Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Иммунофармакологические свойства полисахаридов полыни горькой, клевера лугового, березы повислой

На правах рукописи Л г

ЛИГАЧЁВА АНАСТАСИЯ АЛЕКСАНДРОВНА

ИММУНОФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПОЛИСАХАРИДОВ ПОЛЫНИ ГОРЬКОЙ, КЛЕВЕРА ЛУГОВОГО, БЕРЁЗЫ ПОВИСЛОЙ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 5 НОЯ 2010

Томск-2010

004613916

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук научно-исследовательском институте фармакологии СО РАМН

Научный руководитель:

доктор медицинских наук

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Бельский Юрий Павлович

Чердынцева Надежда Викторовна Иванова Светлана Александровна

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится «_»_2010 года в_часов на заседании

диссертационного совета Д 001.031.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской аю демии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН

Автореферат разослан « » октября 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук ¿г Амосова Е.Н

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Препараты, воздействующие на иммунную систему (иммунотропные препараты), находят широкое применение в профилактике и лечении первичных и вторичных иммунодефицитных состояний, инфекционных, аллергических, аутоиммунных, онкологических заболеваний и многих других. Существует несколько классификаций иммунотропных препаратов, каждая из которых отражает определенный исторический этап в развитии иммунологии. Наиболее ранняя классификация была основана на понятии иммунологической реактивности, которую необходимо усиливать для повышения резистентности организма к инфекционным и онкологическим заболеваниям (иммуностимуляторы) или подавлять при аллергических патологиях (иммунодепрессанты). Позже была выделена еще одна группа, получившая название «иммуномодуляторы» [Лесков В .И., 1999; Пинегин Б.В., 2000; Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 20006]. К ним относятся природные И синтетические соединения, которые угнетают или стимулируют иммунный ответ, усиливая один из иммунологических механизмов и подавляя другие [Бакуридзе А.Д. и др., 1993; Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 1996].

Существуют классификации иммуномодуляторов по их преимущественному влиянию на моноциты/макрофаги, В- и Т-лимфоциты, NK-клетки [Hadden J.W., 1993], а также препараты, воздействующие на неспецифические факторы защиты [Цигулёва О.А., 2005]; по генезу (экзогенные, эндогенные и химически чистые) [Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 1996]. В настоящее время выделяют 7 основных груш иммуномодулирующих препаратов: микробные, тимические, костномозговые, цитокины, нуклеиновые кислоты, растительные, синтетические [Хаитов Р.М., Пинегин Б .В., 2003].

В связи с представлением о дихотомии Т-хелперов в настоящее время термины «иммуностимулятор» и «иммуномодулятор» часто употребляют как синонимы. Препараты, регулирующие баланс Thl/Th2, позволили бы реализовать этиотропный подход в терапии дисфункций иммунной системы. Однако в настоящее время не существует иммуномодуляторов с доказанной селективной способностью изменять баланс Thl/Th2 клеток в желаемом направлении, разрешённых к медицинскому применению [Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 2000а].

В последние годы внимание многих исследователей привлекают работы по изучению иммунотропных свойств полисахаридов (ПС) растительного происхождения. Интерес к ним возник в связи с тем, что полисахариды, ранее считавшиеся инертными, оказались веществами с несомненной биологической активностью. Известно, что ПС растений обладают противовоспалительными [Moreno L. et al., 1998; Дроздова И.Л., Бубенчиков Р.А., 2005], антибактериальными [Johnston W.H. et al., 2001], антигипогликемическими [Sanchez de Medina F. et al., 1994] и противоопухолевыми свойствами [Ali A.M. et al., 1996], способностью изменять продукцию различных цитокинов, экспрессию молекул адгезии [Tzianabos А.О., 2000; Retiñí С. et al., 2001]. По сравнению с бактериальными и синтетическими ПС растений не имеют побочных эффектов и характеризуются низкой токсичностью, что даёт им значительные преимущества при разработке иммуномодулирующих, противоопухолевых и ранозаживляющих средств [Schepetkin I.A., Quinn

М.Т., 2006].

Известно, что ПС могут влиять на поляризацию лимфоцитов через соответствующую активацию антиген-презентирующих клеток [Almeida G.M. et al., 2001; Saito К. et al., 2003; Li W. et al., 2004; Stephen T.L. et al., 2005]. Показано, что ПС, выделенные из Angelica gigas Nakai, стимулировали продукцию NO и провоспа-лительных цитокинов макрофагами через активацию NF-KB/Rel, проявляли сильное ЛПС-миметическое действие [Jeon Y.J. et al., 1999]. ПС из Carthamus tinctorius L. стимулировали синтез различных цитокинов макрофагами, вызывали быструю деградацию 1кВа, стимулируя NF-кВ, повышали экспрессию TLR4 [Ando I. et al., 2002]. Водорастворимые ПС фиалки душистой (Viola odorata L.) и мальвы низкой (Malva pusilla Smith.) проявляли противовоспалительное действие, угнетая стадии экссудации и пролиферации, уменьшая проницаемость капилляров [Дроздова И.Л., Бубенчиков P.A., 2005]. Водорастворимая фракция полисахаридов из Glycyrrhiza uralensis Fish с молекулярной массой 10 кДа in vitro активировала макрофаги, повышая их способность к пиноцитозу, продукции оксида азота, ИЛ-1, ИЛ-6 и ИЛ-12 [Cheng A. et al., 2008].

В связи с изложенным выше, представлялось актуальным изучить иммуно-фармакологические свойства водорастворимых полисахаридов, полученных из фармакопейного сырья полыни горькой (Artemisia absinthium L.), клевера лугового (Trifolium pratense L.) и берёзы повислой (Betula verrucosa Ehrh.), сфокусировав внимание на их действии на приобретенный (адаптивный) иммунитет.

Цель исследования: изучить действие водорастворимых полисахаридов, выделенных из полыни горькой, клевера лугового и берёзы повислой, на Thl и Th2 типы иммунного ответа, а также оценить их способность влиять на функциональное состояние макрофагов.

Задачи исследования:

1. Оценить действие водорастворимых полисахаридов полыни горькой, клевера лугового и берёзы повислой на Thl-зависимый иммунный ответ (на реакцию гиперчувствительности замедленного типа, на антителообразующую функцию лимфоцитов).

2. Оценить влияние водорастворимых полисахаридов полыни горькой, клевера лугового и берёзы повислой на ТЬ2-зависимый иммунный ответ (на системную анафилаксию, на продукцию иммуноглобулинов классов Е и Gl).

3. Исследовать регуляторное действие ПС полыни горькой, клевера лугового и берёзы повислой на макрофагальные клетки (на продукцию оксида азота, ИЛ-12, ИЛ-10 и TNF-a, на активность аргиназы макрофагов).

4. Изучить роль NF-кВ, р38, PI3K, МЕК 1/2, сАМР в механизме действия комплекса водорастворимых полисахаридов клевера лугового, фракций полисахаридов клевера лугового и берёзы повислой на макрофаги.

Научная новизна. Впервые изучены иммунофармакологические свойства водорастворимых полисахаридов, выделенных из фармакопейного сырья полыни, клевера и берёзы. Экспериментально установлено, что эти вещества стимулируют Thl тип иммунного ответа, действуя как на его клеточное звено, так и на гуморальное. Полисахариды полыни и клевера при курсовом введении животным подавляли Th2 тип иммунного ответа, ослабляя системную анафилаксию за счет ин-

гибирования выработки иммуноглобулинов классов Е и G1. В основе иммуномо-дулирующего действия исследуемых полисахаридов полыни и клевера лежит их способность классически активировать макрофаги, что проявляется в усилении продукции оксида азота, TNF-a, ингибировашш активности аргиназы. Наибольшей активностью обладают полисахариды клевера, так как они многократно усиливали продукцию ИЛ-12 перитонеальными макрофагами мыши. Впервые исследовано участие молекул сигнальной трансдукции (NF-kB, р38, PI3K, МЕК1/2 и сАМР) в NO-стимулирующем действии полисахаридов. Выявлено, что полисахариды активируют транскрипционный фактор NF-kB, в позитивной регуляции продукции оксида азота участвуют киназы р38 и PI3, в негативной - сАМР.

Практическое значение работы. Итогом данной работы является получение сведений об иммунофармакологических свойствах новых веществ - водорастворимых полисахаридов Польши, клевера и берёзы: влияние на иммунную систему in vivo, действие на лимфоциты и макрофаги in vitro, механизмы активационного воздействия на пострецепторном уровне. Полученные результаты позволяют обосновать использование растительных полисахаридов для коррекции нарушений иммунной системы, связанных с дисбалансом Thl/Th2. Значительным с точки зрения дальнейшей разработки лекарственного средства с иммуномодулирующей активностью является выявление вещества, способного многократно усиливать продукцию ИЛ-12 (полисахариды клевера).

Апробация работы. Основные результаты доложены и обсуждены на научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Сибири» (Томск, сентябрь 2008 г.), на «IV Съезде физиологов Урала» (Екатеринбург, сентябрь 2009), на XVIII международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Гурзуф, май-июнь 2010 г.).

Публикация результатов исследования. По теме диссертационной работы опубликовано 9 научных статей, из них 7 - в журналах и изданиях, рекомендуемых ВАК; по результатам проведённых исследований получен патент на изобретение.

Объём и структура работы. Диссертация изложена на 161 странице машинописного текста и состоит из введения, 4-х глав, выводов и списка литературы. Работа проиллюстрирована 2 рисунками и 30 таблицами. Библиографический указатель включает 374 источника, в том числе 135 отечественных и 239 иностранных.

МАТЕРИАЛ И МЕТО ДЫ

Животные. Эксперименты проведены на 527 животных: мышах линий BALB/c, C57BL/6J и аутбредных крысах. Использованы животные обоего пола в возрасте 8-12 недель, полученные из питомника НИИ фармакологии СО РАМН (1 категории согласно сертификату). Животные содержались в неполной барьерной системе при световом режиме 12:12 ч на стандартной диете (стерилизованный гранулированный корм), получали кипяченую питьевую воду, подкисленную соляной кислотой до рН 4-4,5.

Получение полисахаридов. Комплексы водорастворимых полисахаридов были выделены на кафедре химии СибГМУ по стандартной методике [Методы исследования углеводов, 1975] из фармакопейного растительного сырья: из надземной части полыни горькой (Artemisia absinthium L.), из надземной части клевера лугового (Trifolium pratense L.), из листьев берёзы повислой (Betula verrucosa Ehrh.).

Стандартизация и характеристика образцов полисахаридов. Полученные комплексы водорастворимых полисахаридов были стандартизованы по содержанию углеводов спектрофотометрическим методом [Dubois М et al., 1956], содержанию белка методом Брэдфорда [Bradford М.М., 1976] и нуклеиновых кислот [Спирин A.C., 1958]. Выход ПС (% от массы воздушно-сухого сырья) составил: 2,77±1,39 (ПС из клевера лугового), 1,07±0,19 (ПС полыни горькой), 2,52±0,66 (ПС из берёзы повислой). Содержание углеводов (%) в исследуемых образцах было равным: 98,4±1,05 (ПС из клевера лугового), 99,0±1,06 (ПС из полыни горькой), 98,6±4,09 (ПС из берёзы повислой). Примеси белка и нуклеиновых кислот (%) в них были незначительными: 0,15±0,02 и 0,042±0,010 (ПС из клевера лугового), 0,61±0,11 и 0,05910,002 (ПС из полыни горькой), 0,89±0,04 и 0,030±0,006 (ПС из берёзы повислой).

Компонентный состав и молекулярно-массовое распределение исследуемых образцов определялись методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на жидкостном хроматографе Agilent 1100 со спектрофотометрическим детектором (детекция при длине волны 190 нм), разделение проводилось на эксклюзионной колонке TSK-gel GMPXL 300x7.8mm («Supelco»), подвижная фаза - вода, 1,0 мл/мин. Молекулярная масса полисахаридов, входящих в состав исследуемых образцов, определялась по времени удерживания в соответствии с калибровочными значениями, определенными по стандартным образцам декстранов с молекулярной массой 15-20 кДа, 40 кДа, 60-90 кДа, 110 кДа, 250 кДа и 500 кДа («Sigma-Aldrich», Великобритания). На спектре ВЭЖХ образцов, полученных из полыни горькой, присутствует 2 пика, соответствующих молекулярной массе 510 и 305 кДа, из клевера лугового - 2 пика, соответствующих 700 и 320 кДа, из берёзы повислой - 3 пика, соответствующих 680, 260 и 170 кДа.

Получение фракций полисахаридов. Комплексы водорастворимых ПС клевера лугового были разделены на кафедре химии СибГМУ методом фракционированного осаждения гидроксидом бария по уровню pH и молекулярно-массовому распределению на нейтральные ПС (PS-62-N300; молекулярная масса - более 300 кДа) и кислые ПС (PS-62-AclOO; молекулярная масса - от 100 до 300 кДа). Из комплексов водорастворимых ПС берёзы повислой в институте физиологии Коми НЦ УрО РАН (г. Сыктывкар) методом ионообменной хроматографии были выделены фракции PS-B1-AG и PS-B2-RG. Обе фракции ПС берёзы представляют собой пектины, главная цепь которых построена из остатков галактуро-новой кислоты, соединенных 1-4-гликозидной связью. Боковые цепи фракции PS-B1-AG построены из остатков арабинозы (3%) и галактозы (6%), а боковые цепи фракции PS-B2-RG - из рамнозы (32%) и галактозы (7%).

Выделение перитонеальных макрофагов. Выделение макрофагов осуществляли по модифицированной нами методике [Гольдберг Е.Д. и др., 1992]. Живот-

ных забивали дислокацией шейного отдела позвоночника, брюшную полость промывали ледяным изотоническим раствором хлорида натрия (ФР), клетки осаждали, ресуспендировали в культуральной среде, оценивали их жизнеспособность в тесте с 0,1% трипановым синим, помещали по 1,5-2,0х106/мл в пластиковые чашки Петри, культивировали 2 ч (в атмосфере 5% С02 и абсолютной влажности) в среде, содержащей 10% ЭТС, после чего собирали только прилипшие к пластику клетки и оценивали их жизнеспособность. В экспериментах использовали суспензии, содержащие не менее 95% жизнеспособных клеток.

Условия культивирования. Культуральная среда была следующего состава: RPMI 1640 («Sigma», США) с добавлением 10% ЭТС («Hyclone», Великобритания), 20 мМ HEPES («Sigma», США), 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола («Sigma», США), 50 мкг/мл гентамицина («Борисовский завод медицинских препаратов», Беларусь) и 2 мМ L-глютамина («Sigma», США). Культивирование проводили при 37°С в атмосфере с 5% ССК и абсолютной влажности.

Влияние полисахаридов на функциональную активность макрофагов. Макрофаги (2,5-3,0х10б клеток/мл), полученные, как описано выше, культивировали в присутствии 10 и 20 мкг/мл ПС, 1 мкг/мл ЛПС (серотип Oll 1:В4, «Sigma», США), 5 и 10 мкг/мл мурамилдипептида - МДП (Ы-ацетилмурамнл-Ь-алашш-Б-изоглютамин, «Calbiochem», Германия). Через 24 и 48 ч от начала культивирования собирали из лунок надосадок и замеряли в нём количество нитритов и концентрацию цитокинов, а в клетках определяли активность аргиназы.

Исследование полисахаридов на наличие примесей эндотоксина. Для определения возможной примеси эндотоксина в исследуемых образцах полисахаридов в 96-луночный планшет помещали исследуемые образцы ПС и полимиксин В (10 мкг/мл, «InvivoGen», США), культивировали при 37°С в атмосфере с 5% С02 и абсолютной влажности в течение 1 часа. Затем в эти же лунки добавляли суспензию макрофагов (2,5-3,0х106 клеток/мл) и культивировали 48 ч, собирали из лунок надосадок и определяли концентрацию в нём нитритов. В качестве контроля использовали ЛПС.

Определение продукции оксида азота. Продукцию NO оценивали по содержанию нитритов в супернатантах при помощи реактива Грейса [Green L.C. et al., 1982]. Реактив (0,1 мл) смешивали с эквивалентным объемом надосадка, абсорбцию замеряли с использованием спектрофотометра при длине волны 540 нм. Концентрацию нитритов определяли по калибровочной кривой, построенной с использованием стандартных растворов нитрита натрия.

Определение активности аргиназы. Активность аргиназы определяли по модифицированной нами методике [Munder М. et al., 1998]. Для этого макрофаги-помещали в 96-луночные плоскододонные планшеты, через 24 и 48 ч от начала культивирования удаляли надосадок из лунок, клетки лизировали 0,1 мл 0,1% раствором тритона Х-100 («Sigma», США), инкубировали при постоянном встряхивании 10 мин при комнатной температуре. Затем для активации аргиназы в лунки вносили 0,1 мл 25 мМ раствора Трис-HCl («Sigma», США) и 0,05 мл 10 мМ раствора хлорида марганца («Реахим», Россия) и инкубировали при 56°С 10 мин. После этого к 0,05 мл лизата добавляли 0,05 мл 0,5 М раствора L-аргинина («Sigma», США) с pH 9,7 и инкубировали при 37°С 60 мин. Реакцию останавли-

вали добавлением 0,4 мл смеси концентрированной серной и фосфорной кислоты с водой (в соотношении 1/3/7 по объему). Концентрацию мочевины в полученном растворе определяли с помощью тест-системы «Мочевина-450» («Био-ЛА-Тест», Чехия) согласно приложенному протоколу с использованием спектрофотометра (540 нм). За 1 единицу активности фермента принимали количество аргиназы, катализирующей образование 1 мкМ мочевины в минуту.

Получение супернатантов перитонеальных макрофагов для определения продукции цитокинов. Макрофаги помещали в 96-луночный планшет (2,5-3,0х106 клеток/мл), продукцию цитокинов стимулировали добавлением ЛПС (1 мкг/мл) и вносили изучаемые растительные ПС (20 мкг/мл). Через 24 ч собирали бесклеточный супернатант, разливали на аликвоты и хранили при -20°С.

Определение количества ИЛ-12. ИЛ-10. Количественное определение цитокинов в исследуемых супернатантах осуществляли твердофазным иммунофер-ментным методом при помощи тест-систем («R&D Systems», США) согласно прилагаемым протоколам.

Изучение роли р38 MAP киназы, PI3K. МЕК 1/2, NF-кВ, сАМР в активации макрофагов. Были использованы следующие ингибиторы: SB203580 - ингибитор р38 MAP киназы («InvivoGen», США), LY294002 - ингибитор PI3 киназы («InvivoGen», США), ауротиомалат - ингибитор NF-кВ («Calbiochem», Германия), PD98059 - ингибитор МЕК 1/2 («InvivoGen», США), 2',5'-дидеоксиаденозин - ингибитор сАМР («Calbiochem», Германия). Макрофаги культивировали с исследуемыми веществами в присутствии или отсутствии ингибиторов в указанных выше условиях 48 ч, после чего оценивали продукцию макрофагами оксида азота и активность их аргиназы.

Выделение мононуклеаров из периферической крови человека. Выделение мононуклеаров осуществляли согласно инструкции, прилагаемой к жидкости для сепарации клеток «Histopaque-1077» («Sigma-Aldrich», Великобритания) с плотностью 1,077. Для этого реактив (4 мл) помещали в пробирки, затем осторожно наслаивали цельную кровь (4 мл), предварительно проинкубированную в термостате при 37°С в течение 1 часа с добавлением гепарина (10 ЕД/мл). После 15-минутного центрифугирования при 400 g собирали клетки, сформировавшие кольцо в растворе. Полученные клетки трижды отмывали холодным ФР, ресус-пендировали в культуральной среде и оценивали их жизнеспособность.

Получение супернатантов мононуклеаров периферической крови человека для определения продукции цитокинов. Мононуклеары помещали в 96-луночный планшет (1х106 клеток/мл) и вносили изучаемые ПС (20 мкг/мл). В качестве контроля использовали ЛПС (1 мкг/мл). Через 24 ч собирали бесклеточный супернатант, разливали его на аликвоты и хранили при -20°С.

Определение количества TNF-q. Количественное определение цитокина в исследуемых супернатантах мононуклеаров осуществляли твердофазным имму-ноферментным методом при помощи тест-системы («Вектор-Бэст») согласно прилагаемому протоколу.

Оценка пролиферации лимфоцитов колориметрическим методом [Mosmann Т.. 1983]. Спленоциты интакгпых мышей культивировали 4 суток в круглодонных 96-луночных планшетах (2-5x104 клеток/лунку) в указанных выше условиях в

присутствии 20 мкг/мл ПС, 1 мкг/мл ЛПС (серотип 0111:В4, «Sigma», США), 5 мкг/мл МДП. За 4 ч до окончания культивирования в лунки вносили 3-[4,5-dimethylthiazol-2-y]]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (МТТ, «Sigma», США), концентрация которого в лунках составляла 200 мкг/мл. Затем из лунок удаляли на-досадок, а осадок растворяли диметилсульфоксидом (димексид, «Татхимфарм-препараты»). Абсорбцию полученных растворов замеряли при помощи многоканального спектрофотометра («Titertek», Финляндия) при длине волны 540 нм.

Иммунизация эритроцитами барана ОБ) [Вельская Н.В. и др.. 20051. Суспензию ЭБ («ЭКОлаб», Россия) предварительно трижды отмывали ФР, подсчитывали их количество и в объеме 0,2 мл внутрибрюшинно вводили по 5x106 - для определении числа АОК и титра антител, по lx 108 - при проведении реакции гиперчувствительности замедленного типа. Контрольным животным таким же образом вводили 0,2 мл ФР.

Реакция гиперчу вствительности замедленного типа (ГЗТ) [Belska N.V. et al.. 20101. На 5-е сутки после иммунизации ЭБ животным проводили разрешающую инъекцию ЭБ в подушечку задней лапы - «опытная лапа» (108 ЭБ в 0,02 мл ФР). В контрлатеральную лапу вводили 0,02 мл стерильного ФР («контрольная лапа»). Местную воспалительную реакцию оценивали через 24 ч. Животных забивали, обе лапки отрезали по выступу кости ниже сочленения мало- и большеберцовой кости и выше пяточного сустава. Величину реакции оценивали по разнице массы опытной (Мо) и контрольной (Мк) лап и выражали в мг.

Определение антителообразуюших клеток (АОК) в селезенке методом Ерне (Terne N.K.. Nordin А.А.. 1963]. Для этого животных забивали на 5-е и 7-е сутки после иммунизации ЭБ, лимфоциты получали гомогенизацией селезенок в стеклянном гомогенизаторе, после чего клеточную взвесь фильтровали через 4-слойный капрон, трижды промывали холодным ФР, ресуспендировали в 4 мл среды 199 и подсчитывали количество жизнеспособных клеток. В пробирки, предварительно нагретые до 49-53°С, вносили 0,9 мл среды культивирования (среда 199, 0,7% агар, «Difco», США), 0,2 мл 20%-ой взвеси эритроцитов барана, 0,2 мл взвеси спленоцитов и 0,1 мл комплемента (ФГУП «НПО» «Микроген»», Россия). После ресуспендирования данной смесью заполняли камеры Горяева, помещали их во влажную камеру, инкубировали 2 ч при 37°С, затем подсчитывали зоны гемолиза при помощи светового микроскопа.

Определение титра антител в сыворотке крови в реакции агглютинации ГХаитов P.M. и др., 1999]. Для этого на 5-е и 7-е сутки после иммунизации животных забивали, вскрывали грудную полость и забирали кровь из сердца, после чего клеточные элементы осаждали центрифугированием. Полученную сыворотку рас-титровывали в 96-луночном планшете с шагом Vi, добавляли ЭБ, инкубировали при 37°С 2 ч и учитывали реакцию. За титр принимали то последнее разведение исследуемой сыворотки, при котором еще наблюдалась агглютинация.

Иммунизация овальбумином (OVA) ["Oshiba A. et al., 1997]. Мышам вводили под кожу бедра OVA (100 мкг/мышь) с гидроокисью алюминия (5 мг/мышь, оба «Sigma») в качестве адьюванта в 0,1 мл ФР. При двукратных иммунизациях интервал между инъекциями составлял 14 суток. Мышам контрольной группы вводили по 0,1 мл ФР.

Реакция общей анафилаксии ("гиперчувствительность немедленного типа) ГБельская Н.В. и др., 2010]. Данный тип реакции моделировали, используя иммунизированных OVA мышей линии BALB/c. В ответ на введение разрешающей дозы OVA (по 10 мкг в 0,1 мл ФР в ретроорбитальный синус) у животных развивалась анафилактическая реакция.

Определения содержания IgGl и IgE иммуноферментным методом. Для определения иммуноглобулинов в сыворотке крови животных забивали цервикаль-ной дислокацией через 7 суток после второго введения овальбумина и на 10 сутки после однократной иммунизации, забирали кровь из сердца, получали сыворотку, разливали на аликвоты и хранили при -20°С. Содержание иммуноглобулинов в сыворотках измеряли иммуноферментным методом с использованием соответствующих тест систем («Immunology Consultants Lab.», США) согласно прилагаемому протоколу.

Непрямая реакция дегрануляции тучных клеток [Алексеева О.Г.. Дуева JI.A.. 1978: Радунская С.Ф.. 19821. Через 7 суток после второго введения овальбумина животных забивали, забирали кровь из сердца, получали сыворотку, разливали на аликвоты и хранили при -20°С. Для получения тучных клеток крысам после забивки в брюшную полость вводили 5-8 мл подогретого до 37°С ФР и собирали экссудат, стекающий с петель кишечника в смоченную гепарином пробирку через надрез брюшной стенки. На обезжиренные и предварительно окрашенные 0,3% спиртовым раствором нейтрального красного предметные стёкла наносили по 0,03 мл взвеси тучных клеток, сыворотки подопытного животного и специфического аллергена (OVA). Препараты инкубировали в термостате при 37°С в течение 15 мин, затем при помощи светового микроскопа подсчитывали количество клеток разной степени дегрануляции (всего 100 клеток в каждом препарате). Показатель дегрануляции тучных клеток (ПДТК) подсчитывали по формуле:

TT ЛТК- - 1а+2б+3с+4д

пдтк - 100

где а, б, с, д - количество дегранулированных клеток с соответствующей степенью дегрануляции (слабо выраженная, умеренная, резкая и степень полной дегрануляции клеток).

Схемы введения водорастворимых полисахаридов. Оптимальная суточная доза ПС (10 мг/кг массы тела ) и схема введения ПС. была подобрана в предварительных экспериментах. В качестве положительного контроля в экспериментах in vivo использовали ликопид в дозе 2 и 10 мг/кг. Препараты вводили внутрибрю-шинно в 0,1 мл ФР.

Для изучения влияния ПС на иммунный ответ, индуцированный ЭБ, мышам вводили раствор ПС внутрибрюшшшо 1 раз в сутки, начиная за 5 дней до иммунизации, всего 10 дней. Спустя 5 дней после иммунизации забирали материал для исследования. Мышам контрольной группы вводили то же количество ФР.

Введение ПС на фоне иммунизации OVA проводили по 2 схемам. При однократной иммунизации исследуемые вещества вводили 10 раз, начиная за 5 дней до инъекции OVA, а при двукратной - животные получали ПС в течение 5 дней

после каждого введения OVA и за 5 дней до первого. Через 5 дней после иммунизации забирали материал для исследования.

Статистическая обработка результатов. Полученные данные обрабатывали статистически с помощью программного обеспечения Statistics 6.0. Для всех выборок проверена гипотеза нормальности распределения по величине коэффициента асимметрии и коэффициента эксцесса [Гмурман В.Е., 2001]. Для каждой выборки вычисляли среднее значение величины признака X и ошибку средней величины т. Проверка гипотезы о равенстве средних проводилась с использованием t-критерия Стьюдента. Различия показателей считали достоверными при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние ПС полыни, клевера и берёзы на Thl тип иммунного ответа. Данный тип иммунного ответа моделировали иммунизацией мышей линии BALB/c ЭБ. По данным ряда авторов [Li L. et al., 1994; Yokozeki H. et al., 2000], а также согласно нашим наблюдениям [Вельская Н.В. и др., 2005], использованная схема иммунизации приводит к развитию Thl-зависимого иммунного ответа. Влияние на иммунный ответ было оценено по изменению реакции ГЗТ (индикаторная Thl реакция) [Mosmann T.R. et al., 1986; Mosmann T.R., Coffman R.L., 1989], а также по количеству АОК и продуцируемых ими гемагглютининов. В качестве препарата сравнения использован ликопид. Все изучаемые вещества стимулировали реакцию ГЗТ (табл. 1): в 1,6, в 1,7, в 2 и 2,2 раза (ПС Польши, клевера, берёзы и ликопид, соответственно).

Таблица 1

Влияние растительных полисахаридов и ликопида при курсовом введении мышам линии ВАЬВ/с на ТЫ-зависимый иммунный ответ, индуцированный эритроцитами барана (Х±т)

Исследуемое вещество Группа Величина реакции ГЗТ, мг Число АОК, 107селезенку Титр гемагтлютишшов, log2

ПС полыни контроль опыт 14,7 + 2,4 23,7 + 2,2* 23,6 ±7,9 80.0+11,2* 10,3 ± 1,3 9.0 + 0,7

ПС клевера контроль опыт 14,7 ± 2,4 24,4 ± 2,5* 57,2 ±15,3 125,9 ± 19,3* 10,3 ± 1,3 7,7 ± 1,4

ПС берёзы контроль опыт 11,8+1,9 23.7 + 3,8* 36,7 + 6,0 82,9 ± 7,6* 5,5 ±0,5 7,7 ± 0,4*

Ликопид (10 мг/кг) контроль опыт - 36,7 + 6,0 66,9 ±9,3* 5,5 ± 0,5 6,0 ± 0,8

Ликопид (2 мг/кг) контроль опыт 16,7 + 5,3 36,4 + 4,0* 36,7 + 6,0 72,9 ± 9,7* 5,5 + 0,5 8,5 ± 0,5*

Примечания: * - различия показателей достоверны, р<0,05, п=10.

Курсовое введение исследуемых веществ приводило к достоверному увеличению числа АОК (табл. 1): у мышей, получавших ПС полыни, в 3,4 раза, ПС клевера- в 2,2 раза, ПС березы - в 2,8 раза, ликопид - в 1,8-2 раза. Усиление синтеза гемагглютининов (1цМ и вырабатываемых В-лимфоцитами в ответ на ЭБ, наблюдалось у животных (табл. 1), получавших ПС берёзы (в 1,4 раза) или лико-

пид (в 1,5 раза). ПС клевера и полыни не влияли на количество синтезируемых антител. Эти данные согласуются с результатами некоторых авторов [Бакуридзе А.Д. и др., 1993; Сычев И.А., 2008; Шканта А. ег а1., 2002].

Кроме того, было оценено влияние ПС на пролиферацию лимфоцитов селезенки интактных мышей (прямое митогенное действие) и на пролиферацию В-лимфоцито в, стимулированных В-клеточным митогеном - ЛПС (костимуляторное действие), так как не все ПС, вызывающие увеличение числа АОК, усиливали титр гемагглютининов. В качестве вещества сравнения был использован мура-милдипептид (МДП), являющийся фармакологической субстанцией ликопида. Исследование показало, что ПС полыни, клевера и берёзы не оказывали митоген-ного действия на В-лимфоциты и не обладали костимуляторными свойствами. Из полученных результатов можно заключить, что водорастворимые ПС стимулируют ТЫ-зависимый иммунный ответ и не оказывают прямого активирующего действия на В-лимфоциты.

Действие ПС полыни, клевера и берёзы на ТЬ2-зависимый иммунный ответ. Известно, что введение ОУА вызывает преимущественно ТЬ2 иммунный ответ [ОвЫЬа А. е1 а1„ 1997; Бепйег К.Ь. е1 а1., 2001; Яе^ш С. & а1., 2001]. Ранее проведённые эксперименты подтвердили, что выбранная нами схема иммунизации приводит к развитию именно этого типа иммунного ответа [Вельская Н.В. и др., 2005]. Влияние ПС полыни, клевера и берёзы на ТЬ2 иммунный ответ оценено по анафилактическому шоку двукратно иммунизированных ОУА мышей линии ВАЬВ/с и по содержанию и ^01 в сыворотке крови однократно (1^) и двукратно 0£О1) иммунизированных ОУА животных. В качестве положительного контроля использовали ликопид. Проведённые эксперименты показали (табл. 2), что ликопид, ПС полыни и ПС клевера снижали летальность мышей в результате анафилактического шока: ликопид - на 10%, ПС полыни - на 12,5%, ПС клевера -на 40%.

Известно, что 1§Е и ТцСг! являются ключевым звеном в реализации анафилактических реакций и важными показателями ТЬ2-зависимого иммунного ответа [ОеЬШаг К. е1 а1., 1999]. Курс инъекций ПС однократно иммунизированным

Таблица 2

Влияние растительных полисахаридов и ликопида при курсовом введешш мышам линии ВАЬВ/с па ТЪ2-зависимый иммунный ответ, индуцированный овальбумином

Исследуемое вещество Группа Летальность (анафилактический шок), % Содержание мкг/мл Содержание ^01, мг/мл

ПС полыни контроль опыт 80 70 4,90+0,64 2,06+0,36* 3,99 ± 0,34 2,52 + 0,42*

ПС клевера контроль опыт 80 50 4,90+0,64 2,10+0,23* 3,99 ± 0,34 1,85 + 0,34*

ПС берёзы контроль опыт 60 80 - -

Ликопид (2 мг/кг) контроль опыт 100 90 4,90+0,64 4,36+1,11 4,22 + 0,28 2,38 ±0,32*

Примечания: * - различия с контролем достоверны, р<0,05, п=10 (анафилактический шок) и п-6

OVA животным приводил к снижению содержания IgE в сыворотке крови (табл. 2): в 2,4 раза (ПС полыни) и в 2,3 раза (ПС клевера). Ликопид не влиял на данный показатель. У дважды иммунизированных животных курсовое введение всех исследуемых веществ вызывало понижение концентрации IgGl (табл. 2): в 1,8 раза (ликопид), в 1,6 раза (ПС полыни) и в 2,2 раза (ПС клевера). Представленные результаты показывают, что водорастворимые ПС полыни и клевера обладают способностью ингибировать продукцию В-лимфоцитами IgE и IgGl и, как следствие этого, снижать тяжесть анафилактического шока.

Курсовое введение ПС берёзы, напротив, увеличивало летальность в результате анафилактического шока на 33%. Мы предположили, что данный образец содержит в своем составе компонент, который вызывает поляризацию второго типа и, тем самым, усиливает тяжесть анафилактического шока. Для проверки этого предположения мы исследовали способность сыворотки мышей, получавших ПС берёзы и иммунизированных OVA, вызывать дегрануляцию тучных клеток интакгных животных. Эксперименты показали, что сыворотка таких животных в 3 раза повышала показатель дегрануляции тучных клеток в присутствии овальбумина, и в 4 раза - в присутствии ПС берёзы, что свидетельствует о наличии в ней аллерген-специфических антител к компонентам этого образца. Сыворотка животных, подвергшихся только иммунизации овальбумином, не давала повышения показателя дегрануляции в присутствии ПС берёзы, реакция развивалась только на добавление к сыворотке овальбумина. Таким образом, повышение летальности в результате анафилактического шока в группе мышей, получавших ПС берёзы, является, вероятно, следствием того, что у этих животных развивалось одновременно два ТЬ2-зависимых ответа (на OVA и ПС берёзы), результатом чего явилось потенцирование ответа на OVA.

Влияние in vitro ПС полыни, клевера и берёзы на продукцию оксида азота, воспалительных и противовоспалительных цитокинов и активность аргиназы макрофагов. В настоящее время активированные макрофаги выделяют в функционально 2 противоположные группы - классически (Ml) или альтернативно активированные (М2). Ml способствуют развитию воспаления с деструкцией как микроорганизмов, так и собственных клеток, заражённых патогеном или трансформированных; способствуют установлению и поддержанию Thl типа иммунного ответа [Goerdt S., Orfanos С.Е., 1999; Ehrt S. et al., 2001; Mosser D.M., 2003; Mantovani A., 2006]. M2, напротив, противодействуют воспалению, способствуют тканевой репарации и ремоделированию, атопическим процессам, резистентности к гельминтозам и опухолевой прогрессии [Mantovani A. et al., 2004; Kreider Т. et al., 2007]. Известно, что главной отличительной чертой активированных тем или иным путем макрофагов является состояние метаболизма аргинина: у Ml макрофагов он утилизируется через индуцибельную NO-синтазу с образованием оксида азота, в то время как у М2 клеток - через аргиназу с образованием полиаминов и орнитина [Munder М. et al., 1998; Kreider Т. et al., 2007].

Известно, что антиген-презентирующие клетки (прежде всего клетки моно-цитарно-макрофагального ряда), обеспечивают направление поляризации Т-хелперов и ее поддержание [Macatonia S.E. et al., 1995; Mills C.D. et al., 2000]. Показано, что растительные ПС могут обладать иммуномодуляторными свойствами,

которые проявляются вследствие взаимодействия ПС с различными рецепторами макрофага [Schepetkin I.A., Quinn М.Т., 2006]. В связи с этим было изучено действие водорастворимых ПС на продукцию оксида азота и аргиназную активность перитонеальных макрофагов мыши, на секрецию ими ИЛ-12 и ИЛ-10, а также оценено влияние ПС на выработку TNF-a мононуклеарами периферической крови человека. В ряде экспериментов в качестве сравнения был использован стандартный активатор макрофагов - ЛПС, а также МДП. В предварительных экспериментах in vitro было установлено, что оптимальными концентрациями ПС являются 10 и 20 мкг/мл, ЛПС - 1 мкг/мл, МДП - 5 и 10 мкг/мл. Следует отметить, что примеси эндотоксина в изученных образцах нет, о чём свидетельствует отсутствие снижения продукции NO при добавлении в культуры клеток полимиксина В.

В результате культивирования макрофагов с растительными ПС в течение 24 ч и 48 ч было обнаружено (табл. 3), что ПС полыни и клевера стимулировали продукцию оксида азота, в то время как ПС берёзы не влияли на данный показатель. МДП также стимулировал выработку NO.

Таблица 3

Влияние различных концентраций растительных полисахаридов и мурамилдипептида на продукцию оксида азота перитонеалъными макрофагами мышей линии BALB/c (X+m)

Исследуемое вещество Время куль-тиви-рова-ния (ч) Концентрация нитритов (без ЛПС), мкМ Концентрация шгтригов (в присутствии ЛПС), мкМ

контроль 10 мкг/мл ПС 20 мкг/мл IIC контроль 10 мкг/мл ПС 20 мкг/мл ПС

ПС полыни 24 2,6±0,5 4,0±0,2* 4,0-L0,j 13,1±0,7 11,6±1,9 11,7±1,0

48 5,0±0,4 6,7=10,2* 6,7±0,6 27,8±0,9 24,8±0,9 26,2±0,6

ПС клевера 24 2,6±0,5 5,5±0,2* 6,6±0,2* 13,1±0,7 10,4±0,7 10,2±1,0

48 5,0±0,4 9,5±0,1* 10,9±0,4* 27,8±0,9 25,0±0,7 24,0±0,6*

ПС берёзы 24 24,0±1,1 23,2±1,4 26,2±0,8 27.0±0,7 24,9±1,9 26,2±1,3

48 46,5±1,7 46,6±1,6 48,2±2,0 53,9±1,8 52,3±1,1 49,3±2,1

МДП 24 2,4±0,1 5 мкг/мл 10 мкг/мл 4,6±0,3 5 мкг/мл 10 мкг/мл

5,1±1.0* 4,4±0,2* 6,6±0,5* 7,0±0,5*

48 2,7±0,2 5,7±0,6* 4,7±0,5* 8,5±0,5 12,6±0,3* 12,2±1,4

Примечания: * - различия показателя с контролем достоверны, р<0,05, п=6.

ПС полыни и берёзы не оказывали влияния на уровень продукции оксида азота ЛПС-стимулированными макрофагами. ПС клевера к концу 48-часового культивирования подавляли эту продукцию, а МДП, напротив, её увеличивал (табл. 3). Известно, что ЛПС Е. соИ является агонистом одного из паттерн-распознающих рецепторов макрофага - Т1Л14 [РоИогак А. й а1., 1998; НоэЫпо К. е1 а1., 1999]. Полученные нами результаты о наличии влияния ПС клевера и МДП на выработку N0 макрофагами в присутствии ЛПС могут косвенно свидетельствовать о том, что данные вещества взаимодействуют с клеткой не через ПЛ14, либо не только через ТЪК4, а задействуют кроме него ещё какой-либо рецептор. Причем в случае ПС клевера, которые ингибируют секрецию N0 к концу 48-часового культивирования, этот предполагаемый рецептор является функцио-

нальным антагонистом TLR4.

Сравнение влияния на продукцию оксида азота макрофагами ПС полыни и клевера с липополисахаридом Е. coli показало, что ПС полыни и клевера повышали активность NO-синтазы, но слабее, чем ЛПС, а ПС берёзы не обладали способностью стимулировать синтез N0 (рис. 1).

Рисунок 1. Влияние распгтельных полисахаридов и ЛПС на продукцию оксида азота перитонеальными макрофагами.

Примечания:* - различия показателя с контролем 1 достоверны, р<0,05, п=6; # - различия с контролем 2 достоверны, р<0,05, п-6.

ПС полыни □ контроль 1 (среда)

ПС клевера Ш контроль 2 (ЛПС) 0 опыт (ПС)

Изучение действия растительных ПС на спонтанную активность аргиназы перитонеальных макрофагов показало (табл. 4), что ПС полыни и клевера в оба срока культивирования либо подавляли активность аргиназы (ПС полыни - 20 мкг/мл; ПС клевера - 10 мкг/мл), либо не влияли на неё. ПС берёзы (обе концентрации) и МДП (10 мкг/мл) либо усиливали (ПС берёзы - к 24 ч; МДП - к 48 ч), либо не влияли на активность фермента.

ЛПС-стимулированную активность аргиназы ингибировали все исследуемые ПС в зависимости от концентрации и срока культивирования (табл. 4): ПС полыни (10 мкг/мл)-через 48 ч, ПС клевера (20 мкг/мл) - через 24 ч, ПС берёзы

Таблица 4

Влияние различных концентраций растительных полисахаридов и мурамиддипептида на активность аргиназы перитонеальных макрофагов мышей шппш С57ВЬЛУ (Х±т)

Исследуемое вещество Время куль-тпви-рова-ния (ч) Активность аргиназы (без ЛПС), ЕА Активность арпшазы (в присутствии ЛПС), ЕА

контроль 10 мкг/мл ПС 20 мкг/мл ПС контроль 10 мкг/мл ПС 20 мкг/мл ПС

ПС полыни 24 12,8±1,6 14,2±2,4 5,8±1,9* 16,1±2,0 12,5±3,5 5,1±2,7*

48 25,3±0,7 22,4±2,2 20.3±1,7* 22,7±2,1 28,8±0,9* 26,3±0,6

ПС клевера 24 12,8±1,6 6,1±1,7* 11,8±1,5 16Д±2,0 ll,8i2,2 4,9±2,0*

48 25,3±0,7 20,4±1,6* 21,1±1,6 22,7±2,1 17,2±2,8 16,0±1,6

ПС берёзы 24 14,2±1,3 25,4±2,6* 19,5±0,9* 14,1±2,0 22,5±2,9 17,4±2.0

48 24,6±1,7 20,5±2,4 18,0i2,0 24,3±3.0 13,7±2,4* 11.7±2,4*

МДП 24 8,2±1,0 5 мкг/мл 10 мкг/мл 6,6±0,6 5 мкг/мл 10 мкг/мл

7,2±1,0 8,0±1.9 6,6±1,3 5,4±0,6

48 13,9±1,7 10,6±1,0 21,4±2,5* 6,1±1,0 12,6±2,3* 19,1±0,9*

Примечания: * - различия показателя с контролем достоверны, р<0,05, п=6.

(обе концентрации) - через 48 ч. ПС только в одном случае усиливали ЛПС-стимулированную активность аргиназы: в концентрации 10 мкг/мл при культивировании 48 часов. Вещество сравнения, МДП, также усиливал активность фермента при более длительном культивировании (обе концентрации).

Влияние растительных ПС на продукцию воспалительного (ИЛ-12) и противовоспалительного цитокинов (ИЛ-10) было оценено в суточных супернатантах культур перитонеальных макрофагов ингактных животных. Из исследованных веществ только ПС клевера усиливали ЛПС-индуцированную продукцию ИЛ-12 макрофагами (в 22 раза), остальные ПС и МДП не влияли на выработку этого ци-токина. На продукцию ИЛ-10, как в присутствии ЛПС, так и без него, исследуемые ПС не влияли (табл. 5).

Было изучено влияние ПС in vitro на цитокинпродуцирующую активность мононуклеаров периферической крови человека. Все исследуемые вещества повышали ЛПС-стимулированную продукцию TNF-a по сравнению с контрольным уровнем (47,3 пг/мл): ПС полыни увеличили продукцию цитокина в 1,6 раза (до 76,4 пг/мл, р<0,05), ПС клевера - в 2 раза (до 98,1 пг/мл, р<0,05), ПС берёзы - в 1,8 раза (до 83,7 пг/мл, р<0,05), МДП - в 2,4 раза (до 115,5 пг/мл, р<0,05).

Таблица 5

Влияние растительных полисахаридов и мурамплдипенгида на продукцию цитокинов перито-неальными макрофагами ингактных мышей линии C57BL/6J (Х±т)

Исследуемое вещество Концентрация ИЛ-12 в присутствии ЛПС, пг/мл Концентрация ИЛ-10, нг/мл

без ЖС в присутствии ЛПС

- (контроль) 4,4 ±5,1 0,91±0,08 2,28 ±0,19

ПС Польши 8,8±5,5 0,81±0,05 2,69 ±0.24

ПС клевера 96,6 ±20,2* 1,08±0,07 2,00 ±0,31

ПС берёзы 16,5 ±9,0 0,81±0,05 2,15 ±0,12

МДП 8,3 ±4,1 1,47±0,15* 2,84 ±0,21

Примечания: * - различия с контролем достоверны, р<0,05, п=6.

Роль М^-кВ, р38. РОК. МЕК 1/2. сАМР в механизме действия на функциональное состояние перитонеальных макрофагов ПС клевера и берёзы. Для изучения роли сигнальных молекул в активации макрофага растительными полисахаридами были использованы ингибиторы следующих сигнальных молекул: №-кВ (ауротиомалат), р38 (БВ203580), Р13К (ЬУ294002), МЕК 1/2 (№98059), сАМР (2',5'-дидеоксиаденозин). Эксперименты проведены с разными по составу образцами ПС клевера: 1) содержащие комплекс водорастворимых полисахаридов (ПС клевера) и 2) полученные методом фракционированного осаждения гидроксидом бария нейтральные ПС (Р8-62-Ш00) и кислые ПС (Р8-62-Ас100). В других сериях экспериментов были использованы фракции ПС берёзы (1'5-В 1-АО и Р8-В2-1Ш) с однородными химическими свойствами, выделенными из суммы ПС методом ионообменной хроматографии. Концентрация данных ингибиторов и фракций ПС клевера и берёзы были определены в предварительных экспериментах.

Учитывая уникальность выявленных свойств у ПС клевера (только ПС клевера резко увеличивали секрецию макрофагами ИЛ-12, а также повышали про-

дукцию оксида азота, подавляли стимулированную ЛПС активность аргиназы, усиливали выработку ТЫР-а, стимулировали ТЫ и ингибировали ТЬ2 иммунный ответ), мы исследовали механизм их ЫО-стимулирующего действия с использованием ингибиторов сигнальных молекул р38 и Р13 киназы. Было обнаружено (табл. 6), что способность ПС клевера стимулировать Ж)-синтазу полностью зависит от р38, о чём говорит подавление продукции оксида азота, стимулированной ПС клевера, ингибитором данной сигнальной молекулы до контрольного уровня (контроль 1), а Р13 киназа играет главную роль в механизмах действия ПС клевера на МО-синтазу макрофагов, так как ингибитор этой киназы резко снижал продукцию N0 в культурах, содержащих ПС клевера.

Таблица 6

Действие ПС клевера (20 мкг/мл) на продукцию оксида азота перитонеальными макрофагами мышей линии ВАЬВ/с в присутствии ингибиторов р38 №203580) и Р13К (ЪУ294002) (Х+т)

Условия культивировання Концентрация нитритов, мкМ

- (контроль 1) + ПС клевера

- (контроль 2) + ингибитор р38 3.0 ±0,2 2.1 ±0,3 6,3 ±0,3* 2,7 ± 0,3#

- (контроль 2) + ингибитор PI3K 6,4 ± 0,2 2,9 ± 0,2# 11,9 ±0,4* 3,1±0,3#

Примечания: * - различия с контролем 1 достоверны, р<0,05, п=6; # - различия с контролем 2 достоверны, р<0,05, п=6.

Как и нефракционированный образец, фракции ПС клевера стимулировали продукцию макрофагами N0, что было обусловлено активацией транскрипционного фактора NF-kB (так как в присутствии его ингибитора - ауротиомалата - наблюдалась отмена NO-стимуляторного действия фракции PS-62-N300 и PS-62-АсЮО). Это согласуется с тем, что NF-kB является главным транскрипционным фактором, проводящим провоспалительные сигналы и вызывающим увеличение количества продуцируемого iNOS оксида азота [Vila-del Sol V. et al., 2007]. Ингибиторы p38 и PI3K в присутствии фракций ПС клевера также снижали стимулированную ими активность NO-синтазы до уровня контроля без ПС. Инкубирование макрофагов с ингибитором МЕК 1/2 и сАМР в присутствии фракций ПС клевера PS-62-N300 и PS-62-AclOO не влияло на уровень продукции NO (табл. 7).

Таким образом, наши исследования показали, что в проведении активирующего сигнала участвует киназа р38, а МЕК1/2 не задействована в активацион-ном каскаде. Индуцированный при воспалении и проводящий противовоспалительные сигналы сАМР способствует затуханию воспаления, т.е. является молекулой отрицательной обратной связи. Действительно, в нашей работе было обнаружено, что ингибирование сАМР приводило к повышению спонтанной продукции макрофагами оксида азота. В активации макрофагов фракциями ПС клевера данная сигнальная молекула не участвует.

Как было сказано выше, кроме ПС клевера необычное действие на ТЫ и Th2 иммунный ответ оказали ПС берёзы. Проведённые исследования показали, что ПС берёзы вызывали смешанную активацию: усиливали некоторые свойства Ml (повышали продукцию TNF-a, снижали активность ЛПС-стимулированной

Таблица 7

Действие фракций ПС клевера РЯ-62-Ы300 и Р8-62-Ас100 (20 мкг/мл) на продукцию оксида азота перитонеалышмн макрофагами мышей лшши ВАЬВ/с в присутствии ингибитора №-кВ (ауротиомалат), р38 (8В203580), Р13К (ЬУ294002), МЕК 1/2 (Р098059), сЛМР (2',5'-дидеоксиаденозин) (Х±т)

Условия культивирования Концентрация нитритов, мкМ

- (коптроль 1) + PS-62-N300 + PS-62-Acl00

- (контроль 2) + ингибитор NF-kB 7,6±0,3 5,3±0,4* 12,5±1,7* 6,0±0,4# 12.2±0,4* 7,0±0,4*#

- (контроль 2) + ингибитор р38 3,9±0,4 2,4±0,5 11,9±1,5* 2,5±0Д# 5,7±0,5* 2,4±0Д#

- (контроль 2) + ингибитор PI3K 7,4±0,2 2,6±0,9* 9,2±0,7* 1,4±0,1# 9,9±0,7* 1,3±0,2#

- (контроль 2) + ингибитор МЕК '/4 7,4±0,2 10,4±1,4 9,2±0,7* 8,1±0,9 9,9±0,7* 10,2±1,3

- (контроль 2) + ингибитор сАМР 7,4±0,2 11,2±0,5* 9,2±0,7* 11,9±1,5 9,9±0,7* 12,6±0,9

Примечания: * - различия с контролем 1 достоверны, р<0,05, п=6; # - различия с контролем 2 достоверны, р<0,05, п=6.

аргиназы, усиливали Thl-зависимый иммунный ответ) и М2 (увеличивали активность нестимулированной аргиназы, усиливали ТЬ2-зависимый иммунный ответ). Стимулирование ПС берёзы как Thl, так и Th2 иммунного ответа, вероятнее всего, связано не только с тем, что эти ПС вызывают смешанную активацию, а с тем, что компоненты образца были иммуногенны и на фоне иммунизации OVA вызывали Th2 иммунный ответ и на себя.

Фракции ПС берёзы, в отличие от суммарного образца, оказывали N0-стимулирующее действие на макрофаги: при культивировании клеток с этими фракциями в концентрации 20 мкг/мл происходило увеличение содержания оксида азота, сравнимое с действием ЛПС.

NO-стимулирующее действие фракций ПС берёзы на макрофаги обусловлено активацией транскрипционного фактора NF-kB, о чём свидетельствует снижение концентрации нитритов в культурах макрофагов, содержащих фракции PS-B1-AG и PS-B2-RG, при блокировании NF-kB ауротиомалатом. Ингибиторы р38 и PI3K подавляли стимулированную обеими фракциями ПС берёзы продукцию оксида азота. Инкубирование макрофагов с ингибитором МЕК 1/2 в присутствии изученных фракций ПС не влияло на уровень продукции N0. Ингибитор сАМР оказывал стимулирующее действие на синтез оксида азота в культурах макрофагов с фракциями ПС берёзы: концентрация нитритов в культуре с фракциями PS-В1-AG и PS-B2-RG была выше, чем в культуре без ингибитора (табл. 8).

Таким образом, изучение роли двух МАР-киназ (р38 и МЕК1/2) в механизме NO-стимулирующего действия фракций ПС берёзы дало результаты, аналогичные полученным в экспериментах с ПС клевера: в проведении сигнала участвует только одна из исследованных МАР-киназ - р38. Как и в случае ПС клевера, в проведении активирующего макрофаги сигнала, индуцированного PS-B1-AG и PS-B2-RG, участвует PI3 киназа. сАМР также участвует в NO-стимулирующем действии фракций ПС берёзы, но в качестве негативного регулятора. Исследова-

Таблица 8

Действие фракций ПС клевера PS-B1-AG и PS-B2-RG на продукцию оксида азота перитонеаль-ными макрофагами в присутствии ингибитора NF-кВ (ауротиомалат), р38 (SB203580), PI3K (LY294002), МЕК 1/2 (PD98059), сАМР (2',5'-дидеоксиаденозцн) (Х±т)

Условия культивирования Концентрация нитритов, мкМ

- (контроль 1) + PS-B1-AG + PS-B2-RG

- (контроль 2) + ингибитор NF-kB 11,4±2,2 4,8±0,2* 24,1±1,2* 16,3±0,9*# 31,0±1,1* 23,2±1,6*#

- (контроль 2) + ингибитор р38 3,9±0,4 2,4±0,5 34,0±3,7* 7,7±1,4*# 53,0±4,7* 8,8±0,9*#

- (контроль 2) + ингибитор PI3K 7,4±0,2 2,6±0,9* 29,5±1,9* 1,7±0,б# 32,5±3,5* 1,6±0,2#

- (контроль 2) + ингибитор МЕК 'Л 7,4±0,2 10,4±1,4 29,5±1,9* 30,4±3,3* 32,5±3,5* 29,7±2,1*

- (контроль 2) + ингибитор сАМР 7,4±0,2 11,2±0,5* 29,5±1,9* 40,7±3,0*# 32,5±3,5* 40,9±2,4*#

Примечания: * - различия с контролем 1 достоверны, р<0,05, п-6; # — различия с контролем 2 достоверны, р<0,05, п=6.

ние вовлечения сигнальных молекул в механизмы действия ПС клевера и берёзы позволило убедиться в том, что по своему качеству и механизму данные образцы в основном сходны, различия касаются только участия сАМР в активации макро-фагальных клеток изучаемыми образцами.

Следует сказать, что механизмы внутриклеточного сигналинга, обеспечивающего активацию макрофагов под действием новых фармакологических агентов полисахаридной природы, исследованы мало. Так, известно, что ПС, выделенные из гриба G. lucidum, через TLR4 запускают сигнальный путь активации протеинкиназ РКС, МЕК1, РАК, MAP киназ, включая ERK, JNK и р38 [Hsu H.-Y. et al., 2004]. Исследование сигнальных путей активационного каскада позволяет предполагать действие исследуемого вещества в динамике иммунного ответа. Так, можно предположить, что ПС клевера и фракции ПС берёзы будут сначала стимулировать иммунное воспаление (активация NF-kB), после чего за счёт усиления противовоспалительных свойств будут способствовать восстановлению поврежденных тканей (активация PI3K).

В заключении следует отметить, что полученные нами результаты показывают возможность дальнейшего изучения исследованных веществ с целью получения лекарственных препаратов с иммуномодулирующим действием. Областью их применения могут быть ситуации, нуждающиеся в стимулировании Thl-зависимых иммунологических реакций, например, инфекционные и онкологические процессы, атопические заболевания.

ВЫВОДЫ

1. Полисахариды, полученные из фармакопейного сырья полыни горькой, клевера лугового и берёзы повислой, при курсовом введении стимулируют Thl тип иммунного ответа, активируя клеточное и гуморальное его звено; при этом только полисахариды берёзы усиливают функциональную активность антителопроду-центов.

2. Повышение количества антителообразующих клеток в селезёнках мышей, иммунизированных эритроцитами барана и получавших курс водорастворимых полисахаридов польши, клевера и берёзы, не связано с прямым митогенным действием изучаемых веществ на лимфоциты.

3. Полисахариды полыни и клевера при курсовом введении подавляют Th2 тип иммунного ответа, снижая тяжесть анафилактического шока и продукцию иммуноглобулинов класса Е и G1 у иммунизированных овальбумином животных. Полисахариды берёзы, напротив, увеличивают смертность животных в результате анафилактического шока и повышают способность сыворотки крови вызывать де-грануляцию интактных тучных клеток.

4. Полисахариды польши и клевера стимулируют in vitro продукцию оксида азота перитонеальными макрофагами, но их NO-активирующая активность уступает липополисахариду Е. coli и не связана с примесью эндотоксина в исследуемых образцах. Полисахариды берёзы не влияют на уровень продуцируемого макрофагами оксида азота. Активированная липополисахаридом Е. coli выработка оксида азота в присутствии ПС клевера снижается в зависимости от концентрации ПС и срока культивирования, в присутствии полисахаридов польши и берёзы не меняется.

5. Полисахариды полыни и клевера подавляют, а полисахариды берёзы стимулируют спонтанную активность аргиназы; при этом ЛПС-стимулированную ее активность ингибируют все исследуемые вещества в зависимости от концентрации ПС и срока культивирования.

6. Все исследуемые вещества стимулируют продукцию TNF-a мононуклеарами периферической крови человека, не влияют на выработку ИЛ-10 перитонеальными макрофагами мыши. Полисахариды клевера резко усиливают продукцию Ш1-12 перитонеальными макрофагами мыши, полисахариды полыни и берёзы не влияют на выработку этого цитокина.

7. В основе NO-стимулирующего действия на макрофаги полисахаридов клевера и фракций полисахаридов берёзы лежит активация транскрипционного фактора NF-kB, в активационном каскаде участвуют киназы р38 и PI3. Киназа МЕК.1/2 не участвует в данном процессе, а сАМР задействован в негативной регуляции продукции оксида азота, стимулированной исследуемыми веществами.

ПЕРЕЧЕНЬ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Молекулы внутриклеточного сигналинга активации макрофага при опухолевом росте: поиск терапевтических мишеней // Сибирский медицинский журнал. 2008. Т.23. № 3. Вып. 1. С. 84-85 (соавторы Н.В. Вельская, М.Г. Данилец и ДР-)-

2. Влияние растительных водорастворимых полисахаридов на продукцию IgE и IgGl // Сибирский медицинский журнал. 2008. Т.23. № 3. Вып. 1. С. 102 (соавторы М.Г. Данилец, Н.В. Вельская, Ю.П. Вельский и др.).

3. Роль р38 и Р13К в активации макрофагов водорастворимыми полисахаридами календулы и клевера // Сибирский медицинский журнал. 2008. Т.23. № 3. Вып. 1. С. 92 (соавторы М.Г. Данилец, Ю.П. Вельский, Н.В. Вельская и др.).

4. Влияние растительных водорастворимых полисахаридов на продукцию иммуноглобулинов классов Е и Gl лимфоцитами мышей, сенсибилизированных овальбумином // Бюлл. эксперим. биол. и медицины. 2008. Т. 146. № 11. С. 520522 (соавторы М.Г. Данилец, Н.В. Вельская, Ю.П. Вельский и др.).

5. Макрофаги как фармакологическая мишень для регуляции баланса Thl/Th2 // Бюлл. эксперим. биол. и медицины. 2008. Приложение № 2. С. 63-68 (соавторы М.Г. Данилец, A.M. Гурьев, Н.В. Вельская и др.).

6. Влияние растительных полисахаридов на NO-синтазу и аргиназу макрофагов мыши И Вестник Уральской медицинской академической науки. 2009. № 2. Вып. 25. С. 49-50 (соавторы М.Г. Данилец, A.M. Гурьев, Н.В. Вельская и др.).

7. Перспективы фармакологической регуляции активности макрофагов путем модуляции внутриклеточного сигнального каскада // Вестник Российской АМН. 2009. № 11. С. 21-25 (соавторы Ю.П. Вельский, Н.В.Бельская, М.Г.Данилец и др.).

8. Влияние полисахаридов из растительного сырья на Thl-зависимый иммунный ответ (скрининговое исследование) // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2010. Т. 73. № 6. С. 19-22 (соавторы М.Г. Данилец, Ю.П. Вельский, A.M. Гурьев и др.).

9. Полисахариды как регуляторы баланса Thl/Th2 при онкологических заболеваниях // Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии. Материалы XVIII международной конференции. Гурзуф, 2010. С.58-59 (соавторы A.M. Гурьев, К.А. Лопатина).

ПАТЕНТ

Патент РФ № 2378004 от 10.01.2010 г. «Средство, обладающее противоаллергическим действием» (соавторы Е.Д. Гольдберг, A.M. Дыгай, М.Г. Данилец и др.).

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АОК - антителообразующие клетки

АПК - антиген-презентирующие клетки

ГЗТ - реакция гиперчувствительности замедленного типа

ЕА — единица активности

ИЛ - интерлейкины

ЛПС - липополисахарид

Ml и М2 - макрофаги 1 и 2 типа

МДП - мурамиддипептид

ПС - полисахариды

ФР - физиологический раствор хлорида натрия

ЭБ - эритроциты барана

сАМР - циклический аденозинмонофосфат

cGMP - циклический гуанозинмонофосфаг

IFN -интерферон

Ig - иммуноглобулины

МАРК - митоген-активируемая протеин-киназа (mitogen associated protein kinase)

NO - оксид азота

NF-кВ - нуклеофильный фактор kappa В

OVA - овальбумин

PI3K - фосфоинозитол-3-киназа

Th - Т-хелперы

TNF - фактор некроза опухоли

Подписано к печати 18.10.10. Бумага офсетная. Печать RISO. Формат 60x84/16. Тираж 100 экз. Заказ № 38-0157 Центр ризографии и копирования. Ч/П Тисленко О.В. Св-во №14.263 от 21.01.2002 г., пр. Ленина, 41, оф. № 7а.