Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Влияние углеводов, представленных на поверхности клеток-мишеней, на цитолитическую активность естественных киллеров человека

На правах рукописи

АБАКУ ШИНА Елена Вячеславовна ^

од

1 5 Г.. А: 1Ш

ВЛИЯНИЕ УГЛЕВОДОВ, ПРЕДСТАВЛЕННЫХ НА ПОВЕРХНОСТИ КЛЕТОК-МИШЕНЕЙ,

НА ЦИТОЛИТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ

/

ЕСТЕСТВЕННЫХ КИЛЛЕРОВ ЧЕЛОВЕКА

14.00.36 - Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2002

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук А.М. Сапожников

доктор медицинских наук,

профессор

М.А. Стенина

доктор биологических наук, Л.А. Захарова

Ведущая организация: Институт вакцин и сывороток

им. И. И. Мечникова, АМН РФ

Защита состоится "_" _ 2002 г. в _ часов на

заседании диссертационного совета Д 208.072.05 при Российском государственном медицинском университете по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского государственного медицинского университета.

Автореферат разослан " 11 " марта 2002 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат медицинских наук Т.Е. Кузнецова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Естественные киллеры (ЕК-клетки) являются эффекторами врожденного иммунитета и выполняют в организме специализированную циготоксическую функцию, направленную на уничтожение опухолевых и вирус-инфицированных клеток. ЕК-клетки не нуждаются в предварительной сенсибилизации для поражения мишеней и обладают способностью самостоятельно распознавать поврежденные клетки, подлежащие элиминации. Механизм этого распознавания пока не изучен. Тем не менее, в настоящее время установлено, что реактивность ЕК-клеток регулируется балансом между поступающими с поверхности клетки-мишени позитивными сигналами, индуцирующими эффекторные функции, и негативными сигналами, которые препятствуют клеточному лизису. В процессе распознавания участвует ряд поверхностных рецепторов ЕК-клеток. Лигандами для таких рецепторов являются различные молекулы, многие из которых еще не идентифицированы, хотя известно, что в качестве негативного сигнала для ЕК-клеток выступают молекулы главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) класса I на поверхности клеток-мишеней. Было найдено несколько типов ингибиторных рецепторов ЕК-клеток, соответствующих разным аллелям этих молекул. Позитивные сигналы в различных моделях опосредуются разными структурами на поверхности клеток-мишеней, в то же время универсального активирующего сигнала пока не найдено.

В распознавании ЕК-клетками клеток-мишеней участвуют углеводы, представленные на клеточной поверхности мишеней. Литературные данные свидетельствуют о существенной роли поверхностных сахаридов в распознавании опухолевых клеток естественными киллерами. Показано как позитивное, так и негативное • влияние различных олигосахаридов на опосредованную ЕК-клетками цитотоксичность. Однако, до сих пор не ясно, какие углеводные составляющие гликопротеинов или гликолипидов приводят к изменению функциональной активности естественных киллеров. Неизвестно также, с какими рецепторами ЕК-клеток взаимодействуют углеводы поверхности клеток-мишеней.

Гетерогенность природных гликоконъюгатов, особенно гликопротеинов, осложняет их применение в качестве инструментов для исследования углеводсвязывающих молекул. Отмечающийся в литературе значительный разброс

данных объясняется различиями применяемых методик. Традиционный подход с использованием синтетических олигосахаридов дня ингибировшшя опосредованной ЕК-клетками циготоксичности в такой сложной системе, как смесь эффекторов и мишеней, не может дать полной информации о том, какие именно компоненты, каких клеток и в какой степени вовлечены в межклеточное взаимодействие. Поэтом}' возникает объективная необходимость изучения роли олигосахаридов поверхности клетки-мишени в регуляции эффекторной функции ЕК-клеток с помощью новых модельных систем. Таким образом, поиск новых подходов дтя изучения влияния олигосахаридных структур, представленных на поверхности клеток-мишеней, на цитотоксическую активность ЕК-клеток человека является актуальной проблемой.

Цель исследования. Целью данной работы явилось исследование влияния углеводов, представленных на поверхности клеток-мишеней, на цитотоксическую активность естественных киллеров человека с помощью новой модельной системы, включающей модификацию поверхности клетки-мишени с использованием липофильных неогликоконъюгатов.

Задачи исследования:

1. Подобрать оптимальные условия для встраивания липофильных неогликоконъюгатов (время, температуру, концентрацию, содержание липидного компонента) в клетки линий К562 и Яа]Ч с учетом клеточной жизнеспособности.

2. Изучить механизм ассоциации гликоконъюгатов с плазматической мембраной и оценить время жизни этих молекул на поверхности клеток-мишеней.

3. Оценить пространственную доступность олигосахаридов, встроенных в плазматическую мембрану клеток-мишеней, для взаимодействия с ЕК-клетками.

4. Проанализировать влияние модификации клеточной поверхности с помощью гликоконъюгатов на фенотип клеток-мишеней (экспрессию молекул СЕ)45 и белков теплового шока).

5. С помощью разработанной модели оценить влияние различных олигосахаридов на цитотоксическую активность ЕК-клеток, полученных из периферической крови человека, с использованием клеток-мишеней линий К562 и Кар.

6. Оценить в данной модели эффекты гликоконъюгатов при использовании обогащенной ЕК-клетками культуры периферических мононутслеаров человека.

7. Оценить в данной модели влияние гликоконъюгатов на цитотоксичность, опосредованную ЛАК-клетками (лимфокин-активированные киллеры) человека.

Научная новизна. До настоящего времени не было проведено широкого скрининга углеводов поверхности клеток-мишеней по их действию на функциональную активность естественных киллеров человека, что в немалой степени связано с отсутствием адекватных моделей для решения этой задачи. В данной работе была создана модельная система с использованием липофильных неогликоконыогатов для изучения роли олигосахаридов, представленных на поверхности клеток-мишеней, в процессе их распознавания ЕК-клетками.

В рамках указанной модели впервые проанализировано влияние девяти различных олигосахаридов, включая опухолеассоциированные, группоспецифические и ксеноантигены, сканированные, сульфатированные и фукозилированные углеводы, на цитотоксичность, опосредованную ЕК-клетками человека. Проведенные исследования выявили позитивные эффекты трех олигосахаридов (Ьех, 3'Н80зЬех и Ье¥), в то время как остальные сахариды не оказывали влияния или незначительно ингибировали цитотоксичность ЕК-клеток. Существенно, что указанные три олигосахарида содержат общий структурный мотив, а именно - трисахарид Ьех.

Практическая значимость. Разработанная модель направлена на изучение механизмов распознавания ЕК-клетками клеток-мишеней, что весьма актуально для экспериментальной иммунологии. В частности, данная модель может явиться эффективным средством не только для идентифицикации лигандов рецепторов ЕК-клеток (например, лектинов), но и для изучения вовлеченности углеводных структур в каскад событий, приводящих к цитотоксическому лизису клеток-мишеней. В то же время, данная модель может эффективно использоваться и в клинической иммунологии, поскольку характеристика углеводных структур, отличающих нормальные клетки организма от измененных, может обеспечить основу для развития новых подходов к иммунотерапии опухолей и инфекционных болезней человека. Наряду с этим, существенной практической значимостью обладают полученные в работе данные о роли структурного мотива 0а1Р(1-4)01сНАсР(1-3)1?иса как сигнала для активации ЕК-клеток. Эти данные расширяют существующие представления о механизмах распознавания мишеней ЕК-клетками и открывают новые возможности

направленной модификации поверхности опухолевых клеток с целью увеличения их чувствительности к цитотоксическому действию естественных киллеров.

Аппобапня работы. Материалы диссертации представлены на 3-ей и 4-ой Международных летних школах по иммунологии (Пущино, 1998, 2000), 2-ом Национальном конгрессе Российской ассоциации аллергологов и клинических иммунологов (РААКИ) (Москва, 1998), 10-ом Интернациональном конгрессе по иммунологии (Нью Дели, 1998), 6-ом конгрессе Британского общества иммунологов (Харрогейт, 1998), 2-ом съезде иммунологов России (Сочи, 1999), 3-ей, 4-ой и 5-ой научных конференциях: "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" (Санкт-Петербург, 1999, 2000, 2001), международной школе по иммунологии (Неаполь, 2000), 7-ой и 8-ой конференциях по человеческим лейкоцитарным антигенам дифференцировки (Харрогейт, 2000, 2001), курсе ФЕБО по молекулярной динамике мембранного биогенеза (Каргез, 2001) и на конференции отдела иммунологии Института биоорганической химии РАН.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ, список которых приводится в конце автореферата.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, собственных исследований и обсуждения полученных результатов, выводов и библиографического списка цитируемой литературы.

Работа изложена на 142 страницах машинописного текста, иллюстрирована 26 рисунками и 6 таблицами. Библиография содержит 166 работ отечественных и зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клетки. Клетки К562, Яа^ и ИРМ1-8866 культивировали во влажной атмосфере с 5% С02 при температуре 37°С (105 кл/мл) в полной питательной среде (ППС), содержащей ИРМ!-1640, 40 мкг/мл гентамицина, 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ

L-глутамина и 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола, с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС).

Клеточную жизнеспособность оценивали с помощью метода проточной цитофлуориметрии. Из всей клеточной популяции выделяли область клеток, сходных по размерам и гранулярности. Далее оценивали процент дискриминированных клеток.

Для выделения популяции эффекторных клеток использовали периферическую кровь здоровых доноров. Мононуклеары выделяли по стандартной методике в градиенте плотности. Элиминацию прилипающих клеток проводили путем инкубирования суспензии периферических мононуклеаров (ПМН) в ППС с добавлением 2% ЭТС в чашках Петри при температуре 37°С в течение 40 мин.

Для выращивания обогащенной естественными киллерами культуры клеток, ПМН (4 х 105 кл/мл) переводили в ППС с 10% ЭТС и культивировали в течение 10 дней с предварительно облученными (3000 рад) клетками RPMI-8866 (105 кл/мл).

Для получения JIAK-клеток мононуклеарные клетки культивировали в ППС в течение 3 дней в концентрации 2,5х105 кл/мл с добавлением 200 ед./мл рекомбинантного ИЛ-2.

Гликоконъюгаты. В работе использовали водорастворимые неогликоконъюгаты типа Glyc-PAA-PE и Glyc-PAA(Flu)-PE, где Glyc - остаток утлевода, РЕ - остаток фосфатидилэтаноламина, РАА - полимерная полиакриламидная матрица, Flu -остаток флуоресцеина. Синтез гликоконъюгатов и присоединение РЕ осуществлялся в лаборатории химии утлеводов Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова.

Встраивание гликоконъюгатов в клетки проводили в фосфатно-солевом буфере (ФСБ). Для этого двукратно отмытые клетки (106 кл/мл) инкубировали в течение разных периодов времени с различной концентрацией молекул гликоконъюгатов при разных температурах. Затем клетки дважды отмывали ФСБ и использовали в эксперименте.

Иммунофенотипирование. Окрашивание клеток проводили с помощью антител к маркерам CD16, CD19, CD3, CD8, CD4, HLA-DR. Клетки инкубировали с антителами в ФСБ в течение 40 мин при 4°С. Затем к дважды отмытым клеткам добавляли вторые антитела (анти-Ig мыши, меченые ФИТЦ). После 40 мин инкубации при 4°С и двукратной отмывки, проводили цитофлуориметрический анализ ПМН.

Спектрофлуоргшетрия. Количество флуоресцентномеченого гликоконъюгата в растворе оценивали с помощью спектрофлуориметра (Hitachi, Япония) в кювете размером 5x5 мм при длине волны возбуждения >.ех=490 им, испускания /*ет=510 им и ширине щели монохроматора 5 нм.

Оценка цитотоксичноспш. Для постановки цитотоксического теста использовали клетки-мишени линий К562 и Raji и эффекторы - ПМН человека без прилипающих клеток и В-клеток, а также культуры ЕК-клеток и JIAK-клетки.

В качестве основного метода оценки цитотоксичности ишользоваш колориметрический ферментативный анализ (C_\toTox96, Promega, США), основанный на измерении оптической плотности неточного супернатанта после выхода лактатдегидрогепазы (ЛДГ) из лизировапных клеток. Нативные и модифицированные клеткн-мишепн смешивали с эффекторами в различных соотношениях и инкубировали в ГТПС с 2% TTC в течение 3 ч в ССМшкубаторе. Далее суисрпатаит in экспериментальных лунок смешивали с субстратной смесью. Через 30 мин проводили оценку оптической плотности при дайне полны 490 им. Процент специфического лизиса клеток-мишеней подсчитывали по формуле:

СЛ 1%) = рм - M - (') - C)]/[Mmax - М| \ 100, где СЛ (%) - процент специфического лизиса, ЭМ - экспериментальный выход ЛДГ, M - фон клеток-минlenen, Э - фон клеток-эффекторов, С - фон культуральной среды, Mtnax - максимальный выход ЛДГ.

Дополнительно ниготоксическую активность ЕК-клеток оценивали методом проточной цитофлуорпметрии с использованием набора реактивов (I.-322-1. "Liye/Dead". Molecular Probes, США), содержащего красители для живых (кальшлш AM - САМ) и мертвых (пи/шум го.мо.шмер-1 - Eth-1) клеток. Предварительно обработанные САМ клетки-мшиепи смешивши с эффекторами в определенных соотношениях и инкубировали в течение 2 ч как описано выше. Далее в экспериментальные образцы добавляли Eth-1 и подвергачи их цптофлуориметрическому анализу, регистрируя процентное содержание окрашенных двумя красителями мертвых клеток-мишеней.

В ряде экспериментов цитотоксичность оценивали с использованием радиоактивной метки (3Н-тимидина). Клетки-мишени и эффекторы смешивачи в различных соотношениях и оставляли на ночь в С02-инкубаторе. После окончания инкубации в образцы на 4 ч добавляли 3Н-тимидин. Количество метки,

включившейся в клетки, измеряли по стандартной методике с использованием сцинтилляционного счетчика. Индекс цитотоксичности (ИЦ) вычисляли по формуле: ИЦ = 1 - ЭМ / (Эк + Мк), где ЭМ - радиоактивность (имп/мин) клеток-эффекторов и клеток-мишеней из экспериментальных лунок, Эк - контроль клеток-эффекторов, Мк - контроль клеток-мишеней.

Проточная цитометрия. Анализ флуоресценции клеток (не менее 5000) проводили на цитофлуориметре EPICS "ELITE" (Coulter Electronics Inc., Великобритания). Интенсивность флуоресценции клеток наблюдали при длине волны возбуждения 488 нм и регистрации 525 нм для ФИТЦ и 580 нм для фикоэритритрина. Результаты подвергали математической обработке с использованием программы MultiGraph и IMMUNO 4 (Coulter Electronics Inc., Великобритания).

Обработку результатов проводили методами вариационной статистики с соответствующими расчетами среднего арифметического и стандартной ошибки среднего. Полученные данные представляли используя программу SigmaPloté.O.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Создание модели для оценки влияния углеводов с использованием липофилъных гликоконъюгатов

Для того чтобы оценить влияние различных углеводов на цитолитическую активность ЕК-клеток, нами разработана модельная система по встраиванию полимерных неогликоконъюгатов в мембрану живых клеток-мишеней. Для модификации клеток-мишеней было предложено использовать неогликоконъюгаты типа Glyc-PAA(Flu)-PE, которые представляют собой водорастворимые, но в то же время достаточно гидрофобные для легкого встраивания в липидный бислой полимерные молекулы. При молекулярной массе около 40 кДа гликоконъюгат (ГК) несет на себе несколько десятков углеводных цепей (Glyc) и остатков фосфатидилэтаноламина (РЕ).

Для изучения условий и оптимизации встраивания полимерных структур в мембрану клеток-мишеней были выбраны флуоресцентномеченые ГК, содержащие в качестве углеводного компонента трисахарид Lex - Galß(l-4)GlcNAcß(l-3)Fuca. Была выявлена зависимость интенсивности флуоресценции клеток от количества добавленного к ним Glyc-PAA(Flu)-PE, свидетельствующая об увеличении доли ГК, удерживаемого на поверхности клеток-мишеней, при возрастании его содержания

в инкубационной смеси в диапазоне концентраций 6-900 мкг/мл. При максимальной концентрации ГК наблюдался выход кривой на плато, что говорит о насыщении процесса встраивания (Рис.1). Оценку жизнеспособности клеток К562 и проводили до и после встраивания ГК. При использовании низких концентраций ГК, а именно от 6 до 100 мкг/мл, жизнеспособность клеток оставалась практически неизменной, а при увеличении концентрации лишь незначительно уменьшалась. Поэтому дальнейшие исследования проводили в диапазоне концентраций ГК от 50 до 100 мкг/мл. Флуориметрический анализ клеток со встроенными молекулами ГК показал, что для указанных концентраций Ьех(15%)-РАА (Р1и(1мол.%))-РЕ(5мол.%) количество остатков Ьех для клеток линии равнялось приблизительно 4 млн. и 8 млн. на клетку, а для клеток линии К562 приблизительно 2 млн. и 4 млн., соответственно. Краткая инкубация модифицированных ГК клеток в кислой среде (рН 4,0) не приводила к существенному снижению уровня флуоресценции, что свидетельствует о доминировании гидрофобных, а не электростатических взаимодействий в системе мембрана - ГК. Т. е. в данной модели имеет место истинное встраивание остатков РЕ в липидный бислой клеточной мембраны.

0 200 400 600 800 1000

концентрация гликоконъюгата, мкг/мл

Рис.1. Зависимость эффективности встраивания молекул гликоконъюгата

Lex (15 мол.%) - РАА (Flu (1 мол.%)) - РЕ (2,5 мол.%) в клетки К562 от их концентрации.

ГК с различным мольным процентом остатков РЕ (0,5; 1; 2,5; 5; 10 и 20 мол.%) встраивали в клетки-мишени линий К562 и Кяр. Было показано (Рис.2), что наилучшее встраивание ГК в мембраны клеток исследуемых линий достигается при содержании РЕ, равном 5 мол.%.

Рис.2. Гистограммы распределения интенсивности флуоресценции клеток линии (слева) и К562 (справа) в зависимости от содержания липидных остатков фосфатидилэтаноламина (РЕ, мол.%) в гликоконъюгате. По оси абсцисс - логарифм интенсивности флуоресценции, по оси ординат - количество клеток.

Для определения оптимального времени встраивания ГК в мембрану клеток-мишеней измеряли интенсивность флуоресценции клеток в течение 75 мин с интервалами в 15 мин. Было показано, что клетки линии К562 встраивают максимальное количество ГК через 45 миг, а клетки линии уже через 30 мин после начала инкубации (Рис.3). В дальнейших экспериментах для клеток обеих линий было выбрано время встраивания равное 45 мин.

При изучении влияния различных температурных режимов (4°С, 20°С и 37°С) на процесс встраивания ГК в клетки К562 и 11аД было показано, что максимальный уровень встраивания для обеих клеточных линий достигается при 37°С (Рис.4).

О 15 30 45 60 75 время встраивания гликоконъюгата, мин.

РиС.З. Динамика встраивания гликоконъюгата (ГК) в клетки линий К562 и Яа^ (концентрация ГК - 100 мкг/мл, содержание РЕ - 5 мол.%).

о >>

я" Я Я" Я О

я о

<и

о

£ •в* л

S

о

3 к о к

4> Н

я я

10

□ К562

ШШ К562 + ГК KtsWj Raji ^^ Raji + ГК

0

4 20 37

температура встраивания гликоконъюгата, °С

Рис.4. Зависимость встраивания гликоконъюгата (ГК) в клетки линии К562 и Raji от температуры (концентрация ГК - 100 мкг/мл, содержание РЕ - 5 мол.%).

Для клеток К562 и Raji было оценено изменение количества ГК, связанного с клеточной поверхностью, с течением времени. Доказано присутствие ГК на клеточной поверхности на протяжении 24 ч. В то же время с течением времени Glyc-PAA(Flu)-PE частично элиминируется с клеточной мембраны, о чем свидетельствует уменьшение интенсивности флуоресценции клеток. На клетках линии К562 ГК удерживается в

6

4

2

течение более длительного времени по сравнению с клетками линии Raji, хотя было показано, что клетки К562 обладают меньшей способностью встраивать ГК. Интенсивность элиминации, вероятно, связана с типом клеток и может зависеть от свойств их клеточных мембран и метаболической активности.

Для выяснения возможных путей элиминации ГК с клеточной поверхности была изучена кинетика этого процесса на протяжении 3 ч, что соответствует продолжительности цитотоксического теста. Установлено, что с течением времени интенсивность флуоресценции клеток плавно уменьшается (Рис.5А). Это указывает на частичное сбрасывание ГК с поверхности клеток во внеклеточную среду. Однако спектрофлуориметрический анализ супернатанта обрабатываемой культуры не выявил роста концентрации не связанных с клетками молекул ГК через 3 ч культивирования (Рис.5Б). Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что сбрасываемые с клеточной поверхности ГК частично эндоцитируются клетками.

5 12 £ 10 I 8

а

а в

о

4 4

6

о 1 X L м

а

о

5 о

100

£

ll> 95

S PJ 90

п

С' XS

>>

еа 80

t

75

ч

70

Б

83% 82,8% 82,1%

-♦

1

3

1

время после встраивания гликоконъюгата, ч.

Рис.5. Динамика элиминации гликоконъюгата (ГК) с поверхности клеток линии К562 в течение 3 ч после встраивания ГК (концентрация ГК - 100 мкг/мл, содержание РЕ - 5 мол.%). А— изменение интенсивности флуоресценции клеток линии К562. Б - изменение содержания молекул ГК в супернатанте.

Модифицируя клетки-мишени гликоконъюгатами, содержащими Ьех (СБ 15), и используя моноклональные антитела к антигену СБ15, была исследована пространственная доступность углеводных остатков для межклеточных взаимодействий. В норме клетки линии К562 экспрессируют на своей поверхности трисахарид Ьех, в то время как у клеток Ка^ такой экспрессии не наблюдается. После встраивания ГК в мембраны отмечается резкое увеличение интенсивности флуоресценции клеток К562 и Яа^, что свидетельствует о пространственной доступности трисахарида для

о

3

2

ЕК-клеточного узнавания. При оценке экспрессии антигена CD15 на клетках-мишенях через 3 ч после встраивания ГК интенсивность флуоресценции клеток-мишеней К562 и Raji достоверно не изменялась, оставаясь на весьма значительном уровне (Рис.6). Полученные результаты свидетельствуют о том, что углеводный эпитоп, экспонированный на клеточной поверхности, доступен для антител, а, следовательно, и для взаимодействия с естественными киллерами на протяжении всего цитотоксического теста.

0 3 0 3

время инкубации, ч.

РиС.6. Экспрессия антигена СШ5 (Ьех) на клетках линии К562 и Ла^ сразу после встраивания гликоконъюгата (ГК) и через 3 часа.

С использованием моноклональных антител к панлейкоцитарному антигену СЕМ 5 было показано, что встраивание ГК и экспонирование на клеточной поверхности олигосахаридов не оказывает влияния на поверхностную экспрессию этого антигенного маркера.

Для проверки предположения, что процедура встраивания ГК в клеточную мембрану может привести к увеличению поверхностной экспрессии белков теплового шока (БТШ) и, как следствие, к увеличению ЕК-опосредованного цитолиза, была проведена оценка экспрессии БТШ70 на клеточной поверхности К562 и Яа^ до и после встраивания ГК. Показано, что клетки К562 несут на своей поверхности некоторое количество БТШ70, что подтверждают литературные данные, в отличие от клеток линии Яа^ (Рис.7). Встраивание ГК достоверно не изменяло поверхностной экспрессии БТШ70 в обеих клеточных линиях, что свидетельствует об отсутствии какого-либо вклада БТШ70 в изменение цитотоксичности.

] аутофлуоресценция 3 антитела к БТШ70

О

К562 К562 +ГК Ка]Ч Ка^ + ГК

РИС.7. Влияние встраивания гликоконъюгата (ГК) в мембрану клеток-мишеней на экспрессию БТШ70 на клеточной поверхности.

Таким образом, нами подобраны оптимальные условия для встраивания ГК в плазматическую мембрану клеток-мишеней. Экспериментально определено содержание липидного компонента в молекуле неогликоконыогата (5 мол.%), концентрация ГК (50-100 мкг/мл), температура (37°С) и время встраивания (45 мин). Изучен механизм ассоциации ГК с плазматической мембраной и кинетика его элиминации с клеточной поверхности. Продемонстрирована пространственная доступность углеводных лигандов для ЕК-клеток человека в течение нескольких часов, необходимых для взаимодействия естественных киллеров с клетками-мишенями. На примере молекул СЕМ 5 и БТШ70 показано, что экспонированные олигосахариды не изменяют поверхностной экспрессии этих антигенов. Разработанная модельная система позволяет использовать модифицированные ГК клетки-мишени в циготоксических тестах для оценки влияния олигосахаридных остатков на цитолитическую активность ЕК-клеток человека.

Изучение влияния олигосахаридов на цитолитическую активность ЕК-клеток человека

В число исследуемых сахаридов вошли такие физиологически значимые углеводные лиганды как опухолеассоциированные антигены (Lex, LeY, SiaTn, SiaLeA), ксеноантигены (B^, Вт), лиганды селектинов (3'HSOjLex - сульфатированный Lex), сиалосодержащие сахариды.

В качестве мишеней для ЕК-клеток человека были выбраны клеточные линии К562 и Raji на основе их различий в экспрессии молекул ГКГС и чувствительности к действию естественных киллеров. В качестве эффекторных клеток использовали мононуклеары периферической крови здоровых доноров, лишенные субпопуляции прилипающих клеток и В-клеток. В экспериментах использовались такие популяции ПМН, в которых содержание ЕК-клеток было не менее 7%. С помощью разработанной модельной системы было оценено влияние девяти различных олигосахаридов на цитотоксическую активность естественных киллеров человека (Рис.8).

олигосахариды

РиС.8. Влияние сахаридов на цитотоксичность свежевыделенных ЕК-клеток, оцененное колориметрическим методом.

Олигосахариды Ьех, 3'Н803Ьех (8иЬех) и Ье¥ увеличивали цитотоксическую активность эффекторных клеток. Процент специфического лизиса модифицированных

клеток в данном случае был почти в два раза выше (27; 33; 31%) по сравнению с контрольными нативными клетками К562 (17%). Подобные положительные эффекты олигосахаридных остатков Ьех, 3'Ш03Ьс>: и Ье"1 были выявлены при использовании в качестве мишеней меток линии Иа^, слабо чувствительной к опосредованному ЕК-клетками лизису. При этом наблюдалось увеличите специфического лизиса модифицированных этими сахаридами кчеток более чем в 2,5 раза (9,6; 10; 9,3%) по сравпешпо с контрольными клетками (3,5%). Позттшное влияние трех упомянутых выгпе олигосахарндов, и разной степиш выраженное, но обязательно достоверное, было обнаружено при использовании ИМИ болытшнетва донором. Как оказачось, олигосахариды, проявившие такое влияние па опосредованный естественными киллерами клеточный лизис, имеют в своем составе сходный стру ктурный эпнтоп, а имешю трисахарнд Рех - 0аф(1-4)01сМАсР( 1-3)Риса.

Обнаруженное иоло',|;ител1.иое влияние углеводов, содержащих стр\кт\риый мотив Рех, было также выявлено и друтими методами дтя оценки цитолитической активности ПК-клеток человека, а имешю, с использованием флуоресцентных красителей для живых и мертвых клеток (Рнс.ОЛ) и по включению радиоактивного ?11-тимиднна в клетки (РпсЛ'К). Таким образом, тремя различными методами был выявлен один и тот же позитивный эффект Ьех-содержащнх ГК на эффекторную функцию ЕК-клеток человека. Полученные данные свидетел!.ствутот в пользу того, что структурный мотив (¡аф(1-4)С1сМДф(. 1-3)1чкхс является актуальным ;ця НК-клеточпого распознавания.

1 5 I 10 1 20 1.-40 151)0 I 20 1 40 1 80

соотношение мишень/эффектор

Р11С.9. Влияние трисахарида Ьех на цитотокеическую активность свежевыделеиных ЕК-клеток, оцененное цитофлуориметрическим методом с использованием флуоресцентных красителей ЕЛс1-1 и САМ (А) и радиоизотопным методом (Б).

Изучение влияния олигосахаридов, представленных на клеточной поверхности, на цитотоксичность ЕК-клеток было продолжено с использованием в качестве эффекторов обогащенной естественными киллерами 10-дневной клеточной культуры. Как правило, доля CD16+ клеток в такой культуре составляла около 70%. ГК Lex и LeY увеличивали ^политическую активность клеток ЕК-культуры, при этом для клеток линии К562, модифицированных Lex, это увеличение составляло 13%, модифицированных LeY - 8% (Рис.11). Для клеток линии Raji олигосахарид Lex увеличивал цитотоксичность до 6% по сравнению с нулевой цитотоксичностью контрольных клеток, LeY до 5%. Полученные результаты свидетельствуют о том, что модификация клеток двух линий гликоконьюгатами, содержащими олигосахаридные остатки Lex и LeY, приводит к существенному увеличению их чувствительности к клеткам ЕК-культуры. При этом встраивание в клетки-мишени ГК, содержащего сахарид Вл> по предварительным данным не влияющего на цитотоксическую активность ЕК-клеток, также не изменяло ЕК-опосредованный цитолиз.

Ье Ье'

олигосахариды

РиС.11. Влияние олигосахаридов на цитолитическую активность клеточной культуры, обогащенной естественными киллерами, оцененное колориметрическим методом. Соотношение мишеней и эффекторов 1:7.

Было проведено изучение влияния олигосахаридов на цитотоксическую активность, опосредованную ЛАК-клетками. В этой модели также было обнаружено заметное (около 10%) позитивное влияние таких олигосахаридов как 3'Н80зЬех и Ье\ несмотря на высокий уровень исходной цитотоксичности, опосредованной ЛАК-

клетками (Рис.12). Эти данные подтверждают результаты, полученные с использованием свежевыделенных ЕК-клеток и клеточной культуры, обогащенной естественными киллерами.

80

К SuLe "Х Le Y В . SiaLe А олигосахариды m

PlIC.12. Влияние олигосахаридов, представленных на поверхности клеток линии К562, на цитолитическую активность ЛАК-клеток, оцененное колориметрическим методом.

Таким образом, с помощью разработанной модельной системы была проведена оценка влияния девяти ГК на цитолитическую функцию естественных киллеров человека. При этом было выявлено три ГК, оказывающих усиливающие воздействие на ЕК-зависимый лизис клеток линий К562 и Raji. В качестве утл вводного компонента они содержат следующие сахариды: Lex, 3'HS03Lex (сульфатированную форму Lex) и опу'холеассоциированный антиген Le\ Все перечисленные сахариды в своем составе содержат од™ и тот же эпитоп - трисахарид LeK. По всей видимости, именно он выполняет роль активирующего сигнача дая ЕК-клеток. Использовашге двух других ГК, Btn и SiaTn, привели к незначительному ингибировашпо цитотоксичности. Сахариды Аы, GlcNAc, ксеноантаген Вл и опухолеассоциировазшьш антиген SiaLeA показали себя инертными в реакции цитотоксичности. Позитивный эффект сахаридов, содержащих эпитоп Lex, бьш подтвержден с использоваш!ем в качестве эффекторов популяции клеток ЕК-культуры, а также ЛАК-клеток, хотя в последнем случае эффект был менее ярко выражен.

выводы

1. Создана модельная система для оценки влияния углеводов, представленных на клетках-мишенях, на цитотоксическую активность естественных киллеров, основанная на модификации поверхности клеток-мишеней с помощью липофильных неогликоконьюгатов.

2. Подобраны оптимальные условия для встраивания глшсоконыогатов типа Glyc-PAA-PE в клетки-мишени линий К562 и Raji (время, температура, концентрация молекул гликоконъюгата и содержание в них липидного компонента).

3. Показано, что с течением времени происходит частичная элиминация молекул гликоконъюгата с клеточной поверхности, однако на протяжении цитотоксического теста (3 часа) количество встроенных молекул практически не изменяется.

4. Встраивание гликоконъюгатов не приводит к изменению фенотипа клеток-мишеней, а именно не изменяет экспрессию молекул CD45 и не вызывает появления стресс-индуцируемых БТШ70 на их поверхности. При этом встроенные углеводные детерминанты пространственно доступны для распознавания ЕК-клетками.

5. Обнаружено, что олигосахариды Lex, 3 'HSOjLex и Ley, содержащие структурный мотив Gaip(l-4)GlcNAcp(l-3)Fuca, служат позитивным сигналом для естественных киллеров человека, что приводит к увеличению их цитолитической активности.

6. Установлено, что олигосахариды Lex, 3'HSOjLex и Le существенно увеличивают цитотоксичностъ как свежевыделенных так и прекультивированных ЕК-клеток, и в" меньшей степени стимулируют цитолитическую активность JIAK-клеток.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Абакушина (Хирова) Е.В., Коваленко Е.И., Саблина М.А., Хайдуков С.В., Бовин Н.В. Встраивание неогликолипидов в мембрану клеток К562. Модель для изучения утлеводзависимого лизиса клеток-мишеней естественными киллерами // Биоорганическая химия. - 1998. - Т. 24. - № 3. - С. 224-228.

2. Abakushina E.V., Kovalenko E.I., Sablina М.А., Khaidukov S.V., Bovine N.V. Model system for the study of the role of carbohydrates in human natural killer cell mediated cytotoxicity // In: Book of abstracts "Fourth John Humphrey advanced summer program in immunology." Pushchino - 1998. - P. 30.

3. Абакушина E.B., Коваленко Е.И., Саблина M.A., Хайдуков С.В., Бовин Н.В. Модель для оценки влияния углеводов клеточной поверхности на эффекторную функцию естественных киллеров (NK) человека // Сборник трудов 2-ого Национального конгресса Российской ассоциации аллергологов и клинических иммунологов (РААКИ) "Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммунофармаколопш." Москва - 1998. - С. 450.

4. Abakushina E.V., Kovalenko E.I., Sablina М.А., Khaidukov S.V., Bovine N.V. The model system for the study of carbohydrate-dependent NK cell-mediated cytotoxicity // The immunologist. - 1998. - Nov. 1-6. - P. 161.

5. Abakushina E.V., Kovalenko E.I., Sablina M.A., Khaidukov S.V., Bovine N.V. The model system for the study of carbohydrate-dependent NK cell-mediated cytotoxicity // Immunology. - 1998. - V. 95. - S. 1. - P. 105.

6. Абакушина E.B., Коваленко Е.И., Саблина M.A., Хайдуков С.В., Бовин Н.В. Модельная система для изучения роли утлеводов поверхности клеток-мишеней на цитотоксическую активность естественных киллеров человека // Медицинская иммунология. - 1999. - Т. 1. - № 3-4. - С. 26.

7. Абакушина Е.В., Коваленко Е.И., Хайдуков С.В., Бовин Н.В. Оценка влияния утлеводов на цитотоксическую активность NK-клеток в новой модели // Russian Journal of Immunology - 1999. - V. 4. - S. 1. - P. 38.

8. Abakushina E.V. A study of the role of carbohydrates in NK cell-mediated cytotoxicity // In: Book of abstracts scuola superiore d'Immunologia R. Ceppellini: "Escape from

immune surveillance of tumors and microorganisms: emerging mechanisms and shared strategies" Napoli, Italy - 2000. - P. 79-80.

9. Абакушина E.B., Коваленко Е.И., Овчинникова T.B., Хайдуков С.В., Бовин Н.В. Изучение влияния углеводов на цитотоксическую активность NK-клеток человека с использованием липофильных гликоконъюгатов // Медицинская иммунология -2000.-Т. 2. -№2. - С. 130.

10. Abakushina E.V., Kovalenko E.I., Khaidukov S.V., Ovchinnikova T.V., Bovine N.V. CD15 and related oligosaccharides upregulate NK-cell-mediated cytotoxicity // Tissue antigen - 2000. - V. 55. - № 1. - P. 30.

11. Abakushina E.V., Kovalenko E.I., Ovchinnikova T.V., Khaidukov S.V., Bovine N.V. A study of influence of carbohydrates on NK cell-mediated cytotoxicity // In: Book of abstracts Fifth John Humphrey advanced summer program in immunology. Pushchino, Moscow region, Russia - 2000. - P. 40.

12. Abakushina E.V., Kovalenko E.I., Khaidukov S.V., Ovchinnikova T.V., Sablina M.A., Bovine N.V. CD 15 and related oligosaccharides upregulate NK-cell-mediated cytotoxicity // Leucocyte typing VII: white cell differentiation antigens.- 2001. P. 156157.

13. Абакушина E.B., Коваленко Е.И., Овчинникова T.B., Хайдуков С.В., Сапожников A.M. Увеличение опосредованного натуральными киллерами лизиса клеток К562 и Raji, модифицированных с помощью липофильных гликоконъюгатов, не связано с экспрессией белков теплового шока на поверхности клеток-мишеней // Медицинская иммунология-2001. -Т. 3. -№2. -С. 133.

14. Abakushina E.V. The incorporation of lipophilic neoglycoconjugates into the membrane of target cells // In: Book of abstracts FEBS advanced course: "Molecular dynamics of membrane biogenesis." Cargese, Corsica, France - 2001. - P. 55.