Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Роль белка теплового шока 70 КДА в активации натуральных киллеров

На правах рукописи

Каневский Леонид Михайлович

РОЛЬ БЕЛКА ТЕПЛОВОГО ШОКА 70 КДА В АКТИВАЦИИ НАТУРАЛЬНЫХ КИЛЛЕРОВ

14.00.36 - Аллергология и иммунология

- 8 2т

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2009

003479108

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Коваленко Елена Ивановна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Филатов Александр Васильевич

доктор медицинскиих наук, профессор Стенина Марина Александровна

Ведущая организация:

ГУ НИИ Вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН

Защита состоится "_" _ 2009 г., в _ часов на заседании

диссертационного совета Д 208.072.05 при Российском государственном медицинском университете по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского государственного медицинского университета по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, 1.

Автореферат разослан "

Ученый секретарь диссертационного совета:

кандидат медицинских наук, доцент

2009 г.

Т.Е. Кузнецова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Натуральные киллеры (1ЧК-клетки) - это особая популяция лимфоцитов системы врожденного иммунитета, играющая важную роль в противоопухолевом и противовирусном иммунитете. ЫК-клетки способны оказывать прямое цитолитическое действие на трансформированные либо инфицированные клетки и принимать участие в регуляции иммунного ответа за счет продукции цитокинов. Две функционально различные субпопуляции МК-клеток, С05бс1'т и CD56bril!',,, могут быть активированы растворимыми медиаторами либо посредством прямого межклеточного контакта. В настоящее время интенсивно изучаются вещества, вызывающие активацию ЫК-клеток, в первую очередь, для получения противовирусных и противоопухолевых средств. В то же время, выяснение механизмов активации и реализации эффекторных функций МК-клеток является актуальной фундаментальной научной проблемой.

В настоящее время предполагается, что нетипично локализованный белок теплового шока 70 кДа (Н$р70) оказывает стимулирующее воздействие на различные компоненты системы врожденного иммунитета, действуя в качестве «сигнала опасности» для организма. Уровень продукции этих белков, в норме выполняющих внутриклеточные шаперопные функции, сильно возрастает под действием различных стрессовых факторов. При этом в организме появляются внеклеточные и мембраносвязанные формы №р70. Описаны активирующие эффекты этого белка на макрофаги, дендритные клетки, Т-лимфоциты. В ряде работ показано, что как мембраносвязашшй, так и экзогашый №р70 может активировать цитотоксичность и пролиферацию натуральных киллеров, а также вызывать положительный хемотаксис МК-клеток. В то же время, остается неясным, как влияет Нэр70 на цитокинпродуцирующую функцию МК-клеток, какая из субпопуляций МК-клеток является более чувствительной к действию Н5р70, в каких условиях реализуется действие №р70 на натуральные киллеры. Неясно также, какой вклад вносит присущая Нзр70 способность взаимодействовать с веществами гидрофобной природы в оказываемые этим белком иммуномодулирующие эффекты.

Таким образом, изучение и расшифровка механизмов регуляции активности МК-клеток с участием НБр70 представляет собой актуальную задачу медицинской иммунологии.

Цель исследования: изучение роли белка теплового шока 70 кДа в функционировании МК-клеток человека, а именно анализ влияния экзогенного и экспонированного на клеточной поверхности Н5р70, а также его пептидных фрагментов, на основные эффекторные функции натуральных киллеров.

Задачи исследования:

1. Проанализировать действие экзогенного рекомбинантного белка Hsp70 на продукцию цитокинов NK-клетками.

2. Охарактеризовать продукцию IFN-y в субпопуляциях NK-клеток CD56dlm и С056ЫеЫ в ответ на Hsp70.

3. Оценить влияние экзогенного Hsp70 на цитотоксичность и экспрессию поверхностных маркеров NK-клеток.

4. Исследовать влияние Hsp70, экспонированного на поверхности клеток-мишеней, на цитотоксичность NK-клеток и продукцию цитокинов.

5. Идентифицировать пептидные фрагменты молекулы Hsp70, способные активировать NK-клетки.

6. Изучить влияние Hsp70 на опосредованную липополисахаридами активацию NK-клеток.

Работа проведена с использованием NK-клеток, выделенных из периферической крови здоровых доноров.

Научная новизна работы

В работе показана способность экзогенного Hsp70 стимулировать функциональную активность натуральных киллеров, и с помощью оригинального подхода идентифицирован пептидный фрагмент субстратсвязывающего домена Hsp70, способный усиливать продукцию цитокинов и цитолитическую функцию NK-клеток человека. Выявлены различия в действии Hsp70 на продукцию IFN-y и TNF-a. Субпопуляция NK-клеток CD56b"eht охарактеризована как наиболее чувствительная к активирующему действию Hsp70. Обнаружен феномен активации NK-клеток под действием бактериальных липополисахаридов (LPS). Выяснено, что Hsp70 способен ингибировать индуцированную LPS цитотоксичность и продукцию цитокинов NK-клетками. Уточнено, что LPS действуют непосредственно на NK-клетки, без участия иных клеток крови. Продемонстрировано активирующее действие мембраносвязанной формы Hsp70 на продукцию цитокинов и цитолитическую активность NK-клеток в оригинальных моделях.

Практическая значимость

К настоящему времени проблема поиска эффективных средств терапии рака и вирусных инфекционных заболеваний остается актуальной. В данной работе исследован эффективный способ стимуляции NK-клеток, лимфоцитов, способных оказывать противоопухолевое и противовирусное действие. Увеличение активности NK-клеток с помощью белка Hsp70 и его пептидного фрагмента может обеспечить, таким образом,

основу для развития новых подходов к иммунотерапии опухолей и инфекционных болезней человека.

Одной из важных медицинских проблем является предупреждение и лечение сепсиса. В работе продемонстрировано ингибирующее действие Hsp70 на вызываемую LPS индукцию секреции провоспалительных цитокинов, в частности, TNF-a, способного вызывать системную воспалительную реакцию. Результаты настоящей работы и ряд литературных данных дают основу для разработки препаратов для предупреждения и терапии сепсиса на основе белка теплового шока 70.

Внедрение в практику

Методические рекомендации по оценке клеточной цитотоксичности и апоптоза с помощью флуорогенного субстрата каспазы-6, а также новые методические подходы к анализу малочисленных популяций лейкоцитов методом проточной цитометрии использованы при выполнении научной работы в лаборатории химии углеводов ИБХ РАН.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на летней научной школе по иммунологии им. Дж. Хамфри (г. Москва, 2005 г.), на XVI Европейском конгрессе по иммунологии (г. Париж, 2006 г.), на научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (2007 г.), на II Всемирной конференции по стрессу (г. Будапешт, 2007 г.), на конференции «Дни иммунологии в Сибири-2008» (г. Томск, 2008 г.), на научной конференции «VIII научная конференция иммунологов Урала» (г. Архангельск, 2009 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста, раздел результатов содержит рисунков и таблиц. Список литературы включает источников.

Материалы и методы

Выделение мононуклеарных клеток периферической крови

Периферическую кровь здоровых доноров либо лейкоцитарную массу, получали в отделении переливания крови Российского Онкологического Научного Центра РАМН. Выделение мононуклеаров проводили путем центрифугирования клеток на растворе фиколла плотностью 1,077-1,078 г/см3 по стандартной методике.

Магнитная сепарация мононуклеаров с негативной селекцией NK-клеток

Мононуклеары подвергали магнитной сепарации с использованием набора для сепарации NK-клеток (MACS NK cell isolation kit II, Miltenyi Biotec, Германия). Доля NK-клеток составляла 90-98%. NK-клетки переводили в среду RPMI-1640 с добавлением 2 мМ L-глутамина, раствора пенициллина и стрептомицина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), далее полную питательную среду.

Культивирование клеточных линий

Клеточные линии культивировали в СОг-инкубаторе, где соблюдались условия повышенной влажности, 5% содержания С02 и +37°С. Линию NK-92 культивировали в полной питательной среде с IL-2 (200 ед./мл) и IL-15 (5 нг/мл). Перед экспериментами клетки NK-92 отмывали от IL-2 и IL-15 и инкубировали в культуральной среде в отсутствие цитокинов в течение 18 ч. Линию NKL культивировали в полной питательной среде с 15% FCS, 1 мМ пируват натрия и IL-2 (100 ед./мл). Перед экспериментами клетки NK-92 отмывали от IL-2 и инкубировали в культуральной среде в отсутствие цитокинов в течение 18 ч. Линии К-562 и Raji культивировали в полной питательной среде.

Фенотипическое окрашивание клеток

Для определения доли NK-клеток в популяции и уровне экспрессии поверхностных маркеров проводили окрашивание клеток флуоресцентномечеными антителами к CD3, CD20, CD16, CD56, CD94, NKG2D, TLR4. Окрашивание проводили при +4°С в течение 30 мин. Во всех опытах использовали рекомендованное производителем количество антител. Окрашенные клетки двукратно отмывали, ресуспендировали в PBS и подвергали цитофлуориметрическому анализу.

Проточная цитофлуориметрия

В работе использовали цитометр FACScan фирмы Becton Dickinson, укомплектованный лазером длиной волны 488 нм и стандартными фильтрами. На диаграмме малоуглового (FS) и бокового (SS) светорассеяния выделяли область событий, которые по значению этих параметров соответствовали живьм лимфоцитам. CD3"CD16+CD56+ NK-клетки, окрашенные флуоресцентномечеными антителами, а также долю продуцирующих

IFN-y NK-клеток вьмвляли по уровню флуоресценции в соответствующих каналах. При каждом цигометрическом измерении анализировали не менее 10000 событий. Для оценки редких популяций собирали не менее 300000 событий в образце. Данные обрабатывали с помощью программ CellQuest и WinMDI.

Стимуляция NK-клеток и определение продукции IFN-y с помощью внутриклеточного окрашивания

NK-клетки в концентрации 1,5 млн/мл инкубировали в 96-луночных иммунологических планшетах в полной питательной среде с цитокинами, Hsp70, LPS в СО2-инкубаторе в течение 18 ч. Затем клетки осаждали, отбирали супернатанты для иммуноферментного анализа, добавляли брефелдин А в концентрации 10 мкг/мл либо моненсин в концентрации 5 мкг/мл и инкубировали клетки дополнительно 4 ч. Супернатанты от стимулированных клеток замораживали. Клетки окрашивали флуоресцентномечеными антителами к поверхностным маркерам и проводили их фиксацию 2%-ным раствором параформальдегида. Затем клетки пермеабилизировали в растворе PBS, содержащем 1% FCS, 0,02% азида натрия и 1% тритона Х-100. Клетки окрашивали флуоресцентномечеными антителами к IFN-y и анализировали методом проточной цитофлуориметрии. Уровень продукции IFN-y определяли по доле продуцирующих клеток.

Иммуноферментный анализ продукции IFN-y

Количество секретируемого во внеклеточную среду IFN-y определяли с помощью набора для иммуноферментного анализа (Human IFN-y ELISA Kit, Pierce Endogen, США). Измерение оптической плотности образцов проводили при длине волны 450 нм на фотометре Multiskan МСС/340 МК II Titertek (Flow Lab, США).

Оценка продукции TNF-a методом проточной цитометрии

NK-клетки в концентрации 1,5 млн/мл инкубировали в 96-луночных иммунологических планшетах в полной питательной среде с цитокинами, Hsp70, LPS в С02-инкубаторе в течение 18 ч. Затем собирали супернатанты и замораживали при -20°С. Продукцию TNF-a в супернатантах NK-клеток оценивали с помощью набора Cytometric Bead Array Human Thl/Th2 Cytokine Kit (BD, CILIA). Концентрацию TNF-a определяли с помощью калибровочной кривой, полученной при анализе стандартов этого цитокина.

Оценка опосредованной NK-клетками цитотоксичности

Цитотоксичность NK-клеток оценивали с помощью набора CyToxiLux Plus (Oncoimmunin Inc., США), содержащего флуорогенный субстрат для каспазы-6. Перед постановкой цитотоксического теста NK-клетки инкубировали 18 ч в полной питательной среде в концентрации 1,5 млн/мл. Затем смешивали с клетками-мишенями К-562, предварительно окрашенными флуоресцентным красителем с эмиссией в области FL2

(фильтр 575/26 нм), в соотношении 3:1. Клеточную смесь осаждали центрифугированием (5 мин, 300 g). Клеточный осадок разводили в растворе флуорогенного субстрата эффекторной каспазы-6, проводили короткое осаждение клеток (1 мин, 300 g) и инкубировали 30 мин в СОг-инкубаторе. Затем клетки двукратно отмывали буферным раствором и анализировали образцы в проточном цитометре. Дискриминацию клеток-мишеней проводили по размеру и флуоресценции красителя для клеток-мишеней. Уровень циготоксичности определяли методом проточной цитометрии по доле клеток К-562 с высоким уровнем флуоресценции в канале FL1 (фильтр 530/30 нм).

Для оценки цитолитической активности NK-клеток использовали также нерадиоактивный цитотоксический тест CytoTox96 (Promega, США), основанный на количественном определении выхода лактатдегидрогеназы (ЛДГ) из клеток-мишеней. Концентрацию ЛДГ в супернатанте измеряли в ферментативном тесте при превращении солей тетразолия в цветные продукты формазана. Оптическую плотность измеряли с помощью фотометра при длине волны 490 нм. Уровень цитотоксичности оценивали как отношение оптической плотности в образце со смесью эффекторов и мишеней к оптической плотности в образце с полностью лизированными мишенями, выраженное в процентах. Учитывали поправки на присутствие ЛДГ в среде и спонтанный выход ЛДГ из эффекторов и клеток-мишеней.

Пептидные фрагменты молекулы Hsp70

Для выбора пептидных фрагментов молекулы Hsp70 использовали метод анализа информационной структуры [Nekrasov A.N., 2004]. Синтез шести выбранных пептидов был проведен в лаборатории химии пептидов ИБХ РАН.

Определение содержания LPS в препаратах Hsp70

Содержание LPS определяли с помощью набора Е-ТОХАТЕ (Sigma, США). Чувствительность теста составила 0,125 ед./мл.

Клеточный сортинг

Сортировку клеток производили на приборе FACSVantage DiVa (BD Biosciences). Для оценки влияния дендритных клеток на натуральные киллеры, NK-клетки сортировали по фенотипу CD3"CDllc"CD16+CD56+, а миелоидные дендритные клетки крови - CD3" CDllc+CD16"CD56". Для выяснения, какая из субпопуляций NK-клеток более чувствительна к опосредуемой Hsp70 активации проводили сортировку по фенотипам CD3"CD16"CD56+ и CD3"CD16+CD56". Чистота популяций клеток составляла 98% и более.

Результаты и их обсуждение

1. Влияниерекомбинантного человеческого Hsp70 на продукцию IFN-y NK-клетками Рекомбинантный человеческий Hsp70 (rhHsp70, Sigma Aldrich, США) сам по себе не вызывал существенного увеличения продукции IFN-y (рис. 1). Инкубация клеток с IL-2 заметно стимулировала продукцию этого цитокина. При инкубации клеток одновременно с IL-2 и rhHsp70 наблюдалось увеличение доли продуцирующих IFN-y клеток. В разных опытах стимулирующий эффект rhHsp70 составлял от 20 до 100% от стимулированной IL-2 продукции IFN-y.

Контроль БТШ70 5 мкг/мл

ИЛ-2 600 едУмл

ИЛ-2 БТШ70 0,05 мкг/мл

ИЛ-2 бтш70 ИЛ-2 бтш70 5 0,5 мкг/мл мкг/мл

Рис. I. Стимуляция продукции 1Р№у в ИК-клетках периферической крови под действием 1Ь-2 (600 ед./мл) и гЬНзр70, оцененная методом проточной цитометрии. В качестве контроля использовали нестимулированные №С-клетки. Представлены результаты одного из пяти репрезентативных экспериментов.

Чтобы подтвердить полученные результаты, была проведена оценка концентрации П-^-у в супернатантах ЫК-клеток, стимулированных \Ь-2 и гЬН5р70, с помощью иммуноферментного анализа. В отсутствие 1Ь-2 ЫК-клетки практически не секретировали ШЫ-у. Инкубация клеток только с гЬН5р70 в дозе 5 мкг/мл также не приводила к стимуляции продукции №N-7 (рис. 2).

rh

Рис. 2. Секреция ИК-клетками

под действием 1Ь-2 (600 ед./мл) и гШ5р70, оцененная методом иммуноферментного анализа. В качестве контроля использовали нестимулированные Ж-клетки. На графике представлены результаты одного из трех репрезентативных экспериментов.

rhHsp70 5 мкгАлп

L-2 600 «ДЛ*П

L-2 rtlH&p70 L-2rhHsp70 L-2rh№p705 0,05 WMfMn O.S MKrlMn мкг/мл

На фоне индуцированной IL-2 секреции IFN-y наблюдался положительный эффект rhHsp70; при концентрации белка 5 мкг/мл он составлял около 60% от эффекта IL-2. Таким образом, иммуноферментный анализ содержания IFN-y в супернатантах подтвердил, что rhHsp70 оказывает костимулирующее действие на продукцию этого цитокина при активации NK-клеток IL-2 и не влияет на нестимулированные клетки.

С целью более полно охарактеризовать костимулирующий эффект Hsp70 на продукцию IFN-y в NK-клетках нами были применены другие способы активации NK-клеток, для этого были использованы цитокины IL-12 и IL-15, а также форболмиристат ацетата (РМА) в сочетании с кальциевым ионофором А23187. Инкубацию NK-клеток, сбор супернатантов, иммуноферментный и цитометрический анализ продукции IFN-y проводили в тех же условиях, что и при стимуляции IL-2. При стимуляции NK-клеток IL-12 продукция IFN-y возрастала с увеличением дозы rhHsp70 (рис. 3). Эффект rhHsp70 при его использовании в дозе 5 мкг/мл составил приблизительно 100% по сравнению с клетками, стимулированными только IL-12. Сходные результаты были получены при активации NK-клеток IL-15 в концентрации 5 нг/мл (данные не приведены).

Рис. 3. Секреция №N-7 Ж-клетками под действием 1И2 (2 нг/мл) и гШзр70, оцененная методом иммуноферментного анализа. В качестве контроля использовали супернатанты от нестимулированных КК-клеток. Представлены результаты одного из двух репрезентативных экспериментов.

При использовании в качестве индуктора продукции цитокинов РМА и А23187 было продемонстрировано усиление в NK-клетках продукции IFN-y, вызванной РМА и А23187, под действием rhHsp70. Эффект rhHsp70 составил более 100% (рис. 4).

Ï " «

ШЯ

И

контроль rhhsp70 5 рма+а23187 рма+а23187 мкг/мл rhhsp70

Рис. 4. Продукция IFN-y в NK-клетках, оцененная методом проточной цитометрии. NK-клетки периферической крови инкубировали с РМА (50 нг/мл), А23187 (500 нг/мл) моненсином и Hsp70 (5 мкг/мл) в течение 5 часов. В качестве контроля использовали нестимулированные NK-клетки. Представлены результаты одного из трех репрезентативных опытов.

Таким образом, НБр70 оказывал костимулирующее действие на продукцию ИТ^-у, индуцированную не только интерлейкинами-2, -12 и -15, но и РМА с А23187. Важно отметить, что сигнальные пути, по которым эти вещества активируют ЫК-клетки, отличаются друг от друга. Следовательно, действие ШрТО на ЫК-клетки в присутствии стимулирующих веществ не зависит от природы и механизма действия последних. По некоторым данным, №р70 может образовывать поры в искусственных бислойных мембранах, способные пропускать различные ионы, в том числе ионы кальция. Можно предположить, что повышение внутриклеточной концентрации ионов кальция под действием Н$р70 приводит к эффекту, сходному с добавлением А23187. Далее, при дополнительной стимуляции РМА или интерлейкинами-2 и -12 активируется протеипкипаза С, и происходит усиление экспрессии гена 1РЫ-у за счет освобождения транскрипционного фактора КР-кВ.

Рис. 5. Секреция 1РИ-у клетками №С-92, оцененная методом иммуноферментного анализа. Клетки стимулировали 1Ь-2 и 1И2 в присутствии Нзр70 в течение 18 ч. В качестве контроля использовали супернатанты от нестимулированных клеток. Представлены результаты одного из двух репрезентативных опытов.

Исследовано влияние Нзр70 на продукцию ШИ-у клетками ЫК-подобных линий 1ЧКЬ и ЫК-92. Рост клеток ГЖЬ и 1ЧК-92 требует присутствия в культуральной среде цитокинов 1Ь-2 и 1Ь-15. Эти линии представляют собой модели активированных ЫК-клеток.

Рис. 6. Продукция ЦТ^-у клетками Ж-92, стимулированными 1Ь-15 (5 нг/мл) и №р70 (5 мкг/мл), оцененная методом иммуноферментного анализа. В качестве контроля использовали супернатанты от нестимулированных ЫК-клеток.

Представлены результаты одного из двух репрезентативных опытов.

■41 —

Контроль Нвр70 5 мкг/мл 1.-15 5 нг/мл 1.-15 Нвр70 5

гЬ№р70 не вызьшал повышения продукции 1РЫ-у ни сам по себе, ни в присутствии интерлейкинов-2 и -12 (рис. 5). Сходные результаты получены при стимулировании этих же клеток 11.-15 (рис. 6). Аналогичные результаты были получены на клетках линии 1ЧКЬ (данные не приведены). Следовательно, ни стимулирующего, ни косгимулирующего действия на продукцию ШИ-у в МК-подобных клеточных линиях гМЬр70 не оказывает.

Отсутствие эффекта Нэр70 можно объяснить тем, что клетки указанных линий являются потомками отдельных клонов ЫК-клеток, которые, возможно, не чувствительны к Нзр70.

Далее было исследовано, влияет ли НБр70 на активированные ШС-клетки. Ж-клетки инкубировали в течение 2-5 суток в полной питательной среде с 1Ь-2 (600 ед./мл). Затем добавляли гШзр70 в дозе 5 мкг/мл, инкубировали дополнительно 18 ч и анализировали продукцию 1ПЧ-у методом проточной цитометрии. Проведены серии экспериментов с разной длительностью предварительной стимуляции. Обнаружено, что в указанном интервале времени инкубации клеток с 1Ь-2 ЛН5р70 не стимулировал продукцию №N-7 (данные не приведены). Можно заключить, что гЬН5р70 не оказывает стимулирующего влияния на предварительно активированные ЫК-клетки с высоким уровнем продукции цитокинов. 2. Различия в чувствительности субпопуляций ЫК-клеток к действию Н$р70 Исследовано, какая из субпопуляций натуральных киллеров - СЭ56+ или С01б+ — вносит больший вклад в повышение продукции 1РМ-у в ответ на стимуляцию Шр70. С помощью двухпараметрического окрашивания поверхностных маркеров и внутриклеточного ШЫ-у продемонстрировано, что гЬШр70 увеличивал продукцию 1ИМ-у как в С016+, так и в СЭ56+ субпопуляциях натуральных киллеров (рис. 7). При этом действие гЬН8р70 в большей степени сказывалось на субпопуляции С056+, чем на СЭ16+; в СЭ56+-клетках эффект Шр70 составил более 100%, в то время как в С016+ - около 30% от уровня клеток, стимулированных только II.-2.

Рис. 7. Продукция ШК-у в субпопуляциях №С-клеток периферической крови, стимулированных 11,-2 в концентрации 600 ед./мл и Шр70 в концентрации 5 мкг/мл, оцененная методом проточной цитометрии. Представлены результаты одного из двух репрезентативных опытов.

Изменение продукции №N-7 под действием №р70 было исследовано в популяциях >1К-клеток СЭ56+С016' и С056+С016+, выделенных путем клеточного сортинга. Было также обнаружено различие в эффектах Шр70 на клетки указанных популяций (рис. 8). Под действием гЬН$р70 уровень продукции 1РМ-у, стимулированной 1Ь-2, увеличивался в обеих популяциях, однако этот эффект значительно сильнее был выражен в популяции С03"С016" СШ6+.

Тот факт, что субпопуляция >ПС-клеток С056+ в большей степени продуцирует ШИ-у в ответ на 1Ь-2 по сравнению с субпопуляцией СБ 16*, находится в соответствии с

современными представлениями о функциях этих двух субпопуляций натуральных киллеров. В субпопуляцию CD56+ входят клетки CD56l",Eh'CD16J""/n'e, которые при стимуляции лимфокинами более активно продуцируют цитокины, чем CD56d,mCD16bnghl. По-вцдимому, это связано с тем, что клетки CD56l'ngh' в целом отличаются повышенной способностью к секреции цитокинов, в частности, только клетки COSâ1"6''' несут на своей поверхности CD25 — а-субъединицу IL-2R, что позволяет им сформировать высокоаффинный рецептор к IL-2.

IFN-y, иг/мл

Рис. 8. Субпопуляции NK-клеток фенотипов CD3"CD 16*CD56* и CD3"CD 16'CD56+ выделяли путем клеточного сортинга, стимулировали IL-2 (600 ед./мл) и Hsp70 (5 мкг/мл) в течение 18 ч. Продукцию IFN-y оценивали методом иммуноферментного анализа. Представлены результаты одного из двух репрезентативных опытов.

С016*СП56* С016+СЕ5б+ С016~СЕИ6* СС1 (ГСЕ56* 11^2 11^2 ил и :

ЬТЧПП ВТШ70

5 ымАта Я итг'мл

3. Нзр70 стимулирует продукцию ТИР-а ЫК-клетками

Исследовано, как влияет №р70 на продукцию "ШИ-а ЫК-клетками. В супериатантах ЫК-клеток, инкубированных с 1Ь-2 и гЬ№р70 в течение 18 ч, были протестировано содержание ЮТ-а методом проточной цитометрии с помощью флуоресцентномеченых частиц. 11.-2 не стимулировал секрецию ТЬТ-ц в МС-клетках, в отличие от №N-7, что свидетельствует о том, что экспрессия "ШР-а в ЫК-клетках регулируется иначе, чем экспрессия №N-7 (рис. 9). гШ5р70, напротив, заметно индуцировал продукцию ТЫР-а в отсутствие дополнительной стимуляции. При инкубации клеток одновременно с 1Ь-2 и гЬ[кр70 также наблюдался высокий уровень секреции ТЫР-а, однако наибольший вклад вносил Н5р70, а не 1Ь-2, как это имело место в случае ¡РИ-у.

Рис. 9. Продукция ТЫР-а ЫК-клетками периферической крови, стимулированными 1Ь-2 и гЬН5р70, оцененная методом иммуноферментного анализа. В качестве контроля использовали супернатанты от нестимулированных МС-клеток. Представлены результаты одного из четырех репрезентативных опытов.

-KlYAJ

3000 2500 2000 1500 1000 500 п

1200 1 ■I 1000

с

£ 800 ■ I-

Î 600 -«

Э- 400

х •

? 200 •

о

ж

О ■

Контроль

rhHsp70 5 rrkg/rrt

IL-2 700 u/ni IL-2 rhHsp70 5 rrkg/rrl

Таким образом, rhHsp70 по-разному стимулирует продукцию IFN-y и TNF-a. На продукцию IFN-y Hsp70 оказывает костимулирующее действие в сочетании с другими активирующими NK-клетки стимулами, такими как цитокины IL-2, IL-12, IL-15 либо РМА с А23187. В то же время, Hsp70 выступает как самостоятельный индуктор продукции TNF-a. Это свидетельствует о существовании независимого пути передачи активирующего сигнала, который опосредует экзогенный Hsp70 в NK-клетках.

4. Hsp70 стимулирует цитотоксичность NK-клеток

rhHsp70 стимулировал цитотоксичность NK-клеток против К-562 (рис. 10). Клетки,

инкубированные с IL-2, демонстрировали предельно высокую цитотоксичность, и

добавление rhHsp70 не приводило к ее достоверным изменениям. Таким образом, rhHsp70

индуцировал цитотоксичность NK-клеток в отсутствие дополнительного стимула.

Рис. 10. Влияние rhHsp70 на цитотоксичность NK-клеток. NK-клетки инкубировали с IL-2 и rhHsp70 в течение 18 ч, затем смешивали с клетками-мишенями линии К-562 в соотношении 3:1. В качестве контроля использовали нестимулированные NK-клетки (0% на графике), положительный контроль (100%) - клетки, стимулированные IL-2 и IL-12. (10 нг/мл). Представлены результаты одного из четырех репрезентативных опытов.

5. Влияние Hsp70 на экспрессию поверхностных маркеров NK-клеток

Было исследовано влияние rhHsp70 на экспрессию маркеров NK-клеток CD 16, CD56 и CD94. Под действием Hsp70 уменьшалась концентрация молекул CD56 на поверхности нестимулированных NK-клеток, в то время как возрастала экспрессия CD94; инкубация NK-клеток с rhHsp70 не приводила к заметному изменению экспрессии CD16 (табл. 1). При добавлении к клеткам одновременно IL-2 и rhHsp70 наблюдалось снижение поверхностной экспрессии CD16 и CD56, а концентрация CD94 заметно не изменялась. Полученные данные свидетельствуют о том, что Hsp70 модулирует экспрессию указанных молекул на плазматической мембране NK-клеток, что, в свою очередь, может приводить к изменению функциональной активности последних.

Средний уровень флуоресценции, усл. ед.

CD16 CD56 CD94

Контроль 1046 60 71

rhHsp70 5 мкг/мл 1014 53 80

IL-2 600 ед./мл 739 93 95

IL-2 + rhHsp70 5 мкг/мл • 593 73 93

Таблица 1. Уровень экспрессии СБ16, С056 и С094 натуральными киллерами, оцененный методом проточной цитометрии. №С-клетки стимулировали 1Ь-2 (600 ед./мл) и Нзр70 (5 мкг/мл) в течение 18 ч, после чего проводили окрашивание флуоресцентномечеными антителами. Приведены результаты одного из пяти репрезентативных экспериментов.

6. Информационный анализ молекулы Hsp70. Стимуляция натуральных киллеров пептидными фрагментами Hsp70

Был проведен анализ информационной структуры молекулы Hsp70. Анализ выявил распределение сайтов повышенной плотности структурной координации (IDIC - increased density of information coordination). На протяжении всей длины любой белковой молекулы концентрация IDIC-сайтов не постоянна. Существуют участки повышенной и пониженной концентрации этих сайтов, названные соответственно ADD+ и ADD" (ADD - anomalously distributed density). Как правило, и ADD+, и ADD" участки располагаются в функционально значимых участках белковых молекул - лигандсвязывающих сайтах, эпитопах пептидных антигенов, активных центрах ферментов.

С целью выяснить, какая часть молекулы Hsp70 ответственна за стимулирующие эффекты этого белка на NK-клетках, были выбраны и синтезированы пептидные фрагменты молекулы Hsp70. Предварительные исследования показали, что субстратсвязывающий домен оказывал стимулирующее действие на продукцию цитокинов NK-клетками (данные не приведены). Поэтому для синтеза были выбраны следующие аминокислотные последовательности, располагающиеся в ADD+ и ADD" сайтах субстратсвязывающего домена Hsp70:

399-408 LSLGLETAGG 461-470 LSGIPPAPRG

411-424 TALIKRNSTIPTKQ 509-515 RLSKEEI

450-463 TKDNNLLGRFELSG 526-543 KAEDEVQRERVSAKNALE

Участки аминокислотной последовательности молекулы Hsp70 399-408, 411-424, 461470 и 509-515 являются АОО+-сайтами, участок 526-543 является сайтом ADD"; участок 450463 (TKD-пептид, чье стимулирующее действие на NK-клетки было ранее описано в литературе) выбран как контрольный пептид. Была протестирована способность синтезированных пептидов стимулировать продукцию IFN-y и цитотоксичность NK-клеток.

il—fi

Контроль L-2 SOO L-2 + L-2* L-2* L-2 * L-2* L-2+ L-2 + ад/мл Hsp70 5 399-408 411-424 450-463 461-470 509-515 526-543 M кг/мл

Рис. 11. Влияние пептидных фрагментов №р70 на продукцию 1КЫ-у КК-клетками, оцененное методом проточной цитометрии. КК-клетки инкубировали с 1Ь-2, гЬ№р70 и пептидами (2 мкг/мл) в течение 18 ч. В качестве контроля использовали нестимулированные ИК-клетки. Представлены результаты одного из четырех репрезентативных опытов.

Как видно из графика (рис. 11), пептид 526-543 оказывал заметное стимулирующее действие на продукцию IFN-y, в то время как эффекты пептидов 309-408, 411-424, 450-463, 461-470 и 509-515, добавленных к клеткам вместе с IL-2, достоверно не отличались от эффекта IL-2.

Было оценено также влияние пептидных фрагментов Hsp70 на цитотоксичность NK-клеток. Эффекты пептидов 309-408, 411-424, 461-470 и 509-515 достоверно не отличались от контроля, которым служили нестимулированные клетки. Пептиды 450-463 и 526-543 заметно стимулировали цитотоксичность (рис. 12).

Таким образом, был обнаружен пептидный фрагмент молекулы Hsp70, соответствующий аминокислотной последовательности 526-543, стимулирующий цитотоксичность и продукцию IFN-y NK-клетками. В проведенных нами опытах данный пептид оказывал более сильное стимулирующее действие, чем описанный в литературе пептид TKD.

18

---Д7

i 14----ГП

I --i-^- -

| 10----ГП----L--

t s ■ I - - - Г1 - - '- П— -

ф IS

: : " "J : :: :

о. LriJ__LL г; l Lj_L. ......... J J.

Контроль Hsp 5 МКГ/МЛ 399-408 411-424 450-463 461-470 509-515 526-543

—m-

Рис. 12. Влияние пептидных фрагментов Нэр70 на цитотоксичность ЫК-клеток. В качестве эффекторов использовали №С-клетки, инкубированные в среде с гШ$р70 и пептидами (2 мкг/мл). Эффекторы смешивали с клетками-мишенями линии К-562 в соотношении 3:1. В качестве контроля использовали нестимулированные "ПК-клетки. Представлены результаты одного из трех репрезентативных опытов.

7. Роль миелоидных дендритных клеток крови в опосредованной Нзр70 стимуляции ИК-клеток

К настоящему времени опубликовано множество работ, в которых показано тесное взаимодействие между дендритными клетками (ДК) и Ж-клетками в организме мыши и человека. Известно, что активация одного типа клеток приводит к активации другого, причем активирующее действие ЬК-клеток на ДК связано, главным образом, с секрецией' а дендритные клетки стимулируют натуральные киллеры с помощью цитокинов 1Ь-12,

П-15 и 1Ь-18 и контактных взаимодействий. В данной работе было исследовано, могут ли миелоидные ДК крови влиять на вызываемую №р70 продукцию №N-7 ЫК-клетками.

Контроль IL-2 300 ед./мл 1Ь2ДК17% И-2ДК5% IL-2 ДК 1 %

Рис. 13. Влияние миелоидных ДК на индуцируемую Hsp70 продукцию IFN^y. Миелоидные дендритные клетки крови и NK-клетки получали путем клеточного сортинга. Клетки коинкубировали в соотношениях 1/6 (17% ДК), 1/20 (5% ДК) и 1/100 (1% ДК) в полной питательной среде в присутствии низкой дозы IL-2 (300 ед./мл) и rhHsp70. После инкубации в течение 18 ч были собраны супернатанты, концентрацию IFN-y в них оценивали методом иммуноферментного анализа. В качестве контроля использовали нестимулированные NK-клетки.

Из графика видно (рис. 13), что стимулированные низкой дозой IL-2 клетки сами по себе слабо отвечали на добавление rhHsp70. Однако в присутствии ДК в концентрации от 5% и выше наблюдался заметный стимулирующий эффект Hsp70. При соотношении №С/ДК= 100/1 уровень продукции IFN-y не отличался от такового NK-клеток, стимулированных только IL-2. Полученные результаты свидетельствуют о том, что вызываемое rhHsp70 повышение продукции IFN-y может быть связано не с прямым действием этого белка на NK-клетки, а опосредовано стимуляцией присутствующих в образцах миелоидных ДК, которые, в свою очередь, стимулируют натуральные киллеры.

8. Роль LPS в активации NK-клеток

Активация NK-клеток белком Hsp70, как показано выше, может быть связана с присутствием во фракции NK-клеток примеси ДК. ДК отвечают на стимуляцию LPS продукцией цитокинов, в частности, IL-12, IL-15 и IL-18, способных стимулировать NK-клетки. Поскольку известно, что Hsp70 способен взаимодействовать с липополисахаридами с образованием прочных комплексов, в работе была проанализирована роль, которую могут играть LPS в активации NK-клеток.

Было определено содержание LPS в экспрессированном в Е. coli рекомбинантном Hsp70, использованном в данной работе. С помощью набора Е-ТОХАТЕ kit (Sigma Aldrich,

США) показано, что rhHsp70 содержал LPS с активностью не менее 25 ед./мкг и, следовательно, был значительно контаминирован LPS. Таким образом, активирующий эффект Hsp70 мог быть отчасти связан с присутствующими в препарате белка липополисахаридами. Более того, рекомбинантный человеческий Hsp70, очищенный от LPS, Hsp70-LE (Stressgen, Канада), не стимулировал продукцию IFN-y в NK-клетках. В то же время, нами не была проверена активность указанного белка в других биологических тестах.

Далее было исследовано, могут ли LPS стимулировать цитотоксичность и продукцию цитокинов высокоочшценными NK-клетками; чистота популяции NK-клеток составляла 98% и выше.

Липополисахариды в дозах 10 и 100 нг/мл оказывали слабое стимулирующее действие на продукцию IFN-y в отсутствие IL-2 (рис. 14). Сочетание LPS с IL-2 приводило к значительному увеличению стимулирующего эффекта. Эффект LPS варьировал от опыта к опыту в интервале от 15 до 100% по сравнению с эффектом IL-2. Одновременное добавление к стимулированным IL-2 клеткам LPS и Hsp70 приводило к значительному ингибированию положительного эффекта LPS, уменьшая продукцию IFN-y почти до уровня клеток, инкубированных только с IL-2 (рис. 14).

Рис. 14. LPS стимулируют продукцию IFN-y наивными и активированными IL-2 NK-клетками. NK-клетки инкубировали с IL-2, Hsp70-LE (5 мкг/мл) и LPS (Sigma Aldrich, США) в концентрациях 10 и 100 нг/мл в течение 18 ч. Затем оценивали уровень продукции IFN-y методом проточной цитометрии. Hsp70-LE ингибировал эффект LPS на продукцию IFN-y (р<0,05). В качестве контроля использовали нестимулированные клетки. На графике представлены результаты одного из пяти репрезентативных опытов.

Также бьио проанализировано влияние LPS и Hsp70-LE на продукцию TNF-a. Обнаружено, что, как и rhHsp70, LPS заметно индуцировали продукцию TNF-a (рис. 15), в то же время, эффект IL-2 почти не отличался от контроля, которым служили супернатанты от нестимулированных NK-клеток. Hsp70-LE, добавленный одновременно с IL-2, не влиял достоверно на продукцию TNF-a, однако, при коинкубации с LPS, ингибировал

положительный эффект липополисахаридов. Важно отметить, что степень ингибирования была пропорциональной количеству добавленного белка Hsp70.

Была проведена оценка влияния LPS на цитотоксичность NK-клеток. Инкубация клеток как с LPS, так и с rhHsp70 приводила к увеличению цитотоксичности NK-клеток (рис. 16). Стимуляция клеток белком Hsp70-LE не приводила к подобному эффекту.

мкг/мл нг/мл ед./мл нг/мл Hsp 5 Hsp 0,5 rhHsp70 5 мкг/мл мкг/мл мкг/мл

Рис. 15. LPS стимулируют продукцию TNF-a наивными и активированными IL-2 NK-клетками. NK-клетки инкубировали с IL-2, Hsp70-LE (5 мкг/мл) и LPS (10 нг/мл) в течение 18 ч. В собранных супернатантах измеряли концентрацию TNF-a. В качестве контроля использовали супернатанты от нестимулированных клеток. На графике представлены результаты одного из пяти репрезентативных опытов.

Представленные данные свидетельствуют о том, что LPS способны активировать NK-клетки. Очищенный от липополисахаридов Hsp70 (Hsp70-LE) не оказывал стимулирующего действия на цитотоксичность и продукцию цитокинов, подобного действию неочищенного от LPS белка (rhHsp70). В то же время, осталась неизвестной активность данного белка в других функциональных тестах. Более того, синтетические пептидные фрагменты субстратсвязывающего домена Hsp70 оказывали стимулирующее действие как на продукцию цитокинов, так и на цитотоксичность NK-клеток. Взятые вместе, эти данные свидетельствуют о том, что активирующее действие рекомбинантного Hsp70 на NK-клетки частично может быть вызвано присутствующими в препарате липополисахаридами. По-видимому, способность Hsp70 взаимодействовать с липополисахаридами имеет существенное физиологическое значение. Инкубация NK-клеток одновременно с Hsp70-LE и LPS приводила к снижению позитивного эффекта LPS. Обнаруженное ингибирующее действие этого белка по отношению к LPS может свидетельствовать о протективной роли Hsp70 в организме в условиях гиперактивации клеток системы врожденного иммунитета, например при септическом шоке.

Одним из возможных механизмов действия Hsp70 в этом случае является непосредственное связывание попавших в кровь липополисахаридов. Другим механизмом

описанного протективного действия Hsp70 может быть связывание белка Hsp70 с рецептором LPS TLR4 и следующее из этого конкурентное ингибирование действия LPS. В пользу последней гипотезы свидетельствует тот факт, что инкубация NK-клеток с другим липидсвязывающим белком — бычьим сывороточным альбумином — не приводила к ингибированию LPS-опосредованной активации NK-клеток.

Рис. 16. LPS стимулируют цитотоксичность NK-клеток против К-562 в соотношении 3:1. В качестве контроля использовали нестимулированные клетки. На графике представлены результаты одного из трех репрезентативных опытов.

9. Выявление популяции клеток, отвечающих на стимуляцию LPS

В предыдущих разделах представлены данные в пользу того, что эффект экзогенного рекомбинантного Hsp70 может включать в себя действие ассоциированных с ним LPS. Следующим этапом экспериментов стало выяснение механизма стимуляции NK-клеток липополисахаридами. Общепризнано, что рецептором LPS является TLR4. Согласно некоторым публикациям, TLR4 может присутствовать на поверхности NK-клеток. С помощью двухпараметрического окрашивания была проведена оценка экспрессии TLR4 на поверхности NK-клеток. Использовали антитела к CD56, конъюгированные с РЕ и моноклональные антитела к TLR4 от разных фирм-производителей: 1) конъюгированные с FITC (HyCult biotechnology, Нидерланды), 2) конъюгированные с биотином (BD Pharmingen, США), для окрашивания использовали стрептавидин-FITC, 3) не конъюгированные с флуорофором (eBioscience, США), для окрашивания использовали вторые антитела, связанные с FITC. Образцы анализировали методом проточной цитометрии. Было обнаружено, что не более 1% С056+-клеток (NK-клеток), в среднем - 0,5%, несло на поверхности TLR4. Поскольку экспрессия TLR4 на NK-клетках весьма мала, представляется маловероятным, что LPS прямо стимулируют натуральные киллеры.

Можно предположить, что LPS действуют на иные типы клеток, в частности, миелоидные ДК крови, которые могут присутствовать в некотором количестве в популяции выделенных NK-клеток. Для проверки этого предположения NK-клетки, окрашенные антителами к CD56 и TLR4, были проанализированы методом проточной цитометрии, при этом на диаграмме SS-FS исследовали регионы, соответствующие лимфоцитам и моноцитам.

Результаты анализа приведены на рис. 17. Не более 0,2% событий в регионе Ш, соответствующем лимфоцитам, оказались позитивными по Т1^4, при этом все они были позитивными и по маркеру СЭ56, следовательно, являлись ИК-клетками. Все СЭ56-негативные клетки оказались ТЫ14-негативными. В регионе К2, характерном для моноцитов, оказались только клетки, экспрессирующие СЭ56 (Ж-клетки), экспрессия Т1Л4 на них составила 1,6%. Поскольку событий в регионе Я2 в 100 раз меньше, чем в регионе доля ТЬЯ4+ клеток этого региона в общей популяции клеток не более 0,016%, что на порядок меньше доли ТЬЯ4+ клеток региона К.1.

94.5% 1-6*

¡¡f

Т1-К4

Рис, 17. Цитометрический анализ количества Т1.К4~ клеток в популяции сепарированных ИК-клеток. Оценивали не менее 380000 событий. Регион К1 (лимфоциты): 350000 событий, К2 (моноциты): 3000. В обоих регионах присутствовали почти исключительно С056+ клетки. Среди С1356" клеток в регионе КЛ отсутствовали ТЬЯ4+ клетки, среди С056~ клеток Т1Л4 несли 0,2% клеток. И2: С0564ТЬЯ4+ клетки составляли 1,6%.

Таким образом, общая доля экспрессирующих TLR4 клеток в популяции равнялась приблизительно 0,2% и все они экспрессировали маркер CD56, характерный для NK-клеток. Следовательно, почти все клетки, экспрессирующие TLR4, являлись натуральными киллерами. Таким образом, действие LPS не могло быть связано с присутствием примеси иных клеток, экспрессирующих TLR4, кроме NK-клеток.

10. Роль экзогенного мембраносвязанного Шр70 в активации ЫК-клеток

Было исследовано действие мембраноассоциированного Нэр70 на продукцию 1Ш-у и

цитотоксичность ЫК-клеток. Для оценки влияния мембраносвязанного №р70 на продукцию

ЫК-клетками использовались клетки линии К-562, у которых после кратковременной

тепловой обработки наблюдалась индукция поверхностной экспрессии Нзр70 (рис. 18).

Рис. 18. Индукция поверхностной экспрессии 1-Ьр70. Клетки К-562 подвергали тепловому стрессу при 60°С в течение 5 мин. Затем оценивали экспрессию Н$р70 на клеточной поверхности с помощью моноклональных антител ВЯМ-22 методом проточной цитометрии. Контролем служили нестрессированные клетки.

К-562 теплое ой и

Коинкубация ЫК-клеток и обработанных указанным образом клеток К-562 приводила к увеличению уровня продукции №N-7 по сравнению с кошролем - ЫК-клетками, инкубированными с нестрессированными К-562 (рис. 19). Для оценки специфического действия мембраноассоциированного НБр70 клетки К-562 обрабатывали специфичными к №р70 антителами. Коинкубация ЫК-клеток с обработанными антителами клетками К-562 приводила к снижению продукции №N-7 до уровня ЫК-клеток, инкубированных с клетками К-562, не подвергнутыми тепловому стрессу.

Рис. 19. Шр70 на поверхности клеток К-562 стимулирует продукцию №N-7 ЫК-клетками. Клетки К-562 подвергали термической обработке при 60°С в течение 5 мин и инкубировали с моноклональными антителами ВМЛ-22 против Н$р70 (10 мкг/мл) в течение 40 мин. Продукцию №N-7 оценивали через 18 ч методом проточной цитометрии.

Таким образом, было показано, что Нзр70, экспонированные на поверхности опухолевых клеток, оказывают стимулирующее влияние на ЫК-клетки человека, приводя к увеличению продукции ШЫ-у.

Для изучения влияния ассоциированного с мембраной Н$р70 на цитолитическую активность ЫК-клеток применяли экспериментальную модель увеличения поверхностной

экспрессии №р70 с помощью теплового шока и обработки клеток моненсином. Термическая обработка клеток Яа^, в отличие от клеток К-562, приводила к появлению Шр70 на клеточной поверхности (рис. 20). Поверхностную экспрессию Нзр70 на клетках К-562 удалось индуцировать с помощью их кратковременной обработки низкой дозой моненсина, препарата, относящегося к группе ингибиторов внутриклеточного транспорта белков.

контроль 42 С

Рис. 20. Индукция поверхностной экспрессии Hsp70 на клеточной поверхности. Клетки К-562 и Raji подвергали термической обработке 42°С в течение 20 мин. Экспрессию Hsp70 на клеточной поверхности оценивали через 6 ч с помощью моноклональных антител BRM-22 методом проточной цитометрии. Контролем служили нестрессированные клетки.

Инкубация

моненсином приводила к значительному повышению экспрессии Шр70 на плазматической мембране клеток К-562 (рис. 21).

S.

с

е-

i 40

В BRM-22

II

К562 К562 + моненсин

Рис. 21. Индукция поверхностной экспрессии №р70 на клеточной поверхности клеток К-562. Клетки обрабатывали в течение 15 мин моненсином в концентрации 0,1 мкг/мл, двукратно отмывали и инкубировали в полной питательной среде в течение 16 ч. В качестве контроля использовали не окрашенные антителами клетки. Экспрессию Нзр70 на клеточной поверхности оценивали с помощью моноклональных антител ВКМ-22 методом проточной цитометрии.

£

о 10

контроль г ""' индукция Msp70

Рис. 22. Оценка опосредованной NK-клетками цитотоксичиости при использовании клеток-мишеней с разным уровнем экспрессии Hsp70 на клеточной поверхности. Клетки К-562 обрабатывали 15 мин моненсином в концентрации 0,1 мкг/мл, двукратно отмывали и инкубировали в полной питательной среде в течение 16 ч. Клетки Raji подвергали термической обработке 42°С в течение 20 мин. Соотношение эффекторов к мишеням составляло 7:1. Цитотоксичность оценивали колориметрическим методом по выходу ЛДГ.

Обработанные в условиях индукции поверхностного Hsp70 клетки К-562 и Raji были использованы в качестве клеток-мишеней в колориметрическом цитотоксическом тесте. Обнаружено, что клетки с увеличенным уровнем мембраноассоциированного Hsp70 более чувствительны к цитолитическому действию NK-клеток (рис 22).

Таким образом, мембраносвязанный Hsp70 оказывал специфическое стимулирующее действие на основные функции натуральных киллеров - продукцию цитокинов и цитотоксичность.

J

а

NK+K562 NK+Rsji

Выводы

Экзогенный рекомбинантный белок Шр70 оказывает костимулирующее действие на продукцию ШЫ-у в ИК-клетках периферической крови человека, вызванную различными стимулами, и индуцирует в них продукцию Т№-а. Установлено, что субпопуляция МК-клеток с фенотипом СВ56ЬН8М, отличающаяся высоким уровнем продукции цитокинов, более чувствительна к стимулирующему действию экзогенного №р70 по сравнению с субпопуляцией С056'|,т.

Экзогенный Нзр70 оказывает стимулирующее действие на цитолитическую активность и модулирует экспрессию поверхностных маркеров МК-клеток. Мембраносвязанный Нзр70, экспонированный на поверхности клеток-мишеней, увеличивает продукцию цитокинов и цитотоксичность МК-клеток. Идентифицирован пептидный фрагмент аминокислотной последовательности субстратсвязывающего домена белка Нзр70, стимулирующий продукцию цитокинов и цитотоксичность МК-клеток.

6. Продемонстрировано, что Hsp70 ингибирует активацию NK-клеток, индуцированную липополисахаридами.

Практические рекомендации

1. При оценке цитотоксичности NK-клеток с помощью набора CyToxiLux Plus (Oncoimmunin Inc., США) рекомендуется определять оптимальное соотношение эффекторов и мишеней, чтобы избежать искажения результатов анализа вследствие некроза клеток-мишеней.

2. При исследовании регуляции функциональной активности NK-клеток следует оценивать долю иных типов клеток, в частности, миелоидных дендритных клеток, в популяции сепарированных натуральных киллеров. Поскольку даже малые количества миелоидных дендритных клеток могут влиять на реализацию эффекторных функций NK-клеток, при цитометрическом анализе необходимо собирать большое число событий (не менее 300000), что позволит достоверно оценить присутствие малочисленных клеточных популяций.

3. В работе описан активирующий эффект липополисахаридов на цитотоксичность и продукцию цитокинов NK-клетками. Следовательно, при изучении функций NK-клеток необходимо определять содержание LPS в используемых реагентах.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Коваленко Е.И., Власкин П.А., Каневский JI.M., Стрельникова Ю.И., Сапожников A.M. Влияние белков теплового шока 70 кДа на продукцию гамма-интерферона натуральными киллерами человека. Доклады Академии наук, 2006, т. 406, № 1, с. 121-124.

2. Власкин П.А., Каневский JI.M., Стрельникова Ю.И., Сапожников A.M., Коваленко Е.И. Активирующее действие белка теплового шока 70 кДа на НК-клетки человека. Иммунология, 2007, Т. 28, № 2, с. 74-79.

3. Шустова O.A., Каневский Л.М., Апполонова М.В.. Бойко A.A., Николаева О.Г., Баранов A.M., Белова Е.В., Ветчинин С.С., Коваленко Е.И., Сапожников A.M. Анализ БТШ70, экспрессируемых лимфоидными клетками, с помощью панели моноклональных антител. Омский научный вестник. 2007, № 3 (61), приложение 2, с. 56-58.

4. Каневский Л.М., Коваленко Е.И. Ассоциированные с БТШ70 липолисахариды оказывают активирующее действие на NK-клетки человека. Вестник Уральской медицинской академической науки, 2009, № 2/1 (24), с. 34-36.

5. Vlaskin P.A., Kancvski L.M., Strelnikova Yu.I., Kovalenko E.I. The influence of heat shock proteins 70 on NK cell IFN-y production. "7th John Humphrey advanced summer programme in immunology", Moscow, 2005. The interface between immunology and medicine. Book of abstracts, p.60.

6. Kovalenko E.I., Telford W., Vlaskin P.A., Kanevski L.M., Strelnikova U.I., Sapozhnikov A.M. Heat shock protein 70 up-regulates IFN-gamma production in human natural killer cells. "1" Joint Meeting of European National Societies of Immunology - 16th European Congress of Immunology", Paris, September 6-9,2006. Book of abstracts, p. 269.

7. Власкин П.А., Каневский JI.M., Стрельникова Ю.И., Коваленко Е.И. Белки теплового шока 70 усиливают продукцию гамма-интерферона в NK-клетках. Медицинская иммунология, 2006, т. 8, № 2-3, с. 127.

8. Коваленко Е.И., Власкин П.А., Каневский JI.M., Стрельникова Ю.И., Сапожников A.M. Активирующее действие белков теплового шока 70 кДа на NK-клетки человека. Медицинская иммунология, 2006, т. 8, № 2-3, с. 146.

9. Власкин П.А., Каневский Л.М., Стрельникова Ю.И., Коваленко Е.И. Влияние белков теплового шока 70 кДа на продукцию гамма-интерферона натуральными киллерами человека. XVIII зимняя международная молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". Сборник трудов. Москва, 2006, с. 72.

10. Каневский Л.М., Власкин П.А., Алексеева Л.Г., Некрасов А.Н., Стрельникова Ю.И., Сапожников A.M., Коваленко Е.И. Пептидные фрагменты белка теплового шока 70 усиливают продукцию гамма-интерферона и модулируют экспрессию поверхностных маркеров в NK-клетках. Медицинская иммунология, 2007, т. 9, № 2-3, с. 142.

11. Kovalenko E.I., Kanevski L.M., Nekrasov A.N., Alekseeva L.G., Vlaskin P.A., Strelnikova Yu.I., Sapozhnikov A.M. Hsp70 and its peptide fragments up-regulate IFN-g production and modulate the expression of surface markers in human NK cells. 2nd World Conference of Stress. Budapest, 2007. Book of abstracts, p. 33-34.

12. Kanevski L.M., Vlaskin P.A., Alekseeva L.G., Nekrasov A.N., Strelnikova Y.I., Kovalenko E.I. Heat shock protein 70 and its peptide fragments increase IFN-gamma production and modify surface marker expression in human natural killer cells. 8th John Humphrey advanced summer programme in immunology. Moscow, 2007. Book of abstracts, p 20.

13. Каневский Л.М., Власкин П.А., Алексеева Л.Г., Некрасов А.Н., Стрельникова Ю.И., Коваленко Е.И. Белок теплового шока 70 и его пептидные фрагменты изменяют экспрессию поверхностных маркеров и усиливают продукцию гамма-интерферона в NK-

клетках. XIX зимняя международная молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". Сборник трудов. Москва,

2007, с. 61.

14. Коваленко Е.И., Каиевский JI.M., Гречихина М.В., Бойко A.A., Луценко Г.В., Огородникова Е.В., Семенков В.Ф., Сапожников A.M. Активные формы кислорода и белки теплового шока 70 кДа в старении человека и активном долголетии. Сибирский медицинский журнал. Материалы конференции «Дни иммунологии в Сибири - 2008»,

2008, т. 23, № 3, с. 99.

Отпечатано в типографии ООО «Гипрософт» г. Москва, Ленинский пр-т, Д.37А Тираж 100 экз.

Актуальность темы

Натуральные киллеры (NK-клетки) — это особая популяция лимфоцитов системы врожденного иммунитета, играющая важную роль в противоопухолевом и противовирусном иммунитете. NK-клетки способны оказывать прямое цитолитическое действие на опухолевые и вирус-инфицированные клетки и принимать участие в регуляции иммунного ответа. Две функционально различные субпопуляции NK-клеток, CD56dimCD16+ и CD56bnghtCD16 , могут быть активированы различными растворимыми медиаторами либо посредством прямого межклеточного контакта. В настоящее время интенсивно изучаются вещества, вызывающие активацию NK-клеток, в первую очередь для получения противовирусных и противоопухолевых средств. В то же время, выяснение механизмов активации и реализации эффекторных функций NK-клеток является актуальной фундаментальной научной проблемой.

В настоящее время предполагается, что нетипично локализованный белок теплового шока 70 кДа (Hsp70) выполняет стимулирующую роль в системе врожденного иммунитета. Уровень продукции этих белков, в норме выполняющих внутриклеточные шаперонные функции, сильно возрастает под действием различных стрессорных факторов - высокой температуры, гипоксии, низкого уровня глюкозы и многих других. При этом в организме появляются внеклеточные и ассоциированные с клеточной мембраной формы Hsp70. Описаны активирующие эффекты этого белка на макрофаги, дендритные клетки, Т-лимфоциты. В ряде работ показано, что как экспонированный на мембране, так и экзогенный Hsp70 может активировать цитотоксичность и пролиферацию натуральных киллеров, а также являться хемоаттрактантом, вызывающим положительный хемотаксис NK-клеток. В то же время, остается неясным, как влияет Hsp70 на цитокинпродуцирующую функцию NK-клеток, какая из субпопуляций NK-клеток является более чувствительной к действию Hsp70, в каких условиях реализуется действие Hsp70 на натуральные киллеры. Неясно также, какой вклад вносит в оказываемые Hsp70 эффекты способность, присущая этому белку, связывать вещества гидрофобной структуры.

Таким образом, изучение и расшифровка механизмов регуляции активности NK-клеток с участием Hsp70 представляет собой актуальную задачу медицинской иммунологии.

Цель исследования: изучение роли белка теплового шока 70 кДа в функционировании NK-клеток человека, а именно анализ влияния экзогенного и экспонированного на клеточной поверхности Hsp70, а также его пептидных фрагментов на основные эффекторные функции натуральных киллеров.

Задачи исследования:

1. Проанализировать изменение продукции цитокинов NK-клетками под действием экзогенного рекомбинантного белка Hsp70.

2. Охарактеризовать продукцию IFN-y в субпопуляциях NK-клеток CD56dimCD16+ и CD56brightCD16" в ответ на Hsp70.

3. Оценить влияние экзогенного Hsp70 на цитотоксичность и экспрессию поверхностных маркеров NK-клеток.

4. Исследовать влияние Hsp70, экспонированного на поверхности клеток-мишеней, на цитотоксичность NK-клеток и продукцию цитокинов.

5. Идентифицировать пептидные фрагменты молекулы Hsp70, способные активировать NK-клетки.

6. Изучить влияние Hsp70 на опосредованную липополисахаридами активацию NK-клеток.

Работа проведена с использованием NK-клеток, выделенных из периферической крови здоровых доноров.

Научная новизна работы

В работе показана способность Hsp70 стимулировать функциональную активность натуральных киллеров, и с помощью оригинального подхода идентифицирован пептидный фрагмент субстрат-связывающего домена Hsp70, способный усиливать продукцию цитокинов и цитолитическую функцию NK-клеток человека. Выявлены различия в действии Hsp70 на продукцию IFN-y (интерферон-у) и TNF-a (фактор некроза опухолей-а). Определена субпопуляция NK-клеток, наиболее чувствительная к активирующему действию Hsp70. Обнаружен феномен активации NK-клеток под действием бактериальных липополисахаридов (LPS). Выяснено, что Hsp70 способен ингибировать индуцированную LPS цитотоксичность и продукцию цитокинов NK-клетками. Уточнено, что LPS действуют непосредственно на NK-клетки, без участия иных клеток крови. Продемонстрировано активирующее действия мембраносвязанной формы Hsp70 на продукцию цитокинов и цитолитическую активность NK-клеток в оригинальных моделях.

Практическая значимость

К настоящему времени проблема поиска эффективных средств терапии рака и вирусных инфекционных заболеваний остаётся актуальной. В данной работе исследован эффективный способ стимуляции NK-клеток, лимфоцитов, способных оказывать противоопухолевое и противовирусное действие. Увеличение активности NK-клеток с помощью белка Hsp70 и его пептидного фрагмента может обеспечить, таким образом, основу для развития новых подходов к иммунотерапии опухолей и инфекционных болезней человека.

Одной из важных медицинских проблем является предупреждение и лечение сепсиса. В работе показано ингибирующее действие Hsp70 на вызываемую LPS индукцию секреции провоспалительных цитокинов, в частности, TNF-a, способного вызывать системную воспалительную реакцию. Результаты настоящей работы и ряд литературных данных [4-6] дают основу для разработки препаратов для предупреждения и терапии г* сепсиса на основе белка теплового шока 70.

Апробация работы

Диссертация апробирована на заседании научного коллоквиума отдела иммунологии ИБХ РАН и рекомендована к защите. Материалы диссертации доложены на летней научной школе по иммунологии им. Дж. Хамфри (г. Москва, 2005 г.), на XVI Европейском конгрессе по иммунологии (г. Париж, 2006 г.), на научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (2007 г.), на II Всемирной конференции по стрессу (г. Будапешт, 2007 г.), на конференции «Дни иммунологии в Сибири-2008» (г. Томск, 2008 г.), на научной конференции «VIII научная конференция иммунологов Урала» (г. Архангельск, 2009 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 109 страницах машинописного текста, раздел результатов содержит 23 рисунка и 1 таблицу. Список литературы включает 118 источников, из которых 105 иностранных.

1. Обзор литературы

Выводы

1. Экзогенный рекомбинантный белок Hsp70 оказывает костимулирующее действие на продукцию IFN-y в NK-клетках периферической крови человека, вызванную различными стимулами, и индуцирует продукцию TNF-a.

2. Установлено, что субпопуляция NK-клеток с фенотипом

CD56bright высокопродуцирующих цитокины, более чувствительна к стимулирующему действию экзогенного Hsp70 по сравнению с субпопуляцией CD56dim.

3. Экзогенный Hsp70 оказывает стимулирующее действие на цитолитическую активность и изменяет экспрессию поверхностных маркеров NK-клеток.

4. Мембраносвязанный Hsp70, экспонированный на поверхности клеток-мишеней увеличивает продукцию цитокинов и цитотоксичность NK-клеток.

5. Идентифицирован пептидный фрагмент аминокислотной последовательности субстратсвязывающего домена индуцируемого белка Hsp70, стимулирующий продукцию и цитотоксичность NK-клеток.

6. Продемонстрировано, что Hsp70 ингибирует активацию NK-клеток, индуцированную липополисахаридами.