Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Химико-фармакологическое исследование полисахаридов высших растений и перспективы их использования в терапии злокачественных новообразований

На права* рукописи

ГУРЬЕВ АРТЕМ МИХАЙЛОВИЧ

ХИМИКО-ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЛИСАХАРИДОВ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ И ПЕРСПЕКТИВЫ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ТЕРАПИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия 14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук

1 7 НОЯ 2011

Пятигорск-2011

005000837

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научные консультанты:

доктор химических наук, профессор Юсубов Мехман Сулейман оглы

доктор фармацевтических наук Белоусов Михаил Валерьевич

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор

Коновалов Дмитрий Алексеевич

доктор медицинских наук, профессор Болиева Лаура Зелимхановна

доктор фармацевтических наук, профессор Куркин Владимир Александрович

Ведущая организация: ГБОУ ВПО Ярославская ГМА

Минздравсоцразвития России

Защита состоится «¿0» 2011 г. в часов на заседании

диссертационного совета Д 208.069.01 в ГБОУ ВПО Пятигорская ГФА Минздравсоцразвития России (357532, Ставропольский край, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Пятигорская ГФА Минздравсоцразвития России (357532, Ставропольский край, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11).

Автореферат разослан « 0£ » УУ 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Е. В. Компанцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Онкологические заболевания занимают одно из первых мест в мире по уровню смертности, и одним из немногих способов их эффективного лечения является цитостатическая химиотерапия. Общеизвестно, что цитостатические препараты не оказывают избирательного действия на опухоль и обладают токсическим влиянием на активно обновляющиеся клетки организма. Следствием этого является целый ряд тяжелых побочных эффектов и осложнений, возникающих при применении цитостатиков. В связи с этим поиск и создание средств, повышающих эффективность и снижающих токсические эффекты цитостатической терапии, является актуальной проблемой современной медицинской и фармацевтической науки.

Одно из наиболее перспективных направлений в данной области - поиск агентов, препятствующих развитию иммунологической резистентности опухоли, которая формируется в результате опухолепротективного влияния макрофагов и дендритных клеток, инфильтрующих опухолевую ткань и, в силу своих регуляторных способностей, обуславливающих локальную иммуносупрессию и жизнеобеспечение опухолевых клеток (ангиогенез, пролиферацию, ремоделирование тканей и т.д.) [Shurin M.R. et al., 2001; Wyckoff J.B. et al., 2007]. Известно, что макрофаги и дендритные клетки способны изменять свое функциональное состояние под влиянием веществ микробного происхождения -липополисахариды, пептидогликаны, тейхоевые кислоты и т.д. Полисахариды высших растений являются структурными аналогами этих веществ и представляют значительный интерес для онкофармакологии, так как они, в отличие от препаратов бактериального происхождения, обладают низкой токсичностью, не вызывают пирогенной реакции, не обладают сенсибилизирующими свойствами. Исследования последних лет свидетельствуют о том, что растительные полисахариды являются перспективными кандидатами на роль средств комплексной терапии злокачественных новообразований [Chauhan D. et al., 2005; Xie J.T. et al., 2006; Lavi 1. et al., 2009; Miao Y. et al., 2009; Hsu J.W. et al., 2009; Mao F. et al., 2010].

Вместе с тем, полисахариды в силу особенностей химической структуры являются весьма сложной для изучения группой биологически активных веществ. Существующие в настоящее время общепринятые в фармацевтической практике методики не позволяют селективно выделять индивидуальные полисахариды из растительного сырья, определять их химическую структуру и проводить стандартизацию исследуемых образцов, что значительно усложняет проведение адекватной оценки их фармакологической активности и затрудняет интерпретацию полученных данных. В связи с этим процесс поиска и разработки новых лекарственных средств на основе полисахаридов в настоящее время характеризуется низкой эффективностью ввиду отсутствия единой методологической схемы, обосновывающей оптимальные пути реализации каждого этапа таких исследований.

Цель работы. На основании химико-фармакологического исследования полисахаридов высших растений разработать рациональные методологические подходы к поиску, оценке эффективности и созданию новых лекарственных средств комплексной терапии злокачественных новообразований.

Задачи исследования:

1. Выбрать растения, перспективные в качестве источников биологически активных полисахаридов, выделить и охарактеризовать полисахаридные комплексы из них.

2. Провести скрининговое исследование влияния полученных полисахаридных комплексов на эффективность химиотерапии злокачественных новообразований и выбрать образцы, обладающие наибольшей биологической активностью для дальнейшего изучения.

3. Провести углубленное изучение наиболее активных образцов в терапии злокачественных новообразований (выбор оптимальной дозы, эксперименты на разных видах лабораторных животных и различных моделях экспериментальных опухолей и т.д.).

4. Выделить индивидуальные компоненты наиболее активных полисахаридных комплексов.

5. Установить структуру веществ, ответственных за биологическую активность.

6. Разработать методы стандартизации биологически активной субстанции и растительного сырья по содержанию действующих веществ.

7. Исследовать механизмы антибластомного действия полисахаридов.

8. Обосновать рациональные методологические подходы к поиску, оценке эффективности и разработке новых лекарственных средств терапии онкологических заболеваний на основе полисахаридов высших растений.

Научная значимость и новизна результатов: На основании полученных экспериментальных данных разработаны рациональные методологические подходы к поиску, оценке эффективности и разработке новых лекарственных средств комплексной терапии злокачественных новообразований на основе полисахаридов высших растений. Впервые предложена последовательная методологическая схема, обосновывающая оптимальные пути реализации каждого этапа исследований.

Впервые экспериментально обоснована и предложена универсальная методика извлечения полисахаридов из растительного сырья, позволяющая выделять максимальный спектр водорастворимых полисахаридов с минимальным количеством примесей.

Впервые охарактеризованы полисахаридные комплексы из сырья 10 видов высших растений по количественному соотношению и молекулярной массе входящих в их состав компонентов и содержанию уроновых кислот. Впервые показано, что:

- полисахаридный комплекс из корневищ с корнями левзеи сафлоровидной содержит 3 основных компонента с молекулярной массой 700 кДа (12,8%), 250 кДа (80,9%) и ЗОкДа (6,3%) (общее содержание уроновых кислот (38,91 ±0,22)%);

- полисахаридный комплекс из побегов багульника болотного также состоит из трех основных компонентов с молекулярной массой 500 кДа (8,66%), 360 кДа (73,23%) и 20 кДа (18,10%), с общим содержанием уроновых кислот (95,32 ± 0,23)%;

- полисахаридный комплекс из корневищ с корнями родиолы розовой содержит 2 основных компонента с молекулярной массой 750 кДа (31,65%) и 380 кДа (68,45%) с содержанием уроновых кислот (10,25 ± 0,11)%;

- лолисахаридный комплекс из корневищ аира болотного состоит из 5 компонентов 720 кДа (8,82%), 460 кДа (8,96%), 370 кДа (46,92%), 290 кДа (4,76%), 40 кДа (30,53%) и содержит (24,36 ± 0,04)% уроновых кислот.

Впервые показано, что в корнях одуванчика, кроме инулина и инулиноподобных полисахаридов, в большом количестве (около 2,5%) содержатся кислые полисахариды с молекулярной массой 310 и 700 кДа.

Впервые детально изучен химический состав полисахаридного комплекса из корневищ аира болотного, показано, что в его составе содержится 3 нейтральных и 2 кислых полисахарида и установлена их химическая структура: а-(1,4)-0-глюкан с молекулярной массой 40 кДа; а-0-галакто-( 1,4)-а-0-гл юкан с разветвлениями, состоящими из остатков а-Ь-рамнопиранозы и молекулярной массой 280 кДа; Р(1,3)-0-ксилопиранозил-а(1,4)-0-галакто-а(1,4)-Б-глюкан с молекулярной массой 440 кДа; рамно-а(1,4)-В-галактопиранозилуронан с разветвлениями из остатков нейтральных Сахаров (ксилозы, галактозы и глюкозы) и молекулярной массой 370 кДа и сильноразветвленный рамногалактуронан I с молекулярной массой 740 кДа.

Экспериментально обоснованы и оптимизированы методические подходы к стандартизации полисахаридсодержащего растительного сырья по содержанию биологически активных полисахаридов.

Впервые предложено проводить стандартизацию корневищ аира болотного по содержанию галактуронана и разработана методика его количественного определения в растительном сырье и в субстанции, позволяющая селективно определять галактуронан в присутствии нейтральных полисахаридов.

Проведено исследование влияния полисахаридных комплексов из сырья 10 видов высших растений на развитие экспериментальной опухоли и её цитостатическое лечение. Впервые выявлено, что:

- полисахаридные комплексы из цветков липы сердцевидной, побегов багульника болотного, корневищ аира болотного и листьев мать-и-мачехи повышают противоопухолевую и антиметастатическую активность циклофосфана в отношении карциномы легких Льюис у мышей;

- полисахариды аира оказывают самостоятельное противоопухолевое

действие, а полисахариды липы, багульника и солодки проявляют самостоятельный антиметастатический эффект;

- полисахариды левзеи, одуванчика и подорожника потенцируют противоопухолевую и не влияют на антиметастатическую активность циклофосфана.

Впервые проведено углубленное фармакологическое изучение полисахаридов аира в комплексной терапии экспериментальных опухолей, показано, что:

- полисахариды аира болотного повышают эффективность цитостатиков, отличающихся по механизму действия (циклофосфан и 5-фторурацил), в отношении различных моделей опухолевого роста (меланома В-16, карциносаркома 256 Уокера, карцинома легких Льюис) и на разных видах лабораторных животных (мыши и крысы).

- рамно-а(1,4)-0-галактопиранозилуронан с молекулярной массой 370 кДа и содержанием уроновых кислот 84% потенцирует противоопухолевую и антиметастатическую активность циклофосфана;

- рамногалактуронан I с молекулярной массой 740 кДа и содержанием уроновых кислот 32% потенцирует антиметастатическую активность циклофосфана в отношении частоты метастазирования, количества и площади метастазов;

- галактоглюканы с молекулярной массой 280 кДа и 440 кДа также способны повышать антимегастатическую активность циклофосфана в отношении частоты метастазирования опухоли и площади метастазов.

- антибластомная активность полисахаридов аира болотного обусловлена наличием в молекуле полисахарида чередующихся линейных участков а-1,4-связанных остатков Б-галактуроновой кислоты и участков, состоящих из а-1,2-связанных остатков Э-галактуроновой кислоты и остатков рамнозы с боковыми цепями из Б-галактозы (соотношение галактуроновой кислоты и нейтральных Сахаров в молекуле полисахарида 1 : 5).

На примере полисахаридов из корневищ аира болотного изучены иммунологические механизмы антибластомного действия полисахаридов высших растений. Впервые установлено, что:

- полисахариды высших растений стимулируют активность опухоле-специфических лимфоидных клеток и созревание Т- и В-лимфоцитов в условиях иммуносупрессии, вызванной опухолевым ростом и применением цитостатиков;

- полисахариды аира болотного вызывают классическую активацию макрофагов и стимулируют продукцию ими провоспалительных цитокинов 1Ь-12 и ТОТа;

- одним из механизмов антибластомного действия полисахаридов высших растений является стимулирование ТЫ-типа и подавление ТЪ2-типа иммунологического ответа.

Практическая значимость работы. На основании химико-фармакологического изучения полисахаридов из 10 видов лекарственных растений разработаны рациональные методологические подходы к поиску, оценке эффективности и созданию новых лекарственных средств, повышающих эффективность химиотерапии злокачественных новообразований. Впервые предложена последовательная методологическая схема реализации каждого этапа исследований.

Данные фармакологического исследования свидетельствуют, что цветки липы сердцевидной, побеги багульника болотного, корневища аира болотного и листья мать-и-мачехи являются перспективными источниками полисахаридов, повышающих эффективность противораковой терапии. Разработка и внедрение в медицинскую практику новых лекарственных препаратов и биологически активных добавок на основе исследованных полисахаридов позволит расширить ассортимент средств комплексной терапии онкологических заболеваний.

Исследование иммунотропной активности образцов позволило выявить факт снижения продукции иммуноглобулинов класса Е и под влиянием полисахаридов аира, мать-и-мачехи и календулы, что дает основания для их дальнейшего исследования с целью разработки на их основе новых лекарственных средств, предназначенных для терапии аллергических заболеваний.

С использованием предложенной методологической схемы поиска и разработки новых лекарственных средств для комплексной терапии злокачественных новообразований, разработан новый лекарственный препарат

Полистан на основе полисахаридов аира: проведено изучение специфической фармакологической активности, общетоксических свойств и возможного мутагенного действия биологически активной субстанции.

На основе химико-фармакологических и фармакогностических исследований разработана методика извлечения полисахаридов из растительного сырья. На основании полученных данных разработана лабораторная технология и лабораторный регламент биологически активной субстанции полисахаридов аира.

На основании фитохимического анализа разработан проект Фармакопейной статьи предприятия «Аира болотного корневища», который является основой нормативной документации, регламентирующей стандартизацию растительного сырья для производства препарата на основе полисахаридов аира болотного.

Результаты фитохимических и фармакологических исследований позволили обосновать в соответствии с современными требованиями аналитические подходы в решении проблемы стандартизации полисахаридсодержащего лекарственного растительного сырья и лекарственных препаратов на его основе. Разработаны валидированные методики количественного определения полисахаридов растительном сырье и субстанции. Унификация и внедрение разработанной методики в практику контрольно-аналитических лабораторий позволит расширить арсенал методов стандартизации полисахаридсодержащего растительного сырья.

На основные практически значимые результаты диссертационной работы получено 8 патентов РФ: Патент №2308285, №2311918, №2329821, №2337700, №2337699, №2379047, №2378004, №2397774.

Материалы внедрения: На основе материалов Патента №2308285 от 14.12.2005 г. «Средство, на основе полисахаридов аира болотного, повышающее противоопухолевую и противометастатическую активность цитостатических препаратов» компанией «Инноком» (г. Томск) ведется разработка нового лекарственного препарата Полистан, предназначенного для комплексной терапии злокачественных новообразований. Разработанные в рамках требований Департамента государственного регулирования обращения лекарственных средств Минздравсоцразвития России материалы (лабораторный регламент «Субстанция Полистан», проект Фармакопейной статьи предприятия

«Аира болотного корневища» и отчеты по изучению специфической фармакологической активности, острой и хронической токсичности, возможных мутагенных свойств нового лекарственного препарата) используются для составления регистрационного досье (акты внедрения от 17.05.2011 г.).

Материалы Патентов №2397774 от 17.0б.2009г. «Средство, снижающее гематотоксичность цитостатических препаратов» и №2329821 от 14.03.2007 г. «Средство, обладающее иммуномодулирующей активностью» используются компанией «БиоСистемы» (г.Томск) для разработки биологически активной добавки, обладающей иммуномодулирующим эффектом и предназначенной для профилактики побочных эффектов химиотерапии (акт внедрения от 20.05.2011 г.)

Разработанная методика количественного определения кислых полисахаридов в растительном сырье, включенная в проект ФСП «Аира болотного корневища», апробирована в контрольно-аналитической лаборатории Центра по сертификации и контролю качества лекарственных средств Томской области (акт апробации от 05.05.2010 г.).

Результаты диссертационной работы включены в монографию Е.П. Зуевой, К.А. Лопатиной, Т.Г. Разиной, А.М. Гурьева «Полисахариды в онкологии» и в учебные пособия «Методы количественного определения поли-и олигосахаридов», «Роль поляризации антигенпрезентирующих клеток в механизмах развития иммунологической толерантности опухолей», «Разработка новых противоопухолевых лекарственных средств на основе природных БАВ», «Применение аира болотного в официнальной и народной медицине», которые внедрены в образовательный процесс Самарского государственного медицинского университета, Сибирского государственного медицинского университета и Новосибирского государственного медицинского университета (акты внедрения от 31.05.2011 г., 30.05.2011 г., 26.05.2011 г. и 24.09.2004 г.).

На защиту выносится: Научно-методическое обоснование использования растительных полисахаридов в качестве средств комплексной терапии злокачественных новообразований, в том числе:

- результаты изучения влияния полисахаридов из 10 видов лекарственных растений на развитие карциномы легких Льюис и эффективность лечения циклофосфаном;

- результаты изучения химической структуры полисахаридов из корневищ аира болотного;

- результаты изучения влияния полисахаридов из корневищ аира болотного на эффективность циклофосфана и 5-фторурацила, на различных моделях опухолевого роста и на разных видах лабораторных животных;

- обоснование методических подходов к разработке методов стандартизации растительного сырья и проекта Фармакопейной статьи предприятия «Аира болотного корневища»;

- результаты изучения механизмов антибластомного действия полисахаридов из корневищ аира болотного.

Апробация работы. Материалы диссертации апробированы на V конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2004); Российской научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2004); II Международной конференции по природным и физиологически активным веществам «Natural Products and Phisiologically Active Substances» ICNPAS-2004 (Новосибирск, 2004); Российско-китайской Международной конференции по фармакологии (Китай, Харбин, 2005); конференции молодых ученых НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2005);. IV Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (Сыктывкар, 2006); 43-й Республиканской научной конференции «Создание новых лекарственных препаратов» (Томск, 2007); II Международной конференции «Natural Products: Chemistry, Technology & Medicinal Perspectives» (Алматы, 2007), конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2010); XVIII Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, Крым, 2010); I Всероссийской молодежной конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биологии» (Томск, 2010); XIV Всероссийской медико-биологической конференции с международным участием. (Санкт-Петербург, 2011); юбилейной научно-практической конференции молодых ученых

«Медицина XXI века». (Новокузнецк, 2011), XII Российском конгрессе молодых ученых с международным участием «Науки о человеке» (Томск, 2011), XIX Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, Крым, 2011).

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований кафедры фармации ФПК и ППС и Лаборатории инновационных фармацевтических технологий ЦНИЛ Сибирского государственного медицинского университета (г. Томск) и в рамках комплексной целевой программы СО АМН РФ «Здоровье человека в Сибири» (№ Гос.регистрации 01.9.2002479).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 55 научных работ, отражающих основное содержание диссертации, из них 23 в журналах, рекомендуемых ВАК, 1 монография и 8 патентов на изобретения.

Экспериментальные исследования по теме диссертации выполнялись в Лаборатории инновационных фармацевтических технологий совместно с кафедрами химии, фармации, фармакогнозии с курсами ботаники и экологии, фармацевтической технологии Сибирского государственного медицинского университета, а также в сотрудничестве с коллективами других научных организаций: НИИ фармакологии СО РАМН (г. Томск) (лаборатория онкофармакологии, лаборатория экспериментального биомоделирования, лаборатория лекарственной токсикологии); НИИ органической химии СО РАН (г. Новосибирск) (лаборатория терпеноидов). НИИ физиологии УрО РАН (г. Сыктывкар).

Исследования по теме диссертации выполнены при поддержке грантов Российского фонда фундаментальных исследований (Грант 06-04-96968-офи), Фонда содействия развитию малых форм предпринимательства в научно-технической сфере (ГК № 4213р/6607 от 26.06.2006 г.), Администрации Томской области в сфере научно-исследовательских и инновационных разработок (ГК № 101 от 20.09. 2005 г. и № 255 от 23.06. 2008 г.), Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (ГК№ 02.740.11.5211 от 10.07.2010 г.).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 314 страницах машинописного текста и состоит из введения, восьми глав, выводов, списка литературы и приложений. Работа иллюстрирована 57 таблицами и 57 рисунками. Библиографический указатель включает 449 источников литературы, из них 384 зарубежных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Для исследования были использованы образцы растительного сырья десяти видов лекарственных растений. Характеристика исследуемых образцов представлена в табл. 1.

Таблица 1

Характеристика исследуемых образцов лекарственного растительного сырья

Наименование растительного сырья Латинское название растения Стандартизовано по нормативной документации

корневища с корнями левзеи Rhaponticum carthamoides Wild. ФС 42-2707-90

корни одуванчика Taraxacum officinale Wed. ГФ XI, в.2, статья 69.

листья подорожника большого Plantago major L. ГФ XI, в.2, статья 20.

цветки липы Tilia cordata Mill ГФ XI, в.2, статья 12.

побеги багульника болотного Ledum palustre L. ГФ XI, в.2, статья 1.

корневища и корни родиолы розовой Rhodiola rosea L. ГФ XI, в.2, статья 75.

корень солодки Glycyrrhiza glabra L. ГФ X, статья 573.

корневища аира Acorus calamus L. ГФ XI, в.2, статья 72.

листья мать-и-мачехи Tussilago farfara L. ГФ XI, в.2, статья 16.

цветки ноготков Calendula officinalis L. ГФ XI, в.2, статья 5.

Растительное сырье было собрано в местах естественного произрастания и на площадках культивирования на территории Томской области и Алтайского края. Сбор материала производили в период 2000-2003 гг. После сбора растительное сырье было высушено на воздухе, под навесом, при температуре 15-25°С, в течение 3-10 суток. Образцы упаковывали и хранили в соответствии с требованиями нормативной документации (ГОСТ 17768-90 и ГФ XI).

Суммарные полисахаридные комплексы получали из высушенного растительного сырья экстракцией подкисленной водой с последующим осаждением этанолом и очисткой методом диализа, после диализа образцы высушивали методом лиофильной сушки. Общее содержание углеводов в

исследуемых образцах определяли спектрофотометрическим методом [Dubois М. et al., 1956]. Для количественного определения белковых примесей использовали методы Брэдфорда [Bradford М.М., 1976] и Лоури [LowryO. et al., 1951]. Нуклеиновые кислоты определяли спектрофотометрическим методом [Спирин А.С., 1958.]; уроновые кислоты - карбазол-серным методом [Galambos J.T., 1967]. Измерение оптической плотности растворов проводили на спектрофотометре «UNICO 2800» (США). Молекулярно-массовое распределение в образцах определяли методом эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) по времени удерживания, в соответствии с калибровочными значениями, определенными по стандартным образцам декстранов с молекулярной массой 15, 40, 60, 90, 110, 250 и 500 кДа («Sigma-Aldrich», Германия). Разделение полисахаридных комплексов на фракции и выделение индивидуальных компонентов проводили методами ионообменной хроматографии на DEAE-целлюлозе, ультрафильтрации и порционного осаждения. Идентификацию моносахаридов, входящих в состав образцов, осуществляли после полного кислотного гидролиза трифторуксусной кислотой. Моносахариды в гидролизате идентифицировали хроматомасс-спектрометрическим методом в виде соответствующих ацетатов полиолов или триметилсилильных производных. Спектры ЯМР (13С и Н) образцов записывали на приборах DRX-500 и DRX-300.

Фармакологические исследования проведены на 744 мышах-самках и 48 самцах линии С57В1/6, 24 мышах-самцах линии CBA/CaLac и 53 крысах-самцах линии Вистар. Для оценки противоопухолевого действия образцов использовали модели перевиваемых опухолей: карциному легких Льюис, меланому В-16 у мышей и карциносаркому 256 Уокера у крыс. Трансплантацию опухолевых клеток проводили общепринятыми методами [СофьинаЗ.П. и др., 1980]. Эффективность проведенных курсов лечения оценивали по противометастатическому и противоопухолевому действию образцов у мышей с меланомой В-16 - на 24 сутки, с карциномой легких Льюис - на 21-22 сутки, у крыс с карциносаркомой 256 Уокер - на 17 сутки после перевивки. Оценка функциональной активности клеток лимфатических узлов в тесте нейтрализации опухолевых клеток Винна проводилась у мышей линии С57В1/6 с карциномой

легких Льюис [Winn HJ., 1961]. Показатели периферической крови исследовали общепринятыми гематологическими методами [Гольдберг Е.Д. и др., 1992]. Продукцию N0 оценивали по содержанию нитритов в супернатантах при помощи реактива Грейса [Green L.C. et al., 1982]. Активность аргиназы определяли по модифицированной методике [Munder М. et al., 1998]. Цитокины в исследуемых супернатантах определяли твердофазным иммуноферментным методом при помощи тест-систем («R&D Systems», США) согласно прилагаемым протоколам.

Полученные экспериментальные данные обрабатывали с использованием пакета программ Statistica 8.0. Для количественных показателей вычисляли среднее значение X и стандартную ошибку среднего т. Для качественных признаков определяли частоту (%). Достоверность различий между показателями оценивали при помощи непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитни. Достоверность различий между качественными признаками проверяли при помощи точного теста Фишера. Различия считали достоверными при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ВЫБОР ОБЪЕКТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ Комплексному химико-фармакологическому исследованию были подвергнуты полисахаридные комплексы (ПСК), выделенные из 10 видов официнального растительного сырья, которые на основании ряда критериев были отобраны из 126 видов лекарственных растений, произрастающих или интродуцированных на территории Западной Сибири. Критериями отбора перспективных видов явились: количественное содержание полисахаридов (более 1,0%), достаточная сырьевая база, фармакопейный статус, наличие противоопухолевой или иммунотропной активности (по данным литературы), применение в традиционной медицине для лечения онкологических заболеваний.

ВЫДЕЛЕНИЕ ПОЛИСАХАРИДНЫХ КОМПЛЕКСОВ ИЗ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ И ИХ ХАРАКТЕРИСТИКА Полисахаридные комплексы выделяли из растительного сырья по оригинальной методике, подобранные нами параметры извлечения позволили

получить максимальный набор полисахаридов в одном образце с минимальным количеством примесей растительного происхождения (рис. 1).

измельченное растительное сырье

0.06 мопь/п HCL, 1:20, t "кип., отстаивание 12 ч., фильтрация

| водный экстракт

упаривание под вакуумом, t °< 50 Т

[концентрат

Рис. 1. Схема выделения полисахаридных комплексов из растительного сырья.

В полученных образцах было определено количество общих углеводов, уроновых кислот, общего белка и нуклеиновых кислот. Результаты

определения представлены в табл. 2.

Таблица 2

_Характеристика полисахаридных комплексов исследуемых растений_

Название образца Выход ПСК, % от массы воздушно-сухого сырья Содержание в ПСК, %

Углеводы Уроновые кислоты Белок Нуклеиновые кислоты

ПСК левзеи 2,3 ± 0,5 97,2 ± 1,2 38,9 ± 0,2 0,10 ±0,04 0,034 ±0,010

ПСК одуванчика 2,5 ± 0,3 99,8 ±0,2 93,6 ± 2,9 1,17 ±0,44 0,132 ±0,012

ПСК подорожника 3,3 ±0,1 98,0 ± 1,1 11,4 ±0,1 0,21 ± 0,05 0,022 ±0,013

ПСК липы 3,9 ± 1,2 99,9 ±0,1 12,9 ±0,1 0,08 ±0,01 0,010 ±0,005

ПСК багульника 1,3 ±0,2 95,9 ±4,1 95,3 ± 0,2 0,14 ± 0,08 0,032 ± 0,007

ПСК родиолы 2,6 ±0,5 98,9 ±1,2 10,3 ±0,1 0,13 ±0,02 0,011 ±0,001

ПСК солодки 4,3 ±1,5 98,4 ± 3,2 14,3 ±0,1 0,82 ± 0,06 0,030 ±0,008

ПСК аира 3,7 ±1,1 99,8 ± 3,2 24,4 ±0,1 0,12 ± 0,02 0,062 ±0,012

ПСК мать-и-мачехи 2,9 ± 0,2 97,9 ± 2,3 26,4 ± 0,2 0,21 ±0,06 0,021 ±0,003

ПСК календулы 1,5 ±0,2 97,8 ±1,1 11,2 ±0,1 1,68 ±0,26 0,165 ±0,024

Выход полисахаридных комплексов из воздушно-сухого сырья составил от (1,3 ±0,2) до (4,3 ±1,5)%. Высокое содержание общих углеводов

(от (95,9 ±2,9) до (99,8 ±3,2)%) и низкое содержание примесей белка (от (0,10 ± 0,04) до (1,68 ± 0,26)%) и нуклеиновых кислот (от (0,010 ± 0,005) до (0,165 ± 0,024)%) свидетельствует об эффективности используемых подходов выделения и очистки полисахаридов из растительного сырья. Наличие уроновых кислот в составе полисахаридных комплексов (до 95,32%) свидетельствует об эффективном извлечении водорастворимых фракций кислых полисахаридов. Исследование образцов методом эксклюзионной ВЭЖХ показало, что молекулярная масса полисахаридов варьирует в пределах 30750 кДа, преобладающие компоненты всех полисахаридных комплексов имеют молекулярную массу 290-380 к Да.

Полученные экспериментальные данные дополняют имеющиеся в литературе сведения о полисахаридах исследуемых растений. Так, нами впервые выделены и охарактеризованы полисахаридные комплексы левзеи сафлоровидной, багульника болотного, родиолы розовой, аира болотного. Впервые показано, что в корнях одуванчика, кроме инулина и инулиноподобных полисахаридов, в большом количестве (около 2,5%) содержатся кислые полисахариды с молекулярной массой 310 и 700 кДа. Полученные характеристики полисахаридного комплекса из листьев подорожника совпадают с данными литературы о содержании высокомолекулярных пектиновых полисахаридов, однако нами показано, что в составе полисахаридного комплекса подорожника присутствуют также и нейтральные полисахариды и установлена их молекулярная масса. Относительно полисахаридов липы, мы подтвердили имеющиеся в литературе сведения о присутствие в его составе одного преобладающего компонента и, в дополнение к этому, впервые показали, что его молекулярная масса составляет 310 кДа. Впервые показано, что ПСК мать-и-мачехи состоит из двух основных компонентов с молекулярной массой 690 и 350 кДа с общим содержанием уроновых кислот около 25%.

Таким образом, на данном этапе работы были выделены и охарактеризованы полисахаридные комплексы из десяти видов лекарственных растений. Следующим этапом работы является скрининговое исследование влияния полученных образцов на развитие и эффективность химиотерапии экспериментальных опухолей.

СКРИНИНГОВАЯ ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ПОЛИСАХАРИДОВ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ НА РАЗВИТИЕ ПЕРЕВИВАЕМОЙ ОПУХОЛИ У МЫШЕЙ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ ЦИТОСТАТИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ При оценке влияния исследуемых полисахаридов на развитие перевиваемых опухолей и эффективность химиотерапии показано, что при самостоятельном применении исследуемые образцы не оказали влияния на рост карциномы легких Льюис. Исключение составили полисахариды аира, которые достоверно, по сравнению с контролем, снижали массу первичного опухолевого узла. В отношении процесса метастазирования, полисахариды липы, багульника и солодки достоверно снижали количество метастазов по сравнению с группой животных, не получавших лечения. При сочетанном применении с циклофосфаном почти все исследуемые образцы достоверно стимулировали противоопухолевую активность последнего. Исключение составили полисахариды родиолы, солодки, календулы, которые проявили эффект на уровне тенденции. Противометастатическую активность циклофосфана достоверно стимулировали полисахариды липы, багульника, аира и мать-и-мачехи (табл. 3).

Полученные данные свидетельствуют о том, что противоопухолевое и антиметастатическое действие изучаемых полисахаридов наиболее эффективно реализуется на фоне цитостатической терапии, и позволяют условно разделить изученные полисахариды на 4 группы: (1) вещества, оказывающие ингибирующее влияние на рост основного опухолевого узла - полисахариды левзеи, одуванчика и подорожника; (2) вещества, преимущественно оказывающие воздействие на процесс метастазирования опухоли -полисахариды родиолы и солодки; (3) вещества, ингибирующие как рост первичного опухолевого узла, так и процесс метастазирования - полисахариды аира, мать-и-мачехи, липы и багульника; (4) вещества, не активные в отношении карциномы легких Льюис - полисахариды календулы. По результатам исследования установлено, что полисахариды аира оказывают наиболее выраженное потенцирующее влияние на активность циклофосфана, проявляя при этом еще и самостоятельное противоопухолевое действие, поэтому мы выбрали этот объект для дальнейшего изучения.

Таблица 3

Влияние полисахаридов высших растений на развитие карциномы легких

Льюис у мышей линии С57В1/6 и эффективность лечения циклофосфаном

Название растения, доза ПСК Масса опухоли Частота метастази-рования Количество метастазов Площадь метастазов

■■■■:■ 1 . 2 '3- ...... 4 5

ПСК одуванчика, 10 мг/кг - - - -

ПСК одуванчика, 10 мг/кг + ЦФ 1 р2<0,05 ,,,._,.... .. -- Т ■"■■■' ' :: I:

ПСК левзеи, 10 мг/кг - - - -

ПСК левзеи, 10 мг/кг + ЦФ 1 Р2<0,05

ПСК подорожника, 10 мг/кг - - - -

ПСК подорожника, 10 мг/кг + ЦФ 1 рг < 0,05 .... ^

ПСКродиолы, 10 мг/кг - - - -

ПСК роди оды, 10 мг/кг + ЦФ . , : _ 1 Р2< 0,001

ПСК солодки, 10 мг/кг - - 1 Р\ < 0,05 1

ПСК солодки, 10 мг/кг + ЦФ Т Рг < 0,05

ПСК липы, 10 мг/кг - - - -

ПСК липы, 10 мг/кг+ ЦФ 1 р2<0,01 | Р1 <0,001 :

ПСК багульника, 10 мг/кг - - - 1 р| <0,05

ПСК багульника, 10 мг/кг + ЦФ | р2 <0,05 ■ .:■ г-:-'? ■.■ 1 : :

ПСК мать-и-мачехи - - -

ПСК мать-и-мачехи, 10 мг/кг + ЦФ 1<0,05 1 Р2< 0,001

ПСК аира, 10 мг/кг 1 р\ <0,01 - - -

ПСК аира, 10 мг/кг + ЦФ | рг < 0,01 | р. <0.001 1 Р2 < 0.05 4 рг <0,05

ПСК календулы, 10 мг/кг - - - -

ПСК календулы, 10 мг/кг + ЦФ .....

Примечание. <ф> - ингибирующее влияние; «|» - стимулирующее влияние; «-» - эффекта не обнаружено, р\- достоверность различий показателей с группой нелеченых животных; рг - достоверность различий показателей с группой мышей, получавших только цитостатик.

Для углубленного изучения влияния полисахаридов аира на эффективность цитостатической терапии перевиваемых опухолей была исследована их противоопухолевая и антиметастатическая активность при изолированном введении и на фоне применения цитостатиков на трех различных моделях перевиваемых опухолей (карцинома легких Льюис, меланома В-16 и карциносаркома 256 Уокера) и разных видах лабораторных животных (мыши и крысы). В качестве химиотерапевтических агентов использовались цитостатические препараты с различным механизмом действия - циклофосфан и 5-фторурацил. Полисахариды вводились внутрибрюшинно в дозе 5, 10, 25 и 50 мг/кг и перорально в дозе 75 мг/кг массы тела животных. Показано, что наиболее эффективной является дозировка полисахаридов аира 10 мг/кг и ее повышение не приводит к увеличению эффективности

воздействия. Полученные результаты демонстрируют как самостоятельное противоопухолевое действие полисахаридов аира, так и их способность повышать противоопухолевую и антиметастатическую активность циклофосфана и 5-фторурацила в отношении карциномы легких Льюис, меланомы В-16, и карциносаркомы 256 Уокер.

ВЫДЕЛЕНИЕ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ И ИССЛЕДОВАНИЕ ИХ ХИМИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ Согласно полученным данным о компонентном составе изучаемых образцов, полисахаридный комплекс аира болотного представляет собой смесь полисахаридов с различной молекулярной массой, с общим содержанием уроновых кислот - (24,4 ± 0,1)%. Для идентификации компонентов, отвечающих за фармакологическое действие полисахаридного комплекса, необходимо было выделить их в чистом виде и установить их химическую структуру. В результате разделения полисахаридного комплекса аира методом ионообменной хроматографии на колонке с ОЕАЕ-целлюлозой было получено около 40

Рис. 2. Хроматограмма полисахаридного комплекса аира болотного. (ОЕАЕ-целлюлоза (СГ-форма), подвижная фаза - 0.01, 0.1,0.2,0.3,0.4 и 0.5 М растворы натрия хлорида.

В полученных фракциях было определено содержание белка и уроновых кислот спектрофотометрическим методом, методом эксклюзионной ВЭЖХ

установлено, что фракции представляют собой индивидуальные вещества с различной молекулярной массой (табл. 4).

Таблица 4

Содержание уроновых кислот и белка во фракциях полисахаридного комплекса

Фракция ПСК аира Выход, % от массы ПСК Характеристики

Содержание уроновых кислот, % Содержание белка, % Молекулярная масса, кДа

PSF-101 42,0 ± 4,6 - - 40

PSF-102 7,3 ±1,2 3,5 ± 0,7 - 280

PSF-103 27,2 ± 3,0 83,9 ±2,1 - 370

PSF-104 11,2 ± 1,2 7,3 ± 0,7 - 440

PSF-105 6,0 ± 1,3 31,7 ± 1,2 1,7 ±0,1 740

Для хроматомасс-спектрометрического исследования моносахаров, полученных при гидролизе исследуемых полисахаридов, осуществляли их химическую модификацию, переводя в «летучие» триметилсилилированные производные. В качестве реагента использовали раствор 14-триметилсилилимидазола в пиридине, что позволило значительно сократить время и увеличить эффективность дериватизации по сравнению с общепринятыми методиками пробоподготовки (использование триметилсилилхлорида и ацетилирующих агентов). В результате хроматомасс-спектрометрического анализа выделенных компонентов полисахаридного комплекса аира, был установлен их мономерный состав (табл. 5).

Таблица 5

Мономерный состав фракций полисахаридного комплекса аира болотного

Моносахарид Содержание моносахаридов, %

PSF-101 PSF-102 PSF-103 PSF-104 PSF-105

Б-арабиноза - - 0,6 0,4 -

Б-рам ноза - 0,2 6,5 1,7 11,1

Б-ксилоза - 1,3 7,4 5.2 4,7

П-машюза - 2,1 0,4 2,5 1,7

Б-галактоза - 31,3 12,5 38,8 25,9

О-глюкоза 99,9 63,8 5,1 41,0 30,9

В-галактуроновая кислота - - 67,5 3,2 25,7

неидентиф. компоненты - - - 7,2 -

Как следует из табл. 5, вещество РБР-КП на 99,9% состоит из остатков глюкозы. Основные сахара, формирующие структуру вещества РБК-102 -

глюкоза и галактоза. В связи с этим мы отнесли данный образец к числу нейтральных полисахаридов, предположительно, по структуре он является галактоглюканом. В составе вещества PSF-103 было найдено 67,5% галакгуроно-вой кислоты (что позволило нам отнести этот образец к кислым полисахаридам), 12,5% галактозы и небольшие количества ксилозы, рамнозы и глюкозы. Вещество PSF-104, также как и фракция PSF-102, представлена в основном глюкозой и галактозой, кроме того, в его составе найдена ксилоза (около 5%) и небольшие количества рамнозы, арабинозы и галактуроновой кислоты. Вещество PSF-105 состоит из трех основных Сахаров - глюкозы, галактозы и галактуроновой кислоты, также в его составе присутствует рамноза, ксилоза и манноза.

Согласно современным представлениям о химической структуре пектиновых веществ [Оводов Ю.С., 2009], главная цепь их макромолекулы состоит из а-1,4-связанных остатков D-галактопиранозилуроновой кислоты, между которыми могут располагаться остатки a-L-рамнопиранозы, включенными в основную цепь галактуронана а-1,2-связями и образующими линейную область рамногалактуронана; разветвленная часть пектинов, как правило, представлена нейтральными сахарами (глюкоза, галактоза, арабиноза). Такая структура называется рамногалактуронан 1-го типа. В связи с этим мы предполагаем, что фракции PSF-ЮЗ и PSF-105 по химической структуре представляют собой рамногалактуронаны 1-го типа с различной степенью разветвленное™: PSF-103 представляет собой линейную молекулу с небольшим количеством разветвлений так как содержит меньшее количество нейтральных остатков (соотношение нейтральные сахара: галактуроновая кислота, примерно, 1:4); PSF-105, по-видимому, представляет собой сильноразветвленную молекулу, в которой разветвленная часть, состоящая из нейтральных Сахаров, преобладает над линейной областью рамногалактуронана (соотношение, примерно, 3 :1).

Для установления характера гликозидных связей в макромолекулах полисахаридов использовался ЯМР-спектрометрический анализ. Положение гликозидных связей вычисляли по сдвигам сигналов соответствующих атомов углерода в 13С-ЯМР спектрах исследуемых соединений (табл. 6). Спектры 13С-ЯМР и 'Н-ЯМР вещества PSF-105 имели большое количество сигналов, что не позволяло достоверно интерпретировать структуру этого вещества. По нашему

мнению, это связано с высокой разветвленностью и нерегулярностью полимерной молекулы данного полисахарида. В связи с этим выводы о химической структуре PSF-105 мы делали на основании данных, полученных хроматомасс-спектрометрическим методом.

Таблица 6

Положение сигналов основных углеводных остатков в спектрах 13С- и 'Н-ЯМР

компонентов полисахаридного комплекса аира болотного

№ п/п Углеводный остаток Спектр Углеродный атом

1 I 2 | 3 | 4 | 5 | 6

PSF-101

1 -+4)a-D-Glc(l—> С 99.5 71.3 73.1 76.5 70.1 60.3

'н 4.68 3.54 5.28 3.62 3.85 3.72

PSF-102

1 —4)a-D-Gal(l—► с 100.0 68.5 69.2 77.9 72.8 60.5

'н 5.30 3.86 3.86 - - 3.68

2 —»4)a-D-Glc(l—» uc 98.50 71.6 73.4 76.5 70.3 60.7

'н 4.68 3.56 - 3.64 - 3.74

3 —2)a-L-Rhafl—► IJC 101.3 70.7 79.2 72.9 69.8 17.4

'н - - - - 3.4-3.2 1.28

PSF-103

1 —>4)a-D-GalAc(l-* "с 99.7 68.9 69.6 78.6 72.0 176.1

'н 5.00 3.88 4.01 4.30 4.68 -

2 —>2)a-L-Rha(l—♦ 'н - - - - 3.67 1.20

PSF-104

1 —>4)a-D-Gal(l—+ ис 99.5 68.1 68.7 78.1 72.8 60.5

■н - 3.72 - - - 3.72

2 ->4)a-D-Glc(l-» ис 98.3 71.5 73.0 76.9 70.4 59.9

'Н 4.68 - - - - 3.72

3 ~'3)ß-D-Xyl(l—» 97.3 74.2 85.7 - 65.8 -

•н - - - - 3.46 -

Таким образом, методами ионообменной колоночной хроматографии и эксклюзионной ВЭЖХ установлено, что в составе полисахаридного комплекса аира содержится 5 основных компонентов, методами ЯМР и хроматомасс-спектромегрии идентифицирована их химическая структура. Нейтральные полисахариды: а-(1,4)-0-глюкан с молекулярной массой 40кДа (Р8Р-101); а-0-галакто-( 1,4)-а-0-глюкан с разветвлениями, состоящими из остатков а-Ь-рамнопиранозы и молекулярной массой 280 кДа (Р8Р-102); 0-0-ксилопиранозил-а( 1,3)-0-галакто-а(1,4)-Б-глюкан с молекулярной массой 440 кДа (Р8Е-104). Кислые полисахариды: рамно-а(1,4)-0-галактопиранозилуронан

с разветвлениями из остатков нейтральных Сахаров (ксилозы, галактозы и глюкозы) и молекулярной массой 370 кДа (PSF-ЮЗ) и сильноразветвленный рамногалактуронан I с молекулярной массой 740 кДа (PSF-105).

ВЛИЯНИЕ КОМПОНЕНТОВ ПОЛИСАХАРИДНОГО КОМПЛЕКСА АИРА НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ ЦИТОСТАТИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ ПЕРЕВИВАЕМЫХ ОПУХОЛЕЙ При исследовании влияния выделенных компонентов полисахаридного комплекса аира на эффективность цитостатической терапии карциномы легких Льюис у мышей, наибольшее влияние на противоопухолевую и антиметастатическую активность циклофосфана проявило вещество PSF-103. Вещество PSF-105 достоверно усиливало только противометастатическую активность циклофосфана у мышей с LLC. Вещества PSF-102 и PSF-104 обладают менее выраженным влиянием на эффективность химиотерапии, однако их использование приводит к снижению частоты метастазирования (PSF-102) и площади метастатического поражения легких мышей с LLC (PSF-104). Фракция PSF-101 в эксперименте не оказывала влияния на эффективность терапии циклофосфаном карциномы легких Льюис у мышей (табл. 7).

Таблица 7

Влияние компонентов полисахаридного комплекса аира болотного на эффективность лечения циклофосфаном мышей-самок линии С57В1/6 с

карциномой легких Льюис

Группа наблюдения, режим введения препаратов, (количество животных) Масса опухоли (Х±т), г Частота метастазирования, % Количество метастазов (Х±т) Площадь метастазов (Х±т), мм2

I. Контроль (10) 6,41 ±0,45 100 27,80 ±8,30 73,20 ±33,53

2. Циклофосфан (ЦФ), 125 мг/кг х 1 (9) 4,87 ± 0,50 1-2р<0,05 89 5,78 ±1,66 1-2р < 0,01 2,97 ±0,91 \-7р < 0,01

3. РЭР-Ш 5 мг/кг х 9 + ЦФ 125 мг/кг х1 (10) 4,55 ±0,17 80 7,90±2,98 3,78 ± 1,97

4. Р8Р-102 5 мг/кг х 9 + ЦФ 125 мг/кг х 1(10) 4,31 ±0,44 40 2-4р < 0,01 3,60±1,95 2,53 ±1,63

5. РБИ-ЮЗ 5 мг/кг х 9 + ЦФ 125 мг/кг х 1 (10) 4,13 ±0,33 2-Sp < 0,05 40 2-5р < 0,01 1,00 ±0,54 2-5р < 0,01 0,19 ±0,10 2-5р < 0,01

6. Р8Р-104 5 мг/кг х 9 + ЦФ 125 мг/кг х 1 (10) 4,54 ± 0,33 60 3,00 ±1,26 1,07 ±0,73 2-6р < 0,05

7. Р8Р-105 5 мг/кг х 9 + ЦФ 125 мг/кг х 1 (10) 4,50 ±0,17 30 2-7р<0,01 0,70 ±0,37 2-7р<0,01 0,06 ±0,04 2-1 р < 0,01

Примечание. Здесь и далее перед уровнем значимости р указанны номера сравниваемых групп

Из результатов данного эксперимента следует, что основными действующими веществами полисахаридного комплекса аира являются соединения PSF-103 и PSF-105, представляющие собой галактуронаны. В связи с этим мы полагаем, что стандартизацию растительного сырья и биологически активной субстанции целесообразно проводить по содержанию кислых полисахаридов в пересчете на галактуроновую кислоту.

РАЗРАБОТКА МЕТОДИК СТАНДАРТИЗАЦИИ КОРНЕВИЩ АИРА БОЛОТНОГО И БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ СУБСТАНЦИИ

Разработка методики количественного определения галактуронана. Из числа рассмотренных нами методов количественного определения кислых полисахаридов, достаточной чувствительностью и селективностью обладает спектрофотометрический метод, который при определенных условиях позволяет с высокой точностью определить содержание уроновых кислот в присутствии нейтральных Сахаров. Карбазольный метод определения кислых полисахаридов основан на реакции продуктов дегидратации уроновых кислот (5-формил-2-фуранкарбоновая кислота) с карбазолом. По данным литературы, присутствие в образце нейтральных Сахаров оказывает минимальное влияние на результаты определения [Bitter, Н.М. Muir, 1962]. Однако в проведенном нами эксперименте было установлено иное. Полосы поглощения в УФ-спектрах растворов нейтральных Сахаров и уроновых кислот после реакции с карбазолом и концентрированной серной кислотой налагались друг на друга (рис. 3). Это свидетельствует о том, что присутствие нейтральных Сахаров в образце будет оказывать существенное влияние на результаты определения.

Известно, что в присутствии сульфаминовой кислоты влияние нейтральных Сахаров может снижаться [Galambos J.T., 1967]. В проведенном нами эксперименте использование сульфаминовой кислоты (0,4 моль/л) значительно снижало интенсивность поглощения продуктов реакции нейтральных Сахаров, и практически не влияло на поглощение продуктов реакции галактуроновой кислоты (рис.4).

Однако оптическая плотность растворов нейтральных Сахаров при длине волны 525 нм все еще была достаточной, чтобы вызвать серьезные погрешности при количественном анализе кислых полисахаридов.

егжН(пт}

Рис. 3. УФ-спектры продуктов реакции

галактуроновой кислоты (а), глюкозы (Ь), арабинозы (с)

с конц. серной кислотой и карбазолом.

Рис. 4. УФ-спектры продуктов реакции

галактуроновой кислоты (а), глюкозы (Ь), арабинозы (с)

с конц. серной кислотой и карбазолом в присутствии сульфаминовой кислоты (0,4 моль/л).

Поэтому на следующем этапе мы провели оценку влияния различных концентраций сульфаминовой кислоты в анализируемой пробе на УФ-спектры нейтральных Сахаров после реакции с конц. серной кислотой и карбазолом (рис. 5). Из рис. 5 следует, что при концентрации сульфаминовой кислоты 0,16 моль/л интенсивность поглощения продуктов, образованных нейтральными сахарами подавляется, а образованных галактуроновой кислотой остается на прежнем уровне.

В следующем эксперименте было показано, что 1-, 5- и 10-кратный избыток глюкозы не оказывал влияния на результаты количественного определения галактуроновой кислоты карбазольным методом, в присутствии 0,16 моль/л сульфаминовой кислоты. Поэтому данная методика была выбрана нами для количественного определения галактуронана аира.

Основным компонентом галактуронана аира является 0-(+)-галактуроновая кислота, поэтому мы использовали ее в качестве стандарта для построения

градуировочного графика. Содержание уроновых кислот в составе гаяакгуронана составляет 84%, поэтому для пересчета концентрации галактуроновой кислоты на концентрацию галактуронана мы предлагаем использовать поправочный коэффициент, который в данном случае будет равен 1,19.

Wavclength(nm)

Рис. 5. УФ-спектры продуктов реакции галактуроновой кислоты (а); глюкозы (Ь) и арабинозы (с) с конц. серной кислотой и карбазолом в присутствии разных концентраций сульфаминовой кислоты. (I) 0,08 моль/л (5 мкл); (II) - 0,16 моль/л (10 мкл); (III) - 0,24 моль/л (15 мкл); (IV) - 0,32 моль/л (20 мкл); (V) - 0,4 моль/л (25 мкл); (VI) - 0,48 моль/л (30 мкл).

Отработка параметров извлечения галактуронана из растительного сырья. Оптимальные параметры извлечения биологически-активных веществ из растительного сырья могут быть установлены индивидуально, с учетом морфолого-анатомических особенностей сырья и физико-химических свойств извлекаемого компонента. Принимая во внимание физико-химические свойства галактуронана

аира, мы предложили оптимальную, по нашему мнению, схему его пробо-подготовки для количественного анализа спектрофотометрическим методом:

- так как галактуронан является кислым полисахаридом и находится в цитоплазме растительных клеток в связанном состоянии (в виде нерастворимых солей с ионами 2-х и 3-х валентных металлов), мы использовали для его экстракции слабые водные растворы хлороводородной кислоты (рН=4);

- галактуронан является высокомолекулярным веществом (370 кДа) и характеризуется медленной растворимостью в воде. Поэтому при его экстракции, особенно из высушенного сырья, необходимо использовать стадию набухания, которая обеспечит количественный переход галактуронана в раствор;

- для очистки полученного извлечения от большинства примесей, мешающих определению, мы использовали ультрафильтрацию через мембрану с размером пор 300 кДа (концентратор «У^аэрт 20-300кБа» («Баполш», Франция)). Анализируемый полисахарид имеет молекулярную массу 370 кДа и не проходит через мембрану, тогда как большинство веществ, присутствующих в извлечении (в т.ч. неорганические соли, полифенольные соединения, крахмал и т.д.), проходят через поры и удаляются. Кроме того, таким образом достигается концентрирование галактуронана в растворе, что в дальнейшем упрощает проведение количественного определения. Параметры экстракции, влияющие на извлечение галактуронана из корневищ аира болотного, представлены в табл. 8.

Установлено, что максимальное извлечение галактуронана из высушенных корневищ аира болотного достигается при степени измельчения растительного сырья - 0,5-1,0 мм; соотношении сырья и экстрагента - 1 : 100; концентрации хлористоводородной кислоты в экстрагенте - 0,5%; времени нагревания сырья с экстрагентом - 120 мин; и продолжительности настаивания извлечения - 24 ч.

Разработанная методика количественного определения галактуронана в корневищах аира болотного валидирована по показателям: повторяемость (Г^БЭ = 1,98%), внутрилабораторная прецизионность (1180=1,86%), межлабораторная прецизионность (ИББ = 4,06%) правильность (100,26%) и линейность (у=0,653х - 0,105,112=0,999). На основании полученных результатов предложенную методику количественного определения галактуронана в корневищах аира болотного можно считать валидной, что позволяет включить ее в проект Фармакопейной статьи предприятия «Аира болотного корневища».

Таблица 8

Влияние параметров экстракции на выход галактуронана из корневищ аира

болотного

Параметры экстракции Содержание галактуронана в корневищах аира, %

серия 1 | серия 2 | серия 3 | серия 4 | серия 5

Размер частиц сырья, мм

0,1-0,5 0,47 г 0,65 0,18 0,21 0,10

0,5-1,0 0,55 0,71 0,23 0,28 0,13

1,0-3,0 0,52 0,70 0,20 0,21 0,12

3,0-5,0 0,47 0,68 0,18 0,24 0,11

5,0-7,0 0,46 0,63 0,16 0,22 0,11

Соотношение сырья и экстрагента

1 -.50 0,68 0,65 0,22 0,27 0,13

1 :100 0,74 0,73 0,30 0,36 0,17

1 :150 0,73 0,73 0,31 0,34 0,18

1 :200 0,74 0,72 0.30 0,35 0,16

1 :300 0,72 0,72 0,29 0,36 0,16

Время настаивания извлечения, ч

3 0,68 0,74 0,22 0,28 0,14

6 0,67 0,73 0,25 0,29 0,14

12 0,64 0,68 0,22 0,25 0,13

24 0,74 0,78 0,27 0,34 0,18

36 0,72 0,79 0,26 0,29 0,16

Время нагревания, мин

30 0,57 0,69 0,16 0,27 0,11

60 0,49 0,68 0,22 0,32 0,15

120 0,64 0,75 0,25 0,35 0,17

180 0,62 0,75 0,21 0,30 0,15

Концентрация хлористоводородной кислоты, моль/л

0,05 0,62 0,55 0.21 0,23 0,09

0,10 0,81 0,78 0,32 0,34 0,18

0,25 0,66 0,75 0,30 0,38 0,16

0,50 0,64 0,73 0,27 0,36 0,13

С использованием разработанной методики было поведено количественное

определение галактуронана в 5 партиях корневищ аира болотного. Показано, что содержание галактуронана в разных промышленных партиях корневищ аира может варьировать от (0,148 ±0,018)% до (0,796 ± 0,024)%. На основании этого считаем возможным установить в проекте Фармакопейной статьи предприятия норму содержания галактуронана - не менее 0,1 %.

ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ АНТИБЛАСТОМНОГО ДЕЙСТВИЯ

ПОЛИСАХАРИДОВ АИРА Известно, что механизмы опухолеиндуцированной иммуносупрессии реализуются во многом благодаря отрицательной регуляторной активности

антиген-презентирующих клеток (макрофагов и дендритных клеток), находящихся под влиянием опухоли, и формированию, в результате этого, ТЬ2-типа иммунологического ответа. Влияние полисахаридов аира на функции клеток иммунной системы до настоящего времени не изучалось. Поэтому исследование механизмов их антибластомного действия мы проводили в три этапа: 1) изучение влияния на функциональную активность и баланс популяций лимфоцитов в условиях опухолевого роста и химиотерапии; 2) изучение влияния на функциональное состояние антиген-презентирующих клеток; 3) оценка влияния на развитие и протекание ТЫ- и ТЬ2-типов иммунного ответа.

Влияние полисахаридов аира на функциональную активность клеток лимфоузлов мышей с карциномой легких Льюис при их изолированном введении и на Фоне цитостатической терапии. Оценка влияния полисахаридов аира на функциональную активность клеток лимфоузлов проводилась с использованием теста нейтрализации опухолевых клеток Винна. Результаты эксперимента представлены в табл. 9.

Таблица 9

Влияние полисахаридов аира на функциональную активность клеток лимфоузлов мышей-самок линии С57В1/6 при их изолированном введении и на фоне терапии циклофосфаном

Группа наблюдения, режим введения препаратов, (количество животных) Масса опухоли (Х±т), г Частота метастази- рования, % Количество метастазов (Х±т) Площадь метастазов (Х±т), мм2

1. Контроль (9) 5,55 ± 0,22 100 32,8 ± 5,2 121,3 ±41,0

2. Опухоль + лимфоузлы интактных мышей (10) 5,70 ±0,15 100 28,1 ±3,1 105,4 ±23,5

3. Опухоль + лимфоузлы нелеченых мышей с LLC (9) 5,70 ±0,36 100 46,8 ± 8,2 2-3р < 0,05 177,5 ±46,0

4. Опухоль + лимфоузлы леченных ЦФ мышей (9) 6,47 ± 0,30 3-4р < 0,05 100 35,3 ± 2,6 171,2 ±17,6

5. Опухоль + лимфоузлы леченных ПСК аира мышей (10) 4,50 ±0,51 3-5р < 0,05 100 28,7 ± 4,7 3-5р < 0,05 113,9 ±26,0

6. Опухоль + лимфоузлы леченных ЦФ и ПСК аира мышей (10) 4,03 ± 0,40 3 -6р < 0,01 4-6р < 0,01 100 27,3 ±2,6 3-6р < 0,05 52,6 ±12,6 3-бр < 0,05 4-6р<0,01

Проведенный эксперимент позволил сделать следующие заключения: 1) активность клеток лимфоузлов животных с карциномой легких Льюис снижена по сравнению со здоровыми животными; 2) полисахариды аира

способны повышать активность клеток лимфоузлов на фоне иммуносупрессии, вызванной опухолевым ростом и применением циклофосфана.

Влияние полисахаридов аира на содержание популяций лимфоцитов в периферической крови мышей с карциномой легких Льюис. В эксперименте показано, что у интактных мышей в периферической крови лимфоциты по субклассам распределялись равномерно. Развитие злокачественного новообразования в организме животных приводило к значительному увеличению количества лимфоцитов в периферической крови (в 1,4 раза), за счет накопления незрелых форм лимфоцитов (в 2,6 раза), количество В-лимфоцитов при этом было несколько снижено по сравнению с контролем (рис. 6).

7 т 6,6*

здоровые животные опухоль опухоль + ПСК аира

Рис. 6. Распределение лимфоцитов периферической крови мышей линии С57В1/6 на субпопуляции (Т, В, О) при развитии карциномы легких Льюис и лечении полисахаридами аира.

Примечание. «*» - значимое (р < 0,05) различие с интактной группой; «**» - значимое (р < 0,05) различие с группой нелеченых мышей с карциномой легких Льюис.

Эти данные свидетельствуют о стимуляции лейкопоэза у животных с опухолью, и одновременной ингибиции процессов созревания наивных лимфоцитов в зрелые формы. При введении полисахаридов аира мышам с опухолью, картина популяционного состава лимфоцитов изменялась: резко увеличивалось количество Т-клеток и В-клеток за счет значительного снижения количества О-лимфоцитов. Эти данные ясно свидетельствуют о том, что полисахариды аира стимулируют трансформацию незрелых лимфоцитов в Т- и В-клетки. Наряду с этим, усиление опухолеспецифической цитотоксичности лимфоцитов, показанное в предыдущем эксперименте, свидетельствует о том,

что антибластомная активность полисахаридов аира реализуется через активацию специфического звена иммунитета.

В результате проведенного эксперимента нами были сделаны следующие заключения: 1) у мышей с карциномой легких Льюис активирован лейкопоэз, однако подавлены процессы созревания Т- и В-лимфоцитов; 2) полисахариды аира стимулируют созревание опухоле-специфических Т- и В-лимфоцитов в условиях опухолевого роста и применения цитостатиков.

Вместе с тем известно, что лимфоциты не имеют специфических рецепторов к полисахаридным структурам. Поэтому наиболее вероятной может быть их опосредованная активация лимфоцитов через антиген-презентирующие клетки.

Влияние полисахаридов аира на функциональное состояние антиген-презентирующих клеток. В эксперименте полисахариды аира стимулировали активность индуцибельной Ж)-синтазы перитонеальными макрофагами мышей, что свидетельствует об их классической активации (М1) (табл.10).

Таблица 10

Влияние полисахаридов аира и мурамилдипептида на продукцию оксида азота

перитонеальными макрофагами мышей (Х±т)

Вещество Время культивирования, ч Концентрация нитритов (мкМ)

контроль 10 мкг/мл ПСК аира 20 мкг/мл ПСК аира

ПСК аира, 10 и 20 мг/кг 24 24,0±1,1 30,1±0,8* 30,0±1,9*

48 46,5±1,7 54.3±!,8* 50,8±0,8*

Мурамилдипептид, 5 и 10 мг/кг 24 2,4±0,1 5 мкг^ Я /й П, 10 мкг/мл

5,1±1,0* 4,4±0,2*

48 2,7±0,2 5,7±0,б* 4,7±0,5*

Примечание. * - здесь и далее различия показателя с контролем достоверны, р<0,05.

Экспрессия аргиназы, которая является маркером альтернативной активации, на первом этапе увеличивалась, но затем происходило ее снижение (табл. 11).

Таблица 11

Влияние полисахаридов аира и мурамилдипептида на экспрессию аргиназы _перитонеальными макрофагами мышей (X +т)_

Вещество Время культивирования, ч Единицы активности аргиназы

контроль 10 мкг/мл ПСК аира 20 мкг/мл ПСК аира

ПСК аира, !0 и 20 мг/кг 24 5,0 ±0,9 9,8 ±1,6* 8,9 ± 1,4*

48 11,5 ±0,9 5.7 ±2,1» 4,7 ± 1,5*

Мурамилдипептид, 5 и 10 мг/кг 24 8,2 ± 1,0 5 мкг/мл - 10 мкг/мл

7.2 ± 1,0 8,0 ± 1,9

48 13,9 ± 1,7 10,6 ±1,0 21,4 ±2,5*

Влияние полисахаридов аира на продукцию ИЛ-12 и ИЛ-10 перитонеаль-ными макрофагами мышей. В эксперименте полисахариды аира значительно стимулировали (в 5,3 раза) ЛПС-индуцированную продукцию ИЛ-12 и не влияли на продукцию ИЛ-10 перитонеальными макрофагами мышей (табл.12).

Таблица 12

Влияние полисахаридов аира на ЛПС-индуцированную продукцию ИЛ-12 и

ИЛ-10 перитонеальными макрофагами интактных мышей (Х+т)

Исследуемое вещество Концентрация ИЛ-12 (пг/мл) Концентрация ИЛ-10 (мкг/мл)

Контроль (ЛПС - 1 мкг/мл) 4,4 ±0,51 2,28 ± 0,06

ПСК аира 20 мкг/мл + ЛПС, 1 мкг/мл 23,3 ± 2,7* 2,57 ± 0,03

Однако реакция макрофагов на регуляторные воздействия у животных и человека может существенно отличаться, поэтому на следующем этапе мы провели оценку влияния полисахаридов аира на продукцию ключевых про- и противовоспалительных цитокинов (ТОТ-а (фактор некроза опухоли) и ИЛ-10) мононуклеарами человека. Полисахариды аира увеличивали продукцию ТИР-а в 1,8 раза и подавляли ЛПС-стимулированную продукцию ИЛ-10 практически до уровня спонтанного контроля (табл. 13).

Таблица 13

Влияние полисахаридов аира на продукцию ТЫР-а и ИЛ-10 мононуклеарами

периферической крови здоровых доноров (Х±т)

Исследуемое вещество Концентрация Т№-а (пг/мл) Концентрация ИЛ-10 (пг/мл)

Контроль 1 (спонтанная продукция) 33,8 ± 0,8* 45,6 ±2,1

Контроль 2 (ЛПС 1 мкг/мл) 47,3 ±4,1* 69,0 ±2,9*

ПСК аира 20 мкг/мл + ЛПС 1 мкг/мл 84,9 ± 7,8*" 45,1 ± 5,5*

Примечание. * - различия с контролем 1 достоверны, р < 0,05, п - 6;

* - различия с контролем 2 достоверны, р < 0,05, п = 6.

Как видно из результатов проведенных экспериментов, полисахариды аира стимулируют продукцию N0, ИЛ-12 и ТОТ-а и подавляют экспрессию аргиназы и ИЛ-10 макрофагами, что свидетельствует об их классической активации (М1) и должно, по-видимому, способствовать формированию ТЬ1-типа иммунного ответа. Для подтверждения этого предположения, мы провели эксперимент по оценке влияния полисахаридов аира на развитие и протекание ТЫ- и ТЪ2- типов иммунного ответа у мышей.

Влияние полисахаридов аира на протекание ТЫ-зависимого иммунного ответа. Влияние полисахаридов и мурамилдипептида на клеточное звено ТЫ-типа иммунного ответа оценивали по интенсивности реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), индуцированной эритроцитами барана [УокогеЫ Н., 2000]. В качестве позитивного контроля был использован мурамилдипептид. В эксперименте курсовое введение полисахаридов аира усиливало реакцию ГЗТ в 2 раза по сравнению с контролем (табл. 14).

Таблица 14

Влияние полисахаридов аира и мурамилдипептида на интенсивность реакции ГЗТ, индуцированной эритроцитами барана у мышей (Х±т)

Исследуемое вещество, дозировка (количество животных в группе) Группа Величина реакции ГЗТ (мг)

ПСК аира, 10 мг/кг (12) контроль опыт 9,85 + 1,73 19,36 ±2,86*

Мурамилдипептид, 2 мкг/кг (10) контроль опыт 16,7 ±5,3 36,4 ± 4,0*

Примечание. * - здесь и далее различия показателя с контролем достоверны,/? < 0,05.

Влияние полисахаридов аира на гуморальное звено ТЫ-типа иммунного ответа оценивали по количеству антителообразующих клеток (АОК) и по их функциональной активности (количеству продуцируемых гемагглютининов). В эксперименте полисахариды аира увеличивали число АОК и не влияли на уровень продуцируемых гемагглютининов (табл. 15).

Таблица 15

Влияние полисахаридов аира и мурамилдипептида на количество антителообразующих клеток (АОК) и продукцию ими гемагглютининов у мышей, иммунизированных эритроцитами барана (Х±т)

Исследуемое вещество, дозировка (количество животных в группе) Группа Число АОК (Ю'/селезенку) Титр гемагглютининов (log2)

ПСК аира, 10 мг/кг (12) контроль опыт 22,3 ± 8,5 60,7 + 5,0* 10,3 + 1,3 9,0 ±0,7

Мурамилдипептид, 2 мкг/кг (10) контроль опыт 36,7 + 6,0 66,9 + 9,3* 5,5 ±0,5 6,0 ± 0,8

При этом возник вопрос: не связан ли такой эффект с прямым митогенным действием полисахаридов на В-лимфоциты? Для ответа на этот вопрос и для выяснения наличия у полисахаридов аира костимуляторных свойств, было оценено их влияние на пролиферацию лимфоцитов селезенки интактных мышей

(прямое митогенное действие) и на пролиферацию В-лимфоцитов, индуцированную липополисахаридом (костимуляторное действие). В качестве положительного контроля использовали мурамилдипептид. В эксперименте показано, что мурамилдипептид стимулировал пролиферацию лимфоцитов, культивированных как в присутствии В-клеточного митогена (ЛПС), так и без него. Полисахариды аира не оказывали самостоятельного митогенного действия и не стимулировали митогениндуцированную пролиферацию В-лимфоцитов (табл. 16).

В результате проведенного эксперимента было сделано заключение, что полисахариды аира стимулируют развитие ТЫ-типа иммунного ответа, вызывая увеличение активности клеточного и гуморального звена, но не влияют на продукцию гемагглютининов и не оказывают митогенное действие на лимфоциты.

Таблица 16

Влияние полисахаридов аира и мурамилдипептида на пролиферацию

лимфоцитов селезенки мышей (Х±т)

Исследуемое вещество Оптическая плотность супернатанта, нм

культивирование без митогена культивирование в присутствии митогена (1 мкг/мл ЛПС)

Контроль 473 ± 46 648 ± 42

ПСК аира, 20 мкг/мл 498 ± 43 597 ± 48

Мурамилдипептид, 5 мкг/мл 817 ±90* 823 ± 45*

Влияние полисахаридов аира на протекание ТИ2-зависимого иммунного ответа. Влияние полисахаридов аира на ТЬ2-зависимый иммунный ответ оценивали по тяжести анафилактического шока, вызванного введением овальбумина [Яейт С., 2001] и по количеству продуцируемых иммуноглобулинов классов Е и 01, характерных для данного типа поляризации [СеЫЬаг К. е1 а1., 1999]. В качестве положительного контроля использовали мурамилдипептид. В эксперименте полисахариды аира на 25%, а мурамилдипептид на 10% снижали летальность животных в результате анафилактического шока. Полисахариды аира уменьшали концентрацию 1§Е в 1,7 раза при однократной иммунизации и в 3,6 раза при двукратной иммунизации. У дважды иммунизированных животных курсовое введение полисахаридов аира и препарата сравнения вызывало

понижение концентрации 1§01: мурамилдипептид уменьшал данный показатель в 1,8 раза, полисахариды аира в 2,1 раза (табл. 17).

В результате проведенного эксперимента было сделано заключение, что полисахариды аира обладают способностью ингибировать продукцию В-лимфоцитами иммуноглобулинов классов Е и Й и развитие ТЪ2-типа иммунного ответа.

Таблица 17

Влияние полисахаридов аира и мурамилдипептида на содержание 1§Е и в сыворотке крови иммунизированных овальбумином мышей (X±т)

Исследуемое вещество, дозировка(количество животных в группе) Количество иммунизаций Группа Содержание № (мкг/мл) Содержание (мг/мл)

ПС аира, 10 мг/кг (10) 1 контроль опыт 4,90 ±0,64 2,92 ± 0,45* -

2 контроль опыт 7,36 ± 0,81 2,05 + 0,49* 4,22 ± 0,28 2,00 ± 0,50*

Мурамилдипептид, 2 мкг/кг(10) 1 контроль опыт 4,90 ± 0,64 4,36 + 1,11 -

2 контроль опыт 7,36 ±0,81 2,17 ±0,47* 4,22 ± 0,28 2,38 ± 0,32*

Таким образом, на основании результатов проведенных экспериментов установлено, что одним из механизмов реализации антибластомного эффекта полисахаридов аира является активация антиген-презентирующих клеток по «классическому» типу и развитие ТЫ-типа иммунологического ответа.

ОБОСНОВАНИЕ РАЦИОНАЛЬНЫХ МЕТОДОЛОГИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ К ПОИСКУ, ОЦЕНКЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ И РАЗРАБОТКЕ НОВЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ КОМПЛЕКСНОЙ ТЕРАПИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ НА ОСНОВЕ ПОЛИСАХАРИДОВ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ Результатом обобщения и структурирования всех выполненных в рамках данной работы исследований стала предложенная нами последовательная методологическая схема поиска, оценки эффективности и разработки новых лекарственных средств комплексной терапии онкологических заболеваний на основе полисахаридов высших растений, которая базируется на трех основных этапах:

1 этап - Выявление перспективных источников полисахаридов - включает в себя 4 последовательных стадии: 1) Отбор перспективных видов растений: в данном случае, по нашему мнению, рационально использование предложенных нами критериев отбора; 2) Выделение полисахаридных комплексов: разработанная и используемая нами оригинальная методика, позволяет получать максимальный спектр водорастворимых полисахаридов в одном образце, что позволило существенно упростить проведение скрининговых фармакологических исследований, увеличить достоверность и воспроизводимость получаемых результатов; 3) Скрининг противоопухолевой активности: на основании результатов проведенных исследований с использованием нескольких экспериментальных моделей опухолевого роста, мы пришли к выводу о том, что наиболее информативной для оценки противоопухолевой активности полисахаридов является карцинома легких Льюис; 4) Выбор объектов для углубленного изучения: основным критерием выбора, по нашему мнению, является не выраженность единичного эффекта, а влияние на все показатели развития опухоли (масса первичного опухолевого узла, частота метастазирования, количество и площадь метастазов).

2 этап - Химико-фармакологическое изучение. В задачи этого этапа входит (1) идентификация структуры действующих веществ полисахаридного комплекса, для чего его необходимо разделить на индивидуальные компоненты, что, как правило, является сложной задачей. Использование в работе различных методов разделения полисахаридов (фракционное осаждение, гель-фильтрация, осаждение ионами 2-х валентных металлов, электрофорез и т.д.) показало, что наиболее эффективным и универсальным методом является ионообменная хроматография в комплексе с ультрафильтрацией. Изучение химической структуры компонентов полисахаридного комплекса наиболее эффективно реализуется с сочетанным использованием двух методов - хроматомасс-спектрометрия и ЯМР-спектроскопия. Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что наиболее эффективным и экспрессным для пробоподготовки при хроматомасс-спектрометрическом анализе полисахаридов, является использование М-триметилсилилимидазола для дериватизации моносахаров, полученных при гидролизе полисахаридов.

(2) Исследование антибластомной активности компонентов полисахаридного комплекса целесообразно проводить на той же модели, которая использовалась для скрининга. (3) При выборе метода стандартизации главным критерием является возможность селективного определения действующих полисахаридов в присутствии балластных веществ (в нашем случае галактуронанов в присутствии нейтральных Сахаров). Использованная нами спектрофотометрическая методика может быть адаптирована для селективного определения кислых полисахаридов и в других объектах. (4) Разработанный нами дизайн и результаты углубленного фармакологического исследования, по нашему мнению, позволяют обосновать дальнейшее изучение объекта и проведение доклинических испытаний. (5) Результаты, полученные при выявлении механизмов действия, обосновывают методологические подходы к поиску противоопухолевых средств среди растительных полисахаридов на основании определенных видов их иммунотропной активности (влияние на активность и баланс популяций лимфоцитов, на функциональное состояние антиген-презентирующих клеток и на развитие ТЫ- и ТЬ2-типов иммунологического ответа).

3 этап - Разработка документации и подготовка регистрационного досье на новый лекарственный препарат: планирование эксперимента в соответствии с предложенной нами методологической схемой позволит использовать полученные материалы для разработки основных элементов регистрационного досье - отчетов по изучению специфической фармакологической активности, Фармакопейных статей и технологических регламентов.

Таким образом, в результате решения поставленных задач была показана перспективность использования полисахаридов высших растений в качестве средств вспомогательной терапии злокачественных новообразований; разработаны рациональные методологические подходы к поиску, оценке эффективности и созданию новых лекарственных средств комплексной терапии злокачественных новообразований на основе полисахаридов высших растений и предложена последовательная методологическая схема, обосновывающая оптимальные пути реализации каждого этапа исследований (рис. 7).

перспективных источников полисахаридов

1.1. Анализ данных литературы, выбор перспективных видов растений и растительного сырья

1.2. Выделение и характеристика полисахаридных комплексов из перспективных видов растительного сырья

1.3. Скрининговое исследование антибластомной активности полисахаридных комплексов и их влияния на эффективность и токсические эффекты циклофосфана на модели перевиваемой опухоли (карциномы легких Льюис)

1.4. Анализ полученных данных и выбор перспективных объектов, обладающих разносторонним эффектом, для дальнейшего изучения

Стадия 2. Химико-фармакологическое изучение полисахаридных

комплексов из перспективных видов растительного сырь;

2.1. Разделение полисахаридного комплекса на индивидуальные компоненты и идентификация их химической структуры

2.1.1. Хроматографическое разделение

2.1.2. Ультрафильтрация

2.1.3. Изучение мономерного состава

2.1.4. ЯМР-спектроскопия

2.3. Выявление компонентов полисахаридного комплекса, ответственных за антибластомное действие (исследование фармакологической активности фракций)

2.5. Разработка методов стандартизации

1. Методика количественного определения действующих веществ

2. Параметры извлечения действующих веществ из растительного сырья Валидация методик анализа

2.2. Углубленное изучение фармакологической активности полисахаридного комплекса

1. На разных моделях опухолевого роста (карцинома легких Льюис, меланома В-16, карциносаркома Уокера)

2. На разных видах лабораторных животных

3. В сочетании с различными цитостатиками (циклофосфан, 5-фторурацил, таксол)

4. В различных дозировках

5. При различных путях введения

2.4. Выявление механизмов реализации антибластомного действия

2.4.1. Влияние на иммунную систему

1. Активность лимфоцитов

2. Популяции лимфоцитов

3. Состояние АПК

4. Баланс ТЫ/ТЬ2

2.4.2. Прямое влияние:

1. На клетки опухоли (in vitro)

2. На микроокружение опухоли

1....................................................»------------------—1

Стадия 3. Разработка документации

Ц 3.1. Изучение 1 специфической Я активности 3.2. Изучение общей 3.3. Разработка нормативной и специфической документации на сырьё, активную токсичности субстанцию и препарат 3.4. Разработка Ц регламента И производства Н

Рис. 7. Методологическая схема поиска, оценки эффективности и разработки новых лекарственных средств комплексной терапии онкологических заболеваний на основе полисахаридов высших растений.

выводы

1. Перспективными источниками полисахаридов для разработки средств комплексной терапии злокачественных новообразований являются корневища с корнями левзеи сафлоровидной, корни одуванчика лекарственного, листья подорожника большого, цветки липы сердцевидной, побеги багульника болотного, корневища и корни родиолы розовой, корни солодки голой, корневища аира болотного, листья мать-и-мачехи обыкновенной, цветки календулы лекарственной.

2. Полисахаридные комплексы исследуемых видов лекарственного растительного сырья характеризуются содержанием кислых полисахаридов (от (10,25 ±0,11) до (95,32 ± 0,23)%), молекулярной массой компонентов в диапазоне от 30 до 750 кДа (преобладающими компонентами являются вещества с молекулярной массой 290-380 кДа).

3. Полисахариды цветков липы сердцевидной, побегов багульника болотного, корневищ аира болотного и листьев мать-и-мачехи повышают цитостатическую и антиметастатическую активность циклофосфана в отношении карциномы легких Льюис у мышей. Полисахариды аира оказывают наиболее выраженное потенцирующее влияние на активность циклофосфана, проявляя при этом еще и самостоятельное противоопухолевое действие.

4. Полисахариды аира повышают эффективность терапии карциномы легких Льюис циклофосфаном и 5-фторурацилом у мышей и ингибируют развитие других видов опухолей (меланома В-16, карциносаркома 256 Уокера) у разных видов животных (мыши и крысы).

5. Полисахаридный комплекс из корневищ аира болотного состоит из 5 основных компонентов: три компонента являются нейтральными полисахаридами: а-(1,4)-Б-глюкан с молекулярной массой 40кДа; a-D-галакто-(1,4)-а-Б-глюкан с разветвлениями, состоящими из остатков a-L-рамнопиранозы и молекулярной массой 280 кДа; р(1,3)-0-ксилопиранозил-a( 1,4)-В-галакто-а( 1,4)-0-глюкан с молекулярной массой 440 кДа; а два представляют собой кислые полисахариды: a(l,2)-L-paMHO-a(l,4)-D-

галактопиранозилуронан с разветвлениями из остатков нейтральных Сахаров (ксилозы, галактозы и глюкозы) и молекулярной массой 370 кДа и сильноразветвленный рамногалактуронан 1 с молекулярной массой 740 кДа.

6. За реализацию антибластомного действия полисахаридов аира ответственны преимущественно кислые полисахариды. Наиболее выраженной активностью обладает рамно-а(1,4)-0-галактопиранозилуронан с молекулярной массой 370 кДа и содержанием галактуроновой кислоты 84%. Нейтральные полисахариды аира также потенцируют антиметастатическую активность циклофосфана.

7. Стандартизацию корневищ аира болотного и биологически активной субстанции (полисахаридов аира) целесообразно проводить по содержанию галактуронанов в пересчете на галактуроновую кислоту.

8. Использование спектрофотометрического метода для количественного определения галактуронанов аира после реакции с карбазолом и концентрированной серной кислотой в присутствии сульфаминовой кислоты (0,16 моль/л) позволяет проводить измерения в присутствии нейтральных Сахаров и, при валидации методики, дает приемлемые отклонения, позволяющие включить ее в состав Фармакопейной статьи предприятия «Аира болотного корневища».

9. Полисахариды аира стимулируют активность и созревание опухоле-специфических Т- и В-лимфоцитов в условиях опухолевого роста и применения цитостатиков, не влияя на их пролиферацию.

10. Одним из механизмов реализации антибластомного эффекта полисахаридов аира является активация антиген-презентирующих клеток по «классическому» типу и развитие ТЫ-типа иммунологического ответа.

11. Разработанные методологические подходы определяют оптимальные пути реализации поиска, оценки эффективности и создания новых лекарственных средств комплексной терапии злокачественных новообразований на основе полисахаридов высших растений.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Монография:

1. Полисахариды в онкологии / Е.П. Зуева, К.А. Лопатина, Т.Г. Разина, A.M. Гурьев. - Томск: Изд-во «Печатная мануфактура», 2010.- 108 с.

2. Патенты:

2. Средство, на основе полисахаридов аира болотного, повышающее противоопухолевую и противометастатическую активность цитостатических препаратов : пат. 2308285 Рос. Федерация : МПК А61К36/882, А61Р35/00 / Т.Г. Разина, A.M. Гурьев [и др.] - № 2005139073/15 ; заявл. 14.12.2005 ; опубл. 20.10.2007, Бюл. №29.

3. Средство, обладающее иммуностимулирующей активностью : пат. 2311918 Рос. Федерация : МПК А61К36/882, А61К125/00, А61Р37/04 / Е.Ю. Шерстобоев, Н.В. Масная, Д.А. Климентова, К.А. Лопатина, Е.П. Зуева, A.M. Гурьев [и др.] -№ 2006113347/15 ; заявл. 9.04.2006 ; опубл. 10.12.2007, Бюл. № 34.

4. Средство, обладающее иммуномодулирующей активностью : пат. 2329821 Рос. Федерация, МПК А61К36/185, А61К31/715, А61Р37/02 / Е.Д. Гольдберг, A.M. Дыгай, М.Г. Данилец, A.M. Гурьев [и др.] - № 2007109361/15 ; заявл. 14.03.2007 ; опубл. 27.07.2008, Бюл. № 21.

5. Средство, обладающее иммуномодулирующей активностью : пат. 2337700 Рос. Федерация, МПК А61К36/28, А61К31/715, А61Р37/02 / Е.Д. Гольдберг, A.M. Дыгай, М.Г. Данилец, A.M. Гурьев [и др.] - № 2007109200/15 ; заявл. 12.03.2007 ; опубл. 10.11.2008, Бюл. № 31.

6. Средство, обладающее противоаллергическим действием : пат. 2337699 Рос. Федерация, МПК А61К36/28, А61КЗ1/715, А61Р37/08 / Е.Д. Гольдберг, A.M. Дыгай, М.Г. Данилец, A.M. Гурьев [и др.] - № 2007109359/15 ; заявл. 14.03.2007 ; опубл. 10.11.2008, Бюл. № 31.

7. Средство, обладающее противоаллергическим действием : пат. 2379047 Рос. Федерация, МПК А61К36/48, А61К31/715, А61Р37/08 / М.Г. Данилец, A.M. Гурьев [и др.]-№ 2008124685/15 ; заявл. 16.06.2008 ; опубл. 20.01.2010, Бюл. №2.

8. Средство, обладающее противоаллергическим действием : пат. 2378004 Рос. Федерация, МПК А61К 36/48, А61К 31/715, А61Р 37/08 / М.Г. Данилец, A.M. Гурьев [и др.] -№2008124685/15 ; заявл. 16.06.2008 ; опубл. 20.01.2010, Бюл. № 2.

9. Средство, снижающее гематотоксичность цитостатических препаратов / пат. 2397774 Рос. Федерация, МПК А61К36/28, А61Р43/00 / К.А. Лопатина, Е.А. Сафонова, A.M. Гурьев [и др.] - № 2009123171/15 ; заявл. 17.06.2009 ; опубл. 27.08.2010, Бюл. №24.

3. Статьи:

10. Изменение состава эфирного масла при разных сроках хранения сырья / A.B. Ткачев, Е.А. Королюк, М.С. Юсубов, A.M. Гурьев // Химия растительного сырья. - 2002. - № 1. - С. 19-30.

11. Аир болотный в комплексной терапии злокачественных новообразований / A.M. Гурьев [и др.] // Фармация. - 2003. - № 3. - С. 32-34.

12. Растительные полисахариды в экспериментальной онкологии / К.А. Лопатина, Т.Г. Разина, Н.В. Шилова, А.М. Гурьев // Российский биотерапевтический журнал. - 2006. - Т. 5, № 1. - С. 17.

13. Действие водорастворимых полисахаридов корневищ аира болотного на функциональную активность клеток лимфоузлов в условиях цитостатической терапии перевиваемой опухоли / К.А. Лопатина, A.M. Гурьев [и др.] // Сибирский онкологический журнал. - 2006. - № 3. - С. 59-63.

14. Tkachev, A.V. Acorafiiran, a new sesquiterpenoid from Acorus calamus essential oil / A.V. Tkachev, A.M. Guriev, M.S. Yusubov // Chemistry of Natural Compounds. -2006. - Vol. 42, N 6. - C. 696-698.

15. Влияние настойки эхинацеи пурпурной (Echinacea purpurea L.) и ее полисахаридного комплекса на эффективность цитостатической терапии перевиваемой опухоли / Т.Г. Разина, К.А. Лопатина, Е.П. Зуева, A.M. Гурьев [и др.] // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2007. - Т. 70, № 3. - С. 33-35.

16. Растительные полисахариды в комплексной терапии перевиваемых опухолей / К.А. Лопатина, Т.Г. Разина, Е.П. Зуева, С.Г. Крылова, E.H. Амосова, A.M. Гурьев // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2007. - Т. 143, прил. 1. - С. 30-34.

17. Водорастворимые полисахариды растений Сибири совместно с циклофосфаном в комплексной терапии перевиваемой опухоли Льюиса у мышей / К.А. Лопатина, Т.Г. Разина, Е.П. Зуева, С.Г. Крылова, E.H. Амосова, A.M. Гурьев. // Растительные ресурсы. - 2008. - Вып. 2. - С. 108-116.

18. Роль Р38 и PI38K в активации макрофагов водорастворимыми полисахаридами календулы и клевера / М.Г. Данилец, Ю.П. Вельский, Е.Г. Учасова, Н.В. Вельская, A.A. Лигачева, Е.С. Трофимова, A.M. Гурьев, [и др.] // Сибирский медицинский журнал. - 2008. - Т. 23, № 3. - Вып. 1. - С. 92.

19. Влияние растительных водорастворимых полисахаридов на продукцию IgE и IgGl / A.A. Лигачева, М.Г. Данилец, Н.В. Вельская, Ю.П. Вельский, Е.С. Трофимова, Е.Г. Учасова, А.М. Гурьев [и др.] // Сибирский медицинский журнал. - 2008. - Т. 23, № 3. - Вып. 1. - С. 102.

20. Влияние водорастворимых полисахаридов девясила на продукцию NO и экспрессию аргиназы макрофагами мыши / Е.Г. Учасова, A.A. Лигачева, М.Г. Данилец, Н.В. Вельская, Ю.П. Вельский, Е.С. Трофимова, A.M. Гурьев [и др.] // Сибирский медицинский журнал. - 2008. - Т. 23, № 3. - Вып. 1. - С. 121-122.

21. Влияние растительных водорастворимых полисахаридов на продукию иммуноглобулинов классов Е и Gl лимфоцитами мышей, стабилизированных овальбумином / М.Г. Данилец, Н.В. Вельская, Ю.П. Вельский, Е.Г. Учасова, Е.С. Трофимова, A.A. Лигачева, A.M. Гурьев [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2008. - Т. 146, № 11. - С. 520-522.

22. Противоатопическое действие полисахаридов аира / М.Г. Данилец, Н.В. Вельская, Ю.П. Вельский, Е.Г. Учасова, Е.С. Трофимова, A.A. Лигачева, A.M. Гурьев [и др.] // Российский аллергологический журнал. - 2009. - № 3. - Вып. 1. - С. 442.

23. Влияние растительных полисахаридов на NO-синтазу и аргиназу макрофагов мыши / М.Г. Данилец, A.M. Гурьев [и др.] // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2009. - Т. 25, № 2. - С. 49-50.

24. Исследование острой токсичности комплекса водорастворимых полисахаридов корневищ аира болотного {Acorus calamus L.) / A.M. Гурьев [и др.]// Бюллетень сибирской медицины. - 2010. - Т. 9, № 1. - С. 36-39.

25. Исследование влияния длительного введения водорастворимых полисахаридов аира болотного (Acorus calamus L.) на состояние внутренних органов лабораторных животных (патоморфологические аспекты) / A.M. Гурьев [и др.] // Бюллетень сибирской медицины. - 2010. - Т. 9, № 3. - С. 57-64.

26. Water-soluble polysaccharide obtained from Acorus calamus L. classically activates macrophages and stimulates Thl response / N.V. Belska, A.M. Guriev [et al.]// International Immunopharmacology. - 2010. - Vol. 10, N 8. - P. 933-942.

27. Влияние полисахаридов из растительного сырья на Thl-зависимый иммунный ответ (скрининговое исследование) / М.Г. Данилец, Ю.П. Вельский, A.M. Гурьев [и др.] // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2010. - Т. 73, № 6. - С. 19-22.

28. Исследование мутагенных свойств водорастворимых полисахаридов аира болотного / A.M. Гурьев [и др.] // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2010. - Т. 73, № 8. - С. 43-45.

29. Снижение токсического эффекта паклитаксела на систему крови водорастворимыми полисахаридами мать-и-мачехи обыкновенной и аира болотного / Е.А. Сафонова, Т.Г. Разина, К.А. Лопатина, Е.П. Федорова, Е.П. Зуева, A.M. Гурьев // Сибирский онкологический журнал. - 2010. - № 2. - Вып. 38. - С. 42-46.

30. Исследование влияния длительного введения водорастворимых полисахаридов аира болотного (Acorus calamus L.) на функциональные показатели лабораторных животных / A.M. Гурьев [и др.] // Бюллетень сибирской медицины. - 2010. - Т. 9, №6.-С. 18-23.

31. Количественное определение полисахаридов в корневищах аира болотного (Acorus calamus L.) / А.П. Корж, A.M. Гурьев [и др.] // Фармация. - 2011. - № 4. - С. 22-23.

32. Водорастворимые полисахариды подземной части Inula heienium L. / А.П. Корж, A.M. Гурьев [и др.] //Растительные ресурсы. -2011. - Вып. 3. - С. 88-92.

4. Публикации:

33. Макрофаги как фармакологическая мишень для регуляции баланса Thl/Th2 / М.Г. Данилец, Ю.П. Вельский, Н.В. Вельская, Е.С. Трофимова, Е.Г. Учасова, А.А. Лигачева, A.M. Гурьев [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2008. - № 2, прил. 1. - С. 63-68.

34. Корж, А.П. Содержание кислых моносахаридов в полисахаридном комплексе Inula heienium. / А.П. Корж, A.M. Гурьев // Вестник Российского Государственного медицинского университета.-2011.-Спецвып. 1.-С. 178-179.

35. Лопатина, К.А. Экстракт из корневищ аира болотного и его биологически активные вещества в экспериментальной онкологии / К.А. Лопатина, Т.Г. Разина, A.M. Гурьев // Сборник статей по материалам конференции «Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии». - Томск, 2004. - С. 202-203.

36. Lopatina, К.А. The influence of preparation Echinacea purpurea L. and its polysaccharide complex on efficacy of cytostatic therapy of transplanted tumors / K.A. Lopatina, T.G. Razina, A.M. Guryev // Сборник статей по материалам «China-Russia International Conference on Pharmacology». - Harbin, China, 2005. - P. 26-27.

37. Лопатина, K.A. Влияние водорастворимых полисахаридных комплексов растительного происхождения на эффективность цитостатической терапии перевиваемых опухолей / К.А. Лопатина, A.M. Гурьев // Сборник статей по

материалам конференции «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии»: - Томск, 2005. - С. 23-25.

38. Лопатина, К.А. Способность полисахаридов из подорожника большого и липы сердцевидной повышать эффективность цитостатической терапии перевиваемой опухоли / К.А. Лопатина, A.M. Гурьев // Сборник статей по материалам конференции «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии». - Томск, 2005. - С. 26-28.

39. Фармакогностическое исследование аира болотного и перспективы создания на его основе новых лекарственных средств / A.M. Гурьев [и др.] // Сборник статей по материалам IV всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ». - Сыктывкар, 2006. - С. 242.

40. Исследование иммунорегуляторных свойств полисахаридов из растительного сырья / М.Г. Данилец, Ю.П. Вельский, Е.С. Трофимова, Н.В. Вельская, Е.Г. Учасова, В.И. Агафонов, A.M. Гурьев, М.В. Белоусов // Сборник статей по материалам конференции «Создание новых лекарственных препаратов». - Томск, 2007. - С. 53-55.

41. Растительные полисахариды в комплексной терапии перевиваемых опухолей / К.А. Лопатина, Е.П. Зуева, Т.Г. Разина, E.H. Амосова, С.Г. Крылова, A.M. Гурьев // Сборник статей по материалам II International Conference «Natural Products: Chemistry, Technology & Medicinal Perspectives». - Алматы, 2007. - С. 164.

42. Химический состав водорастворимых полисахаридов из корневищ аира болотного / A.M. Гурьев [и др.]// Сборник статей по материалам II International Conference «Natural Products: Chemistry, Technology & Medicinal Perspectives». -Алматы, 2007. - С. 282.

43. Лопатина, К.А. Коррекция нейтропенического эффекта паклитаксела у животных с перевиваемой опухолью / К.А. Лопатина, Е.А. Сафонова, A.M. Гурьев // Сборник статей по материалам конференции «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины». - СПб., 2010. - С. 71-72.

44. Выделение и исследование строения водорастворимых полисахаридов из цветков календулы лекарственной Calendula officinalis L. / А.П. Корж, A.M. Гурьев [и др.] // Труды Томского государственного университета. - 2010. - Т. 275. - С. 275-277.

45. Определение содержания уроновых кислот в полисахаридном комплексе мать-и-мачехи (Tussilago farfara L.) / А.П. Корж, A.M. Гурьев [и др.] // Вестник ПГФА. -2010.-№ 7. - С. 95-97.

46. Гурьев, A.M. Полисахариды как регуляторы баланса Thl/Th2 при онкологических заболеваниях / A.M. Гурьев [и др.]// Сборник статей по материалам XVIII международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». - Гурзуф, 2010. -С. 58-59.

47. Определение содержания уроновых кислот в полисахаридах календулы лекарственной / А.П, Корж, A.M. Гурьев [и др.]// Сборник статей по материалам 68 конференции с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины». - Волгоград, 2010. - С. 311-313.

48. Выделение и исследование строения водорастворимых полисахаридов из цветков календулы лекарственной Calendula officinalis L. / А.П. Корж, A.M. Гурьев [и др.] // Сборник статей по материалам первой Всероссийской молодежной конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биологии». -Томск,2010.-С. 60-61.

49. Определение содержания уроновых кислот в полисахаридах Trifolium pratense L. / А.П. Корж, A.M. Гурьев [и др.] // Сборник статей по материалам международной конференции «Актуальные проблемы химии природных соединений». - Ташкент, 2010.-С. 244.

50. Водорастворимые полисахариды корневищ с корнями Inula helenium / А.П. Корж, A.M. Гурьев [и др.]// Сборник статей конференции «66-я региональная конференция по фармации и фармакологии».-Пятигорск, 2011 - С. 121.

51. Корж, А.П. Полисахариды Trifolium pretense L. / А.П. Корж, A.M. Гурьев // Сборник статей по материалам XII научно-практической конференции «Молодежь и медицинская наука в XXI веке». - Киров, 2011 - С. 198.

52. Корж, А.П. Полисахариды Inula helenium / А.П. Корж, A.M. Гурьев // Сборник статей по материалам юбилейной научно-практической конференции молодых ученых «Медицина XXI века». - Новокузнецк, 2011. - С. 197-199.

53. Корж, А.П. Водорастворимый полисахаридный комплекс Trifolium pratense L. / А.П. Корж, A.M. Гурьев // Сборник статей по материалам XIV Всероссийской медико-биологической конференции с международным участием «Фундаментальная наука и клиническая медицина - человек и его здоровье». -Санкт-Петербург, 2011. - С. 127-128.

54. Корж, А.П. Выделение и исследование мономерного состава полисахаридного комплекса из травы Trifolium pratense L. / А.П. Корж, A.M. Гурьев // Сборник статей по материалам XII Российского конгресса молодых ученых с международным участием «Науки о человеке». - Томск, 2011. - С. 82-83.

55. Изучение химической структуры водорастворимых полисахаридов некоторых растений Сибири / A.M. Гурьев [и др.] // Сборник статей по материалам XIX международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». - Гурзуф, 2011. - С. 175-177.

Автор выражает глубокую признательность и благодарность коллективам лаборатории онкофармакологии и лаборатории экспериментального биомоделирования НИИ фармакологии СО РАМН; заведующему лабораторией терпеноидов НИИ органической химии СО РАН (г.Новосибирск) доктору хим. наук, профессору A.B. Ткачеву, заведующей кафедрой фармакогнозии с курсами ботаники и экологии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвитш России доктору фарм. наук, профессору Г.И. Калинкжой и консультантам данной диссертационной работы: заведующему кафедрой химии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвитш России доктору хим. наук, профессору М.С. Юсубову и заведующему кафедрой фармации ФПК и ППС ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвитш России доктору фарм. наук MB. Белоусову.

ГУРЬЕВ АРТЕМ МИХАЙЛОВИЧ

ХИМИКО-ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЛИСАХАРИДОВ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ И ПЕРСПЕКТИВЫ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ТЕРАПИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия 14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук

Подписано к печати 17.10.2011 г. Формат 60 х 84 1/16. Бумага офсетная. Печат. л. 3,0. Тираж 130 экз. Заказ № 142. Отпечатано на участке оперативной полиграфии ООО «Печатная мануфактура». 634055, г. Томск, а/я 3967. Тел./факс (3822) 49-31-19, тел. (3822) 49-00-74. E-mail: pechat@tomsk.ru

Актуальность проблемы

Онкологическая патология занимает одно из первых мест в мире по причине смертности, поэтому проблема поиска новых подходов к лечению, а также лекарственных средств для борьбы с опухолями в настоящее время является чрезвычайно актуальной.

В современной медицине для лечения злокачественных новообразований широко используются ионизирующее излучение, хирургическое удаление опухолей и цитостатические препараты, подавляющие клеточное деление. Однако общеизвестно, что эти методы имеют ряд существенных недостатков и часто не дают полной гарантии выздоровления пациентов. После проведения оперативного вмешательства высок риск развития метастазов. При лучевой терапии поражаются как раковые клетки, так и окружающие здоровые ткани. Противоопухолевые препараты, к сожалению, не оказывают избирательного действия на опухоль и обладают токсическим влиянием на активно обновляющиеся клетки организма - костный мозг, слизистую оболочку кишечника, фолликулы волос, гонады [8].

Известно, что в традиционной медицине разных народов для лечения опухолевых заболеваний использовались лекарственные растения, причем многие эмпирически полученные данные впоследствии были подтверждены научной медициной. Также хорошо известно, что, как правило, лекарственные средства растительного происхождения обладают минимальными побочными N эффектами наряду с выраженной биологической активностью. Однако доля препаратов растительного происхождения, используемых в клинической терапии злокачественных опухолей, невелика. Широкое применение как цитотоксические агенты нашли алкалоиды винбластин и винкристин, выделенные из барвинка розового, колхицин и колхамин из луковиц безвременника, тенипозид и этопозид - синтетические производные подофиллотоксинов из подофилла щитовидного, камптотецин из китайского дерева Camptotheca acuminata и его полусинтетический аналог топотекан. Высокой противоопухолевой активностью обладают алкалоиды из тиса тихоокеанского, один из которых - таксол - в настоящее время внедрен и активно применяется в клинической онкологии.

В связи с вышеперечисленными недостатками антибластомные препараты в клинической практике применяются с большими ограничениями, что определяет актуальность поиска новых лекарственных средств. Вопрос поиска и создания средств, повышающих эффективность цитостатической терапии, ингибирующих развитие метастазов и позволяющих преодолеть иммунологическую и лекарственную резистентность опухоли, остается центральным в онкофармакологии и экспериментальной терапии по сегодняшний день.

Известно, что одним из важнейших механизмов формирования иммунологической толерантности опухоли является протективное действие антигенпрезентирующих клеток (АПК) - макрофагов, дендритных клеток, инфильтрующих опухолевую ткань и, в силу своих регуляторных способностей, имеющих функциональный статус, обеспечивающий локальную иммуносупрессию и жизнеобеспечение опухолевых клеток (ангиогенез, пролиферацию, ремоделирование тканей и т.д.). Такое функциональное состояние является результатом «альтернативной» активации АПК, развивающейся в ответ на опухолевые антигены, под мощным влиянием иммуносупрессивных факторов, продуцируемых опухолью. Наряду с этим, известно, что АПК способны изменять свое функциональное состояние и поляризационный профиль при воздействии на их рецепторы - семейство TLR (Toll-like receptors 1-10) и NOD 1-4, CD14 (LPS-рецептор), CR3 (complement receptor 3, известный также как CDllb/CD18, Мас-1 или амр2 integrin), скавенджер рецептор, дектин-1 и маннозный рецептор. Естественными экзогенными агонистами рецепторов АПК являются компоненты клеточных стенок бактерий и грибов - липополисахариды, пептидогликаны, тейхоевые кислоты и т.д. В качестве структурных аналогов этих веществ, способных связываться с рецепторами АПК, представляют интерес полисахариды высших растений, т.к. они лишены многих недостатков, присущих препаратам бактериального происхождения (пирогенные, аллергизирующие эффекты). Исследования последних лет, проводимые в мире, позволяют предположить, что некоторые представители этого класса БАВ могут быть перспективными кандидатами на роль средств вспомогательной терапии злокачественных новообразований [71, 88, 98, 136, 214, 216, 228, 260, 261, 286, 325, 326, 329]. Поэтому направленный поиск (среди растительных полисахаридов) веществ, повышающих эффективность цитостатической терапии, выяснение особенностей и механизмов их действия, наряду с детальным изучением химической структуры, представляется нам актуальным направлением исследований, нацеленных на создание высокоэффективных средств сопутствующей терапии раковых заболеваний.

Вместе с тем, существующие в настоящее время общепринятые в фармацевтической практике методики не позволяют селективно выделять индивидуальные полисахариды из растительного сырья, определять их химическую структуру и проводить стандартизацию исследуемых образцов, что значительно усложняет проведение адекватной оценки их фармакологической активности и затрудняет интерпретацию полученных данных. В связи с этим процесс поиска и разработки новых лекарственных средств на основе полисахаридов, в настоящее время, характеризуется низкой эффективностью ввиду отсутствия единой методологической схемы, обосновывающей оптимальные пути реализации каждого этапа таких исследований.

Цель диссертационной работы:

На основании химико-фармакологического исследования полисахаридов высших растений разработать рациональные методологические подходы к поиску, оценке эффективности и созданию новых лекарственных средств комплексной терапии злокачественных новообразований.

Задачи исследования:

1. Выбрать растения, перспективные в качестве источников биологически активных полисахаридов, выделить и охарактеризовать полисахаридные комплексы из них.

2. Провести скрининговое исследование влияния полученных полисахаридных комплексов на эффективность химиотерапии злокачественных новообразований и выбрать образцы, обладающие наибольшей биологической активностью, для дальнейшего изучения.

3. Провести углубленное изучение наиболее активных образцов в терапии злокачественных новообразований (выбор оптимальной дозы, эксперименты на разных видах лабораторных животных и различных моделях экспериментальных опухолей и т.д.).

4. Выделить индивидуальные компоненты наиболее активных полисахаридных комплексов.

5. Установить структуру веществ, ответственных за биологическую активность.

6. Разработать методы стандартизации биологически активной субстанции и растительного сырья по содержанию действующих веществ.

7. Исследовать механизмы антибластомного действия полисахаридов.

8. Обосновать рациональные методологические подходы к поиску, оценке эффективности и разработке новых лекарственных средств терапии онкологических заболеваний на основе полисахаридов высших растений.

Научная новизна

На основании полученных экспериментальных данных разработаны рациональные методологические подходы к поиску, оценке эффективности и разработке новых лекарственных средств комплексной терапии злокачественных новообразований на основе полисахаридов высших растений.

Впервые предложена последовательная методологическая схема, обосновывающая оптимальные пути реализации каждого этапа исследований.

Впервые экспериментально обоснована и предложена универсальная методика извлечения полисахаридов из растительного сырья, позволяющая выделять максимальный спектр водорастворимых полисахаридов с минимальным количеством примесей.

Впервые охарактеризованы полисахаридные комплексы из сырья 10 видов высших растений по количественному соотношению и молекулярной массе входящих в их состав компонентов и содержанию уроновых кислот. Впервые показано, что:

- полисахаридный комплекс из корневищ с корнями левзеи сафлоровидной содержит 3 основных компонента с молекулярной массой 700 кДа (12,8%), 250 кДа (80,9%) и 30 кДа (6,3%) (общее содержание уроновых кислот 38,91±0,22%);

- полисахаридный комплекс из побегов багульника болотного также состоит из трех основных компонентов с молекулярной массой 500 кДа (8,66%), 360 кДа (73,23%) и 20 кДа (18,10%), с общим содержанием уроновых кислот 95,32±0,23%;

- полисахаридный комплекс из корневищ с корнями родиолы розовой содержит 2 основных компонента с молекулярной массой 750 кДа (31,65%) и 380 кДа (68,45%) с содержанием уроновых кислот 10,25±0,11%;

- полисахаридный комплекс из корневищ аира болотного состоит из 5 компонентов 720 кДа (8,82%), 460 кДа (8,96%), 370 кДа (46,92%), 290 кДа (4,76%), 40 кДа (30,53%) и содержит 24,36±0,04% уроновых кислот.

Впервые показано, что в корнях одуванчика, кроме инулина и инулиноподобных полисахаридов, в большом количестве (около 2,5%) содержатся кислые полисахариды с молекулярной массой 310 и 700 кДа.

Впервые детально изучен химический состав полисахаридного комплекса из корневищ аира болотного, показано, что в его составе содержится 3 нейтральных и 2 кислых полисахарида и установлена их химическая структура: а-(1,4)-0-глюкан с молекулярной массой 40 кДа; а-Б-галакто-(1,4)-а-В-глюкан с разветвлениями, состоящими из остатков а-Ь-рамнопиранозы и молекулярной массой 280 кДа; |3(1,3)-0-ксилопиранозил-а(1,4)-В-галакто-а(1,4)-0-глюкан с молекулярной массой 440 кДа; рамно-а(1,4)-Б-галактопиранозилуронан с разветвлениями из остатков нейтральных Сахаров (ксилозы, галактозы и глюкозы) и молекулярной массой 370 кДа и сильноразветвленный рамногалактуронан I с молекулярной массой 740 кДа.

Экспериментально обоснованы и оптимизированы методические подходы к стандартизации полисахаридсодержащего растительного сырья по содержанию биологически активных полисахаридов.

Впервые предложено проводить стандартизацию корневищ аира болотного по содержанию галактуронана и разработана методика его количественного определения в растительном сырье и в субстанции, позволяющая селективно определять галактуронан в присутствии нейтральных полисахаридов.

Проведено исследование влияния полисахаридных комплексов из сырья 10 видов высших растений на развитие экспериментальной опухоли и её цитостатическое лечение. Впервые выявлено, что:

- полисахаридные комплексы из цветков липы сердцевидной, побегов багульника болотного, корневищ аира болотного и листьев мать-и-мачехи повышают противоопухолевую и антиметастатическую активность циклофосфана в отношении карциномы легких Льюис у мышей;

- полисахариды аира оказывают самостоятельное противоопухолевое действие, а полисахариды липы, багульника и солодки проявляют самостоятельный антиметастатический эффект;

- полисахариды левзеи, одуванчика и подорожника потенцируют противоопухолевую и не влияют на антиметастатическую активность циклофосфана.

Впервые проведено углублённое фармакологическое изучение полисахаридов аира в комплексной терапии экспериментальных опухолей, показано, что:

- полисахариды аира болотного повышают эффективность цитостатиков, отличающихся по механизму действия (циклофосфан и 5-фторурацил), в отношении различных моделей опухолевого роста (меланома В-16, карциносаркома 256 Уокера, карцинома легких Льюис) и на разных видах лабораторных животных (мыши и крысы).

- рамно-а(1,4)-0-галактопиранозилуронан с молекулярной массой 370 кДа и содержанием уроновых кислот 84% потенцирует противоопухолевую и антиметастатическую активность циклофосфана;

- рамногалактуронан I с молекулярной массой 740 кДа и содержанием уроновых кислот 32% потенцирует антиметастатическую активность циклофосфана в отношении частоты метастазирования, количества и площади метастазов;

- галактоглюканы с молекулярной массой 280 кДа и 440 кДа также способны повышать антиметастатическую активность циклофосфана в отношении частоты метастазирования опухоли и площади метастазов.

- антибластомная активность полисахаридов аира болотного обусловлена наличием в молекуле полисахарида чередующихся линейных участков а-1,4-связанных остатков О-галактуроновой кислоты и участков, состоящих из а-1,2-связанных остатков О-галактуроновой кислоты и остатков рамнозы с боковыми цепями из Б-галактозы (соотношение галактуроновой кислоты и нейтральных Сахаров в молекуле полисахарида 1:5).

На примере полисахаридов из корневищ аира болотного, изучены иммунологические механизмы антибластомного действия полисахаридов высших растений. Впервые установлено, что:

- полисахариды высших растений стимулируют активность опухоле-специфических лимфоидных клеток и созревание Т- и В-лимфоцитов, в условиях иммуносупрессии, вызванной опухолевым ростом и применением цитостатиков;

- полисахариды аира болотного вызывают классическую активацию макрофагов и стимулируют продукцию ими провоспалительных цитокинов 1Ы2иТИРа;

- одним из механизмов антибластомного действия полисахаридов высших растений является стимулирование ТЫ-типа и подавление ТЬ2-типа иммунологического ответа.

Практическая значимость работы

На основании химико-фармакологического изучения полисахаридов из 10 видов лекарственных растений разработаны рациональные методологические подходы к поиску, оценке эффективности и созданию новых лекарственных средств повышающих эффективность химиотерапии злокачественных новообразований. Впервые предложена последовательная методологическая схема реализации каждого этапа исследований.

Данные фармакологического исследования свидетельствуют, что цветки липы сердцевидной, побеги багульника болотного, корневища аира болотного и листья мать-и-мачехи являются перспективными источниками полисахаридов, повышающих эффективность противораковой терапии. Разработка и внедрение в медицинскую практику новых лекарственных препаратов и биологически активных добавок на основе исследованных полисахаридов позволит расширить ассортимент средств комплексной терапии онкологических заболеваний.

Исследование иммунотропной активности образцов позволило выявить факт снижения продукции иммуноглобулинов класса Е и 01 под влиянием полисахаридов аира, мать-и-мачехи и календулы, что дает основания для их дальнейшего исследования с целью разработки на их основе новых лекарственных средств, предназначенных для терапии аллергических заболеваний.

С использованием предложенной методологической схемы поиска и разработки новых лекарственных средств для комплексной терапии злокачественных новообразований, разработан новый лекарственный препарат Полистан на основе полисахаридов аира: проведено изучение специфической фармакологической активности, общетоксических свойств и возможного мутагенного действия биологически активной субстанции.

На основе химико-фармакологических и фармакогностических исследований разработана методика извлечения полисахаридов из растительного сырья. На основании полученных данных разработана лабораторная технология и лабораторный регламент биологически активной субстанции полисахаридов аира.

На основании фитохимического анализа разработан проект Фармакопейной статьи предприятия «Аира болотного корневища», который является основой нормативной документации, регламентирующей стандартизацию растительного сырья для производства препарата на основе полисахаридов аира болотного.

Результаты фитохимических и фармакологических исследований позволили обосновать, в соответствии с современными требованиями, аналитические подходы в решении проблемы стандартизации полисахаридсодержащего лекарственного растительного сырья и лекарственных препаратов на его основе. Разработаны валидированные методики количественного определения полисахаридов растительном сырье и субстанции. Унификация и внедрение разработанной методики в практику контрольно-аналитических лабораторий позволит расширить арсенал методов стандартизации полисахаридсодержащего растительного сырья.

На основные практически значимые результаты диссертационной работы получено 8 патентов РФ: Патент №2308285, №2311918, №2329821, №2337700, №2337699, №2379047, №2378004, №2397774.

Материалы внедрения

На основе материалов Патента № 2308285 от 14.12.2005 г. «Средство, на основе полисахаридов аира болотного, повышающее противоопухолевую и противометастатическую активность цитостатических препаратов» компанией «Инноком» (г. Томск) ведется разработка нового лекарственного препарата Полистан, предназначенного для комплексной терапии злокачественных новообразований. Разработанные в рамках требований Департамента государственного регулирования обращения лекарственных средств Минздравсоцразвития России материалы (лабораторный регламент «Субстанция Полистан», проект Фармакопейной статьи предприятия «Аира болотного корневища» и отчеты по изучению специфической фармакологической активности, острой и хронической токсичности, возможных мутагенных свойств нового лекарственного препарата) используются для составления регистрационного досье (акты внедрения от 17.05.2011 г.).

Материалы Патентов №2397774 от 17.06.2009 г. «Средство, снижающее гематотоксичность цитостатических препаратов» и №2329821 от 14.03.2007 г. «Средство, обладающее иммуномодулирующей активностью» используются компанией «БиоСистемы» (г.Томск) для разработки биологически активной добавки, обладающей иммуномодулирующим эффектом и предназначенной для профилактики побочных эффектов химиотерапии (акт внедрения от 20.05.2011 г.)

Разработанная методика количественного определения кислых полисахаридов в растительном сырье, включенная в проект ФСП «Аира болотного корневища», апробирована в контрольно-аналитической лаборатории Центра по сертификации и контролю качества лекарственных средств Томской области (акт апробации от 05.05.2010 г.).

Результаты диссертационной работы включены в монографию Зуевой Е.П. Лопатиной К.А. Разиной Т.Г., Гурьева A.M. «Полисахариды в онкологии» и в учебные пособия «Методы количественного определения поли- и олигосахаридов», «Роль поляризации антигенпрезентирующих клеток в механизмах развития иммунологической толерантности опухолей», «Разработка новых противоопухолевых лекарственных средств на основе природных БАВ», «Применение аира болотного в официнальной и народной медицине», которые внедрены в образовательный процесс Самарского государственного медицинского университета, Сибирского государственного медицинского университета и Новосибирского государственного медицинского университета (акты внедрения от 31.05.2011 г., 30.05.2011 г., 26.05.2011 г. и 24.09.2004 г.).

На защиту выносится:

Научно-методическое обоснование использования растительных полисахаридов в качестве средств комплексной терапии злокачественных новообразований в т.ч.:

- результаты изучения влияния полисахаридов из 10 видов лекарственных растений на развитие карциномы легких Льюис и эффективность лечения циьслофосфаном;

- результаты изучения химической структуры полисахаридов из корневищ аира болотного;

- результаты изучения влияния полисахаридов из корневищ аира болотного на эффективность циклофосфана и 5-фторурацила, на различных моделях опухолевого роста и на разных видах лабораторных животных;

- обоснование методических подходов к разработке методов стандартизации растительного сырья и проекта Фармакопейной статьи предприятия «Аира болотного корневища»;

- результаты изучения механизмов антибластомного действия полисахаридов из корневищ аира болотного.

Апробация работы

Материалы диссертации апробированы на V конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2004); Российской научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2004); II международной конференции по природным и физиологически активным веществам «Natural Products and Phisiologically Active Substances» ICNPAS-2004 (Новосибирск, 2004); Российско-китайской Международной конференции по фармакологии (Китай, Харбин, 2005); конференции молодых ученых НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2005);. IV всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (Сыктывкар, 2006); 43-й Республиканской научной конференции "Создание новых лекарственных препаратов" (Томск, 2007); II международной конференции "Natural Products: Chemistry, Technology & Medicinal Perspectives" (Алматы, 2007), конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2010); XVIII международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, Крым, 2010); I всероссийской молодежной конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биологии» (Томск, 2010); XIV всероссийской медико-биологической конференции с международным участием. (Санкт-Петербург, 2011); юбилейной научно-практической конференции молодых ученых «Медицина XXI века». (Новокузнецк, 2011), XII Российского конгресса молодых ученых с международным участием «Науки о человеке» (Томск, 2011), XIX международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, Крым, 2011).

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук

Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований кафедры фармации ФПК и 1ШС и Лаборатории инновационных фармацевтических технологий ЦНИЛ Сибирского государственного медицинского университета и в рамках комплексной целевой программы СО АМН РФ «Здоровье человека в Сибири» (№ Гос.регистрации 01.9.2002479).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 55 научных работ, отражающих основное содержание диссертации, из них 23 в журналах, рекомендуемых ВАК, 1 монография и 8 патентов на изобретения.

Экспериментальные исследования по теме диссертации выполнялись на кафедре химии, кафедре фармакогнозии с курсами ботаники и экологии, кафедре фармацевтической технологии и в Центральной научно-исследовательской лаборатории Сибирского государственного медицинского университета, а также в сотрудничестве с коллективами других научных организаций: НИИ Фармакологии СО РАМН г. Томск (лаборатория онкофармакологии, лаборатория экспериментального биомоделирования, лаборатория лекарственной токсикологии); НИИ Органической химии СО РАН г. Новосибирск (лаборатория терпеноидов). НИИ физиологии УроРАН г.Сыктывкар.

Исследования по теме диссертации выполнены при поддержке грантов Российского фонда фундаментальных исследований (Грант 06-04-96968-офи), Фонда содействия развитию малых форм предпринимательства в научно-технической сфере (ГК № 4213р/6607 от 26.06.2006 г.), Администрации Томской области в сфере научно-исследовательских и инновационных разработок (ГК № 101 от 20.09. 2005 г. и № 255 от 23.06. 2008 г.), Федеральной целевой программы "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009-2013 годы (ГК№ 02.740.11.5211 от 10.07.2010 г.)

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 315 страницах машинописного текста и состоит из введения, восьми глав, заключения, выводов, списка литературы и приложений. Работа иллюстрирована 57 таблицами и 57 рисунками. Библиографический указатель включает 449 источников литературы, из них 384 зарубежных.

240 ВЫВОДЫ

1. Перспективными источниками полисахаридов для разработки средств комплексной терапии злокачественных новообразований являются корневища с корнями левзеи сафлоровидной, корни одуванчика лекарственного, листья подорожника большого, цветки липы сердцевидной, побеги багульника болотного, корневища и корни родиолы розовой, корни солодки голой, корневища аира болотного, листья мать-и-мачехи обыкновенной, цветки календулы лекарственной.

2. Полисахаридные комплексы исследуемых видов лекарственного растительного сырья характеризуются содержанием кислых полисахаридов (от 10,25±0,11 до 95,32±0,23%), молекулярной массой компонентов в диапазоне от 30 до 750 кДа (преобладающими компонентами являются вещества с молекулярной массой 290-380 кДа).

3. Полисахариды цветков липы сердцевидной, побегов багульника болотного, корневищ аира болотного и листьев мать-и-мачехи повышают цитостатическую и антиметастатическую активность циклофосфана в отношении карциномы легких Льюис у мышей. Полисахариды аира оказывают наиболее выраженное потенцирующее влияние на активность циклофосфана, проявляя при этом, еще и самостоятельное противоопухолевое действие.

4. Полисахариды аира повышают эффективность терапии карциномы легких Льюис циклофосфаном и 5-фторурацилом у мышей и ингибируют развитие других видов опухолей (меланома В-16, карциносаркома 256 Уокера) у разных видов животных (мыши и крысы).

5. Полисахаридный комплекс из корневищ аира болотного состоит из 5 основных компонентов: 3 компонента являются нейтральными полисахаридами: а-(1,4)-Б-глюкан с молекулярной массой 40 кДа; a-D-галакто-(1,4)-а-0-глюкан с разветвлениями, состоящими из остатков a-L-рамнопиранозы и молекулярной массой 280 кДа; (3(1,3)-0-ксилопиранозил-а(1,4)-0-галакто-а(1,4)-В-глюкан с молекулярной массой 440 кДа; а 2 представляют собой кислые полисахариды: а(1,2)-Ь-рамно-а(1,4)-0-галактопираиозилуронан с разветвлениями из остатков нейтральных Сахаров (ксилозы, галактозы и глюкозы) и молекулярной массой 370 кДа и сильноразветвленный рамногалактуронан I с молекулярной массой 740 кДа.

6. За реализацию антибластомного действия полисахаридов аира ответственны преимущественно кислые полисахариды. Наиболее выраженной активностью обладает рамно-а(1,4)-Б-галактопиранозилуронан с молекулярной массой 370 кДа и содержанием галактуроновой кислоты 84%. Нейтральные полисахариды аира также потенцируют антиметастатическую активность циклофосфана.

7. Стандартизацию корневищ аира болотного и биологически активной субстанции (полисахаридов аира) целесообразно проводить по содержанию галактуронанов в пересчёте на галактуроновую кислоту.

8. Использование спектрофотометрического метода для количественного определения галактуронанов аира после реакции с карбазолом и концентрированной серной кислотой в присутствии сульфаминовой кислоты (0,16 моль/л) позволяет проводить измерения в присутствии нейтральных Сахаров и, при валидации методики, дает приемлемые отклонения, позволяющие включить ее в состав Фармакопейной статьи предприятия «Аира болотного корневища».

9. Полисахариды аира стимулируют активность и созревание опухоле-специфических Т- и В-лимфоцитов в условиях опухолевого роста и применения цитостатиков, не влияя на их пролиферацию.

10. Одним из механизмов реализации антибластомного эффекта полисахаридов аира является активация антиген-презентирующих клеток по «классическому» типу и развитие ТЫ-типа иммунологического ответа.

11. Разработанные методологические подходы определяют оптимальные пути реализации поиска, оценки эффективности и создания новых лекарственных средств комплексной терапии злокачественных новообразований на основе полисахаридов высших растений.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Методология поиска, оценки эффективности и разработки новых лекарственных средств для вспомогательной терапии раковых заболеваний на основе полисахаридов высших растений

Результатом обобщения и структурирования всех выполненных в рамках данной работы исследований стала предложенная нами поэтапная методология рационального поиска, оценки эффективности, выявления действующих веществ и механизмов антибластомного действия полисахаридных комплексов из различных видов растительного сырья для создания на их основе новых лекарственных средств сопутствующей терапии раковых заболеваний (рис. 57). Методология базируется на трех основных этапах:

1. поиск новых источников активных полисахаридов;

2. выделение и определение структуры действующих веществ ПСК и доказательство их специфической активности;

3. проведение исследований, подтверждающих эффективность и безопасность лекарственного средства и подготовка регистрационного досье на лекарственный препарат.

Соответственно, первый этап должен состоять из четырёх последовательных стадий: аналитический отбор перспективных объектов по данным литературы, основанный на сведениях о применении растений в традиционной или официнальной медицине для лечения онкологических заболеваний(стадия 1); выделение полисахаридных комплексов из выбранных на первой стадии видов растительного сырья и характеристика их компонентного состава, необходимая для выявления количества примесей природного происхождения (белок, пептиды, нуклеиновые кислоты), присутствующих в составе выделенной субстанции (стадия 2). Методика выделения должна позволять выделить максимальный спектр полисахаридов и минимизировать количество балластных веществ, извлекаемых из растительного сырья вместе с полисахаридами.

Этап 1. Выявление перспективных источников полисахаридов

1.1. Анализ данных литературы, выбор перспективных видов растений и растительного сырья

1.2. Выделение и характеристика полисахаридных комплексов из перспективных видов растительного сырья

1.3. Скрининговое исследование антибластомной активности полисахаридных комплексов и их влияния на эффективность и токсические эффекты циклофосфана на модели перевиваемой опухоли (карциномы легких Льюис)

1.4. Анализ полученных данных и выбор перспективных объектов, обладающих разносторонним эффектом, для дальнейшего изучения

Этап 2. Химико-фармакологическое изучение полисахаридных комплексов из перспективных видов растительного сырья

2.1. Разделение полисахаридного комплекса на индивидуальные компоненты и идентификация их химической структуры

2.1.1. Хроматографическое разделение ▼ —

2.1.2. Ультрафильтрация

2.1.3. Изучение мономерного состава

2.1.4. ЯМР-спектроскопия

2.4. Углубленное изучение фармакологической активности полисахаридного комплекса

1. В различных дозировках

2. При различных путях введения

3. На разных моделях опухолевого роста (карцинома легких Льюис, меланома В-16, карциносаркома Уокера)

4. На разных видах лабораторных животных

5. В сочетании с различными цитостатиками (циклофосфан, 5-фторурацил, таксол)

2.2. Выявление компонентов полисахаридного комплекса, ответственных за антибластомное действие (исследование фармакологической активности фракций)

2.3. Разработка методов стандартизации

1. Методика количественного определения действующих веществ

2. Параметры извлечения действующих веществ из растительного сырья

3. Валидация методик анализа

2.5. Выявление механизмов реализации антибластомного действия

2.5.1. Влияние на иммунную систему

1. Активность лимфоцитов

2. Популяции лимфоцитов

3. Состояние АПК

4. Баланс ТЫДИ2

2.5.2. Прямое влияние:

1. на клетки опухоли (in vitro)

2. на микроокружение опухоли

3.1. Изучение специфической активности

Этап 3. Разработка документации

3.2. Изучение общей| и специфической токсичности

3.3. Разработка нормативной документации на сырьё, активную| субстанцию и препарат

3.4. Разработка регламента производства

Рисунок 57. Методологическая схема поиска, оценки эффективности и разработки новых лекарственных средств комплексной терапии онкологических заболеваний на основе полисахаридов высших растений.

После подтверждения полисахаридной природы исследуемых субстанций проводится скрининговое исследование их противоопухолевой активности (стадия 3), самостоятельно и в сочетании с цитостатиком, на модели перевиваемой опухоли у лабораторных животных - карциномы легких Льюис (LLC).

Данная модель патологии показала себя как наиболее удобная для количественной оценки противоопухолевого и антиметастатического действия как в случае монотерапии исследуемым препаратом, так и при изучении его влияния на эффективность терапии известными цитостатиками. Далее, на основании результатов скринингового исследования, отбираются образцы с наиболее выраженной и разносторонней активностью (стадия 4). При этом учитывается выраженность влияния препарата как на рост первичного опухолевого узла, так и на процессы диссеминации опухоли. Не менее важным аспектом является протекторное влияние в отношении токсических эффектов, вызываемых применением цитостатика.

На втором этапе необходимо выявить, какие компоненты полисахаридного комплекса ответственны за противоопухолевый эффект, и идентифицировать их химическую структуру. Для этого, в первую очередь (стадия 1), проводится разделение полисахаридного комплекса на индивидуальные компоненты. Данные ориентированных литературных источников и собственный экспериментальный опыт позволили нам предложить оптимальный алгоритм разделения полисахаридных комплексов, который состоит из двух шагов: (а) разделение на колонке с ионообменным сорбентом (ионная форма сорбента подбирается эмпирически в зависимости от природы и физико-химических свойств разделяемых полисахаридов); (б) разделение фракций по молекулярной массе методом ультрафильтрации (или гельфильтрации). После выделения индивидуальных компонентов полисахаридного комплекса и доказательства их гомогенности (методом эксклюзионной ВЭЖХ) проводится изучение их химической структуры. Относительно полные данные о химической структуре полисахарида можно получить, используя комбинацию двух методов - хроматомасс-спектрометрического исследования полисахарида (после его гидролиза и дериватизации) и ЯМР-спектроскопии нативного полисахарида. Для выявления действующих веществ проводится сравнительное скрининговое исследование полученных фракций на модели 1ХС (стадия 2). Надо отметить, что при изучении химической структуры индивидуальных полисахаридов повышенное внимание стоит уделять выявлению структурных единиц тех фракций, которые проявляли наиболее выраженную противоопухолевую активность. Т.к. практически все полисахариды состоят из повторяющихся структурных элементов, биологическая активность разных полисахаридов может быть обусловлена одинаковыми (или близкими по структуре) фрагментами их молекулы, что должно быть учтено впоследствии, при разработке методов стандартизации активной фармацевтической субстанции (АФС) и растительного сырья (РС) для ее производства. Разработка методов стандартизации АФС и РС (стадия 3) является необходимым этапом исследования, т.к. дальнейшее углубленное изучение фармакологической активности и механизмов действия исследуемых полисахаридов должно непременно проводиться с использованием стандартизованных образцов. При разработке методики определения действующего вещества необходимо учитывать такие особенности полисахаридных препаратов, как схожесть химической структуры и физико-химических свойств действующих веществ и возможных примесей. Например, содержащийся в препарате крахмал или белковые примеси могут дать завышенные результаты количественного определения действующего полисахарида при неправильном выборе метода анализа. Поэтому методика количественного определения активного полисахарида должна обеспечивать достаточную селективность, учитывать присутствие возможных примесей и, наряду с этим, быть максимально доступной для выполнения в условиях стандартной аналитической лаборатории. Для количественного определения действующих полисахаридов в растительном сырье необходимо экспериментально установить оптимальные параметры их извлечения из анализируемого сырья. Особенностью полисахаридов, в данном случае, является длительное время экстракции, необходимое для набухания и растворения полисахаридов, и существенное влияние рН-среды и температуры экстракции. Оптимальные значения всех параметров должны быть максимально точно установлены для каждого конкретного вида сырья, т.к. в исследовании нами показано снижение удельного выхода действующих полисахаридов как при малых значениях исследуемых параметров, так и при слишком высоких их величинах. Однако, несмотря на это, процесс подготовки анализируемого раствора, при количественном определении полисахаридов в сырье, на наш взгляд, весьма упрощает использование ультрафильтрационных картриджей с установленным размером пор, которые позволяют приготовить рабочий раствор для анализа полисахаридов прямо из водного экстракта и избежать многоступенчатой очистки, как известно, зачастую увеличивающей ошибку методики.

На следующей стадии (стадия 4) химико-фармакологического исследования необходимо экспериментально установить оптимальные дозы и пути введения препарата и доказать воспроизводимость полученного в скриниговом исследовании эффекта на различных моделях опухолевого роста (в нашем случае мы использовали 3 модели - карцинома легких Льюис, меланома В-16, карциносаркома Уокера) на разных видах лабораторных животных, в сочетании с различными цитостатиками, отличающимися по механизмам действия (например, циклофосфан - относится к алкилирующим агентам, 5-фторурацил - антиметаболит, таксол - алкалоид растительного происхождения с оригинальным механизмом действия).

Исходя из анализа литературных данных, касающихся влияния полисахаридов на клетки опухоли и иммунную систему, мы выделили три возможных точки приложения биологической активности полисахаридов, с которыми может быть связана реализация их антибластомной активности: (1) прямое влияние на клетки опухоли, (2) влияние на микроокружение опухоли и (3) влияние на клетки иммунной системы. Последний аспект является наиболее разносторонне изученным, и существует большое количество экспериментальных данных, свидетельствующих, что коррекция функционального состояния клеток иммунной системы с помощью различных полисахаридов может существенно влиять на развитие опухолевого процесса и на результаты химиотерапии. Существенным является то, что под влиянием факторов, продуцируемых опухолью, происходит подавление функций иммунных клеток, и применение цитостатических препаратов, в дополнение к этому, приводит к резкому увеличению иммуносупрессии. Поэтому восстановление функций иммунной системы при опухолевом росте и, особенно, при терапии цитостатическими препаратами является одним из важнейших требований к препаратам для вспомогательной терапии опухолей. В связи с этим мы считаем, что целесообразно начинать изучение механизмов антибластомного действия полисахаридных препаратов (стадия 5) с теста Винна, который демонстрирует изменение функциональной иммунных клеток организма-носителя опухоли в условиях цитостатического лечения под влиянием исследуемого полисахарида. В случае положительных результатов теста Винна стоит определить, за счет каких популяций лимфоцитов реализуется этот эффект, и связан ли он с прямым пролиферативным влиянием исследуемого препарата на лимфоидные клетки. При этом необходимо учитывать, что пролиферативное действие может распространяться и на опухолевую ткань. Отсутствие активности исследуемого препарата в тесте Винна будет свидетельствовать о том, что его антибластомный эффект может быть связан с прямым ингибирующим действием на опухолевые клетки или реализовываться другим путем.

Известно, что влияние полисахаридов на лимфоциты может осуществляться, в основном, посредством антиген-презентирующих клеток -АПК (макрофаги, дендритные клетки), которые имеют ряд специфических рецепторов к полисахаридным структурам и, наряду с этим, обладают мощнейшим регуляторным влиянием в отношении иммунных клеток. При этом одни популяции макрофагов (М1) способны обеспечить массированную иммунологическую атаку опухоли, в то время как другие (М2), находясь в микроокружении опухоли, обеспечивают её «защиту» и изоляцию от литических факторов иммунной системы. Поэтому на следующем этапе логичным будет изучение влияния исследуемого полисахарида на функциональное состояние АПК. Наиболее информативным в данном случае, по нашему мнению, является определение направления активации макрофагов под действием изучаемого вещества (экспрессия ¡МОБ/аргиназы и продукция 1Ь-12 и 1Ь-10). В случае активации макрофагов по классическому пути (М1), следующим шагом должно стать изучение влияния полисахарида на направления развития и на протекание уже сформировавшегося иммунного ответа (баланс ТЬ1/ТЬ2). При отсутствии влияния полисахарида на макрофаги иммунотропный эффект может быть связан с прямым стимулирующим влиянием ПСК на клетки иммунной системы, например натуральные киллеры и нейтрофилы, которые также имеют на своей поверхности специфические «полисахаридные» рецепторы и могут, в «симбиозе» с полисахаридами, проявлять специфическую комплемент-опосредованную цитотоксичность, которая в отсутствии полисахаридов, при опухолевом росте, не проявляется.

Третий этап исследования - разработка регистрационного досье -регламентируется требованиями Росздравнадзора Минздравсоцразвития РФ к документации, предоставляемой для регистрации новых лекарственных средств. Он является фазой опытно-конструкторских разработок, проводимых параллельно с некоторыми стадиями второго этапа, и включает в себя: а) разработку нормативной документации в ряду сырьё - активная фармацевтическая субстанция - препарат; б) проведение испытаний на эффективность и безопасность нового лекарственного средства (отчеты о доклинических исследованиях препарата); в) разработку технологических регламентов (или технологических инструкций), содержащих подробное описание технологии производства активной фармацевтической субстанции и готовой лекарственной формы нового препарата; г) разработку инструкции на применение препарата.

Рекомендации по внедрению полученных результатов в медицинскую практику и образовательный процесс

На основании результатов проведённых исследований ПСК из цветков липы, побегов багульника болотного, корневищ аира болотного и листьев мать-и-мачехи на антибластомную и иммунотропную виды активности, перспективно рекомендовать указанные виды лекарственного растительного сырья для дальнейшего изучения как в качестве источников индивидуальных биологически активных полисахаридов, так и в виде сырья для производства галеновых препаратов и компонентов лекарственных сборов для назначения больным с раковыми заболеваниями, с целью повышения эффективности и снижения побочных эффектов цитостатической терапии, уменьшения рисков образования метастазов. На разработанные в ходе выполнения работы лекарственные средства были получены патенты: «Средство, на основе полисахаридов аира болотного, повышающее противоопухолевую и противометастатическую активность цитостатических препаратов». Патент № 2308285 от 14.12.2005 г.; «Средство, снижающее гематотоксичность цитостатических препаратов» Патент №2397774 от 17.06.2009 г.

Особый интерес, по нашему мнению, представляет полисахаридный комплекс из корневищ аира болотного. В его составе нами обнаружено 5 компонентов полисахаридной природы, из которых наибольшую противоопухолевую активность проявляло вещество PSF-103, представляющее собой а(1,2)-Ь-рамно-а(1,4)-0-галактопиранозилуронан с разветвлениями из остатков нейтральных Сахаров (ксилозы, галактозы и глюкозы) и молекулярной массой 370 кДа (содержание галактуроновой кислоты 84%). На основании изучения влияния ПСК аира на эффективность цитостатической терапии (специфическая фармакологическая активность) и исследования его безопастности (острая и хроническая токсичность, мутагенное действие) совместно с ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ и ООО «Инноком» было принято решение разработки на его основе лекарственного препарата «Полистан», предназначенного для вспомогательной терапии раковых заболеваний.

Результаты, полученные при выявлении механизмов антибластомного действия изучаемых полисахаридов, позволяют не только идентифицировать патогенетические мишени для их воздействия, но также дают представление о возможностях применения природных полисахаридов для терапии различных заболеваний, патогенез которых связан с нарушением функций иммунной системы. Так, на основании полученных результатов нами были запатентованы новые средства, обладающие противоаллергической и иммунотропной активностью (Патент №2311918 от 19.04.2006 г., Патент №2329821 от 14.03.2007 г., Патент №2337700 от 12.03.2007 г., Патент №2337699 от

14.03.2007 г., Патент №2371975 от 22.04.2008 г., Патент №2379047 от

16.06.2008 г.), которые использованы компанией ООО «Инноком» для разработки биологически активной добавки «Эрипал» (акт внедрения от 17.04.2008 г.) и компанией ООО «БиоСистемы» для разработки биологически активной добавки «Мультимет» (акт внедрения от 20.10.2009 г.).

Полученные результаты могут быть использованы для разработки новых лекарственных препаратов и биологически активных добавок иммунотропного и противоаллергического действия как на основе изолированных ПСК из исследуемых растений, так и нативного полисахаридсодержащего растительного сырья.

Решение проблемы стандартизации полисахаридсодержащего сырья привело к созданию методики количественного определения кислых полисахаридов в растительном сырье, которая была разработана применительно к корневищам аира болотного. Данная методика является простой в исполнении, не требует специального дорогостоящего оборудования и может быть адаптирована для количественного определения кислых полисахаридов в других видах лекарственного растительного сырья, в т.ч. фармакопейного полисахаридсодержащего сырья, стандартизация которого в настоящее время проводится гравиметрическим методом. С использованием данной методики был разработан проект Фармакопейной статьи предприятия «Аира болотного корневища», который включен в комплект документов для регистрации нового лекарственного препарата «Полистан» и будет использован производителем (ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ ) в качестве нормативной базы при приемке и оценке качества растительного сырья.

Перечень внедрений в медицинскую практику и образовательный процесс дополняется монографией Е.П. Зуевой, К.А. Лопатиной, Т.Г. Разиной и A.M. Гурьева «Полисахариды в онкологии», а также 3 учебно-методическими пособиями, используемыми в учебном процессе студентами, преподавателями и практическими работниками: «Роль поляризации антигенпрезентирующих клеток в механизмах развития иммунологической толерантности опухолей», «Методы количественного определения поли- и олигосахаридов», «Разработка новых противоопухолевых лекарственных средств на основе природных БАВ».

Предложенная методология, основанная на результатах данной диссертационной работы, может быть рекомендована как для организации учебно-лабораторного процесса, так и при выполнении квалификационных научных работ в качестве принципиальной схемы поиска и оценки эффективности полисахаридов высших растений в качестве средств вспомогательной терапии злокачественных новообразований.

Область применения, новизна и степень внедрения полученных результатов в медицинскую практику и образовательный процесс представлены в таблице 57.