 ррт, этилового спирта до 30,5 ррт, кислоты уксусной до 400 ррт

Для определения срока годности стандартного образца изучали его физико-химические характеристики Было установлено, что ГЦ-А относится к числу малогигроскопичных субстанций, отличается светочувствительностью, требует определенной температуры хранения Таким образом, стандартные образцы ГЦ-А следует хранить в укупоренной таре оранжевого стекла, защищенном от света месте, при температуре 15-25°С Результаты определения стабильности стандартного образца в указанных условиях свидетельствуют о том, что срок его годности может быть определен 3 годами

Таким образом, результатом выполненных исследований является разработка методики выделения и очистки, определение основных показателей качества и сроков годности стандартного образца полисахаридного состава и создание проекта ФС

Разработка методов оценки качества липы сердцевидной листьев, цетрарии исландской слоевищ, липы сердцевидной листьев экстракта сухого, цетрарии исландской слоевищ экстракта сухого, таблеток и сиропов Ислацет с применением стандартного образца ГЦ-А (глава 5)

Для оценки качества выше перечисленных объектов исследования по содержанию в них полисахаридов использовали стандартный образец ГЦ-А при определении таких показателей как «Подлинность», «Количественное определение», для таблетированной лекарственной формы - тест «Растворение» По разделу «Подлинность» проводили сравнительную оценку хроматограмм, полученных при ВЭЖХ анализируемых объектов и стандартного образца Идентичность времени удерживания соответствующих пиков ГЦ-А на хромато-граммах является подтверждением подлинности сырья и лекарственных средств Количественное содержание полисахаридов также определяли методом ВЭЖХ, оно составило липы сердцевидной листьев - не менее 4,0%, цетрарии исландской слоевищ - не менее 10%, липы сердцевидной листьев экстракта сухого - не менее 25%, цетрарии исландской слоевищ экстракта сухого - не менее 28%, для таблеток Ислацет - не менее 0,01 г/таб, сиропа Ислацет состава 1 - не менее 3,4%, состава 2 - не менее 1,2%

Кроме того, были проведены исследования по разработке состава, технологии и методов анализа сиропа Ислацет, полученного с использованием водных и спиртовых извлечений слоевищ цетрарии исландской и простого сахарного сиропа Для данной лекарственной формы были определены показатели качества и предложены соответствующие методы анализа, в том числе с использованием стандартного образца ГЦ-А, которые явились основанием к составлению проекта ФСП на лекарственное средство Ислацет сироп

Параллельно проводилась сравнительная оценка полученных результатов с результатами анализов, выполненных в соответствии с требованиями разработанных ранее проектов ФСП, где в качестве стандартного образца использовалась глюкоза Применение стандартного образца ГЦ-А позволило достичь требуемой специфичности анализа

Разработанные методики в виде «Изменений и дополнений» внесены в соответствующие разделы нормативной документации (табл 8)

Таблица 8 - Наименования разделов нормативной документации, с внесением в них изменений и дополнений, связанных с использованием __стандартного образца ГЦ-А__

Объект нд Раздел анализа

«Липы сердцевидной листья» Изменения и дополнения к ФСП Подлинность, количественное определение

«Цетрарии исландской слоевища»

«Липы сердцевидной листьев экстракт сухой»

«Цетрарии исландской слоевищ экстракт сухой»

Таблетки «Ислацет» Подлинность, количественное определение, тест «Растворение»

Сироп «Ислацет» Проект ФСП Количественное определение

ВЫВОДЫ

1 Определение качества лекарственного растительного сырья липы сердцевидной листьев, цетрарии исландской слоевищ и лекарственных средств на их основе может быть осуществлено с использованием стандартного образца гемицеллюлозы-А

2 Биологически активные полисахаридные комплексы липы сердцевидной листьев, цетрарии исландской слоевищ представлены водорастворимыми полисахаридами, пектиновыми веществами и гемицеллюлозами А и Б, которые имеют различный моносахаридный состав, при этом моносахаридный состав гемицеллюлоз-А изучаемых растительных объектов одинаков и представлен глюкозой, ксилозой, галактуроновой кислотой, арабинозой и рамнозой

3 Доказан вклад гемицеллюлозы-А, как одной из фракций полисахарид-ного комплекса липы сердцевидной листьев и цетрарии исландской слоевищ в проявляемые лекарственными средствами на основе этих видов сырья фармакологические эффекты антигипоксический, противовоспалительный, антимикробный

4 В качестве сырья для получения стандартного образца гемицеллюлозы-А следует использовать цетрарии исландской слоевища, т к в этом случае выход составляет не менее 20%, в то время как при использовании листьев липы сердцевидной выход стандартного образца гемицеллюлозы-А составляет не более 7%

5 Для очистки стандартного образа следует использовать метод переосаждения с применением кислоты уксусной разведенной

6 Оценку качества разработанного стандартного образца следует осуществлять по таким показателям как «Подлинность» (химические реакции, ИК-спектроскопии, ГЖХ, ВЭЖХ), «Чистота» и «Количественное определение» (ВЭЖХ), «Остаточные органические растворители» (ГЖХ) Составлен проект ФС и определен срок годности стандартного образца - 3 года (срок наблюдения)

7 Доказано преимущество использования стандартного образца гемицел-люлозы-А при оценке качества липы сердцевидной листьев, цетрарии исландской слоевищ, цетрарии исландской слоевищ экстракта сухого, липы сердцевидной листьев экстракта сухого, таблеток и сиропа Ислацет, т к разработанные с его применением методики отличаются специфичностью

8 Разработанные методики определения подлинности и количественного содержания действующих веществ (полисахаридов) в липы сердцевидной листьях, цетрарии исландской слоевищах, цетрарии исландской слоевищ экстракте сухом, липы сердцевидной листьев экстракте сухом, таблетках и сиропе Ислацет методами спектрофотометрии и ВЭЖХ с использованием стандартного образца гемицеллюлозы-А позволили внести «Изменения и дополнения» в соответствующие проекты ФСП

Список работ, опубликованных по теме диссертации'

1 Криштанова, Н А Перспективы использования растительных полисахаридов в качестве лечебных и лечебно-профилактических средств /НА Криштанова, М Ю Сафонова, В Ц Болотова, Е Д Павлова, Е И Саканян // Вестник Воронежского Государственного Университета, Серия Химия Биология Фармация - 2005 - № 1 - С 212-221

2 Криштанова, Н А Изучение фармакологической активности отдельных компонентов полисахаридного комплекса слоевищ цетрарии - Cetraria islandica (L) Ach /НА Криштанова, И А Наркевич, В Ц Болотова, М В Заварзина, Е И Саканян // Вестник Российской военно-медицинской академии -2006-№2(16) - С 69-75

3 Криштанова, Н А Разработка метода количественного определения в препарате Ислацет /НА Криштанова, К Э Кабишев, М Ю Сафонова, Е И Саканян // Труды 76-й научной сессии КГМУ и отделения мед-биол наук центрально-черноземного научного центра РАМН (Часть II) - Курск, 2002 - С 93-94

4 Криштанова, HAK вопросу получения стандартного образца на основе полисахаридов цетрарии исландской /НА Криштанова, Е И Саканян // VI Международный Съезд «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» - 4 - 6 июля 2002 г Санкт-Петербург - СПб , 2002 - С 247-248

5 Криштанова, Н А Изучение химического состава и фармакологической активности полисахаридов листьев липы сердцевидной /НА Криштанова, Е Д Павлова, В Ц Болотова, Е И Саканян, Е Е Лесиовская // VII Международный Съезд «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения», Фитофарм 2003, 3-5 июля 2003 г, Санкт-Петербург-Пушкин - СПб, 2003 -С 59-61

6 Криштанова, Н А Перспективы создания лекарственных и лечебно-профилактических средств на основе растительных полисахаридов /НА Криштанова, В Ц, Болотова, М Ю Сафонова, Е И Саканян, Е Е Лесиовская // Материалы IV

Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке», 23 мая 2003 г - М , 2003 - С 350

7 Криштанова, Н А Листья липы сердцевидной - перспективный источник лекарственных средств для ветеринарной практики /НА Криштанова, В Ц Болотова // Материалы I международной научно-практической конференции аспирантов и соискателей «Предпосылки и эксперимент в науке», посвященной 300-летию Санкт-Петербурга - СПб, 2003 -С 17-18

8 Криштанова, Н А Разработка методов стандартизации лекарственных форм на основе фитоэкстрактов, содержащих полисахариды /НА Криштанова, Е И Саканян, В.Ц Болотова // VIII Международный Съезд «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения», Фитофарм 2004, 21-23 июня 2004 г, Финляндия -Миккели, 2004 - С 274-278

9 Криштанова, Н А Современный подаод к вопросу стандартизации лекарственных форм с экстрактом цетрарии исландской /НА Криштанова, Т В Астахова, Е В Фли-сюк, В А Кашицина, М Ю Сафонова, Е И Саканян, А В Палечкин // Материалы международной науч -практической конф, посвященной 85-летию академии «Выпускник фармацевтического ВУЗа (факультета) в прошлом, настоящем и будущем»

09 09 04-13 09.04/Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия - СПб СПХФА, 2004 -С 277-281

10 Криштанова, HAK вопросу разработки стандартного образца полисахаридного состава /НА Криштанова, И К Журкович, Е И Саканян // Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 85-четию академии «Выпускник фармацевтического ВУЗа (факультета) в прошлом, настоящем и будущем» 09 09 04 - 13 09 04 / Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия -СПб СПХФА,2004 - С 270-271

11 Криштанова, HAK разработке метода количественного определения полисахаридов в таблетированной лекарственной форме «Ислацет» /НА Криштанова // Материалы научно-методической конференции «Состояние и перспективы подготовки специалистов для фармацевтической отрасли», 20 февраля 2004 г - СПб, 2004 - С 131-132

12 Криштанова, Н А Разработка стандартного образца полисахаридов листьев липы сердцевидной и слоевищ цетрарии исландской /НА Криштанова, И К Журкович, Е И Саканян // XI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» тезисы докладов, 19-23 апреля 2004 г - М , 2004 - С 206.

13 Потехина, ТС Антимикробная активность полисахаридных фракций слоевищ цетрарии исландской /ТС Потехина, Е И Саканян , Н А Криштанова, М В Завар-зина // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции сб науч трудов (Пятигорская государственная фармацевтическая академия) - Пятигорск, 2006 - Вып 61 - С 378-379

14 Криштанова, НА Изучение фармакологической активности сиропа на основе слоевищ цетрарии исландской - Cetraria islandica (L) Ach /НА Криштанова, В Ц Болотова, В А Кашицина, Е И Саканян // «Традиционная медицина - 2007» сб науч тр конгресса, посвященного 30-летию со дня открытия Центрального научно-исследовательского института рефлексотерапии г Москва, 1-3 марта 2007 года -М, 2007 -С 63-65

На правах рукописи

Криштанова Надежда Александровна

РАЗРАБОТКА СТАНДАРТНОГО ОБРАЗЦА ПОЛИСАХАРИДНОГО СОСТАВА ДЛЯ ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА ЛИПЫ СЕРДЦЕВИДНОЙ ЛИСТЬЕВ,

ЦЕТРАРИИ ИСЛАНДСКОЙ СЛОЕВИЩ И ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ НА ИХ ОСНОВЕ

Специальность 15 00.02 —Фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Печать Н В Андриановой

Подписано к печати 10 10 2007 Формат 60x90/16 Бумага тип Печать ризограф _Гарнитура «Тайме» Печ л 3,0 Тираж! 00 экз Заказ 703_

Санкт-Петербург 2007

Изучение заболеваемости населения Российской Федерации показало увеличение числа заболеваний органов дыхания, в том числе инфекционного характера [17, 92]. К числу наиболее распространенных патологий, сопровождающихся потерей трудоспособности и высокой смертностью, следует отнести туберкулез [93, 107, 114, 156, 196].

Профилактика и лечение этого заболевания проводится с использованием целого ряда препаратов, преимущественно синтетического происхождения, среди которых следует отметить рифампицин, а также производные изоникотиновой и парааминобензойной кислот, однако, применение этих средств не всегда позволяет достичь требуемых результатов. Многие исследователи отмечают возрастающую с каждым годом резистентность бактерий туберкулеза к перечисленным выше лекарственным средствам [154, 107]. В связи с этим актуален поиск и разработка новых субстанций и препаратов на их основе, которые могут быть успешно применены в профилактике и лечении туберкулеза [77, 154]. К их числу следует отнести низкотоксичные препараты растительного происхождения, которые на протяжении многих веков широко применяются в традиционной и народной медицине в профилактике и лечении инфекционных заболеваниях верхних дыхательных путей и легких.

Анализ литературных данных, а также результаты научных исследований, выполненных в СПХФА, позволили выделить среди них слоевища цет-рарии исландской - Cetraria islandica (L.) Ach., сем. Пармелиевые -Parmeliaceae L. и листья липы сердцевидной - Tilia cordata Mill., сем. Липовые - Tiliaceae L., применяемые при заболеваниях верхних дыхательных путей.

Исследованиями, проведенными в СПХФА, было доказано, что состав биологически активных веществ этого лекарственного растительного сырья, представленный полисахаридами, флавоноидами, дубильными веществами, микроэлементами, органическими кислотами, стероидными сапонинами, обуславливает полифункционалы юсть фармакологического действия. Для листьев липы сердцевидной установлено наличие противовоспалительной, аитигипоксической, прогивомикробной, фервопротекторной, психотропной, иммунотропной, обезболивающей фармакологической активности. Это явилось основанием к разработке на основе слоевищ цетрарии исландской лекарственных средств «Ислацет», включающей сухой экстракт, таблетки и сироп, а на основе листьев липы сердцевидной - «Тилиафол», представляющий собой полиэкстракт.

Следует отметить, что для обоих растительных объектов характерным является преобладание в комплексе биологически активных веществ полисахаридов, которые в свою очередь и обуславливают ряд фармакологических эффектов, проявляемых этими растениями, а именно противовоспалительного, рапозаживляющего, иммуногропного.

В связи с активным изучением этих растений следует разрабатывать адекватные методы анализа сырья и препаратов на его основе. Так как полисахариды являются основной группой БАВ растительных объектов, то стандартизацию слоевищ цетрарии исландской и препаратов серии «Ислацет», а также листьев липы сердцевидной и препаратов серии «Тилиафол», и следует' вести по ним. Однако до настоящего времени, ввиду недостаточной изученности составов полисахаридных комплексов этих растений, было предложено использовать метод качественной и количественной оценки фитопрепаратов цетрарии исландской и липы сердцевидной по продуктам гидролиза их полисахаридов, в частности, по глюкозе, что не обеспечивает специфичность методов анализа.

Наличие соответствующего стандартного образца полисахаридного состава могло бы существенно повысить качество аналитических исследований.

В настоящее время в РФ применяется порядка 200 стандартных образцов, из них 46 растительного происхождения. Большинство используемых стандартных образцов представляет собой моносубстапции, в ряде случаев — это очищенные суммы биологически активных веществ, однако, среди них отсутствуют стандартные образцы группы полисахаридов.

В связи с этим представляется актуальным изучение полисахаридных комплексов слоевищ цетрарии исландской и листьев липы сердцевидной, и разработка технологии получения стандартного образца полисахаридного состава, а также методов стандартизации этих растительных объектов, их экстрактов и лекарственных форм с его использованием.

Целью настоящей диссертационной работы явилась разработка стандартного образца на основе полисахаридных комплексов цетрарии исландской слоевищ и липы сердцевидной листьев и методов стандартизации этих растительных объектов, а также их лекарственных средств с применением полученного образца.

Задачи исследования:

1) Выделение и изучение полисахаридных комплексов липы сердцевидной листьев и цетрарии исландской слоевищ, предварительная оценка их фармакологической активности.

2) Очистка полисахаридных фракций липы сердцевидной листьев и цетрарии исландской слоевищ и получение на их основе стандартного образца.

3) Определение основных показателей качества стандартного образца и составление на него необходимой нормативной документации в виде проекта ФС.

4) Разработка методов стандартизации липы сердцевидной листьев и цетрарии исландской слоевищ и препаратов на их основе с применением стандартного образца полисахаридного состава и включение установленных показателей в нормативную документацию.

Научная новизна. Впервые выделены и изучены полисахаридные фракции липы сердцевидной листьев и цетрарии исландской слоевищ, котоI рые представлены водорастворимыми полисахаридами, пектиновыми веществами, гемицеллюлозой-А и гемицеллюлозой-Б.

С помощью методов химического и физико-химического анализа (бумажной и тонкослойной хроматографии, ГЖХ, ВЭЖХ, ИК-, УФ-, ЯМР-спектроскопии) определен мономерный состав выделенных полисахаридных фракций и установлена гомогенность качественного состава фракции гемицеллюлозы-А, выделенной из двух растительных объектов.

Впервые исследована фармакологическая, в том числе, микробиологическая активность различных фракций полисахаридов и суммарного полиса-харидного комплекса липы сердцевидной листьев и цетрарии исландской слоевищ. Установлено наличие антигипоксического, противовоспалительного, иммунотропного, противомикробного действия выделенных полисахаридных фракций и доказан их вклад в общий фармакологический эффект, проявляемый лекарственными средствами липы сердцевидной листьев и цетрарии исландской слоевищ.

Впервые доказана целесообразность использования стандартного образца полисахаридного состава, полученного па основе полисахаридной фракции гемицеллюлозы-А, для стандартизации липы сердцевидной листьев, цетрарии исландской слоевищ и препаратов на их основе.

Предложена схема выделения и очистки стандартного образца полисахаридного состава, определен перечень показателей его качества.

Практическая значимость полученных результатов заключается в разработке технологии получения и очистки стандартного образца гемицеллюлозы-А, которая может быть использована предприятиями, специализирующимися в производстве фитопрепаратов и стандартных образцов, а проект ФС на стандартный образец гемицеллюлозы-А следует использовать соответствующими контрольно-аналитическими лабораториями при оценке его качества.

Предложены методы стандартизации липы сердцевидной листьев, цетрарии исландской слоевищ, липы сердцевидной листьев экстракта сухого, цетрарии исландской слоевищ экстракта сухого, таблеток и сиропа Ислацет по показателям "Подлинность" и "Количественное определение полисахаридов" с использованием стандартного образца гемицеллюлозы-А. Составлены «Изменения и дополнения» к проектам нормативной документации — ФСП на липы сердцевидной листья, цетрарии исландской слоевища, липы сердцевидной листьев экстракт сухой Тилиафол, цетрарии исландской слоевищ экстракт сухой Ислацет, таблетки и сироп Ислацет.

Разработанные методики анализа полисахаридных комплексов используются в учебном процессе на кафедре фармацевтической химии СГТХФА, а также в Центре аналитических исследований СПХФА, ФГУП СПбНИИВС ФМБА РФ, ООО ЭКОС.

Работа выполнена на кафедре фармацевтической химии ГОУ ВПО СПХФА Росздрава в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ СПХФА по теме: «Изыскание и изучение биологически активных веществ синтетического, микробного и растительного происхождения». Фармакологические и микробиологические исследования проводились на кафедрах фармакологии и микробиологии СПХФА соответственно. Исследования с использованием приборных хроматографических и спектроскопических методов выполнены в лаборатории аналитических методов НИУ академии.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Результаты исследования полисахаридных комплексов цетрарии исландской слоевищ и липы сердцевидной листьев: методы их выделения, определение фракционного и мономерного состава.

2. Результаты фармакологических и микробиологических исследований полисахаридных комплексов, выделенных из липы сердцевидной листьев и цетрарии исландской слоевищ.

3. Результаты исследований по получению стандартного образца полиса-харидного состава, определению показателей его качества.

4. Материалы нормативных документов в виде проекта ФС «Гемицеллю-лоза-А - стандартный образец», «Изменений и дополнений» к проектам ФСП на «Липы сердцевидной листья», «Цетрарии исландской слоевища», «Липы сердцевидной листьев экстракт сухой», «Цеграрии исландской слоевищ экстракт сухой», таблетки и сироп «Ислацет».

Публикации: Основное содержание диссертации отражено в 14 научных статьях и тезисах докладов.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на 1

VI, VII, VIII Международных съездах «Актуальные проблемы создания ноi вых лекарственных препаратов природного происхождения» Фитофарм 2002, I

2003, 2004 (СПб., СПб., Миккели); IV Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXl веке» (М., 2003); I Международной межвузовской научно-практической конференции аспирантов и соискателей «Предпосылки и эксперимент в науке*> (СПб., 2003); XI Российском 'I и национальном конгрессе «Человек и лекарство» (М., 2004); Научно-методической конференции «Состояние и перспективы подготовки специалистов для фармацевтической отрасли» (СПб., 2004); Международной научно-практической конференции, посвященной 85-летию СПХФА (СПб., 2004); Межрегиональной конференции «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2006); Конгрессе «Традиционная медицина - 2007» (М., 2007). .

0У

выводы

1. Определение качества лекарственного растительного сырья липы сердцевидной листьев, цетрарии исландской слоевищ и лекарственных средств на их основе может быть осуществлено с использованием стандартного образца гемицеллюлозы-А.

2. Биологически активные полисахаридные комплексы липы сердцевидной листьев, цетрарии исландской слоевищ представлены водорастворимыми полисахаридами, пектиновыми веществами и гемицеллюлозами А и Б, которые имеют различный моносахаридный состав, при этом моносахаридный состав гемицеллюлоз-А изучаемых растительных объектов одинаков и представлен глюкозой, ксилозой, галактуроновой кислотой, арабинозой и рамнозой.

3. Доказан вклад гемицеллюлозы-А, как одной из фракций полисахаридного комплекса липы сердцевидной листьев и цетрарии исландской слоевищ в проявляемые лекарственными средствами на основе этих видов сырья фармакологические эффекты: антигипоксический, противовоспалительный, антимикробный.

4. В качестве сырья для получения стандартного образца гемицеллюлозы-А следует использовать цетрарии исландской слоевища, т.к. в этом случае выход составляет не менее 20%, в то время как при использовании листьев липы сердцевидной выход стандартного образца гемицеллюлозы-А составляет не более 7%.

5. Для очистки стандартного образа следует использовать метод переосаждения с применением кислоты уксусной разведенной.

6. Оценку качества разработанного стандартного образца следует осуществлять по таким показателям как «Подлинность» (химические реакции, ИК-спектроскопии, ГЖХ, ВЭЖХ), «Чистота» и «Количественное определение» (ВЭЖХ), «Остаточные органические растворители» (ГЖХ). Составлен проект ФС и определен срок годности стандартного образца - 3 года (срок наблюдения).

7. Доказано преимущество использования стандартного образца гемицеллюлозы-А при оценке качества липы сердцевидной листьев, цетрарии исландской слоевищ, цетрарии исландской слоевищ экстракта сухого, липы сердцевидной листьев экстракта сухого, таблеток и сиропа Ислацет, т.к. разработанные с его применением методики отличаются специфичностью.

8. Разработанные методики определения подлинности и количественного содержания действующих веществ (полисахаридов) в липы сердцевидной листьях, цетрарии исландской слоевищах, цетрарии исландской слоевищ экстракте сухом, липы сердцевидной листьев экстракте сухом, таблетках и сиропе Ислацет методами спектрофотометрии и ВЭЖХ с использованием стандартного образца гемицеллюлозы-А позволили внести «Изменения и дополнения» в соответствующие проекты ФСП.