Автореферат и диссертация по медицине (14.00.09) на тему:Внутриутробные инфекции, клинико-морфологическая оценка современной специфической диагностики

На правах рукописи

ОСТРОВСКАЯ Ольга Васильевна

ВНУТРИУТРОБНЫЕ ИНФЕКЦИИ, КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА СОВРЕМЕННОЙ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ

14.00.09 - педиатрия 03.00.06 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

сР

\Р

Ф

Хабаровск 2009

003462120

Работа выполнена в Хабаровском филиале Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания СО РАМН - НИИ охраны материнства и детства (директор - член-корр. РАМН, д.м.н., заслуженный деятель науки РФ, проф. В.К. Козлов)

Научные консультанты:

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, заслуженный деятель науки РФ, профессор

КОЗЛОВ Владимир Кириллович

доктор медицинских наук, профессор

КИЦАК Василий Яковлевич

Официальные оппоненты:

академик РАМН,

доктор медицинских наук,

профессор

БЕСЕДНОВА Наталья Николаевна

доктор медицинских наук, профессор

БОЖЕНОВ Юрий Александрович

доктор медицинских наук, профессор

ЛУЧАНИНОВА Валентина Николаевна

Ведущая научная организация: ГУ НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН

Защита диссертации состоится «_»_2009 г. в_часов на заседании

диссертационного совета Д 208.026.01 при ГОУ ВПО ДВГМУ Росздрава (680000, г. Хабаровск, ул. Муравьёва-Амурского, 35).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Дальневосточного государственного медицинского университета по адресу: Хабаровск, ул. Муравьёва-Амурского, 35.

Автореферат диссертации разослан «_»_2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

ДОБРЫХ Вячеслав Анатольевич

Список сокращений

БКМ - быстрый культуральный метод

ВД - врожденные дефекты

ВПР - врожденные пороки развития

ВУИ - внутриутробная инфекция

ДККБ - детская краевая клиническая больница

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДНК-емия - определение генома вируса в крови

ЗВУР - задержка внутриутробного развития

НДС - иммунодефицитные состояния

ИПКСЗ - Институт повышения квалификации специалистов здравоохранения ИППП - инфекции, передающиеся половым путем ИФА - иммуноферментный анализ КТГ - кардиотокография

МВП - межворсинчатое пространство плаценты

МВПР - множественные врожденные пороки развития

МГНК - метод гибридизации нуклеиновых кислот

МФА - метод флюоресцирующих антител

ОАА - осложненный акушерский анамнез

ПК - персональный компьютер

ПН - плацентарная недостаточность

ПС - перинатальная смертность

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РИФ - реакция прямой иммунофлюоресценции

РНИФ - реакция непрямой иммунофлюоресценции

РНК - рибонуклеиновая кислота

РПГА - реакция пассивной гемагглютинации

СДР - синдром дыхательных расстройств

СЗРП - синдром задержки развития плода

Cand - Candida albicans

Chi. tr. - Chlamydia trachomatis

CMV - Cytomegalovirus

Evs - Enteroviruses

HHV-4 - Herpes human virus 4 type

HHV-6 - Herpes human virus 6 type

HHV-8 - Herpes human virus 8 type

HIV A - Human Influenza virus A

HRSV - Human respiratory syncytial virus

HSV - Herpes simplex virus

IE - сверхранние белки цитомегаловируса

Klebs. pn. - Klebsiella pneumoniae

L - структурные белки цитомегаловируса

L. mon. - Listeria monocytogenes

M. hom. - Mycoplasma hominis

M. gen. - Mycoplasma genitalium

PV-B19 - Parvovirus В19

Rub - Rubella

Str. ag. - Streptococcus agalactiae Str. pn. - Streptococcus pneumonia Str. pyogen. - Streptococcus pyogenes Toxo - Toxoplasma gondii Tr. vag. - Trichomonas vaginalis Ur. ur. - Ureaplasma urealyticum

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы перинатальной патологии определяется снижением репродуктивного потенциала и сохраняющейся депопуляцией (В.И. Кулаков. В.Н. Серов. 2007). В последние годы отмечаются неуклонный рост внутриутробных инфекций (ВУИ) и повышение их роли в структуре перинатальной и младенческой заболеваемости и смертности. Ближайшие и отдаленные последствия ВУИ являются причиной отклонений в состоянии здоровья детей раннего возраста и инвалидизации в более старших возрастных группах (J1.J1. Нисевич и соавт., 1999; Н.Н. Володин и соавт., 2001; Г.Б. Безнощенко и соавт., 2003; В.И. Кулаков и соавт., 2004; Н.П. Шабалов, 2004; А.Я. Сенчук, З.М. Дубоссарская, 2005; В.В. Иванова и соавт., 2008; AJ. Antsaklis et al., 2000; М. Gencay et al„ 2001).

Под «внутриутробной инфекцией» подразумевают процесс распространения инфекционных агентов в организме плода и вызванные ими патофизиологические изменения различных органов и систем, характерные для инфекционной болезни, возникшей акте- или интранатально и выявляемой пренатально или после рождения (В.И. Кулаков и соавт., 2004).

ВУИ характеризуются множественностью этиологических агентов и преобладанием неспецифических клинических проявлений, для обозначения совокупности последних применяется термин «TORCH-синдром», где «Т» - Toxoplasmosis - токсоплаз-моз; «О» - other — другие инфекции (сифилис, хламидиоз, вирусные гепатиты, листери-оз, ветряная оспа. ВИЧ, инфекции, вызываемые парвовирусом В19, энтеровирусами и др.); «R» - Rubella - краснуха; «С» - Cytomegalia - цитомегалия; «Н» - Herpes simplex virus - герпес (T.I. Libro et al., 1997; R. Kaur et al., 1999; E.R. Newton, 1999; S. Imura, 2000; N.A. Khan, S.N. Kazzi, 2000).

Тяжесть инфекционного процесса у матери и плода не всегда коррелирует между собой. Легкая, мало- или бессимптомная инфекция матери, обусловленная различными инфекционными агентами, может сопровождаться тяжелыми поражениями органов и систем плода или его гибелью. В то же время острая и достаточно выраженная инфекция у матери не обязательно фатальна для плода (И.В. Орджоникидзе, B.JI. Тютюник, 2001). Трудности анте- и постнаталыюй диагностики ВУИ связаны с широким распространением персистирующих инфекций и условно-патогенных агентов в человеческой популяции, неоднозначностью возможной реализации инфекционного процесса и неспецифичностью клинических проявлений. Устоявшихся канонов пренаталыюй диагностики в мире не существует (Е.В. Юдина, 2006).

Прогресс в изучении ВУИ связан с разработкой и широким внедрением в практику здравоохранения принципиально новых диагностических технологий - высокочувствительных и специфичных методов иммуноферментного анализа и генодиагностики. В связи с этим оценка эффективности современной специфической диагностики ВУИ приобретает особую актуальность.

Инвазивные методы дородовой диагностики (кордоцентез, амниоцентез, биопси хориона) для детекции маркеров ВУИ применяют редко из-за большого числа противо показаний и возможности осложнений беременности. Чаще используют непрямые мето ды: выявление возбудителя, его нуклеиновых кислот и антигенов в клиническом мате риале у беременных женщин, специфических антител в сыворотке крови.

Особый интерес в плане совершенствования пренаталыюй диагностики ВУ представляет определение диагностической и прогностической значимости маркёро продуктивной HSV- и CMV-инфекции. После первичного инфицирования вирусы се мейства Herpesviridae в форме нуклеокапсида могут пожизненно находиться в клетка

нервных ганглиев, секреторных желез, лимфоретикулярных клетках почек, лимфобла-стах, В-лимфоцитах (М. РаравсЬ, Л^айнпз, 2001; ЭХ. ¡ЗикьОгееп е1 а1., 2004). При первичной инфекции и при реактивации латентной инфекции происходит активная репродукция и экскреция вируса, появляются специфические иммуноглобулины класса М, низкоавидные антитела к сверхранним белкам - маркёры продуктивной инфекции. Активизация инфекции у беременной может протекать как с клиническими проявлениями, так и бессимптомно, при этом вирус может попасть в плаценту и плод и вызвать деструктивные процессы. Риск развития инфекции и болезни плода при выявлении у беременной маркёров продуктивной герпес-инфекции не изучен.

Нерешенной и дискуссионной проблемой остается определение роли бессимптомных, персистирующих, хронически-рецидивирующих инфекций матери в формировании фетоинфантильных потерь и врожденных пороков развития. Вирусы обладают уникальными свойствами, способствующими развитию внутриутробной инфекции, поражению клеток эмбриона и плода. Ключевым патогенетическим механизмом вирусной инфекции является внедрение в клетку чужеродного генетического материала. Важным компонентом патогенного действия вируса на клетки эмбриона или плода являются нарушение митоза инфицированных клеток, их цитолиз, хромосомные аберрации, то есть прямое цитопатическое, тератогенное или мутагенное действие. Непрямое воздействие вирусов связано с развитием плацентита, эндометрита, патологии плодных оболочек (В.Я. Ки-цак, 2004).

Вирусологическое и бактериологическое исследование аутопсийного материала при фетоинфантильных потерях в большинстве случаев не проводится из-за высокой стоимости и больших трудозатрат (Л.Л. Нисевич и соавт., 2002). Поэтому данные о частоте и этиологической структуре ВУИ, как причине ПС - противоречивы. По сведениям Госкомстата РФ, доля инфекций, специфичных для перинатального периода, в структуре ПС в 2006 году составляла 5,7 %. Многолетние исследования, проведенные в Санкт-Петербурге, выявили ВУИ в качестве основной причины ПС в 20,0-30,0 % случаев (В.А. Цинзерлинг, В.Ф. Мельникова, 2002), в Великом Новгороде - в 67,5 % (Ю.М. Уваров, 2003). При стандартных методах исследования этиология потерь плода в 40,0-50,0 % случаев остается нераспознанной (В.Н. Серов и соавт., 1997; Ь. 81д'оИегЬгапс1-8раге е1 а1., 2000). Причины МВПР у детей, умерших в перинатальном и младенческом периоде, не удается установить в 60,3 % случаев (А.Ю. Мощинецкий, 1998).

Новые перспективы в изучении распространенности, патогенеза, этиологии ВУИ открывает использование высокочувствительного молекулярно-биологического метода ПЦР, основанного на детекции специфической нуклеотидной последовательности, присущей ДНК или РНК искомого агента. Метод позволяет оценить роль ВУИ в развитии фетоинфантильных потерь, врожденных аномалий на качественно новом методическом уровне.

До настоящего времени не установлена распространенность инфекций, влияющих на состояние плода и новорожденного в популяции женщин - жительниц Приамурья, не определены диагностическое и прогностическое значение дородового выявления маркёров репликации возбудителей персистирующих инфекций, не изучена эффективность генодиагностики при определении роли ВУИ в формировании фетоинфантильных потерь.

Целью настоящего исследования была разработка современной комплексной технологии специфической диагностики ВУИ, ее клиническая и патоморфологическая оценка, определение на ее основе реальной роли ВУИ в формировании фетоинфантильных потерь.

Задачи:

1. Изучить распространенность TORCH-инфекций в популяции женщин репродуктивного возраста г. Хабаровска.

2. Установить прогностическое значение для плода и новорожденного фактов выявления у беременной маркёров бессимптомной активизации герпетической и цито-мегаловирусной инфекции.

3. Разработать способ ранней диагностики ВУИ у новорожденных путем исследования плаценты методом ПЦР.

4. Изучить методом ПЦР инфицированность плодов и эндометрия при раннем спонтанном прерывании беременности.

5. Проанализировать динамику показателей перинатальной смертности, определить значение бессимптомных и персистирующих инфекций матери в формировании фетоинфантильных потерь при изучении аутопсийного материала.

6. Определить структуру врожденных летальных пороков развития плода и новорожденного и роль внутриутробных инфекций в их формировании.

Научная новизна:

Впервые установлено значение сочетанного развития плацентарной недостаточности и продуктивной герпес-вирусной инфекции для адекватной оценки поражения плода и новорожденного.

Впервые разработан и апробирован способ раннего определения ВУИ у новорожденных путем исследования плаценты методом ПЦР - «Способ ранней диагностики внутриутробных инфекций у новорожденных», патент № 2005129856/15 от 07.06.2006 г.

Впервые разработан и использован алгоритм комплексного исследования аутопсийного материала от погибших плодов и новорожденных вирусологическими методами и с помощью генодиагностики для выявления возбудителей инфекций TORCH-комплекса.

Впервые методом ПЦР определена инфицированность плодов (30,4 %) и эндометрия женщин (65,6 %) при ранних спонтанных выкидышах. В тканях погибших плодов и образцах эндометрия преобладали возбудители уреамикоплазмоза - 23,7 % и 37,5 % соответственно. Показана значительная роль инфекционных процессов и трансмурапьного пути передачи в генезе потерь плода на ранних сроках гестации.

Впервые методом ПЦР установлены спектр и частота выявления возбудителей ВУИ в аутопсийном материале при потерях плода и новорожденного. Частота детекции возбудителей составила 63,8 %. Cytomegalovirus, Herpes simplex virus, Enteroviruses обнаружены в равных долях - по 18.7 %. L. monocytogenes - 15,0 %, Herpes human virus 6 type - 7,5 %, Chi. trachomatis - 5,0 %. вирусы респираторной группы и Rubella - по 3,8 %, Ur. urealyticum — 2,5 %. Этиологическая роль выявленных инфекционных агентов в генезе потерь плода и новорожденного подтверждена наличием альтеративно-пролиферативных, фиброзно-склеротических воспалительных процессов в тканях, ги-гантоклеточным метаморфозом, морфологическими проявлениями иммунодефицитного состояния.

Впервые показаны различия в выявляемое™ возбудителей ВУИ при потерях плода на разных сроках гестации. В материале от ранних выкидышей чаще определяли Ur. urealyticum, от поздних выкидышей - Herpes simplex virus, L. monocytogenes. Cytomegalovirus, при перинатальной смертности - Enteroviruses и Cytomegalovirus.

Впервые методом ПЦР изучены частота и этиологическая структура ВУИ при ле тапьных врожденных дефектах. Наряду с типичными для отдельных возбудителей вро жденными пороками развития зарегистрированы ранее не описанные сочетания: гаст

рошизис, болезнь Гиршпрунга и Enteroviruses, аденоматоз коры надпочечников и Cytomegalovirus, нейробластома крестцово-копчиковой области и Herpes simplex virus, аплазия лёгкого, ложная и истинная диафрагмальная грыжа и Human respiratory syncytial virus, Human Influenza virus A.

Впервые показано участие L. monocytogenes в генезе фетоинфантильных потерь в г. Хабаровске. В летний период 2005 года патогенные штаммы L. monocytogenes определили при поздних выкидышах в 43,5 % случаев. В последующие годы L. monocytogenes выявляли спорадически.

Впервые при летальных бронхолёгочных дисплазиях (дистелектаз, фиброзная дисплазия, очаговая гипоплазия бронхиол, незрелость легочной ткани с преобладанием стромальных компонентов, периваскулярный фиброз) в 68,2 % случаев были обнаружены перинатально-значимые возбудители. ВУИ могут быть одним из механизмов антенатального формирования бронхолёгочных дисплазий у детей.

Практическая значимость работы

Проведен клинико-морфологический анализ эффективности подходов в ремоде-лировании комплекса исследований по специфической диагностике ВУИ. Предложена новая современная технология специфической диагностики, включающая изучение ау-топсийного материала, плаценты, эндометрия. Анализ структуры перинатальной патологии и смертности способствует совершенствованию организации лабораторно-клинического обеспечения мониторинга перинатальных потерь, этиологически связанных с ВУИ.

Ввиду того, что TORCH-инфекции носят оппортунистический характер, часто протекают субклинически, доказательством этиологической роли возбудителя в развитии ВУИ у беременных и врожденных патологических процессов у плода является выделение возбудителя из биологических проб, обнаружение его антигена, генома (ДНК, РНК) в крови, пораженных тканях, регистрация специфических морфологических (гистологических, цитологических) изменений при летальных исходах, индукция иммунитета (детекция противовирусных IgM, низкоавидных G-антител, антител к предранним белкам, наличие сероконверсии или диагностического прироста антител).

Тяжесть перинатальной патологии в существенной степени зависит от сочетания плацентарной недостаточности с продуктивной инфекцией.

Результаты исследования, основные положения, выводы, сформулированные в диссертационной работе, позволили разработать новые, более рациональные подходы организации современной специфической диагностики ВУИ, включая исследование методом ПЦР аутопсийного материала, тканей плаценты и эндометрия, что способствует повышению достоверности оценки их роли в перинатальной патологии и разработке на их основе адекватных лечебных и профилактических мер по снижению удельного веса ВУИ.

Внедрение результатов исследования в практику здравоохранения

Материалы, полученные в ходе выполнения работы, использованы в подготовке Закона Хабаровского края № 306 от 25.04.2001 г. «О краевой целевой программе «Охрана здоровья женщин, детей и подростков Хабаровского края на 2001-2005 гг.».

Результаты работы стали основой ряда документов, применяющихся в практическом здравоохранении:

- Информационное письмо для врачей-гинекологов «Обследование женщин при подготовке к беременности», Хабаровск, 2000.

- Пособие для врачей акушеров-гинекологов и педиатров «Дородовая диагностика внутриутробных инфекций», Хабаровск, 2000.

- Методические рекомендации «Клинический материал для диагностики вирусных и бактериальных инфекций, условия забора и транспортировки». Хабаровск, 2004.

Получен патент на изобретение «Способ ранней диагностики внутриутробных инфекций у новорожденных» № 2005129856/15, решение о выдаче патента № 236 от 07.06.2006 г.

Результаты анализа постмортального фенотипа 480 погибших плодов и новорожденных с врожденными пороками развития введены в базу данных и внедрены в практику работы медико-генетической лаборатории ГУЗ «Перинатальный центр» с 2005 г.

Полученные материалы использованы для обучения на рабочем месте, на научно-практических семинарах врачей ФГУЗ Роспотребнадзора по Хабаровскому краю. Краевого центра по профилактике и борьбе со СПИДом, Территориального центра Роспотребнадзора по Амурской области, Благовещенской областной больницы, детской инфекционной больницы Петропавловска-Камчатского, детской больницы г. Комсомольска-на-Амуре, врачей акушеров-гинекологов в селе Троицком Нанайского района Хабаровского края. Материалы диссертационной работы включены в курс лекций и практических занятий для студентов, клинических ординаторов и интернов кафедр детских болезней, акушерства и гинекологии, микробиологии, вирусологии и иммунологии ДВГМУ. врачей-лаборантов на сертификационных циклах ИПКСЗ, в клиническую практику ГУЗ «Перинатальный центр», женских консультаций №№ 2, 3 г. Хабаровска, патологоанатомического отделения ДККБ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Доля ВУИ как основной причины перинатальной смертности возросла в последние годы в 3,5-4,2 раза, что объясняется ухудшением состояния здоровья женщин репродуктивного возрастало беременности, ростом числаэкстрагенитальных заболеваний, тяжелых анемий, болезней мочеполовой системы в 2-16 раз, снижением иммунно-эндокринного статуса. Высокая частота выявления возбудителей ВУИ в аутопсийном материале от погибших плодов и новорожденных (63,8 %) указывает на существенно более высокую значимость инфекционной патологии в развитии перинатальной смертности по сравнению с данными официальной статистической отчетности.

2. Выявление маркёров репликации HSV и CMV в сочетании с плацентарной недостаточностью у беременной имеет существенное диагностическое и прогностическое значение для состояния новорожденного. У новорожденных от матерей с плацентарной недостаточностью и продуктивной герпес-инфекцией достоверно чаще диагностируются: тяжелая асфиксия, ЗВУР, ВПР и аномалии развития, респираторные нарушения. ВУИ с манифестными проявлениями в виде энцефалита, гепатита, в генерализованной форме, признаки церебральной ишемии 2-ой степени. В дальнейшем у этих детей сохраняется стойкий неврологический дефицит, отмечается задержка моторного и умственного развития, формируется иммунодефицитное состояние.

3. У новорожденных от матерей с физиологически протекающей беременностью и маркёрами репродукции HSV и CMV с помощью нейросонографии определяются признаки инфекционного поражения структур мозга: незрелость тканевых структур, признаки эпендиматита в виде утолщения и подчеркнутости стенок боковых желудочков, разрыхленность и фрагментарность сосудистых сплетений боковых желудочков, дилатация желудочков, перивентрикулярное повышение эхогенности.

4. Обнаружение маркёров активизации хламидиоза при беременности с плацентарной недостаточностью ассоциируется с патологическим состоянием плаценты, гипоксией плода, самопроизвольным прерыванием беременности и церебральной ишемией но-

ворожденных. Хламидиоз часто сопровождается инфекцией плода in utero, что подтверждается определением ДНК Chi. trachomatis в плацентах с выраженными патологическими изменениями (воспалительными, дефектами и кистами, аномалиями прикрепления плаценты) - в 45,0 %. 5. ПЦР - информативный, точный и быстрый метод, открывающий новые возможности в диагностике ВУИ, позволяющий выявлять широкий спектр вирусов и бактерий, в том числе трудно культивируемых, в одной пробе, практически в любом клиническом материале, в том числе аутопсийном и биопсийном. Метод эффективен для экспресс-диагностики ВУИ у новорожденных, а также при фетоинфантильных потерях и летальных врожденных дефектах развития. Этиологическая роль выявленных вирусов подтверждается наличием альтеративно-продуктивных, фиброзно-склеро-тических изменений в тканях, гигантоклеточным метаморфозом, морфологическими признаками иммунодефицитного состояния. Верификация инфекционных агентов при внутриматочной гибели плода, врожденных летальных дефектах развития способствует адекватной реабилитационной терапии женщин с потерей плода в анамнезе и прогнозированию исходов будущих беременностей.

Апробация работы

Научные результаты диссертации доложены на научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальные и клинические аспекты охраны детского и взрослого населения Дальневосточного региона» в рамках 2-го симпозиума «Доказательная медицина - основа современного здравоохранения», Хабаровск, 2003; научно-практической конференции с международным участием «Комплексная оценка состояния здоровья детей и подростков в Дальневосточном регионе», Хабаровск, 2004; заседании Проблемной комиссии 37.13 «Физиология и патология дыхания», Хабаровск, 2004; выездном заседании Проблемной комиссии 53.12 «Физиология и патология дыхания» межведомственного научного совета № 53 по медицинским проблемам Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера, Хабаровск, 2004; международной научно-практической конференции «Репродуктивное здоровье женщин Дальнего Востока», Владивосток, 2004; Дальневосточном региональном конгрессе «Человек и лекарство», Владивосток, 2005; заседании Проблемной комиссии 37.04 «Охрана здоровья матери и ребенка», Владивосток, 2005; II Региональной научно-практической конференции «Инфекционная патология Дальнего Востока в начале XXI века», Хабаровск, 2005; отчетной конференции исполнителей проектов регионального конкурса РФФИ «Приамурье», Хабаровск, 2005; региональной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы охраны здоровья женщин и детей на современном этапе», Хабаровск, 2006; научно-практической конференции с международным участием «Клинические и фундаментальные аспекты состояния здоровья коренного и пришлого населения в Дальневосточном федеральном округе», Хабаровск, 2007; заседаниях Хабаровского отделения Всероссийских научных обществ эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, акушеров-гинекологов (2000-2007 гг.); на сессии Президиума СО РАМН, Новосибирск, 2007; на 26 сессии общего собрания СО РАМН «Роль фундаментальной медицины в проблеме формирования здоровья населения Сибири», Новосибирск, 2007; межрегиональной научно-практической конференции «Современные факторы формирования, методы оценки и прогнозирования общественного здоровья на территории Дальневосточного региона» к 70-летию Хабаровского края, Хабаровск, 2008.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 33 основные научные работы, в том числе 12 статей в журналах, рекомендуемых ВАК для публикации материалов докторских диссертаций, в сборниках международных конгрессов за рубежом - 3, в сборниках материалов международных конгрессов, форумов в Москве - 10, патент РФ на изобретение в области медицины - 1, раздел в монографии.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов, 5-ти глав с изложением результатов собственных исследований, их обсуждения и выводов. Работа изложена на 319 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 56 таблицами и 38 рисунками. Список цитированной литературы включает 263 отечественных и 219 иностранных источников.

Диссертация выполнена в рамках НИР Института охраны материнства и детства СО РАМН: «Тактика обследования и лечения женщин с персистирующими вирусными инфекциями». Г.Р. 01.9.90 00II54. ИН 02.20.02 04816, тема получила грант по Федеральной целевой научно-технической программе «Национальные приоритеты в медицине и здравоохранении. Вирусная инфекция» (1999-2001 гг.); «Усовершенствование дородовой диагностики внутриутробных герпес-инфекций и хламидиоза», Г.Р. 01.20 0.120215 (2002-2006 гг.), ИН 02.2.007 038443; тема включена в план мероприятий по выполнению постановления IX сессии Общего собрания РАМН, 2000; «Оценка роли инфекционных факторов в формировании перинатальной смертности», работа выполнена при поддержке РФФИ грант 04-04-97006 «Приамурье 2004», Г.Р. 0120.0 500685 (2004-2005 гг.). Научным руководителем, ответственным исполнителем и соисполнителем этих тем является автор диссертации.

Личный вклад автора: разработка дизайна исследования, организация работы на всех этапах от создания ПЦР-лаборатории, определения возбудителей ВУИ методами БКМ и МФА до анализа, систематизации, статистической обработки результатов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования были женщины репродуктивного возраста Хабаровского края, беременные и их дети, а также аутопсийный материал от погибших плодов и новорожденных. Количество проведенных исследований и используемые методы указаны в табл. 1. Инфицированность женщин TORCH-инфекциями определена путем исследования мазков цервикального канала у 2 730 женщин и 118 девочек, а также с помощью выявления антител к перинатально-значимым инфекциям у 850 взрослых и 162 детей (табл. 1, разд. 1).

ПЦР-анализ проведен сертифицированными тест-системами АмплиСенс (ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора). Учет результатов Г1ЦР осуществляли методом электрофореза в 2,0 % агарозном геле с регистрацией видеосистемой «Gel-Imager» (Россия) или методом гибридизационно-флюоресцентной детекции «по конечной точке» (детектор «Джин», пр-во «ДНК-технология», Россия).

При ДНК-зондовой гибридизации (МГНК) пробы цервикального канала обрабатывали и гибридизировали с биотиновым зондом с помощью тест-системы «ДОТ-спот гибридизация» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск).

Количественное определение микоплазм в генитальных мазках выполнено куль-турапьным экспресс-методом с помощью стандартизированного диагностического набора «Микоплазма ДУО» (производство «Био-Рад-Лаборатории», Франция) у 70 женщин с положительным результатом ПЦР на Ur. urealyticum.

10

Таблица 1

Методы выявления маркёров перинатально-значимых инфекций и количество проведенных исследований

Направление исследований Методы Кол-во обследованных Кол-во анализов

Раздел 1. Выявление возбудителей тсжсн- инфекций и антител к ним у женщин и детей г. Хабаровска Детекция ДНК CMV, HSV, HHV-4, HHV-6, HHV-8, Chi. tr., М. hom., М. gen., Ur. ur., L. mon., PV-B-19, Cand, Tr. vag. в генитальных мазках методом ПЦР 2 730 женщин фертильного возраста г. Хабаровска и 50 беременных с. Троицкое 16 692

118 девочек 1-6 лет 472

Выявление Ig М и G к HSV, Ig М и G к структурным и сверхранним белкам CMV, IgG к нуклеарному и раннему антигену HHVA IgG к HHV-6, IgG к HHV-8, Ig М и G к Rub, Ig М и G к Тохо, Ig М, А и G к Chi. tr. в сыворотках крови методом ИФА, антител к L. шоп. в РПГА 162 ребенка от новорожденное™ до 14 лет и 345 взрослых 2 038

505 женщин репродуктивного возраста 6 698

Раздел 2. Оценка диагностической и прогностической ценности определения маркёров продуктивной герпетической и цитомегалови-русной инфекции у беременной для состояния плода и новорожденного Определение антигена HSV в генитальных мазках МФА 490 беременных 490 980 1 960

Детекция ДНК HSV и CMV в генитальных мазках МГНК с биотиновым зондом

Определение IgM и IgG к HSV, CMV в сыворотках крови методом ИФА

Выявление ДНК HSV и CMV в сгустках крови методом ПЦР 220 беременных с ПН 440 1 100 3 520

Выявление ДНК HSV, CMV, Chi. tr., Ur. ur., M. hom. в генитальных мазках методом ПЦР

Определение IgM и IgG к HSV, CMV; IgM, IgA, IgG к Chi. tr.; низкоавидных антител к HSV, CMV, Rub; IgM, IgG к сверхранним белкам CMV в сыворотках крови методом ИФА

Раздел 3. Детекция возбудителей ВУИ в аутопсийном и биопсийном материале при фе-тоинфантиль-ных потерях 1. Иммуноцитохимический метод. Детекция антигенов HIV AI, HIVA2, HIV В, Adenovirus, HRSV, HSV 1, 2, Rub, CMV в отпечатках органов в РИФ. Антигены Evs: ECHO 1-32 (4 пула), Кок-саки А1-24 (5 пулов), Коксаки В1-6 выявляли в РНИФ 38 погибших плодов и новорожденных, органы: головной мозг, сердце, лёгкие, печень, почки, тимус, селезёнка, плацента 5 472

2. Быстрый культуральный метод. Выявление антигенов Evs: ЕСН01-32 (4 пула), Коксаки А1-24 (5 пулов), Коксаки В1-6, HSV в пробах органов на культуре тканей ФЭЧ с последующей идентификацией в РИФ и РНИФ 38 погибших плодов и новорожденных, органы: головной мозг, сердце, лёгкие, печень, почки, тимус, селезёнка, плацента 2 926

3. Генодиагностика. Детекция ДНК HSV, CMV, HHV-4, HHV-6, HHV-8, Evs, Rub, PV-B19, HIV-A, HIV- 118 погибших плодов и новорожденных с подозрением на ВУИ, пробы органов 6 608

В, Adenovirus, HRSV, Chi. tr„ M. horn., Ur. ur.. Toxo, L. mon., Str. pn., Str. ag методом ПЦР 58 случаев летальных врожденных аномалий, пробы органов 1 218

205 образцов хориалыюй и плодовой тканей от спонтанных (135)и добровольных абортов (70), 32 пробы аспиратов эндометрия 1 845

81 плацента 1 296

Специфические антитела к возбудителям ВУИ выявляли диагностическими наборами ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск). Индекс авидности антител класса G в сыворотках крови у 87 беременных с ПН и 25 здоровых женщин к CMV, HSV 2 типа и Rub определяли с помощью тест-систем НПО «Диагностические системы» (Нижний Новгород). Антитела к L. monocytogenes выявляли в РПГА по методу А.Г. Рахманова, В.К. Пригожина (1999).

Диагностическую и прогностическую ценность маркёров продуктивной инфекции определяли в 2-х опытах при обследовании 710 беременных по следующей схеме: сбор анамнеза, стандартное клиническое тестирование, УЗ-исследование, кардиотокография, микробиологический посев отделяемого цервикалыюго канала, определение маркёров активизации HSV. CMV, Chi. trachomatis (табл. 1. разд. 2). Как признаки ПН расценивали отсутствие физиологической прибавки массы тела, увеличения размеров матки и плода согласно сроку беременности, гипоксию плода, патологию околоплодной среды -мало- или многоводие, синдром задержки внутриутробного развития плода, угрозу прерывания. аномалии прикрепления и предлежание плаценты.

В сравнительном исследовании сопоставляли состояние новорожденных от беременных женщин с наличием признаков Г1Н и выявленными маркёрами продуктивной инфекции с состоянием новорожденных, родившихся у женщин с физиологически протекающей беременностью и отсутствием маркёров активизации ВУИ, а также с популя-ционными показателями.

Изменения структуры ПС и удельного веса ВУИ за последние годы исследованы путем сравнительного анализа протоколов патологоанатомического вскрытия плодов и новорожденных патологоанатомического отделения ДККБ (246 случаев Г1С за 1988 г.. 226 - за 2003 г. и 132 - за 2007 г.).

Структуру врожденных летальных дефектов изучили, анализируя 480 случаев ВД, отобранных из 2 832 протоколов вскрытия погибших плодов и детей с массой тела от 500 гр. до возраста 1 год за 10-летний период (с 1993 по 2002 г.). Синдромологический анализ постморталыюго фенотипа проводили в группе системных и множественных пороков развития с помощью компьютерных баз данных «Syndiag» (Минск) и «OMD-LDDB» (Лондон).

Выявление возбудителей ВУИ в пробах органов погибших плодов, новорожденных и младенцев, у которых при жизни или при патологоанатомическом исследовании возникло подозрение на врожденную инфекцию, проводили тремя методами: иммуноцитохимиче-ским, быстрым культуральным, методом генодиагностики (табл. 1, разд. 3). Изучали пробы головного мозга, сердца, лёгких, печени, почек, селезёнки, тимуса, плаценты. Детекцию антигенов HIV A, HIV В, Adeno, HRSV, Rub, HSV в мазках-отпечатках органов осуществляли прямым методом иммунофлюоресценции с помощью флюоресцирующих антител, разработанных в НИИ гриппа РАМН (ООО «Предприятие по производству диагностических

препаратов», Санкт-Петербург). Антиген CMV определяли с помощью моноклонапьных антител против сверхраннего белка р72 CMV, набор «ЦитомегаФлюоСкрин» (НИАРМЕДИК ПЛЮС при НИИ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Москва). Антигены Evs выявляли в реакции непрямой иммунофлюоресценции в соответствии с методическими рекомендациями Л.С. Лозовской и соавт. (1989). В РНИФ использовали диагностические сыворотки к пулам Evs и отдельным штаммам (ФГУП «ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН», Москва). Для БКМ использовали культуру тканей ФЭЧ с последующей идентификацией антигенов в реакции прямой и непрямой иммунофлюоресценции.

Статистическая обработка материала проведена с вычислением интенсивных и экстенсивных показателей и их ошибок. Достоверность различия показателей (р) 2-х групп определена по t-критерию Стьюдента и z-критерию, вычисленных на основе выборочных долей и стандартной ошибки (С. Гланц, 1998; В.И. Сергиенко, И.Б. Бондарева, 2001). При р<0,05 вероятность безошибочного суждения соответствовала 95 %, при р<0,01 - 99 %. Для статистического и графического анализа использован ПК и пакет прикладных программ Statistica V6.0, Exell 2000 для Windows ХР.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Распространенность TORCH-инфекций у женщин репродуктивного возраста г. Хабаровска и сельских районов Хабаровского края

Изучена частота выявления возбудителей инфекций, влияющих на течение беременности и состояние плода и новорожденного. Методом ПЦР обследовано 2 730женщин и 118 девочек 3-6 лет г.Хабаровска, 50 беременных с. Троицкое. В Хабаровске обследованы практически здоровые женщины (группа прегравидарной подготовки) - 125, небеременные с ОАА - 81, женщины с бесплодием - 123, с хроническими воспалительными гинекологическими заболеваниями - 320, эрозией и лейкоплакией шейки матки - 350, вагинозом - 70, а также беременные с физиологически протекающей - 735, осложненной ПН беременностью - 70, с ОАА - 35, женщины разных возрастов - 821.

Частота определения ДНК HSV варьировала от 0 до 8,6 % (рис. 1). В группе женщин с воспалительными гинекологическими заболеваниями ДНК HSV выявляли в 2,4 раза чаще, чем в популяции, что объясняется наличием атипичных и малосим-птомных форм генитальной герпетической инфекции в этой группе. При бесплодии ДНК HSV обнаружена нами в 1,6±1,1 % случаев, тогда как Н.Г. Налбандян и Л.Г. Хачатрян (2004) в Ереване определили ДНК HSV в 7,6 раза чаще (12,2 %) у женщин этой категории с использованием таких же наборов фирмы АмплиСенс.

ДНК CMV детектировали у 0-6,2 % женщин без существенной разницы в исследуемых группах. ДНК - HHV-4 и HHV-8 в генитальных мазках не обнаружили. ДНК HHV-6 определяли редко - у 3,33±1,8 % женщин.

Показатель выявления ДНК Chi. trachomatis в генитальных мазках женщин репродуктивного возраста г. Хабаровска колебался в диапазоне 4,9-15,7 %. Частота детекции Chi. trachomatis при бесплодии и вагинозе была наиболее высокой. В г. Хабаровске у женщин с воспалительными гинекологическими заболеваниями Chi. trachomatis определена в 6,9 %, что не совпадает с данными С.А. Костюк и соавт. (Минск, 2004 г.) - 49,3 %.

40

40

30

20

118У

9 10

CMV

1.6

6.2 3.2 ±2.7

f 0 8 ±0,, . .., ^1±0.8 iOJtl/«1'5,!,'«

3,7 1.7 1,4 26 28

2.3

I 23456789 10

p<0,05 4 и 10

30

20

123456789 10 p<0,05 3 и1, 3 и 2,3 и 4,3 и 7, 6 и 1,6 и 2, 6 и 4, 6 и 7

1 МПрегравидарная подготовка

2 Ш Небеременные с ОАА

3 □ Бесплодие

4 ИХр. восп. гинекол. заб-ния

5 И Эрозии

6 □ Вагиноз

7 В Норм, беремен.

8 0 Беремен, с ПН

? В Беремен, с ОАА юВ Популяция

М. hominis

9 10

54,7' 51,2±2.850 9 48.2 ±4

5.9 47950,0

- ±5.9

±1.8_ ±1.1

123456789 10 Ur. urealyticum р<0,05 4 и 1, 4 и 7

р<0,05 3 и 1,3 и 7, 3 и 10,

6 и 1, 6 и 2, 6 и 4, 6 и 5, 6 и 7, 6 и 10, 8 и 7 Рис. 1. Выявление возбудителей перинатально-значимых инфекций в генитальных мазках женщин г. Хабаровска методом ПЦР (%)

Chi. trachomatis

10,0

6,7 ±3,6 7,9 ±0,6

Инфицирование цервикального канала женщин г. Хабаровска Ur. urealyticum и М. hominis варьировало от 40,0 до 54,7% и от 15,1 до 37,2% соответственно. М. hominis достоверно чаще (р<0,05) определяли при бесплодии, вагинозе и у беременных с ПН. Уровень выявления Ur. urealyticum при хронических воспалительных гинекологических заболеваниях был достоверно выше (р<0,05), чем в группе условно здоровых женщин, готовящихся к беременности, и у женщин с нормально развивающейся беременностью. М. genitalium определяли в 2,4-4,8 % случаев без существенной разницы в изучаемых группах.

Количественный анализ содержания Ur. urealyticum в генитальных мазках 70 женщин, у которых ранее выявлена ДНК возбудителя в ПЦР, подтвердил результаты генодиагностики в 91,4±4,7% случаев. Высокое содержание Ur. urealyticum (в титре > 10x4 КОЕ/мл) обнаружено в 74,3±7,4 %. Причем высокая массивность инфицирования Ur. urealyticum сохранялась более 3 месяцев у 44,2 % женщин, несмотря на 2 курса лечения антибиотиками.

У девочек 1-6 лет с вульвовагинитами и синехиями Chi. trachomatis не выявили. Частота определения М. hominis составила 15,3 %, Ur. urealyticum - 16,9 %, что в 1,4-3,2 раза меньше, чем у взрослых женщин с воспалительными гинекологическими заболеваниями.

Сравнение повозрастной динамики выявления возбудителей ИППП в генитальных мазках у женщин г. Хабаровска в 2002 г. (обследовано 356 женщин) и в 2005 г. (465 обследованных) показало подъемы частоты детекции возбудителей ИППП в возрасте 14— 20 (период повышенной сексуальной активности) и 36-40 лет (наступают возрастные изменения гормонального профиля, дисбаланс рН и соответствующие изменения инфицированное™ половых путей) (рис. 2).

Рис. 2. Частота выявления ДНК Chi. trachomatis и Ur. urealyticum в генитальных мазках у женщин разного возраста (%)

Частота выявления возбудителей ИППП в генитальных мазках беременных женщин села Троицкое Нанайского района была в 2-9,6 раза выше аналогичных показателей городских женщин (р<0,05, рис. 3). В 100,0 % случаев возбудителей ИППП обнаруживали при выраженных воспалительных процессах в генитальном тракте, что свидетельствует о плохой подготовке к беременности и может быть одной из причин высоких показателей ПС в Нанайском районе.

* р<0,05 " рО.О1 *** рО.ОО 1

Рис. 3- Частота выявления ДНК возбудителей ИППП в генитапьных мазках беременных женщин с. Троицкое в сравнении с показателями беременных женщин г Хабаровска (%)

Определено содержание специфических антител к возбудителям инфекций TORCH-комплекса в сыворотках крови 850 взрослых и 162 детей разных возрастных групп - от новорожденное™ до 14 лет.

Частота выявления IgG к HSV и к CMV у женщин репродуктивного возраста г. Хабаровска составляет 97,6-97,2 % (рис. 4). В разных странах эти показатели варьируют от 40,0 % до 90,0 % (К. Фризе, В. Кахель, 2003; В.И. Кицак, 2005; R. Kaur et а!., 2005). Индикаторы первичной герпес-инфекции (IgM+, IgG-, низкоавидные IgG) опре-

Рис. 4. Антитела к вирусам семейства Herpesviridae (%)

Таким образом, инфицирование плода HSV или CMV у беременных женщин г. Хабаровска может происходить, главным образом, не за счет первичного инфицирования с самым высоким риском трансплацентарной передачи, а при реактивации персистирующе-го вируса или суперинфекции. Серологические маркёры активизации персистирующей HSV- и CMV-инфекции (анти-HSV IgM. анти-CMV IgM к структурным и сверхранним белкам) выявляли редко - в 3,2±0,8 %, 2,4±0,7 %, 2,9±1,2 % соответственно.

Анти-HSV IgG чаще всего определяли в высоких титрах 1:6400 и 1:12800 -71.7 %, а анти-CMV IgG - в титрах 1:1600-1:3200 - 53,3 % случаев (рис. 5).

50,0

Рис. 5. Распределение титров анти-HSV IgG и анти-CMV IgG у женщин репродуктивного возраста (%)

Высокий уровень материнских антител класса G к герпес-вирусам в пуповинной крови новорожденных постепенно снижается до 42,4 % в возрасте 3-7 лет к HSV и до 30,8 % к CMV к году. В последующем у детей образуются собственные антитела, частота их определения повышается с возрастом и достигает 98,9-100,0 % у женщин 20-35

до 1 мес. 1мес.-1год 1-3 года 3-7 лет 7-14 лет 20-35 лет

Рис. 6. Возрастная динамика циркуляции антител класса в к герпес-вирусам в крови (%)

На основе тестирования антител установлена значительная инфицированность женщин г. Хабаровска вирусами ННУ-4 и ННУ-6. Антитела класса в к ядерному антигену ННУ-4 выявлены у 70,2±6,0 % женщин, к ННУ-6 - у 100,0±12,5 %. Антитела класса О к HHV-8 определяли редко (1,2±0,4 %).

Самый низкий уровень серопозитивности к хламидиям определен у молодых девушек - студенток медицинского университета (4,4 %), что достоверно ниже (р<0,05), чем у женщин, планирующих беременность (20,0 %). Частота определения анти-хлами 1§М была низкой и колебалась от 0 до 3,6 %, анти-хлами - от 0 до 7,1 % без достоверной разницы в исследованных нами группах.

Изучение иммунитета к вирусу краснухи показало, что 11,6 % женщин из числа планирующих беременность не имеют антител к этому вирусу или имеют их в низких непротективных титрах и нуждаются в вакцинации. 12,0 % беременных на ранних сроках гестации также не имеют защитных антител и представляют группу риска развития краснухи при контакте с больными или носителями. Низкоавидные анти-ЯиЬ определены у 2,1±2,1 % беременных. Среди беременных, имевших кон-

такт с больными краснухой, у 23,8±6,6 % обнаружены анти-ЯиЬ ^М и/или диагно стический прирост титров анти-ЯиЬ Инапарантная форма краснухи, как и манифестная, требует особого наблюдения с учетом клинических, эхографических, эпидемиологических данных, повторных серологических исследований и решения вопроса о дальнейшей тактике ведения конкретной беременной (Р.Г. Десятскова и со-авт., 1998).

Число беременных женщин Хабаровска серопозитивных к возбудителю токсо-плазмоза составляет 26,1 ±2,1 %, в сельских районах Хабаровского края - 56,5±7,3 % (рис. 7). Риск врожденного токсоплазмоза у женщин г. Хабаровска по лабораторным показателям невысок, так как анти-Тохо ^М практически не выявляются, а 4-кратное и более повышение титров анти-Тохо и клинические симптомы токсоплазмоза регистрируются очень редко (0,9±0,9 %). У женщин сельских районов риск врожден-1 ного токсоплазмоза в 9,5 раза выше, чем у жительниц г. Хабаровска (р<0,05). По данным патологоанатомического отделения ДККБ г. Хабаровска, токсоплазмоз при морфологическом исследовании погибших плодов и детей диагностируется в 0-2-х случаях на 200 аутопсий в год. По многолетним наблюдениям В.А. Цинзерлинга и В.Ф. Мельниковой (2002) в Санкт-Петербурге токсоплазмоз в аутопсийном материале определяется в единичных случаях. В Архангельске % выявления анти-Тохо ^М у беременных составляет 9,7 % (О.В. Самодова, 2006), в Ираке - 0,97 % (А.Н. Яаэзак й а!., 2005), в Норвегии - 0,17 % (Р.А. .[епит et а!., 1998).

60 50 40 30 20 10 0

56,5±7.3

Sr. Хабаровск Й Сельские р-ны

2.2+2,1

Анти-Тохо IgM

Сероконверсия

Анти-Тохо IgG

: р<0,05 — в сравнении с г. Хабаровском

Рис. 7. Частота выявления антител к Т. gondii у женщин репродуктивного возраста (%)

Исследование проб цервикального канала и мазков из зева у 50 беременных с ПН на наличие ДНК L. monocytogenes дало отрицательные результаты. При изучении сывороток крови 100 женщин г. Хабаровска с ОАА на содержание антигемагглютини-нов к L. monocytogenes антитела в высоких титрах (>1:400) обнаружены у 25,0±4,3 % обследованных женщин, показано существование природного очага листериоза в г. Хабаровске.

Таким образом, изучена распространенность инфекций TORCH-комплекса у детей и женщин репродуктивного возраста г. Хабаровска и сельских районов Хабаровского края. Выявлены региональные особенности, различия инфицированное™ в зависимости от возраста, а также у городских и сельских жительниц. Частота опре-

18

деления анти-НвУ и анти-СМУ в сыворотках крови женщин репродуктивного возраста г. Хабаровска составляет 97,6-97,2 %, поэтому развитие внутриутробной герпетической или цитомегаловирусной инфекций у женщин г. Хабаровска наиболее вероятно за счет активизации персистирующей инфекции или суперинфицирования. В связи с этим следующей задачей было определение состояния новорожденных от матерей с маркёрами бессимптомной активизации персистирующей герпетической и/или цитомегаловирусной инфекций.

Эффективность антенатальной диагностики ВУИ

Для выполнения вышеуказанной задачи проведено два исследования. В первое включено 490 беременных женщин. Устанавливали значимость выявления таких маркёров продуктивной HSV и CMV-инфекции, как определение антигена, ДНК в генитальных мазках (МФА, МГНК), а также специфических IgM в сыворотках крови (ИФА). Маркёры активизации герпес-инфекций определены у 156 беременных (31,8±2,1%).

1 группа ПН+Вир+ 2 группа ПН+Вир-

14,0

3 группа ПН-Вир+

4 группа ПН-Вир-

1 и 3 р<0,02 1 и 4 р<0 ,01 1 и 3 р<0,001 1 и 4 р<0,001 2 и 4 р<0,001

1 и 2 р<0,02 1 и 3 р<0,05 1 и 4 р<0,001 2 и 4 р<0,05 3 и 4 р<0,02 1 и 2 >0,05 1 и 3 р>0,05 1 и 4 р>0,05 1 и 2 р<0,01 1 и 3 р<0,002 1 и 4 р<0,01 1 и 4 р<0,02

Рис, 8. Отклонения в состоянии здоровья новорожденных в зависимости от наличия у матери ПН и продуктивной герпес-инфекции (%)

Н Тяжелая асфиксия

□ ЗВУР

ШВПР и аномалии

□ Гидроцефалия ЙВУИ

ИЮ Респираторные нарушения 1 и 3 р<0,01

Сравнивали состояние новорожденных у женщин, беременность которых протекала с ПН и продуктивной герпес-инфекцией (1 группа, п=106), женщин с ПН и отрицательными результатами выявления маркёров активизации герпес-инфекций (2 группа, п=38), женщин с нормально развивающейся беременностью и маркёрами продуктивной герпес-инфекции (3 группа, п=50) и женщин с нормально развивающейся беременностью и негативными результатами выявления маркёров активиза- , ции герпес-инфекций (4 группа, п=36).

При сочетании у матери ПН и маркёров активизации герпес-вирусных инфекций (1 группа) определены наиболее тяжелые отклонения в состоянии здоровья новорожденных. В этой группе чаще обнаруживали: асфиксию при рождении, ЗВУР, I врожденные пороки и аномалии развития, респираторные нарушения. Манифестные формы ВУИ с клиническими проявлениями в виде энцефалита, гепатита, генерализованной инфекции встречались только в этой группе. Врожденная гидроцефалия диагностирована только у детей вирус-инфицированных матерей (1 и 3 группы, рис. 8).

У детей 1-й группы находили неврологические синдромы, свидетельствующие о церебральной ишемии 2 степени: угнетение ЦНС, судорожный синдром, внутричерепная гипертензия, вегето-висцеральные нарушения (рис. 9).

1 группа ПН+Вир+

О

2 группа ПН+Вир-

16.0

3 группа ПН-Вир+

14,0

4 группа ПН-Вир-

ЕЭ Синдром угнетения ЦНС

□ Судорожный синдром

□ Внутричерепная гипертензия

В Вегето-висцеральные нарушения

1 и 2 р<0,02

1 и 2 р<0,05 1 и 4 р<0,01

1 и 2 р<0,02 1 и 3 р<0,005 1 и 4 р<0,001

1 и 3 р<0,005 1 и 4 р<0,001 2 и 4 р<0,01

Рис. 9. Неврологические синдромы у новорожденного в зависимости от наличия у матери Г1Н и продуктивной герпес-инфекции (%)

Результаты нейросонографии достоверно чаще фиксировали у новорожденных 1-й группы незрелость, разрыхленность и фрагментарность сосудистых сплетений,

признаки эпендиматита в виде утолщения и подчеркнутости стенок боковых желудочков. Субэпендимальные кисты определены только у детей 1-й группы (рис. 10).

В 3-й группе женщин беременность протекала физиологически, но маркёры бессимптомной продуктивной вирусной инфекции были выявлены. У новорожденных 3-й группы достоверно чаще, чем в 4-й, определены признаки поражения ЦНС, которые могут развиться вследствие ВУИ: незрелость тканевых структур мозга, пе-ривентрикулярное повышение эхогенности, изменения в сосудистых сплетениях. Таким образом, обнаруженные при нейросонографии патологические изменения могут быть связаны не только с внутриутробной гипоксией плода, развившейся в результате ПН, но и с включением в патологический процесс образующегося при реактивации нового вирусного потомства.

■ Незрелость 1 и 3 р<0,001 1 и 4 р<0,001 2 и 3 р<0,001 2 и 4 р<0,001

□ Повышенная эхогенность 1 и 4 р<0,005 2 и 4 р<0,001 3 и 4 р<0,05

В Кисты 1 и 4 р>0,05

ЕЗ Изменения сосуд, сплетений 1 и 2 р<0,001 1 и 3 р<0,05 1 и 4 р<0,001 3 и 4 р<0,05 2 и 4 р<0,05

В Дилатация желудочков 1 и 2 р<0,01 1 и 3 р<0,01 1 и 4 р<0,0001

И Эпендиматит 1 и 2 р<0,01 1 и 4 р<0,01

Рис. 10. Результаты ультразвукового исследования мозга новорожденных при развитии у матери ПН и наличие маркеров продуктивной герпес-инфекции (%)

Проспективное наблюдение детей до года показало, что в 1-й группе чаще регистрировали дистрофию по типу гипотрофии (38,3 %), задержку моторного и умственного развития (53,3 %, рис. 11). Неврологические отклонения не компенсировались к 1-му году у 30,0 % детей и сохранились в виде синдромов: нейромышечной дистонии, мозжечковых нарушений, гидроцефального синдрома. У них же отмечено снижение иммунологической реактивности, формирование иммунодефицитного со-

стояния (28,4 %), которое проявилось большой частотой ОРВИ, бронхитов, пневмоний (43,3 %), гнойно-воспалительных заболеваний кожи и слизистых (31,7 %), рецидивирующей герпетической инфекции (10,0%). Тимомегалия и рецидивирующая герпетическая инфекция определены только при наличии маркёров продуктивной герпес-вирусной инфекции у матери (1 и 3 группа). Резидуальную энцефалопатию наиболее часто диагностировали в 3-ей группе.

Беременность окончилась летальным исходом для новорожденного или развитием стойкой психосоматической патологии у 9 из 156 детей от женщин с выявленными маркёрами активизации герпес-инфекций (5,8±1,9 %). Двое детей из 9 умерли с явлениями генерализованной ВУИ. Инвалидизирующие психосоматические заболевания установлены у 7 детей (2 - гидронефроз с хроническим непрерывно-рецидивирующим пиелонефритом, 4 - окклюзионная гидроцефалия и расстройство психического развития, 1 - глубокая задержка нервно-психического развития).

53,3

1 фуппа ПН+Вир+ 2 группа ПН+Вир-

3 группа ПН-Вир+ 4 группа ПН-Вир-

■ Гипотрофия 1 и 3 р<0,002 1 и 4 р<0.001 2 и 3 р<0.05

□ Частые OP3 и бронхолегочные заболевания 1 и 2 р<0,05 1 и 4 р<0,001 2 и 3 р<0.01 3 и 4 р<0,005

□ Гнойные инфекции 1 и 3 р<0,05 1 и 4 р<0,005 2 и 4 р<0.05

■ Вторичное ИДС 1 и 2 р<0,001 1 и 3 р<0,005 1 и 4 р<0,001

□ Тимомегалия 1 и 2 р<0,005 1 и 4 р<0,01

□ Рецидивирующий герпес 1 и 2 р<0.05 1 и 4 р=0,05 0 Атопический дерматит 1 и 3 р>0,05

□ Задержка развития 1 и 3 р<0,001 1 и 4 р<0,001 2 и 3 р=0.001 2 и 4 р<0,001

□ Резидуальная энцефалопатия 1и2р<0,01 1и4р<0,001 2 и 3 р<0,001 3 и 4 р<0,001

Рис. 11. Заболеваемость детей до 1 года в зависимости от наличия при беременности у матери ПН и продуктивной герпес-инфекции (%)

Таким образом, наиболее прогностически неблагоприятным для новорожденного является сочетание у беременной ПН и продуктивной HSV- и CMV-инфекции. При этом у новорожденных достоверно чаще определяются тяжелые отклонения в

22

состоянии здоровья (асфиксия, ЗВУР, ВПР и аномалии развития, респираторные нарушения, манифестные признаки ВУИ, признаки церебральной ишемии 2-ой степени). В дальнейшем у этих детей сохраняются: стойкий неврологический дефицит, задержка умственного развития, иммунодефицитное состояние.

В связи с разработкой отечественными научно-практическими объединениями новых тест-систем для диагностики ВУИ во втором исследовании определяли прогностическую значимость выявления у беременных ранних маркёров продуктивной ЦМВИ: ДНК-емия, маркёры первичной инфекции, низкоавидные антитела, антитела к предранним (регуляторным) белкам CMV. Всего обследовано 220 беременных с ПН. Для исключения влияния других инфекций определяли маркёры краснухи, ток-соплазмоза, хламидиоза, уреамикоплазмоза.

ДНК CMV в крови обнаружили в 8 случаях, ДНК CMV в церви¡сальном канале-si, анти-CMV IgM к структурным белкам - в 7 (в том числе в 2 - маркёры первичной инфекции - анти-CMV IgM+ и IgG-), анти-CMV IgM к сверхранним белкам -в 7 случаях, низкоавидные IgG - в 1. Эти женщины составили группу риска по реализации внутриутробной ЦМВИ - всего 30 пациенток, или 13,6±2,3 % (1-я группа наблюдения).

Детекция анти-HSV IgG выявила 95,9±1,3 % серопозитивных женщин. Первичная инфекция (анти-HSV IgM+, анти-HSV IgG-) не была определена. Реактивация латентной инфекции (анти-HSV IgM+, анти-HSV IgG+) установлена в 3,6±1,3 % случаев. Низкоавидных антител к HSV не обнаружено. ДНК-емия HSV не выявлена. ДНК HSV в генитальных мазках определена в 4,5±1,4 %. Прогностическое значение обнаруженных маркёров HS V-инфекции было установлено в предыдущем исследовании.

Маркёры острой или рецидивирующей хламидийной инфекции определены у 20 женщин из 220 (9,1±1,9 %): ДНК Chi. trachomatis в генитальных мазках (12), анти-хлами IgM (2) и IgA (9) определены впервые во время беременности (у 3 из 20 обследованных выявлены одновременно два маркёра хламидиоза). Эти женщины составили 2-ю группу наблюдения.

ДНК Ur. urealyticum методом ПЦР в генитальных мазках обнаружена в 88 случаях (40,0±3,3 %). У 2 из этих женщин произошел спонтанный выкидыш, а в абортных тканях определена ДНК Ur. urealyticum.

Не выявлено манифестной или бессимптомной краснухи, первичного (IgM+, IgG-) или текущего (IgM+, IgG+) токсоплазмоза.

Сравнивали течение беременности у женщин 1-ой и 2-ой групп наблюдения и состояние здоровья их детей с показателями группы сравнения (89 беременных с ПН и отсутствием маркёров активации ЦМВИ и хламидиоза), а также с популяционными показателями беременных, новорожденных и детей 1 года жизни г. Хабаровска (группы контроля).

В двух группах наблюдения беременность закончилась спонтанными выкидышами в 8 случаях (16,0±5,2 %), что в 3,1 раза чаще, чем в группе контроля (5,2±0,6 %, р<0,05). В том числе у 3-х из 8 женщин определили ДНК CMV в крови, у 3-х - ДНК Chi. trachomatis в генитальных мазках, у 2-х - Ur. urealyticum в генитальных мазках.

Во время беременности у женщин с маркёрами активизации ЦМВИ осложнения, регистрировали достоверно чаще, чем в группе сравнения: сочетание признаков ПН - в 4,6 раза (р<0,001), СЗРП - в 1,7 раза чаще (р<0,02), утолщение плаценты - в

4,0 (р<0,02), преждевременное созревание плаценты - в 3,3 раза (р<0,02), внутриутробную гипоксию-в 1,7 раза чаще (р<0,01) (рис. 12).

Наличие ДНК СМУ в крови у беременных женщин в 100 % случаев сопровождалось СЗРП и хронической внутриутробной гипоксией, в 3-х из 8 случаев (37,5±18,2%) беременность окончилась спонтанными выкидышами, что в 7 раз выше, чем в группе контроля (5,2±0,6%). Таким образом, ДНК-емия у беременных с ПН - редкий, но прогностически неблагоприятный показатель течения беременности.

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

56.7*"

■ Сочетание признаков ПН ЕЗСЗРП

□ Утолщение плаценты В Прежд. созр. плаценты ЕЭХр. в/у гипоксия

| 1

ПН+ЦМВИ+

пн+цмви-

* р<0,01, ** р<0,02, *** р<0,001 - с группой сравнения

Рис. 12. Течение беременности у женщин с П11 на фоне продуктивной бессимптомной ЦМВИ (%)

Сравнение состояния новорожденных от матерей с ПН и продуктивной ЦМВИ (п=27) с показателями состояния новорожденных г. Хабаровска (п=102) показало, что у детей из группы наблюдения в 2—15 раз чаще регистрировали недоношенность, ЗВУР, кожно-геморрагический синдром, позднее восстановление массы тела, кар-диопатию, нейромышечную дистонию, симптомы церебральной ишемии 2-ой степени, гидроцефалию (р<0,05-0,001, рис. 13).

80 70 60 50 40 30 20 10 0

11,1*

,0 3,71,

44,4*

19,6

о

14.8*

74,1*

11,1*

11,1*

¡3 ° о о £ э I— н 5

37.0*

1,9

ч)

X

33,3*

;; 1,9

о

X 3"

18,5*

3,8 щ Шза

ш си £ Э

ЕЗ Новорожденные от матерей с ПН+СМ\/+ □ Новорожденные гр.контроля

*р<0,05, **р<0,01, ***р<0.001 - с группой контроля

Рис. 13. Здоровье новорожденных от матерей с ПН и маркёрами продуктивной ЦМВИ (%)

В возрасте 1 год у детей группы наблюдения в 2,8-4,5 раза чаще определяли гипотрофию, острую пневмонию, тимомегалию (рис. 14). В конце 1 года жизни у 4 из 27 детей 1-й группы наблюдения (14,8±6,9%) определены ВПР (дефект межжелудочковой перегородки - 1, гидроцефалия - 3), а в группе контроля - у 3 из 102 (пупочная грыжа - 1, ВПС - 1, крипторхизм - 1, 2,9±1,7%). В целом патологические синдромы обнаружены в группе наблюдения в 3,3 раза чаще, чем в группе контроля (100-13,7 % и 30,3±4,5 % соответственно, р<0,05).

50 40 30 20 10

55,6"

19,6

4,9 4,9

2,9 2,9

0 Гипотрофия ОО. пневмония ЕЗТимомегалия Н ВПР

□ Задержка нервно-психического развития

□ Гидроцефалия

Дети от матерей с ПН+ СМ\/+

Дети из популяции

* р<0,05, ** р<0,01 — с группой контроля

Рис. 14. Состояние детей 1 года жизни от матерей с ПН и маркёрами ЦМВИ (%)

У 3 из 20 беременных с маркёрами активной хламидийной инфекции (2-я группа наблюдения) произошел спонтанный выкидыш, у 17 - проследили за течением и исходами беременности (рис. 15). По результатам КТГ, внутриутробная гипоксия установлена в 2 раза чаще, чем в группе сравнения (р<0,02). Наиболее выраженная патология отмечалась со стороны плаценты.

0 В/у гипоксия [±1 Преждевр созр. плаценты Ш Кисты, дефекты плаценты

41.2"

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0

П H-t-Chl.tr.+

* р<0.05. ** р<0,02 — с группой сравнения

Рис. 15. Осложнения течения беременности у женщин с ПН и хламидийной инфекцией (%)

При УЗ-исследовании патологические изменения плаценты (утолщение, преждевременное созревание, кисты, дефекты ворсинчатого хориона, аномалии прикрепления) в группе наблюдения выявлены в 70,6±11,4%, что в 4,5 раза чаще (р<0,001), чем в группе сравнения —15,7±3,9%. Кисты и дефекты плаценты определены только в группе женщин с хламидиозом.

У новорожденных, родившихся от женщин с хламидиозом, в 80,0-85,0 % случаев определили церебральную ишемию гипоксического генеза 1 степени, у половины детей зафиксирован поздний восстановительный период (до 2-х лет). У 47,1±12,5 % детей зарегистрировали церебральную ишемию 2 степени: синдром угнетения или возбуждения ЦНС продолжительностью более 7 дней, вегето-висцеральные нарушения, что в 3 раза чаще, чем в среднем у новорожденных г. Хабаровска (15,7±3,9 %, р<0,05). Проспективное наблюдение за детьми 2-ой группы наблюдения выявило через год только паратрофию (5,9±5,7 %), дисбактериоз (5,9±5,7%), рецидивирующую патологию ЛОР-органов (29,4±11,0 %). Таким образом, следствием сочетания ПН и хламидиоза у беременных являются спонтанные выкидыши, патологическое состояние плаценты, гипоксия плода и церебральная ишемия у новорожденных. Такие исходы связаны с антенатальным заражением плода, встречаются чаще, чем заражение ребенка при прохождении инфицированных родовых путей, которое проявляется хламидийными пневмониями в младенческом возрасте.

У 4-х беременных, у которых выявлены IgG к HHV 6 типа и не было других маркёров активизации ВУИ, удалось проследить за течением беременности и ее исходом. В 3-х случаях по УЗИ установлен СЗРП, в 1-м - внутриутробная гипоксия плода. В 3-х случаях дети родились с гипоксически-ишемическим поражением ЦНС, в 1-м случае - без выраженных патологических симптомов. Эти наблюдения свидетельствуют о возможности участия HHV-6 в развитии перинатальных расстройств. В литературе имеются единичные описания, в которых показана связь HHV-6 с перинатальной патологией (D.M. Zerr et al., 2002).

Таким образом, у новорожденных от беременных с ПН и такими маркёрами репродукции ЦМВИ как ДНК-емия, ДНК CMV в генитальных мазках, анти-CMV IgM к IE, низкоавидные IgG в 2-15 раз чаще, чем в группе сравнения, диагностируется недоношенность, ЗВУР, кожно-геморрагический синдром, позднее восстановление массы тела, кардиопатия и признаки церебральной ишемии 2 степени. В дальнейшем у этих детей чаще регистрируют гипотрофию, острую пневмонию, тимоме-галию, ВПР. Наличие маркёров активизации хламидиоза у беременных ассоциируется с патологическим состоянием плаценты, гипоксией плода, самопроизвольным выкидышем и гипоксически-ишемическим поражением ЦНС.

Ранняя диагностика ВУИ у новорожденных по исследованию плаценты методом ПЦР

Ко времени начала нашего исследования не было разработано тест-систем для экстракции НК из аутопсийного материала, удаления посторонних примесей и получения чистого препарата, пригодного для постановки ПЦР. Аутопсийный материал богат продуктами некроза и аутолиза тканей, распада ядер и клеток. Экспериментальным путем нами были подобраны условия получения чистого препарата нуклеиновых кислот: размельчение, щелочная экстракция, обработка анионным детергентом додецилсульфатом натрия, фенольно-хлороформная экстракция, осаждение этанолом. Такая обработка приводит к денатурации, солюбилизации белка, переходу нуклеиновых кислот в раствор, инактивации нуклеаз. При сравнении инфицированное™ различных участков плацент оказалось, что наиболее часто возбудители ВУИ обнаруживаются в 2-х участках плаценты: в месте разрыва плодных оболочек и в

межворсинчатом пространстве. Это места наиболее вероятного пути проникновения вируса в плаценту и плод при восходящем и трансплацентарном путях передачи. В дальнейшем ограничивались исследованием образцов двух участков плаценты.

Указанным способом проведено исследование 50 плацент у новорожденных. В 4-х случаях определены ДНК инфекционных агентов (8,0±3,8 %) - 2 СМУ, Еуб и иг. игеа1у1кшп. При выявлении ДНК СМУ в плаценте ребенка, родившегося на 36-й неделе с массой тела 2 800 гр., обнаружены воспалительно-дистрофические изменения: отложение фибриноида на поверхности ворсин, псевдоинфаркты, кальци-фикаты, диссоциированное созревание ворсин плаценты, дистрофические изменения в строме ворсин, в стенках сосудов, а у новорожденного - кожные петехии, длительная желтуха, нарушение функции печени. На основании клинических данных, воспалительно-дистрофических изменений в плаценте и результатов генодиагностики сделан вывод о высоком риске реализации внутриутробной ЦМВИ. Даны рекомендации о переводе ребенка из роддома в отделение патологии новорожденных с наблюдением и решением вопроса о лечении, включающем применение иммуноглобулина для внутривенного введения или антицитомегаловирусного иммуноглобулина, виферона, метаболического комплекса и других адекватных мер, наблюдение педиатра, психолога, отоларинголога в постнатальном и младенческом периодах.

Таким образом, нами предложен способ, позволяющий выявлять конкретных возбудителей ВУИ методом ПЦР в пробах плаценты, с целью ранней диагностики ВУИ у новорожденных. Метод запатентован-№ 2005129856/15 (033481), решение о выдаче патента № 236 от 07.06.2006 г. Способ рекомендуется для исследования плаценты у новорожденных, родившихся с клиническими признаками ВУИ.

Оценка роли инфекций матери в генезе фетоинфантильных потерь

Сравнение структуры ПС проводили по материалам патологоанатомического отделения ДККБ и обсервационного роддома №11 г. Хабаровска. Проанализировано 246 протоколов вскрытия при ПС за 1988 г., 226 - за 2003 г. и 132 - за 2007 г. Частота выявления ВУИ как основной причины смерти в 2003 г. и 2007 г. увеличилась в 3,54,2 раза (р<0,01) по сравнению с 1988 г. и составила 35,8±3,2 % и 42,4±4,3 % соответственно (рис. 16).

Если учесть, что при морфологическом исследовании ВУИ диагностируется не только как основное, но и как сочетанное и фоновое заболевание, то в целом в структуре ПС в 2003 г. и 2007 г. признаки ВУИ определили в 92,3±1,8% случаев и 97,8±1,3 % случаев, что в 2,2-2,4 раза чаще, чем в 1988 г. (41,5±3,1 %, р<0,05).

В последние годы ВУИ при аутопсиях чаще регистрировали в генерализованной форме. Так в 1988 г. генерализованные формы составили 6,5±1,6 %, в 2003 г. — 23,0±2,8 %, а в 2007 г. - 78,7±3,5 %. В 2003 г. причиной ПС в 11,5±2,1 % случаев стал сифилис, который не регистрировали в прошлые годы. В 2007 г. частота выявления сифилиса достоверно не снижается - 9,8±2,6 %. Если в 1988 г. в аутопсийном материале преобладали гнойно-воспалительные реакции, то в 2003 г. и 2007 г. - гнойные и продуктивно-альтеративные процессы установили в соотношении 1:1.

100 90 -j 80 70 J 60 j 50 -j 40 J 30 H 20 j 10 j 0 -

"pO.Ol,

34,3

1988

□ Асфиксия

□ СДР В ВУИ

ЕЭ Врождённые пороки

jf И Другие

2003

2007

" р<0,001 - в сравнении с 1988 г. ° - р<0,001 - в сравнении с 2003 г.

Рис. 16. Динамика изменений структуры ПС (%)

В 2007 г. в 2,3 раза снизилась частота врожденных дефектов (8,3±2,4 %) по сравнению с 2003 г. (19,0±2,6 %, р<0,01), что связано с улучшением выявления врожденных дефектов при УЗ-исследовании беременных на ранних сроках и своевременным медицинским прерыванием беременности.

30

ИТяжелая анемия В Экстрагенитальные заболевания

25,7±3,7"

1988

2003

2007

* р<0,01, ** р<0,001 - в сравнении с 1988 г; 0 - р<0,05 - в сравнении с 2003 г.

Рис. 17. Состояние до беременности матерей погибших плодов и детей (%)

Рост ВУИ в структуре ПС можно объяснить ухудшением состояния здоровья женщин фертильного возраста до беременности. Экстрагенитальные заболевания, тяжелая анемия, болезни мочеполовой системы выявлены в 2,0-16,0 раза чаще, чем в 1988 г. (рис. 17). Снижение иммуноэндокринного статуса, низкий уровень прогестерона и высокая доля вторичных иммунодефицитных состояний определены у беременных женщин г. Хабаровска сотрудниками нашего института в прежние годы (Е.П. Когут и со-авт., 1995, 2001; C.B. Кузнецова, 1998).

Парко- и никотинозависимыми в 2003 г. и 2007 г. были 6,9 и 7,2% рожениц. Не становятся на учет по беременности и не наблюдаются в женских консультациях до 20,0 % женщин. Длительный безводный период в родах (до 14 суток) был у 20,0 % матерей погибших плодов и новорожденных, что отражает не только влияние ВУИ. но кроме того - недостаточную осведомленность женщин о течении беременности и родов. Возраст вступления в половые отношения снизился до 12 лет. ')ти факты связаны с деструктивными процессами в обществе, равнодушным отношением части молодых женщин к состоянию своего здоровья и здоровья ребенка.

Частота и структура возбудителей ВУИ при фетоинфантильных потерях

Тремя методами (МФА, БКМ и ПЦР) проведено исследование аутопсийного материала от 38 погибших плодов и новорожденных с морфологическими и клиническими признаками ВУИ.

Таблица 2

Характерные для отдельных возбудителей морфологические изменения,

обнаруженные при детекции вирусов разными методами в пробах _ органов погибших плодов и новорожденных_

№ Данные протокола вскрытия Органы Вирус, метод Морфологические признаки ВУИ

1 Поздний выкидыш на сроке 26 нед. гестации, масса тела 970 гр. Клинический диагноз: генерализованная ВУИ, ЗВУР Головной мозг Сердце Печень Evs (ПЦР) Evs (ПЦР) Evs (МФА) Генерализованная форма инфекции: продуктивное воспаление в строме миокарда и почек, интерсти-ции легких, пролиферация бронхиального эпителия в форме «подушечек». В плаценте - очаговые кровоизлияния, некроз и склероз стромы ворсин

2 Преждевременные роды на 29 нед. гестации, прожил 2 дня, масса тела 1 600 гр. Клинический диагноз: асфиксия, СДР, гиалиновые мембраны Почка, печень Лёгкое, печень HIV А (МФА) H1V А (ПЦР) Двухсторонняя серозно-геморрагическая пневмония с очаговыми некрозами, «подушкообразное» разрастание бронхиального эпителия, десквамация альвеоцитов с явлениями кариорексиса; бропхоле-гочная дисплазия. Неравномерное расправление расиираторного отдела (очаги ателектаза и острой эмфиземы, гиалиновые мембраны), в децидуальной пластине плаценты - крупные клетки с гиперхром-ными ядрами.

3 Поздний самопроизвольный выкидыш, 26 нед. гестации, масса тела 970 гр. Клинический диагноз: генерализованная ВУИ Лёгкое Почки Печень Головной мозг HSV (МФА БКМ ПЦР) HSV (МФА) HSV (МФА) HSV (ПЦР) Генерализованная форма ВУИ: продуктивный лимфоцитарный менишоэнцефалит, интерстици-альная пневмония, эпиренит, мелкоузелковый некротический гепатит, кровоизлияния в надпочечниках, головном мозге и миокарде. Вилочковая железа гипоплазирована. Крупные ДНК-вирусные клетки с гиперхромными ядрами в эпителии бронхов. Гипоплазия плаценты, продуктивно-некротический лимфолейкоцитарный плацентит.

Антигены или геном вирусов обнаружены у 28 обследованных (73,7±7,1 %). В большинстве случаев определено сочетание возбудителей (55,3±8,0 %), моноинфекции выявлены в 18,4±6,2 %. Один и тот же патоген диагностирован у 28,9±7,3 % погибших плодов и детей одновременно методом ПЦР, который регистрирует нуклео-

тидные последовательности генома возбудителя, и с помощью БКМ и/или МФА, определяющих репродуцирующийся вирус. При этом были зафиксированы патогномо-ничные для отдельных инфекций морфологические изменения (табл. 2).

Частота детекции отдельных возбудителей с использованием трех методов оказалась следующей: Evs - 34,2±7,7 %, HSV - 26,3±8,2 %, CMV - 26,3±8,2 %, респираторные вирусы - 23,7±6,7 %, Rub - 5,3±3,6 %, HHV-6 - 2,6±2,5 %. Среди энтеровиру-сов преобладали ECHO 22 типа, Коксаки Al-6, 11-15, 22 типов, Коксаки В1, 1-6.

Применение 3-х методов исследования аутопсийного материала объективизирует результаты, но длительно и трудоемко. Метод ПЦР лишен субъективности в оценке результатов реакции, присущей МФА и БКМ, а главное с его помощью в одной пробе можно в течение 1-2 дней проводить детекцию большого числа вирусных и бактериальных агентов, в частности трудно культивируемых (PV-B19, Rub, Chi. trachomatis, Ur. urealyticum, M. hominis). Последующее изучение аутопсийного материала при фетоинфантильных потерях осуществляли только методом ПЦР-диагностики с расширенным спектром выявляемых возбудителей.

Было проведено исследование образцов хориальной и плодовой тканей от ранних спонтанных выкидышей (135 проб) в сопоставлении с аналогичным материалом от добровольных медицинских абортов (70), а также проб, полученных при аспира-ционных биопсиях эндометрия вне беременности у женщин с невынашиванием (32) (рис. 18).

0HSV E3CMV В Evs В Chi. tr. ИМ. hom. ИМ. gen. Ш Ur. ur.

* р<0,001 - в сравнении с материалом от ранних спонтанных выкидышей и медицинских абортов

Рис. 18. Частота выявления возбудителей ВУИ в пробах аспирационных биопсий эндометрия при привычном невынашивании беременности и в образцах хориальной и плодовой тканей при ранних спонтанных выкидышах (%)

В аспиратах эндометрия женщин с привычным невынашиванием беременности процент инфицированных образцов (65,6±8,3 %) был в 2,2 и в 2,9 раза выше, чем в материале от ранних спонтанных выкидышей (30,4±3,9 %, р<0,01) и медицинских абортов (22,9±5,0 %, р<0,01). В пробах эндометрия и в тканях плодов при ранних выкидышах чаще определяли 2-3 возбудителя, а в материале от медицинских абортов - моноинфекции. В аспиратах полости матки и в тканях погибших плодов чаще всего обнаруживали

возбудителей уреамикоплазмоза - 37,5±12,1 % и 23,7±3.7 %. что в 3,3-2,1 раза выше, чем при добровольных медицинских абортах - 11.4±3,8 % (р<0,05). Кроме того, в тканях погибших плодов и эндометрии выявляли HSV, CMV, [as и Chi. trachomatis. L. monocytogenes обнаружена в одном случае в тканях плода при раннем спонтанном выкидыше.

Таким образом, детекция генома возбудителей ВУИ в образцах тканей погибших на ранних сроках гестации плодов и в пробах эндометрия показала значительную роль инфекционных процессов и трансмурального пути передачи в генезе потерь плода на ранних сроках гестации.

Методом Г1ЦР проведено изучение проб органов и плаценты от 80 случаев гибели плодов и новорожденных с признаками ВУИ, установленными клинически и при морфологическом исследовании (табл. 3).

Таблица 3

Частота обнаружения возбудителей ВУИ при потерях плода и новорожденного

методом ПЦР (п=80)

Срок гестации 16-28 нед. Срок гестации 28—37 нед. Срок гестации

38-40 нед.

поздние самопроизвольные мертворожденные — 9

выкидыши недоношенные живорожденные — 14 мертворожденные — 8

живорожденные — 3

п = 46 п = 23 п= 11

моноинфекция

CMV-5 Evs-2 HSV-3

HSV-6 CMV — 2 Evs - 1

Evs-4 L. mon. — 1 HHV-6-1

HHV-6 - 1 HIV А- 1

L. топ. - 8

смешанны ей нфекции

HSV+HRSV — 1 CMV+Evs - 1 CMV+Evs - 1

HSV+CMV+ Chi. tr. -2 Evs+Rub+HHV-6 — 1 Rub+Evs - 1

HSV+CMV+Rub - 1 Evs+Chl. tr.+L. mon. - 1

CMV+ Evs+Ur. ur. - I CMV+HHV-6-2

HSV+L. топ. - 1 HSV+Evs+HRSV — 1

H11V-6+L. топ - 1

Evs+Ur. ur.+Chl tr - 1

Всего положительных результатов (абс / %±m)

32 /69,56±6,8 И / 47,83±10,4 8 / 72,73±13,4

Геном возбудителей ВУИ обнаружен в 51 случае (63,8±5,3 %). Среди положительных находок преобладали моноинфекции (43,8±5,5 %), сочетание возбудителей определено в 20,0±4.5 %. Чаще всего выявляли ДНК HSV. CMV, Evs. При этом морфологически была установлена ВУИ в генерализованной форме с поражением 3-5 органов и плаценты. Частота детекции отдельных возбудителей показана на рис. 19.

В мае-сентябре 2005 г. в аутопсийном материале от 10 поздних выкидышей из 23 исследованных (43,5±10,3%) была определена ДНК L. monocytogenes. Культу-ральные, биохимические исследования этого же материала, а также конъюнктивапь-ная проба на морских свинках позволили показать вирулентность выделенных

штаммов. В последующем выявление ДНК L. monocytogenes было спорадическим. В случаях детекции L. monocytogenes в аутопсийном материале в анамнезе у матерей были указания на лихорадку до 39°С во время беременности и родов, зеленый или желтый цвет околоплодных вод. Морфологически были обнаружены признаки ВУИ в форме генерализованной инфекции, гранулёзно-некротические изменения в печени, почках и селезёнке.

Вирус HHV-6 обнаружен в 4-х случаях в сочетании с другими возбудителями, а в 2-х - в виде моноинфекции. Морфологически при этом определили ВУИ в генерализованной форме.

Если в целом при исследовании материала от 80 плодов и новорожденных ДНК Chi. trachomatis определена в 5,0 % случаев, то при целенаправленном изучении 20 плацент с наличием выраженных воспалительных процессов и/или дефектов развития установлен более высокий уровень выявления Chi. trachomatis - 45,0±11,1 %.

Вирус краснухи определен в 3-х случаях, при этом не было анамнестических сведений о контакте матери с больным краснухой.

Учитывая тропизм PV-B19 к эритропоэтическим клеткам и эритробластам, способность вызывать анемию, отеки, многоводие, обследовано 16 погибших плодов с отечно-геморрагическим синдромом, PV-B19 не обнаружен.

Не выявлены ДНК М. genitalium, Т. gondii, HHV-4, HHV-8, HIV В, Adeno.

18,7+4,3

18,7±4,3

18,7+4,3

15,0±3,9

5,0±2,4

3,8±2,1

3,8±2,1

ШИШ ■ИИ 2 5±1 7

<р>

Рис. 19. Частота выявления возбудителей ВУИ в аутопсийном материале от погибших плодов и новорожденных с морфологическими признаками инфекционно-воспалительных процессов (%±т)

Установлена зависимость частоты выявления отдельных возбудителей ВУИ от сроков гестации. При ранних выкидышах чаще определяли Ur. urealyticum, Chi. trachomatis, при поздних - HSV, L. monocytogenes, CMV при гибели плода и новорожденного на сроке больше 28 недель гестации - Evs, CMV (рис. 20).

■ НБУ □ СМУ ЙЕуэ 01_. топ. 0СЫ. ¡г. 0 иг. иг.

Ранние выкидыши

Поздние выкидыши

Перинатальная смертность

* р<0.05, ** р<0,01 — в сравнении с ранними выкидышами; ° р<0,05 — в сравнении с поздними выкидышами.

Рис. 20. Частота выявления возбудителей ВУИ методом ПЦР в органах погибших плодов и новорожденных в зависимости от срока гестации (%)

В изученном аутопсийном материале морфологические воспалительные изменения, свойственные вирусным инфекциям, установлены в 65,2±5,7 %, вирусно-бактериальным - в 34,8±5,7 %.

При детекции вирусов в изучаемых органах были обнаружены явления серозного, альтеративного, продуктивного воспалительного процесса - продуктивный лимфолейкоцитарный плацентит, продуктивный лимфоцитарный и серозно-лимфоцитарный энцефалит, пролиферативный эндоваскулит сосудов головного мозга, интерстициальная продуктивно-лимфоцитарная пневмония, очаги некроза в тканях легких, кариорексис в клетках бронхиального эпителия, продуктивный межуточный гепатит, миелоидная инфильтрация печеночных долек, интерстициальный фиброз поджелудочной железы, узелковое воспаление в надпочечниках. Регистрировали признаки длительного инфекционного процесса: клеточные инфильтраты в строме органов, очаги некроза с образованием кист, воспалительные гранулемы, кальцифи-каты. Фиксирован гигантоклеточный метаморфоз в различных тканях погибших: «ДНК-вирусные клетки» - увеличенные иногда до гигантских размеров клетки с крупными гиперхромными ядрами (иногда с ядрами неправильной формы) с явлениями глыбчатого или мелкоглыбчатого распада ядра, как правило, рядом с этими клетками находились очаги скопления лимфоцитов и очаги некроза; «РНК-вирусные клетки» - крупные, светлые клетки со светлыми крупными ядрами и мелкозернистой цитоплазмой. В этих же отделах отмечали отек, лимфоцитарную инфильтрацию и очаги некроза, иногда с кальцификатами. В 40,0 % случаев были выявлены признаки недостаточности иммунной системы: отсутствие явлений акцидентальной трансформации тимуса, лимфоидная гиперплазия и преждевременная жировая трансформация тимических долек, кистозное перерождение тимических телец, признаки гипоплазии тимического ретикулоэпителия.

Обнаружена патогномоничность морфологических изменений при детекции отдельных инфекционных агентов (табл. 4).

Таблица 4

Антенатальные воспалительные поражения органов и выявленные инфекционные агенты

Характерные морфологические изменения Возбудитель

Серозно-геморрагическая пневмония, «подушкообразное» разрастание бронхиального эпителия, десквамированные альвеолоциты с крупными светлыми ядрами, явления кареорексиса, бронхолегочная дисплазия с преобладанием интерстиции HIV А

ДНК-вирусные клетки в плаценте, лимфоцитарный менингоэнцефа-лит, ВУИ в генерализованной форме, продуктивно-некротический гепатит, интерстициальная пневмония HSV

Продуктивная инфильтрация в строме миокарда, язвенно-некротический энтероколит, РНК-вирусный плацентит Evs

Фиброкистоз околоушных желез, ДНК-вирусный метаморфоз, ВУИ в генерализованной форме, гепатит, миокардит, плацентит CMV

Продуктивный мелкоузелковый некротический гепатит, плацентит L. mon.

Плацентит, патологическая незрелость плаценты, пороки развития плаценты, децидуальные клетки с базофильными включениями Chi. tr.

Отдельные возбудители ВУИ определялись в разных органах, что объясняется способностью инфекционных агентов хорошо размножаться в эмбриональных тканях. Самый высокий показатель детекции вирусов был в селезёнке и тимусе - по 9,6±1,6 %, почках - 7,3±1,4 %, лёгких - 4,9±1,1 %.

Показана возможность использования метода ПЦР для выявления причин младенческой смертности. При изучении аутопсийного материала в случаях младенческой смертности обнаруживали ДНК CMV, РНК Evs в пробах почек, печени, сердца в сочетании с фиброэластозом в мышцах и эндокарде сердца, персистенцией эмбриональных тканевых структур почек и легких, выраженными явлениями миелоидной инфильтрации печеночных долек, нарушением тканевого строения органов иммуно-эндокринной системы, которые свидетельствовали о длительном антенатальном инфекционном процессе. Присоединение острой респираторной вирусной инфекции (HRSV, HIV А) приводило к развитию инфекционного процесса в лёгких, вызывало резкую и очень быструю декомпенсацию.

Таким образом, использование метода ПЦР перспективно для выявления возбудителей ВУИ в аутопсийном материале при фетоинфантильных потерях, позволяет проводить экспресс-диагностику широкого круга вирусов и бактерий, в том числе трудно культивируемых, в аутопсийном материале. Этиологическая роль выявленных вирусов подтверждается наличием патогномоничных и неспецифических альте-ративно-продуктивных и диспластических изменений в тканях, гигантоклеточным метаморфозом, морфологическими признаками иммунодефицитного состояния.

Бессимптомные и персистирующие инфекции матери как тератогенный фактор

Анализ 2 832 протоколов вскрытия погибших плодов и новорожденных за 10-летний период (с 1993 по 2002 г.) показал, что частота врожденных дефектов при

фетоинфантильных потерях колебалась по годам от 12 до 24 на 100 летальных случаев с пиком в 1998, 2000, 2004 гг. Подъем частоты летальных врожденных дефектов произошел синхронно с экологическими катастрофами - обширными лесными пожарами в эти годы в Хабаровском крае. Дым содержит тератогенные факторы и способствует развитию гипоксии плода.

Анализ ВД показал, что группа «гаметопатии» составила 19,79 % (рис. 21). Нарушения развития плода в результате хромосомных аберраций определены в 37 случаях (7,71 %): синдром Дауна (30 случаев), синдром Эдвардса (3), синдром Патау (3), синдром Тернера (1). Генные нарушения, передающиеся по законам Менделя (33), и с неуточненным типом наследования (25) составили 12,1 %.

Среди ВД наиболее многочисленна группа «бласто- и эмбриопатий» - 59,8 %. Изолированные и системные ВПР составили 38,1 %, в том числе ВПР центральной нервной системы — 13,9 %, сердечно-сосудистой системы - 12,5 %, органов пищева-I рения — 5,6 %, бронхолёгочной системы — 3,9 %, почек и мочевыводящих путей -1,7 %. Множественные неклассифицированные комплексы обнаружены в 21,7 %.

МВПР-

Дисплазии -

Хромосомные и наследственные синдромы -19,79

Изолированные ВПР-

38,13

Рис. 21. Структура врожденных дефектов развития при фетоинфантильных потерях (%)

Врожденные дефекты по типу тканевых дисплазий или фетопатии явились причиной смерти плода или новорожденного в 20,4 %, при этом во всех случаях гистологическое исследование показало наличие диспластических процессов в органах иммунной системы. Кроме того, тканевые дисплазии выявляли в сочетании с гамето-и эмбриопатиями. Фетопатии могут развиться в результате генерализованной ВУИ с преобладанием альтеративного и экссудативного компонента с исходом в фиброзно-склеротические деформации органов. Чаще всего в головном мозге находили нарушение цитоархитектоники коры больших полушарий, микрополигирию, в сердце -очаговый фиброэластоз, липоматоз, в лёгких — бронхиоло-сосудистую дисплазию, дистелектаз, гипоплазию, бронхиальные кисты, в почках — микронефронию, олиго-нефронию, дисплазию с наличием эмбриональных клубочков, в печени - гипоплазию и пролиферацию внутрипечёночных желчных ходов, в поджелудочной железе - не-зидиодисплазию, в надпочечниках — гипоплазию коркового и мозгового слоев, дисплазию мозгового слоя, аденоматоз, в тимусе -тимомегалию, дисплазию тимических долек, преждевременную жировую трансформацию.

35

Методом ПЦР изучены образцы органов от 58 погибших плодов и новорожденных с врожденными дефектами развития, морфологическими проявлениями ВУИ и тканевыми дисплазиями (табл. 5). Геном возбудителей ВУИ определен в 60,34 % исследованных случаев, моноинфекции обнаружены - в 44,83 %, смешанные инфекции-в 15,52%.

Таблица 5 1

Частота выявления возбудителей перинатальных инфекций при фетоинфантильных потерях с врожденными дефектами развития методом ПЦР

№ Врожденная аномалия п абс Моноинфек- Сочетание

п/п %±т ции возбудителей

1 Изолированные и 21 14 ШУ-4 СМУ+ЯиЬ - 1

системные врожденные 66,67±10,3 СМУ-1 НЭУ+СМУ - 1

пороки развития, тканевые дисплазии Буе-2 ЛиЬ-З НЯБУ- 1 Ь. топ.+ННУ-6 -1

2 Неклассифицированные комплексы МВПР, тканевые дисплазии 17 7 41,17±11,9 НЭУ- 1 СМУ-2 Еув-З ШУ+СМУ - 1

3 Генерализованная ВУИ, 20 14 НЭУ —4 НЗУ+ЕУ8-1

тканевые дисплазии 70,0±10,2 СМУ-З Еув - 2 НвУ+ЯиЬ - 1 СМУ+ЯиЬ - 1 СМУ+ННУ-6-1 СМУ+Еув+ННУ-б -1

4 Всего 58 35 60,34±6,4 26 44,83±6,5 9 15,52±4,8

Частота детекции отдельных инфекционных агентов показана на рис. 22. Возбудители токсоплазмоза, хламидиоза, уреамикоплазмоза, вирус Эпштейна-Барр, РУ-В19 не выявлены.

нэу ему

10,3

| «

1 и 1,7 1,7

ННУ-6 НКЗУ 1_.топ

Рис. 22. Частота выявления возбудителей ВУИ при исследовании аутопсийного материала от погибших плодов и детей с врожденными аномалиями развития методом ПЦР (%)

Частота определения возбудителей TORCH-инфекций варьировала в различных органах от 4,9±1,5 % (в сердце) до 8,8±1,9 % (в почках). В случаях выявления РНК Rubella в аутопсийном материале в анамнезе у матери не были зарегистрированы заболевания краснухой или контакт с больным краснухой перед зачатием или во время беременности, тем не менее РНК Rubella обнаружили в 10,3±5,8 %. Источником краснушной инфекции для беременной могут быть не только дети с манифестной формой инфекции, но и дети, и взрослые со стертой, бессимптомной или субклинической инфекцией. Эти факты требуют более тщательной диагностики бессимптомной краснухи у беременной, в частности при заболевании ОРВИ.

Органотропность возбудителей ВУИ проявлялась в формировании патогномо-ничных морфологических изменений (табл. 6).

Таблица 6

Врожденные дефекты и выявленные возбудители ВУИ

Врожденный дефект Возбудитель

Аплазия лёгкого, ложная или истинная диафрагмальная грыжа с вторичной гипоплазией лёгкого HRSV, HSV, HIVA

МВПР, включающие пороки сердца (общий артериальный ствол, транспозиция магистральных сосудов, продуктивная инфильтрация в строме миокарда) и глаз (катаракта). Rub

Гастрошизис, болезнь Гиршпрунга, врожденные пороки сердца, микроцефалия, аденоматоз надпочечников, синдром МВПР Evs

Микроцефалия, гидроцефалия, поликистоз больших полушарий головного мозга, порэнцефалия, спинномозговая грыжа, глиоматоз головного мозга, стеноз аорты, фиброкистоз околоушных желёз, поликистоз и аденоматоз коры надпочечников, множественные диспла-стические пороки, поликистоз почек, гипоплазия лёгких, гипоплазия и дисхрония лёгких, гипоплазия и кальцификация тимуса, тимома лимфоидного типа CMV

Врожденная тимома, дистелектаз лёгких, полимикрогирия, микроэн-цефалия, гидроцефалия, порок лёгкого, нейробластома крестцово-копчиковой области, аденоматоз надпочечников, лимфангиома шеи HSV

Пороки последа: пороки пуповины и ее прикрепления, добавочная долька плаценты L. mon. Chi. tr.

Известно, что для каждого органа существуют критические периоды, которые соответствуют стадии максимального напряжения обменных процессов в ходе его формирования. Если инфицирование плода происходит в одни и те же периоды развития, то разные вирусы обусловливают сходные нарушения. С другой стороны, один и тот же вирус, поражая зародыш в разные гестационные сроки, приводит к формированию разных ВПР. В наших наблюдениях в 34,5 % случаев врожденных ле-

тальных дефектов были определены морфологические признаки генерализованной ВУИ, диспластические процессы в тканях с формированием врожденных дефектов нескольких органов, при этом обнаруживали различные вирусы и бактерии и их сочетания. В остальных случаях установлены типичные для конкретных возбудителей ВПР, а также выявлены ранее не описанные: при выявлении HRSV - аплазия и гипоплазия лёгких, при Evs - гастрошизис, болезнь Гиршпрунга, при HSV - нейробла-стома крестцово-копчиковой области, при L. monocytogenes и Chi. trachomatis - пороки последа.

Таким образом, детекция нуклеотидных последовательностей возбудителей ВУИ в аутопсийном материале при врожденных летальных дефектах развития с дис-пластическими изменениями в тканях установила ведущую роль инфекционного процесса в мультифакториальной природе тератогенеза.

С целью определить возможность участия ВУИ в формировании хронических воспалительных заболеваний лёгких у детей изучено 22 случая гибели плодов с гистологически выявленными бронхолёгочными дисплазиями (дистелектаз, фиброзная дисплазия, очаговая гипоплазия бронхиол, незрелость лёгочной ткани с преобладанием стромальных компонентов, периваскулярный фиброз в виде муфт). Инфекционные агенты установлены в виде моно- и смешанных инфекций в 15 случаях (68,2±9,9 %), в том числе Evs - 5 случаев, CMV - 4, Rubella - 4, HHV-6 - 2, HSV - 2, HRSV - 1. Не определены такие инфекционные агенты как Т. gondii, HHV-4, Chi. trachomatis, М. hominis, Ur. urealyticum. Анализируя полученные результаты, можно заключить, что ВУИ могут быть одним из механизмов формирования бронхолёгоч-ных дисплазий и хронических рецидивирующих заболеваний бронхолёгочной системы у детей младенческого и старшего возраста.

Проведенные исследования позволили усовершенствовать дородовую и раннюю диагностику у новорожденных, уточнить существующие представления и получить новые данные о распространенности и путях передачи ВУИ, о влиянии отдельных возбудителей TORCH-комплекса на формирование фетоинфантильных потерь и врожденных дефектов развития, заболеваемости новорожденных и младенцев. Плацентарная недостаточность и перинатальная гипоксия обуславливают активизацию персистирующих инфекций. Это сопровождается появлением нового вирусного потомства. Вероятность инфекционного поражения плода зависит от вирусной нагрузки, от сочетания инфекции с другими патогенетическими факторами, при этом вирусная инфекция может играть коморбидную роль, провоцируя или усиливая патогенетические процессы. Исходы беременности для плода при этом варьируют от отсутствия клинических проявлений или неспецифических симптомов и нарушения процессов адаптации у новорожденного до клинически выраженных форм в раннем или отдаленном периодах. Дородовое выявление активизации вирусной инфекции способствует формированию групп риска, направлено на предупреждение врожденной патологии.

Потеря плода и ребенка - всегда трагедия для семьи. Использование современного молекулярно-биологического метода ПЦР для детекции возбудителей ВУИ в аутопсийном материале позволяет найти вероятное этиологическое объяснение причин фетоинфантильных потерь и врожденных дефектов, способствует адекватной реабилитационной терапии женщин и улучшению прогноза и исхода будущих беременностей. ВУИ - важное патогенетическое звено в совокупности факторов, обу-

словливающих формирование потерь плода и новорожденного. При выявлении в ау-топсийном материале Chi. trachomatis, Ur. urealyticum, Listeria monocytogenes необходимо лечение матери антибиотиками. При детекции таких возбудителей как Rubella и Toxoplasma gondii образуется стойкий иммунитет, предотвращающий гибель плода при следующей беременности. Определение в аутопсийном материале Herpes simplex virus, Cytomegalovirus, Enteroviruses требует мероприятий по укреплению неспецифического иммунитета. Развитие патологических процессов при мультифакториаль-ной этиологии ВПР возможно только при наличии всех патогенетических факторов. Разработка метода детекции инфекционных агентов с помощью ПЦР практически в любом клиническом материале, в том числе аутопсийном, биопсийном, постоянно пополняющийся список выпускаемых амплификационных тест-систем для ПЦР расширяют возможности диагностики ВУИ. Метод ПЦР перспективен для применения в разных областях педиатрии: для исследования клинического материала у новорожденных с врожденными пневмониями, неонатальным сепсисом, везикулопустулёзом, с перинатальным поражением ЦНС, в хирургии ВПР и т.д.

Выводы

1. Выявлены региональные особенности распространенности инфекций TORCH-комплекса у женщин репродуктивного возраста г. Хабаровска, различия инфицированное™ в зависимости от возраста, у городских и сельских жительниц, в различных группах беременных и небеременных женщин. Установлено высокое содержание антигерпетических и антицитомегаловирусных IgG в сыворотках крови (97,6-97,2 %), вследствие чего развитие внутриутробной герпетической или цитомегаловирусной инфекции наиболее вероятно за счет активизации пер-систирующей инфекции или суперинфицирования.

2. У новорожденных, родившихся от матерей, беременность которых протекала с плацентарной недостаточностью и маркёрами активизации герпетической и/или цитомегаловирусной инфекции (антигены вируса простого герпеса, ДНК вирусов простого герпеса или цитомегалии в цервикальном канале, анти-HSV или анти-CMV IgM в сыворотках крови), достоверно чаще, чем в группах сравнения установлены тяжелые отклонения в состоянии здоровья: асфиксия при рождении (16,9%), ЗВУР (52,6 %), врожденные пороки и аномалии развития (29,2 %), манифестные признаки внутриутробных инфекций (16,9%), респираторные нарушения (13,2%), признаки церебральной ишемии 2-й степени (12,2-40 %). В течение первого года жизни у этих детей сохранялась неврологическая симптоматика (30,0 %), формировались задержка моторного и умственного развития (53,3 %) и иммунодефицитное состояние (28,4%).

3. У новорожденных от матерей с физиологически протекающей беременностью и бессимптомной продуктивной герпес-инфекцией с помощью нейросонографии определены признаки инфекционного поражения структур мозга: незрелость тканевых структур, признаки эпендиматита в виде утолщения и подчеркнутости стенок боковых желудочков, разрыхленность и фрагментарность сосудистых сплетений боковых желудочков, дилатация желудочков, перивентрикулярное повышение эхогенности.

4. У новорожденных от матерей с плацентарной недостаточностью и такими маркёрами активизации цитомегаловирусной инфекции, как ДНК-емия, анти-CMV IgM к сверхранним и структурным белкам, маркёры первичной инфекции (IgM+IgG - и низкоавидные IgG) в 2-15 раза чаще, чем в группе контроля, выявлены недоношенность, ЗВУР и признаки церебральной ишемии 2 степени. В дальнейшем у этих детей чаще регистрировали гипотрофию, острую пневмонию, тимомегалию, ВПР.

5. Разработан и апробирован способ диагностики внутриутробных инфекций у новорожденных в первые дни жизни путем исследования плаценты методом ПЦР. Способ позволяет при неспецифических клинических проявлениях внутриутробной инфекции у новорожденных идентифицировать вид возбудителя и проводить адекватную терапию.

6. Установлена значительная роль инфекционных процессов и трансмурального пути заражения в генезе потерь плода на ранних сроках гестации. В образцах хо-риальной и плодовой ткани при ранних самопроизвольных выкидышах и в пробах эндометрия при невынашивании беременности инфекционные агенты выявлены в 30,4 % и 65,6 % соответственно.

7. Доля внутриутробных инфекций, как основной причины перинатальной смертности, возросла в последние годы: в 1988 г. - 10,2 % , в 2003 г. - 35,8 %, в 2007 г. - 42,4 %. Это объясняется ухудшением состояния здоровья женщин, увеличением в 2,0-16,0 раз числа беременных с экстрагенитальными заболеваниями, хроническими и острыми воспалительными процессами в мочеполовой системе, тяжелыми анемиями. Исследование аутопсийного материала от погибших плодов и новорожденных методом ПЦР установило присутствие возбудителей внутриутробных инфекций в 63,8 % случаев. Участие выявленных агентов в та-натогенезе подтверждается наличием специфических и неспецифических гистологических и цитологических изменений в органах, а также морфологических признаков иммунной недостаточности.

8. Частота определения отдельных возбудителей внутриутробных инфекций в ау-топсийном материале зависит от сроков гестации: при гибели плода на ранних сроках чаще обнаруживали Ur. urealyticum (11,9%) и Chi. trachomatis (5,2%), при поздних выкидышах - Herpes simplex virus (23,9 %), L. monocytogenes (21,8 %) и Cytomegalovirus (19,6 %), при перинатальной смертности - преимущественно Enteroviruses (26,5 %) и Cytomegalovirus (17,6 %).

9. У детей, погибших до одного года жизни с явлениями острой сердечной и дыхательной недостаточности, при исследовании аутопсийного материала выявлены признаки длительного антенатального инфекционного процесса (фиброэластоз эндокарда, интерстициальный фиброз легких, кистофиброз поджелудочной железы, кистофиброз слюнных желез, гипоплазия тимуса и надпочечников) и проявления острой инфекции - наличие серозно-некротических воспалительных изменений во внутренних органах. В пробах печени, почек, легких обнаружен Cytomegalovirus и Enteroviruses, в пробах легких - Human respiratory syncytial virus.

10. Частота врожденных дефектов при фетоинфантильных потерях составляет от 12 до 24 на 100 летальных случаев в разные годы. В структуре летальных врожденных дефектов хромосомные и наследственные синдромы обнаружены в 19,8 %,

изолированные и системные врожденные пороки развития - в 38,1 %, множественные врожденные пороки развития - в 21,7 %, тканевые дисплазии - в 20,4 % случаев. Возбудители внутриутробных инфекций в аутопсийном материале при летальных врожденных дефектах определены в 60,3 % случаев, в том числе Herpes simplex virus и Cytomegalovirus - по 20,7 %, Enteroviruses - 15,5 %, Rubella -10,3 %, Herpes human virus 6 type - 5,2 %, Human respiratory syncytial virus и L. monocytogenes - no 1,7 %. В 34,5 % случаев летальных врожденных дефектов установлены внутриутробные моно- и микст- инфекции в генерализованной форме с альтеративно-продуктивными, фиброзно-склеротическими изменениями в тканях. В большинстве случаев были определены отдельные инфекционные агенты и характерные для конкретного возбудителя врожденные пороки развития.

Практические рекомендации

1. Результаты работы позволяют рекомендовать выделение новорожденных от беременных с плацентарной недостаточностью и маркёрами активизации герпетической, цитомегаловирусной инфекций, хламидиоза в группу высокого риска реализации ВУИ, динамическое наблюдение в неонатальном и постнатальном периоде педиатром, неврологом, окулистом, отоларингологом, логопедом с учетом возможности формирования иммунодефицитного состояния, отставания в физическом и нервно-психическом развитии, нейросенсорной глухоты, вероятности других манифестных проявлений внутриутробных инфекций.

2. Для ранней диагностики внутриутробных инфекций у новорожденных с признаками TORCH-инфекций необходимо в максимально ранние сроки проводить детекцию возбудителей внутриутробных инфекций в пробах плаценты методом ПЦР. Патент № 129856/15 от 07.07.2006 г.

3. С целью выявления этиологической роли внутриутробных инфекций при фето-инфантильных потерях рекомендуется исследование образцов органов и плаценты от погибших плодов и новорожденных по разработанному алгоритму (рис. 23). Это позволит проводить адекватную реабилитационную терапию женщин и профилактику фетоинфан-тильных потерь и врожденных заболеваний у детей при последующих беременностях.

4. Пробы хориальной и плодовой тканей от ранних спонтанных выкидышей и образцы, полученные при аспирационных биопсиях эндометрия, рекомендуется исследовать на наличие возбудителей внутриутробных инфекций методом ПЦР для установления этиологических факторов потерь плода и назначения рациональной реабилитационной терапии.

5. С целью профилактики внутриутробного инфицирования плода листериями у беременных с потерей плода в анамнезе при наличии катаральных или ангинозно-септических изменений в ротоглотке, гриппоподобных состояний, субфебрилитета, воспалительных заболеваний мочевыводящих путей, гастроэнтеритов, головных, суставных болей или при зеленой или коричневой окраске околоплодных вод в комплексную диагностику внутриутробных инфекций необходимо включать исследование на листериоз (моча, мазки из зева, генитальные мазки).

* культуры клеток

Рис. 23. Алгоритм исследования аутопсийного материала от погибших плодов и новорожденных для выявления основных возбудителей TORCH-комплекса

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Владимирова, Н.Ю. Роль генитальной вирусной инфекции в привычном невынашивании беременности / Н.Ю. Владимирова, Е.П. Когут, Е.Б. Наговицына, Г.А. Воронцова, Д.Х. Ян, М.А. Власова, И.П. Сысолетина, О.В. Островская // Акушерство и гинекология. —1997. — № 6. — С. 23-25.

2. Ostrovskaya, O.V. Risk of intrauterine herpetic and cytomegaloviral infection / O.V. Ostrovskaya, E.P. Kogut, M.A. Vlasova et al. // Japan-Russia International medical Symposium VII. — Hirosaki, Japan, 1999 — P. 192.

3. Maksimtchuk, L.V. Pathogenetal approach to the treatment of motor impairments in neonates and early-age children / L.V. Maksimtchuk, O.G. Dontsov, O.V. Ostrovskaya, E.P. Kogut // Japan-Russia International medical Symposium VII. — Hirosaki, Japan, 1999, —P. 188.

4. Островская, О.В. Прогностическое значение маркёров герпетической инфекции у женщин с осложненным течением беременности / О.В. Островская, М.А. Власова, Д.Х. Ян и соавт. II Акушерство и гинекология. — 2000. — №2. —С. 52-53.

5. Боровская, Т.Ф. Применение специфического иммуноглобулина для лечения беременных с фетоплацентарной недостаточностью и герпес-инфекциями / Т.Ф. Боровская, О.В. Островская, Е.П. Когут и соавт. И Медицинская иммунология. - 2000. — № 2. — С. 211-213.

6. Островская, О.В. Пренатальная диагностика цитомегаловирусной инфекции / О.В. Островская, Е.П. Когут, И.П. Сысолетина и соавт. // Клиническая лабораторная диагностика. — 2001. — № 2. — С. 20-23.

7. Островская, О.В. Состояние здоровья новорожденных, родившихся у вирус-инфицированных женщин / О.В. Островская, Д.Х. Ян, Е.П. Когут и соавт. П Мат-лы IX съезда педиатров России «Детское здоровье России: стратегия развития».

- Москва, 2001, 20-23 февраля. - С. 281.

8. Тактика обследования и лечения женщин с персистирующими вирусными инфекциями: отчет о НИР (заключит.) / ГУ ХФ ДНЦ ФПД СО РАМН - НИИ охраны материнства и детства; рук. Островская О.В.; исполн. Островская О.В., Власова М.А., Наговицына Е.Б. - Хабаровск. - 2001. - 37 с. Грант «Национальные приоритеты в медицине и здравоохранении. Вирусная инфекция». -№ГР 01.09.90 001154.

9. Островская, О.В. Тактика исследования и лечения женщин с персистирующими вирусными инфекциями // Под ред. В.К. Козлова «Клинические аспекты перинатальной медицины на Дальнем Востоке» / О.В. Островская, Н.Ю. Владимирова.

- Хабаровск: изд-во Краевой психиатр, больницы. — 2003. — С. 96-124.

10. Островская, О.В. Риск неблагоприятных исходов беременности, обусловленный герпес-вирусными инфекциями / О.В. Островская, Е.Б. Наговицина, М.А. Власова и соавт. // Мат-лы 5-го Всероссийского научного форума: «Охрана здо-ровья матери и ребенка». — Москва, 2003. — С. 206.

11. Островская, О.В. Лабораторные доказательства участия вирусных инфекций в формировании врожденных пороков развития / О.В. Островская, Н.М. Ивахнишина, Д.Х. Ян и соавт. И Дальневосточный медицинский журнал. — 2004. — № 1. — С. 82.

12. Островская, О.В. Состояние детей, родившихся от беременных с фетопла-центарной недостаточностью и выявленными маркёрами активации гер-пес-вирусчых инфекций / О.В. Островская, Д.Х. Ян, М.А. Власова н соавт. // Дальневосточный медицинский журнал. — 2004. — № 1. — С. 83.

13. Островская, О.В. Выявление маркёров вирусных инфекций в аутопсийном материале при фетоинфантильных потерях / О.В. Островская, Е.Б. Наговицына, Н.М. Ивахнишина и соавт. // Мат-лы VI Российского форума «Мать и дитя». — Москва, 2004, —С. 628.

14. Ивахнишина, Н.М. Участие вирусных инфекций в формировании врожденных пороков развития / Н.М. Ивахнишина, О.В. Островская, Г.М. Бутко и соавт. // Мат-лы III Российского конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии». — Москва, 2004. — С. 376-377.

15. Nagovitsyna, Е. Revealing of activators of intra-uterine infections in a material from spontaneous abortions and not developing pregnancy / E. Nagovitsyna, O. Os-trovskaya, N. Ivahnishina, M. Vlasova // The XI International Symposium of the Japan-Russia Med. Exchange, Niigata «JRME NIIGATA'04». — 2004. — P. 350.

16. Островская, О.В. Зараженность вирусами внутренних органов погибших плодов и детей с врожденными пороками развития / О.В. Островская, Н.М. Ивахнишина, Г.М. Бутко и соавт. // Дальневосточный медицинский журнал. — 2004. — № 3. — С. 123.

17. Островская, О.В. Распространенность герпес-вирусных инфекций / О.В. Островская, М.А. Власова, Е.Б. Наговицына и соавт. // Тихоокеанский медицинский журнал. - 2004. - № 3. - С. 87-88.

18. Оценка роли инфекционных факторов в формировании перинатальной смертности: отчет о НИР (заключит.) / ГУ ХФ ДНЦ ФПД СО РАМН - НИИ охраны материнства и детства; рук. Островская О.В.; исполн. Островская О.В., Ивахнишина Н.М., Наговицына Е.Б. - Грант РФФИ 04-04-97006 «Приамурье 2004», №ГР 0120.0 500685 (2004-2005 г.). - Хабаровск. - 25 с.

19. Ивахнишина, Н.М. Врожденные пороки развития среди причин гибели при фе-тоинфантильных потерях / Н.М. Ивахнишина, О.В. Островская, Г.М. Бутко // Мат-лы X Съезда педиатров России «Пути повышения эффективности медицинской помощи детям». — Москва, 8-10 февраля, 2005. — С. 196.

20. Наговицына, Е.Б. Оценка роли инфекционных факторов в формировании перинатальной смертности / Е.Б. Наговицына, О.В. Островская, Н.М. Ивахнишина и соавт. // Мат-лы X Съезда педиатров России «Пути повышения эффективности медицинской помощи детям». — Москва, 8-10 февраля, 2005. — С. 385.

21. Островская, О.В. Внутриутробная инфекция в генезе аномалий развития бронхолёгочной системы при фетоинфантильных потерях / О.В. Островская, Н.М. Ивахнишина, Г.М. Бутко и соавт. // Дальневосточный медицинский журнал. — 2005. — № 4. — С. 5-9.

22. Пуховская, Н.М. Вопросы участия Listeria monocytogenes в перинатальной патологии / Н.М. Пуховская, Ю.С. Муратов, О.В. Островская и соавт. // Мат-лы 6-й Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней». — Сосновка, Новосибирская обл. — 2005. — С. 146148.

23. Островская, О.В. Внутриутробные инфекции в этиологии врожденных дефектов развития / О.В. Островская, Н.М. Ивахнишина, Г.М. Бутко и соавт. // Дальневосточный журнал инфекционной патологии. — 2005. — № 7. — С. 73-74.

24. Островская, О.В. Структура и частота встречаемости врожденных дефектов при фетоинфантильных потерях / О.В. Островская, Н.М. Ивахнишина, Г.М. Бутко и соавт. // Дальневосточный медицинский журнал. — 2006. — № 1. — С. 19-23.

25. Пат. 2292551 Российская Федерация. МПК 51 G01N 33/53 G01N 1/28 (2006.01). Способ ранней диагностики внутриутробных инфекций у новорожденных / О.В. Островская, Н.М. Ивахнишина, Е.Б. Наговицына и соавт.; заявитель и патентообладатель ГУ ДНЦ физиологии и патологии дыхания СО РАМН. -№ 2005129856/15; заявл. 26.09.2005; опубл. 27.01.2007 // Бюл. - 2007. - № 3. -4 с.

26. Пуховская, Н.М. Выявление Listeria monocytogenes при фетоинфантильных потерях / Н.М. Пуховская, Ю.С. Мусатов, Л.И. Иванов, О.В. Островская // Мат-лы III Российской научно-практической конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера». — Новосибирск. — 2006. — С. 299-300.

27. Островская, О.В. Оценка роли инфекционных факторов при перинатальной смертности / О.В. Островская, Г.М. Бутко, Н.М. Ивахнишина и соавт. // Мат-лы

8-го Всероссийского научного форума «Мать и дитя». — Москва, 3-6 октября 2006. — С. 603-604.

28. Островская, О.В. Инфекционные факторы при перинатальной смертности / О.В. Островская, Н.М. Ивахнишина, Е.Б. Наговицына н соавт. // Дальневосточный медицинский журнал. — 2006. — № 3. — С. 5-8.

29. Усовершенствование дородовой диагностики внутриутробных герпес-инфекций и хламидиоза: отчет о НИР (заключит.) / ГУ ХФ ДНЦ ФПД СО РАМН - НИИ охраны материнства и детства; рук. Островская О.В.; исполн. Островская О.В., Наговицына Е.Б., Власова М.А. - Хабаровск. - 2007. - 51 с. -№ГР 01.20.01.20215.

30. Островская, О.В. Прогностическая ценность маркёров активизации внутриутробных инфекций / О.В. Островская, Т.В. Комиссарова, Е.В. Ваганова и соавт. // Дальневосточный медицинский журнал. — 2007. — №. 1 — С. 5053.

31. Островская, О.В. Эндогенные инфекции матери как биологический тератогенный фактор / О.В. Островская, Н.М. Ивахнишина, Т.М. Бутко и соавт. // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. - 2007. — Вып. 24. - С. 10-15.

32. Островская, О.В. Эндогенные инфекции матери при фетоинфантильных потерях / О.В. Островская, Н.М. Ивахнишина, Е.Б. Наговицына и соавт. // Мат-лы I Международного семинара «Инфекция в акушерстве и перинатологии». — Москва.-2007.-С. 121.

33. Ивахнишина, Н.М. Оптимальный метод выделения нуклеиновых кислот вирусов в аутопсийном материале / Н.М. Ивахнишина, О.В. Островская, Е.П. Когут // Дальневосточный медицинский журнал. - 2008. — №. 4 — С. 104— 105.

Заказ № 478. Тираж 100 экз. Отпечатано ООО «Издательский дом «АРНО», г. Хабаровск, ул. Волочаевская, 1816, оф. 201, тел.: (4212) 566-921, e-mail: arno_design@mail.ru

Актуальность проблемы

Актуальность проблемы перинатальной патологии определяется снижением репродуктивного потенциала и сохраняющейся депопуляцией (В.И. Кулаков, В.Н. Серов, 2007).

В последние годы отмечается неуклонное увеличение частоты случаев ВУИ и повышение их роли в формировании акушерско-гинекологической патологии, перинатальной и младенческой заболеваемости и смертности. Ближайшие и отдалённые последствия ВУИ являются причиной отклонений в состоянии здоровья детей раннего возраста и инвалидизации в более старших возрастных группах (JLJL Нисевич и соавт., 1999; Н.Н. Володин и соавт., 2001; Г.Б. Безнощенко и соавт., 2003; В.И. Кулаков и соавт., 2004; Н.П. Шабалов, 2004; А .Я. Сенчук, З.М. Дубоссарская, 2005; В.В. Иванова и соавт., 2008; A.J. Antsaklis et al., 2000; М. Gencay et al:, 2001).

Под «внутриутробной инфекцией» подразумевают не только процесс распространения инфекционных агентов в организме плода, но и вызванные ими патофизиологические изменения различных органов и систем, характерные для инфекционной болезни, возникшей анте- или интранатально и выявляемой пренатально или после рождения. «Внутриутробное инфицирование» не имеет клинических проявлений и не всегда приводит к развитию ВУИ. Оно выражается лишь в проникновении в организм возбудителя. Отсутствие заболевания у плода при этом объясняется мобилизацией иммунитета и защитных механизмов в системе «мать-плацента-плод» (В.И. Кулаков и соавт., 2004).

Не существует параллелизма между тяжестью инфекционного процесса у матери и плода. Лёгкая, мало- или бессимптомная инфекция матери, вызванная различными инфекционными агентами, способна вызвать гибель плода или тяжёлые поражения его органов и систем. В то же время острая и достаточно выраженная инфекция у матери не обязательно заканчивается фатально для плода (Н.В. Орджоникидзе, B.JI. Тютюнник, 2001; С. Захаренко, 2004). В возникновении инфекционного процесса у плода, тяжести его поражения, времени проявления имеют значение вид возбудителя, его вирулентность, пути проникновения от матери к плоду, срок беременности, тропизм возбудителя к органам и тканям плода, защитные резервы матери и способность плода к иммунному ответу (В.Я. Кицак, 2004; В.И. Кулаков и соавт., 2004).

Среди огромного числа микроорганизмов, патогенных для человека, насчитывается порядка 3 500 видов, из которых 1000 видов являются вирусами -данные новой классификации вирусов от 2002 г. и международного конгресса по таксономии вирусов 2001 г. (А.А. Воробьёв и соавт., 2004). Количество инфекционных агентов, способных к вертикальной передаче практически не ограничено (Э.К. Айламазян, 1995; М.А. Башмакова и соавт., 1995; О.А. Пустонина, 1999; Е.М. Малкова, О.Н. Гришаева, 2000; В.И. Кулаков и соавт., 2004; V.Becker, 1992; A.J. Antsaklis et al., 2000).

Вирусы- обладают уникальными свойствами, способствующими развитию внутриутробной инфекции, поражению клеток эмбриона и плода. Ключевым патогенетическим механизмом вирусной инфекции является внедрение в клетку чужеродного генетического материала. Важным компонентом патогенного действия вируса на клетки эмбриона или плода являются нарушение митоза инфицированных клеток, их цитолиз, хромосомные аберрации, то есть прямое цитопатическое, тератогенное или мутагенное действие. Непрямое воздействие вирусов связано с развитием плацентита, эндометрита, патологии плодных оболочек (В.Я. Кицак, 2004).

ВУИ характеризуются множественностью этиологических агентов и преобладанием неспецифических клинических проявлений. В раннем неонатальном периоде — это изменение цвета кожных покровов, снижение мышечного тонуса, двигательной активности, пролонгированная желтуха, первоначальная потеря массы тела на 10% и более и медленное её восстановление, субфебрильная температура. *

В позднем неонатальном периоде симптомами ВУИ могут быть желтуха, сыпь, ге-патоспленомегалия, дыхательные расстройства, сердечно-сосудистая недостаточность, неврологические нарушения, врождённые пороки развития (В.А. Цинзер-линг и соавт., 1997; В.И. Кулаков и соавт., 2004). Для обозначения совокупности клинических проявлений применяется термин «TORCH-синдром», где «Т»

Toxoplasmosis — токсоплазмоз; «0» - other — другие инфекции (сифилис, хламиди-оз, вирусные гепатиты, листериоз, ветряная оспа, ВИЧ, инфекции, вызываемые парвовирусом В19, энтеровирусами и др.); «R» - Rubella - краснуха; «С» - Су-tomegalia - цитомегалия; «Н» - Herpes simplex virus - герпес. (T.I. Libro et al., 1997; R. Kaur et al., 1999; E.R. Newton, 1999; S. Imura, 2000; N.A. Khan, S.N. Kazzi, 2000).

Трудности диагностики ВУИ связаны с широким распространением перси-стирующих инфекций и условно-патогенных агентов в человеческой популяции, неоднозначностью возможной реализации инфекционного процесса и неспецифичностью клинических проявлений. Устоявшихся канонов пренатальной диагностики в мире не существует (Е.В. Юдина, 2006).

Антенатальная и постнатальная диагностика ВУИ проводится с учётом данных анамнеза, выявления эхографических маркёров ВУИ и клинической симптоматики. Из-за трудоёмкости и ретроспективности исследований лабораторная диагностика ВУИ еще 5 - 10" лет назад проводилась только в специализированных научно-исследовательских лабораториях. Прогресс в изучении ВУИ связан с разработкой и широким внедрением*в практику здравоохранения принципиально новых молекулярно-диагностических технологий - высокочувствительных и специфичных методов иммуноферментного анализа и генодиагностики. В связи с этим оценка современной специфической диагностики ВУИ приобретает особую актуальность.

Существуют прямые - инвазивные и непрямые - косвенные методы дородовой диагностики ВУИ. Инвазивные методы (кордоцентез, амниоцентез, биопсия хориона или.плаценты) используют как для выявления генетических заболеваний плода и хромосомных аномалий, так и для детекции маркеров ВУИ. Из-за большого числа противопоказаний и возможности осложнений беременности чаще применяют непрямые методы дородовой диагностики: выявление возбудителя, его нуклеиновых кислот и антигенов в клиническом материале у беременных женщин, специфических антител в сыворотке крови. Факт инфицирования не только матери, но и плода-еще не означает неизбежного развития врожденных уродств, угрозы выживания или инфекционного заболевания плода.

Известно, что наибольший риск вертикальной передачи HSV-инфекции существует при первичном генитальном герпесе во время беременности — 33,070,0%, при рецидивирующем генитальном герпесе риск снижается до 2,0-5,0% (Z.A. Brown et al., 1987; C.G. Prober et al., 1997; G.T. Vasileiadis et al., 2003). Клинические проявления неонатального герпеса регистрируются в виде менин-гоэнцефалита, генерализованной инфекции с вовлечением внутренних органов или локализованного поражения кожи и слизистых. Частота врожденного герпеса составляет 1 случай на 4 000 - 30 000 живорожденных (Бюл. ВОЗ, 1985). В настоящее время воздействие герпетической инфекции на состояние плаценты I и плода рассматривается более широко. Считается, что поражение плаценты, трансплацентарная* передача и внутриутробное заражение плода HSV может проявиться утолщением плаценты, многоводием, маловодием, угрозой выкидыша, невынашиванием, неспецифическими симптомами ВУИ в неонатальном периоде: поражением ЦНС (повышение внутричерепного давления, гиперрефлексия, нарушением терморегуляции, судорожный синдром), пневмонией, ге-патоспленомегалией, гипербилирубинемией, ДВС-синдромом (Н.И. Кудашов и ' соавт., 1998; А .Я. Сенчук, З.М. Дубоссарская, 2005).

Риск вертикальной передачи вируса при первичной ЦМВИ составляет 30,0-50,0%. При реактивации латентной ЦМВИ или суперинфекции другим штаммом во время беременности, которые регистрируются у 10,0-20,0% серо-позитивных женщин, внутриутробное заражение плода возможно в 0,2-2,2% случаев (S. Stagno, 1982; С. Peckhan, 1991).

Особый интерес в плане совершенствования пренатальной диагностики ВУИ представляет определение диагностической и прогностической значимости маркёров продуктивной HSV- и CMV-инфекции. После первичного инфицирования вирусы семейства Herpesviridae в форме нуклеокапсида могут пожизненно находиться в клетках нервных ганглиев, секреторных желез, лимфоретикулярных клетках почек, лимфобластах, В-лимфоцитах (М. Papasch, R.Watkins, 2001; D.L. Sitki-Green et al., 2004). При первичной инфекции и при реактивации латентной инфекции происходит активная репродукция и экскреция вируса, появляются специфические иммуноглобулины класса М, низкоавидные IgG, антитела к сверхранним белкам — маркеры продуктивной инфекции. Активизация инфекции у беременной может протекать как с клиническими проявлениями, так и бессимптомно, при этом вирус может попасть в плаценту и плод и вызвать деструктивные процессы. В настоящее время появились отечественные диагностические системы для выявления маркеров репликации герпес-инфекций. Риск развития инфекции и болезни плода при выявлении у беременной маркеров продуктивной герпес-инфекции не изучен.

Актуальной и нерешённой проблемой остаётся определение роли хронических и персистирующих инфекций матери, в формировании фетоинфантильных потерь, а также в этиологии летальных врожденных аномалий развития. Региональный показатель ПС превышает российский. В 2005 г. ПС в ДВФО составила 11,71 %о; в РФ - 10,17%о (Спр.-инф. мат. Минздравсоцразвития РФ, 2007), а также* показатели ПС в Европе и США - 5,4-7,9%о (В.Н. Демидов, 2003). Вирусологическое и бактериологическое исследование аутопсийного материала при фетоинфантильных потерях в большинстве случаев не проводится из-за высокой стоимости и больших трудозатрат (Л.Л. Нисевич и соавт., 2002). Поэтому данные о частоте и этиологической структуре ВУИ, как причине ПС - противоречивы. По сведениям Госкомстата РФ доля инфекций, специфичных для перинатального периода, в структуре ПС составляет 5,7% (А.А. Баранов, В.Ю. Альбицкий, 2006). Многолетние исследования, проведённые в Санкт-Петербурге, выявили ВУИ в качестве основной причины ПС в 20,0 - 30,0% случаев (В.А. Цинзерлинг, В.Ф. Мельникова, 2002), в Великом Новгороде - в 67,5% (Ю.М. Уваров, 2003). При стандартных методах исследования этиология потерь плода в 40,0 -50,0% случаев остаётся неустановленной (В.Н. Серов и соавт., 1997; L. Skjolderbrand-Spare et al., 2000). В структуре врожденных летальных дефектов в г. Хабаровске наследственные и хромосомные синдромы составляют 19,5% (А.Ю. Мощинецкий, 1998). В большинстве же случаев причины формирования врожденных летальных аномалий не распознаются.

Новые перспективы в изучении распространённости, патогенеза, этиологии ВУИ открывает использование высокочувствительного и специфичного метода

ПЦР, позволяющего определять возбудителей острых, хронических и латентных инфекций в любом клиническом материале, в том числе аутопсийном, и биопсий-ном, и оценить.их реальную роль в развитии фетоинфантильных потерь, врожденных аномалий на качественно новом методическом уровне.

До настоящего времени не установлена распространённость инфекций, влияющих на течение беременности; состояние плода и новорожденного в популяции женщин репродуктивного возраста - жительниц Приамурья, не определено диагностическое и прогностическое значение для состояния плода и новорожденного выявления маркёров репликации возбудителей персистирующих инфекций у беременных, не изучена; эффективность генодиагностики при определении роли ВУИ в формировании фетоинфантильных потерь.

Цель исследования: разработка современной комплексной технологии специфической диагностики ВУИ; ее клиническая и патоморфологическая оценка; определение на ее основе роли ВУИ в формировании фетоинфантильных потерь. Задачи:

1. Изучить распространенность TORCH-инфекций в популяции женщин репродуктивного возраста г. Хабаровска.

2. Установить прогностическое значение для плода и новорожденного фактов выявления у беременной маркёров бессимптомной активизации герпетической и цитомегаловирусной инфекци и.

3. Разработать способ ранней диагностики ВУИ у новорожденных путем исследования плаценты методом ПЦР.

4. Изучить методом ПЦР инфицированность плодов и эндометрия при раннем спонтанном прерывании беременности.

5. Проанализировать динамику показателей перинатальной смертности, определить значение бессимптомных и ; персистирующих инфекций; матери- в формировании фетоинфантильных потерь-при, изучении аутопсийного материала. ■ : ■

6. Определить структуру врожденных летальных пороков развития плода и новорожденного и роль внутриутробных инфекций в их формировании.

Научная новизна: v

Впервые установлено значение сочетанного развития плацентарной недостаточности и продуктивной герпес-вирусной инфекции для адекватной оценки поражения плода и новорожденного.

Впервые разработан и апробирован способ раннего определения ВУИ у новорожденных путем исследования плаценты методом ПЦР - «Способ ранней диагностики внутриутробных инфекций у новорожденных», патент № 2005129856/15 от 07.06.2006 г.

Впервые разработан и использован алгоритм комплексного исследования аутопсийного материала от погибших плодов и новорожденных вирусологическими методами и с помощью генодиагностики для выявления возбудителей инфекций TORCH-комплекса.

Впервые методом ПЦР определена инфицированность плодов (30,4%) и эндометрия женщин (65,6%) при ранних спонтанных выкидышах. В.тканях погибших плодов и образцах эндометрия преобладали возбудители уреамикоплазмоза - 23,7% и 37,5% соответственно. Показана значительная, роль инфекционных процессов и трансмурального пути передачи в генезе потерь плода на ранних сроках гестации.

Впервые методом ПЦР установлены спектр и частота выявления возбудителей ВУИ в аутопсийном материале при потерях плода и новорожденного. Частота детекции возбудителей составила 66,3%. Cytomegalovirus, Herpes simplex virus, Enteroviruses обнаружены в равных долях - по 18,7%, L. monocytogenes - 15,0%, Herpes human virus 6 type и Chi. trachomatis - no 7,5%, вирусы респираторной группы и Rubella — по 3,8%, Ur. urealyticum - 3,7%, M. hominis - 2,5%. Этиологическая роль выявленных инфекционных агентов в генезе потерь плода и новорожденного подтверждена наличием альтеративно-пролиферативных, фиброзно-склеротических воспалительных процессов в тканях, гигантоклеточным метаморфозом, морфологическими проявлениями иммунодефицитного состояния.

Впервые показаны различия выявляемости возбудителей ВУИ при потерях плода на разных сроках гестации. В материале от ранних выкидышей чаще определяли Ur. urealyticum и Chi. trachomatis, от поздних выкидышей - Herpes simplex virus, L. monocytogenes, Cytomegalovirus, при ПС - Enteroviruses и Cytomegalovirus.

Впервые методом ПЦР изучены частота и этиологическая структура ВУИ при летальных врожденных дефектах. Наряду с типичными для отдельных возбудителей врожденными пороками развития зарегистрированы ранее не описанные сочетания: гастрошизис, болезнь Гиршпрунга и Enteroviruses, аденоматоз коры надпочечников и Cytomegalovirus, нейробластома крестцово-копчиковой области и Herpes simplex virus, ложная диафрагмальная грыжа с гипоплазией лёгкого и Human respiratory syncytial virus, Herpes simplex virus.

Впервые показано участие L.monocytogenes в генезе фетоинфантильных потерь в г. Хабаровске. В летний период 2005 года патогенные штаммы L.monocytogenes определили при поздних выкидышах в 43,5%. В последующие годы L.monocytogenes выявлялисьхпорадически.

Впервые при летальных бронхолёгочных дисплазиях (дистелектаз, фиброзная дисплазия, очаговая гипоплазия, незрелость легочной ткани, периваскулярный фиброз) в 68,2% случаев были обнаружены перинатально-значимые возбудители. ВУИ1 могут быть одним из механизмов антенатального формирования бронхолёгочных дисплазий у детей.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Доля ВУИ как основной причины перинатальной смертности возросла в последние годы в 3,5-4,2 раза, что объясняется ухудшением состояния здоровья женщин репродуктивного возраста до беременности, ростом числа экстрагени-тальных заболеваний, тяжелых анемий, болезней мочеполовой системы в 2—16 раз, снижением иммунно-эндокринного статуса. Высокая частота выявления возбудителей ВУИ в аутопсийном материале от погибших плодов и новорожденных (66,3%) указывает на существенно более высокую значимость инфекционной патологии в развитии перинатальной смертности по сравнению с данными официальной статистической отчетности.

2. Выявление маркёров репликации HSV и CMV-инфекций в сочетании с плацентарной недостаточностью у беременной имеет существенное диагностическое и прогностическое значение для состояния новорожденного. При рождении у таких детей достоверно чаще диагностируются: тяжелая асфиксия, ЗВУР, ВПР и аномалии развития, респираторные нарушения, ВУИ с манифестными проявлениями в виде энцефалита, гепатита, в генерализованной форме, признаки церебральной ишемии 2-ой степени. В дальнейшем у этих детей сохраняется стойкий неврологический дифицит (30,0%), отмечается задержка моторного и умственного развития (53,3%)^. формируется, иммунодефицитное состояние (28,4%).

3. У новорожденных от матерей с физиологически протекающей беременностью и маркёрами репродукции HSV и.СМУ- с помощью нейросонографии определяются признаки инфекционного поражения структур мозга: незрелость тканевых структур, признаки эпендиматита в виде утолщения и подчеркнутое™ стенок- боковых желудочков,, разрыхленность и фрагментарность сосудистых сплетений? боковых; желудочков, дилатация желудочков, перивентрикулярное повышение эхогенностш.

4. Обнаружение маркёров? активизации хламидиоза при беременности с плацентарной недостаточностью ассоциируется с патологическим состоянием плаценты; гипоксией* плода, самопроизвольным прерыванием беременности и церебральной ишемией новорожденных. Это объясняется инфицированием плода Chi. trachomatis in utero,. что подтверждается высокой частотой определения ДНК возбудителя в плацентах с выраженными патологическими изменениями (воспалительными, дефектами и кистами, аномалиями прикрепления плаценты) -в 45,0%.

5. ПЦР - информативный^ точный и быстрый метод, открывающий новые диагностические возможности в определении ВУИ, позволяющий выявлять широкий спектр вирусов и бактерий, в том числе трудно культивируемых в одной пробе, практически в любом клиническом? материале, в том числе аутопсийном и био-псийном. Метод эффективен для экспресс-диагностики ВУИ у новорожденных, для детекции ВУИ при; фетоинфантильных потерях и летальных врожденных дефектах развития. Этиологическая роль выявленных вирусов подтверждается . наличием; альтеративно-продуктивных, фиброзно-склеротических изменений в тканях, гигантоклеточным метаморфозом, морфологическими признаками им-мунодефицитного состояния. Этиологическая верификация инфекционных агентов при необъяснимой внутриматочной гибели плода, врожденных летальных дефектах развития способствует адекватной реабилитационной терапии женщин с потерей плода в анамнезе и прогнозированию исходов будущих беременностей.

Практическая значимость работы

Проведен клинико-морфологический. анализ эффективности подходов в ре-моделировании комплекса исследований по специфической диагностике ВУИ. Предложена новая современная технология специфической диагностики, включающая изучение аутопсийного материала; плаценты, эндометрия. Анализ структуры перинатальной патологии и смертности способствует совершенствованию организации лабораторно-клинического; обеспечения мониторинга перинатальных потерь, этиологически связанных с ВУИ.

Ввиду того; что TORCH-инфекции носят оппортунистический характер, часто протекают субклинически, доказательством этиологической; роли возбудителя; в развитии ВУИ у беременных' и врожденных патологических процессов у плода является выделение возбудителя из биологических проб, обнаружение; его генома (ДНК, РНК) в крови, пораженных тканях, регистрация специфических морфологических (гистологических, цитологических) изменений5 при летальных исходах, индукция иммунитета (детекция противовирусных IgM, низкоавидных Gr антител, антител к предранним белкам, наличие сероконверсии или диагностического прироста антител).

Тяжесть перинатальной патологии в существенной степени зависит от сочетания плацентарной недостаточности с продуктивной инфекцией.

Результаты исследования, основные положения,, выводы, сформулированные в диссертационной работе; позволили разработать новые, более рациональные подходы организации современной специфической диагностики ВУИ, включая исследование методом ПЦР аутопсийного материала, тканей плаценты и эндометрия, что способствует повышению достоверности оценки их роли в перинатальной патологии: и разработке на их основе адекватных лечебных и профилактических мер по снижению удельного веса ВУИ.

Внедрение результатов исследования вшрактику здравоохранения

Материалы, полученные в ходе выполнения работы, использованы в подготовке Закона:Хабаровского края № 306 от 25.04.2001 г. «О краевой целевой программе «Охрана; здоровья женщин, детей и подростков Хабаровского края на 2001-2005 гг.».

Результаты работы стали основой ряда документов, применяющихся в практическом здравоохранении:

Информационное письмо для врачей-гинекологов «Обследование женщин при подготовке к беременности»;; Хабаровск, 2000.

Пособие для врачей акушеров-гинекологов и педиатров «Дородовая диагностика внутриутробных инфекций», Хабаровск,,2000;

Методические рекомендации «Клинический: материал для; диагностики вирусных и; бактериальных инфекций, условия забора; и,транспортировки», Хабаровск;-. 2004:

Получен патент на;, изобретение «Способ ранней диагностики внутриутробных, инфекций у новорожденных» № 2005129856/15, решение о выдаче патента № 236 от 07.06.2006 г.

Результаты анализа постмортального фенотипа 480 погибших плодов и новорожденных с врожденными пороками развития введены в базу данных и внедрены в практику работы медико-генетической лаборатории ГУЗ «Перинатальный центр» с 2005 г.

Полученные материалы использованы для обучения на рабочем месте, на научно-практических семинарах врачей ФГУЗ Роспотребнадзора по Хабаровскому краю, Краевого центра по профилактике и борьбе со СПИДом, Территориального центра Роспотребнадзора по Амурской области, Благовещенской областной больницы, детской инфекционной больницы Петропавловска-Камчатского; детской больницы г. Комсомольска-на-Амуре, врачей; акушеров-гинекологов в селе Троицком Нанайского района; Хабаровского края: Материалы диссертационной работы включены в курс лекций и практических занятий для студентов, клинических ординаторов и интернов кафедр детских болезней, акушерства и гинекологии, микробиологии, вирусологии и иммунологии ДВГМУ, врачей-лаборантов на сертификационных циклах ИПКСЗ, в клиническую практику ГУЗ «Перинатальный центр», женских консультаций №№ 2, 3 г. Хабаровска, патологоанатомического отделения ДККБ.

Апробация диссертации

Научные результаты диссертации доложены на научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальные и клинические аспекты охраны детского и взрослого населения Дальневосточного региона» в рамках 2-го симпозиума «Доказательная медицина — основа современного здравоохранения», Хабаровск, 2003; научно-практической конференции с международным участием «Комплексная, оценка состояния здоровья детей и подростков в Дальневосточном регионе», Хабаровск, 2004; заседании Проблемной комиссии 37.13 «Физиология и патология дыхания», Хабаровск, 2004; выездном заседании^Проблемной комиссии 53.12 «Физиология и патология дыхания» межведомственного научного совета № 53 по медицинским проблемам Сибири, Дальнего, Востока и Крайнего Севера, Хабаровск, 2004; международной научно-практической конференции «Репродуктивное здоровье женщин Дальнего Востока», Владивосток, 2004; Дальневосточном региональном конгрессе «Человек и лекарство», Владивосток, 2005; заседании Проблемной комиссии 37.04 «Охрана здоровья матери и ребенка», Владивосток, 2005; II Региональной научно-практической конференции «Инфекционная патология Дальнего Востока в начале XXI века», Хабаровск, 2005; отчетной конференции- исполнителей проектов регионального конкурса РФФИ «Приамурье», Хабаровск, 2005; региональной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы охраны здоровья женщин и детей на современном этапе», Хабаровск, 2006; научно-практической конференции с международным участием «Клинические и фундаментальные аспекты состояния здоровья коренного и пришлого населения в Дальневосточном федеральном округе», Хабаровск, 2007; заседаниях Хабаровского отделения Всероссийских научных обществ эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, акушеров-гинекологов (2000—2007 гг.); на сессии Президиума СО

РАМН, Новосибирск, 2007; на 26 сессии общего собрания СО РАМН «Роль фундаментальной медицины в проблеме формирования здоровья населения Сибири», Новосибирск, 2007; межрегиональной научно-практической конференции «Современные факторы формирования, методы оценки и прогнозирования общественного здоровья на территории Дальневосточного региона» к 70-летию Хабаровского края, Хабаровск, 2008.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 33 основные научные работы, в том числе 12 статей в журналах, рекомендуемых ВАК для публикации материалов докторских диссертаций, в сборниках международных конгрессов за рубежом — 3, в сборниках материалов международных конгрессов, форумов в Москве - 10, патент РФ на изобретение в области медицины - 1, раздел в монографии «Клинические аспекты перинатальной медицины на Дальнем Востоке».

Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора данных литературы, главы с описанием материалов и методов, 5-ти глав с изложением результатов собственных исследований; их обсуждения и выводов. Работа изложена на 318 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 56 таблицами и 38 рисунками. Библиография включает 490 источников литературы (271 отечественной и 219 зарубежной).

1. Результаты работы позволяют рекомендовать выделение новорожденных от беременных с плацентарной недостаточностью и маркёрами активизации герпетической, цитомегаловирусной инфекций, хламидиоза в группу высокого риска реализации ВУИ, динамическое наблюдение в неонатальном и пост-натальном периоде педиатром, неврологом, окулистом, отоларингологом, логопедом с учетом возможности формирования иммунодефицитного состояния, отставания в физическом и нервно-психическом развитии, нейросенсорной глухоты, вероятности других манифестных проявлений внутриутробных инфекций.

2. Для ранней диагностики внутриутробных инфекций у новорожденных с признаками TORCH-инфекций необходимо в максимально ранние сроки проводить детекцию возбудителей внутриутробных инфекций в пробах плаценты методом ПЦР. Патент № 129856/15 от 07.07.2006 г.

3. С целью выявления этиологической роли внутриутробных инфекций при фетоинфантильных потерях рекомендуется исследование образцов органов и плаценты от погибших плодов и новорожденных по разработанному алгоритму. Это позволит проводить адекватную реабилитационную терапию женщин и профилактику фетоинфантильных потерь и врожденных заболеваний у детей при последующих беременностях.

4. Пробы хориальной и плодовой тканей от ранних спонтанных выкидышей и образцы, полученные при аспирационных биопсиях эндометрия, рекомендуется исследовать на наличие возбудителей внутриутробных инфекций методом ПЦР для установления этиологических факторов потерь плода и назначения рациональной реабилитационной терапии.

5. С целью профилактики внутриутробного инфицирования плода листе-риями у беременных с потерей плода в анамнезе при наличии катаральных или ангинозно-септических изменений в ротоглотке, гриппоподобных состояний, субфебрилитета, воспалительных заболеваний мочевыводящих путей, гастроэнтеритов, головных, суставных болей или при зеленой или коричневой окраске околоплодных вод в комплексную диагностику внутриутробных инфекций необходимо включать исследование на листериоз (моча, мазки из зева, гени-тальные мазки).

266

Практические рекомендации