Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Взаимодействие иммунокомпетентных клеток, участвующих в противоопухолевом иммунитете, при злокачественных новообразованиях желудочно-кишечного тракта

РГБ ОД

УДК: 612.017.1:616.33434-006,04

1 з СЕН 1953

На правах рукописи

БУЛЕГЕНОВА МИНИРА ГУСЕЙНОВНА

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК, УЧАСТВУЮЩИХ В ПРОТИВООПУХОЛЕВОМ ИММУНИТЕТЕ, ПРИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЯХ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА

(14.00.36 - аллергология и иммунология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Республика Казахстан Алматы 1999

Работа выполнена в Институте мигания МПнВО РК

Научные консультанты:

Официальные оппоненты:

академик РАМН и АН РК доктор медицинских наук профессор Шарманов Т.111.

доктор медицинских наук профессор Цой И.Г.

доктор биологических наук, профессор Ьеляев Н.Н.; доктор медицинских наук, профессор Тимофеева Л.II.; доктор медицинских наук,' профессор Шорганбаев А.А.

Ведущая организация: Институт иммунологии АН Рес-

публики Узбекистан

Защита диссертации состоится « 9 » июня 1999 г. в /Г на заседаниии диссертационно!« совета Д 09.08.02 при Научном центре гигиены и эпидемиологии КЗ МЗОиС по адресу: 480002, г. Ал маты, ул. Макагаева,34

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научного центра I шхены и эпидемиологии КЗ МЗОиС РК

Автореферат разослан «<£_____1999г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, професс

атибалдиева Ж. А.

Р^ЬО.ЧЪЪ' яг, о

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Иммунологический гомеостаз организма, направленный на сохранение антигенного постоянства его тканей, прежде всего поддерживается балансом между регуляторными механизмами иммунной системы. Он отражает сложные взаимосвязи клеточных и гуморальных компонентой системы при регулировании различных функций как в нормальных физиологических условиях, так и при возможной патологии ( Фукс Ь.Б, 1991; Ыа1г Я а!.,1995). Дол! ос премя иммунный стату с организма оценивался по отдельным изолированным показателям и при использовании различных отдельно взятых методик для их определения (ОЬтЧМ К. е! а!., 1992; Накап К. е! а1.,1996). Последнее являлось причиной значительного варьирования результатов как у здоровых людей, гак и при развитии патологии, в том числе и онкологической. Проблема заключалась не столько в количестве применяемых методик, сколько в отсутствии стабильных тест-систем для исследования особенностей взаимодействия компонентов иммунной системы и в недооценке в этом комплексной кооперации роли других факторов (Ляшенко В.А. и соавт., 1988, Апа.чЮроЫои Ее! а!., 1991).

На сегодняшний день, как правило, любое заболевание сопровождается развитием рахчичного рода иммунологических нарушений, не говоря уже о такой патологии, как злокачественные новообразования ( Акита У е1 а1., 1986;Агар V/. е1 а1.,1998). Поэтому актуальность проблемы восстановления функциональных показателей цитотоксичсекого звена иммунитета для эффективной элиминации малигнизироаанных клеток, стимуляции компонентов иммунной системы, наиболее подверженных ингибирующему воздействию при развитии злокачественных процессор, очевидна. Принципы активации противоопухолевого звена иммунитета также особо актуальны для обоснования новых подходов иммунокорригирующей терапии, являющейся одним из основных патогенетических методов в комплексном лечении новообразований. Увеличение количества клеток в опухолевом узле чревато развитием на первой стадии иммунологического паралича, а затем переориентировкой функций иммунокомпетентных клеток. Последнее ограничивает возможность иммунотерапии рака как самостоятельного вида лечения и превращает ее лишь в дополнительный вид терапии, предупреждающий и отдаляющий распространение метастазов ( Ломакин М.С.,1990;Говалло В.И., 1997).

В проблеме иммунорегуляции большой интерес представляет изучение возможности восстановления иммунологических нарушений при развитии злокачественного процесса нейтрофильными гранулокитами. Долгое врем*

основной функцией последних считался фагоцитоз, значение которою бесспорно. Однако не окалывалось должного внимания рассмотрению друг ой, не менее важной функции нейтрофила - продукции большою числа медиаторов и гуморальных факторов, стимулирующих или офаничинанчцих функциональные свойства иммунокомпетентных клеток. Последняя функция нейтрофилов послужила поводом для многих исследователей называп. данный вид клеток - «одноклеточной 1-уморалыюй железой» (Зурочка ЛИ, l99l;Gougerot-Podicalo M. el al,,19%). Способность нейтрофильиых гранулоцитов оказывать цитотоксическое и цитостатическое действие на различные опухолевые клетки in vitro и интибировать рост 'жепериментальных опухолей in vivo, а также многочисленные литературные данные об изменении состояния чтих клею к на фоне развития новообразований свидетельствуют об их непосредственном участи в патогенезе опухолевого роста Кроме тою, мейтрофилы способны вызывать как амтителозанисимый, так и независимый or антител цнтолт опухолевых клеток ( Bosco M. cl al, 1995).

Механизмы депрессии всех чвеньев иммунитета при злокачественном процессе до конца не определены, несмотря на то, что данный вопрос имеет большое значение для обоснования подходов иммунокоррекции с целью восстановления выявленных нарушений в системе иммунитета Также практически мало изучены вопросы межклеточного взаимодействия, хотя кооперация и вшиморегуляция иммунокомпетентных клеток могут являйся определяющим моментом в иротишхтпухолевой защите организма. В доступной нам литературе, практически не обнаружено данных по межклеточному взаимодействию нейтрофильных гранулоцитов и цитотоксических субпопуляций лимфоцитов при злокачественном росте.

Известно также, что клетки спонтанной опухоли у больных отличаются по антигенному составу от стандартных линий опухолевых клеток и от клеток, близких по тканевому происхождению к опухолям в исследуемых группах. Потгому, особый интерес представляет решение вопросов о способности эффекторных клеток лидировать аутологичные мишени и сопоставлении киллерной активности эффекторов в отношении классических и аутологичных опухолевых клеток.

Целью настоящей работы явилась комплексная оценка регуляторной роли ненгрофилов и продуктов их активации на основные функциональные показатели естественных киллеров, лимфокнн-активированных киллерных клеток и цитотоксических Т-лнмфоцитов, установление киллерной активности самих нейтрофилов у больных со злокачественными новообраюванмямн желудка и прямой кишки, определение возможности

влияния лимфоцитов на цитотоксичность нсйтрофильных гранулоцитов при изучаемой патологии.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи: I Пронести анализ функционального состояния естественных киллерных клеток, лнмфокин-пкзивированнмх киллеров н цитотоксических Т-лимфоцитов, вылслеиных из места локализации опухоли, регионарных лимфоузлов и периферической кропи у пациентов с язвенной болезнью желудка, раком желудка и прямой кишки.

2. В сравнительном аспекте щучить ишсисния функции основных цитотоксических субпопуляций лимфоцитов при язвенной болезни желудка, раке желудка и прямой кишки 3-4 стадий в отношении различных видов клеток-мишеней.

3. Определить характер гуморального влияния иейтрофилов на активность естественных киллерных клеток, лимфокин-активиропанных киллеров и цитотоксических Т-лимфоцитов в норме у здоровых людей и при изучаемых патологиях.

4 Изучить цитотоксическую функцию самих нсйтрофильных гранулоцитов против аутологичных опухолевых клеток и классических клеток-мишеней и провести сравнительный анализ чувствительности мишеней.

5 Определить регуляториую роль супернатаитов стимулированных и не стимулированных иейтрофилов в отношении пролиферативной способности лимфоцитов больных язвой желудка, раком желудка и прямой кишки.

6. Установить особенности рецепции ИЛ-2 под действием гуморальных факторов активированных и не активированных нсйтрофильных гранулоцитов в норме и при изучаемых иатологиях.

7. Изучить возможность обратного регуляторного влияния в системе лимфоцит-нейтрофил у здоровых доноров и пациентов с исследуемыми патологиями и провести сравнительный анализ полученных результатов.

Связь с планом научно-исследовательских работ. Работа выполнялась в рамках фундаментального исследования «Медико-биологическое обоснование новых видов специализированных лечебно-профилактических продуктов с направленной биологической активностью» Института питания МН-АН РК.

Научная новизна. Проведенное комплексное изучение функционального состояния эффекторных субпопуляций лимфоцитов, выделенных из места локализации опухоли, регионарных лимфоузлов и периферической крови, указывает на достоверное снижение функций данных клеток при развитии хтокачественного процесса с однонаправленностью и )менений цитотоксичности изучаемых эффекторов локального и системною

í>

иммунитета. В ходе выполнения работы установлена способность естественных киллеров и лимфокин-активированных киллеров лидировать аутологичные опухолевые клетки, при этом показатели цитокжсичсской активности данных ^эффекторов в отношении аутологичных опухолевых кпеток были па уровне цитотоксичпости в отношении НКК-чувспнпе.тмюй линии клеток-Мишеней.

Впервые покатана высокая цитогоксическая активность нейтрофилов периферической крови в эксперименте in vitro как в отношении стандартных клеток-мшненей, так и против аутологичных опухолевых клеток.

Установлено наличие регуляторного влияния нейтрофильных фанулоцнтов на естественные киллерпые клетки, лимфокин-активированные киллеры, цитотоксические Т-лимфоциты как в труппе условно здоровых доноров, так и в группе пациентов со злокачественными опухолями желудка и прямой кишки. Показано, что в норме нейтрофилы выполняют ограничительную роль с целью сохранения физиологического баланса между функционально активными популяциями иммуноцитон. С развитием патологического процесса установлено наличие опнозитной функции нейтрофилов, проявляющейся в стимуляции литичсских свойств цитотокеических клеток. Кроме тою, показаны также регуляторные свойства лимфоцитов в отношении ци тотоксичпости нейтрофильных граиулоци i он. Результаты проведенною исследования можно рассматривать как экспериментально-теоретическое обоснование новых подходов иммунологического мониторинга и иммунокорригирующей терапии у больных опухолевыми заболеваниями желудка и прямой кишки.

Практическая значимость. На основании результатов нпсюяшего исследования показано наличие взаимосвязи между изменениями функциональной активности киллерных клеток локального и системного иммунитета при развитии опухолевого процесса.

Данные, полученные в ходе выполнения работы указывают, что определяющим моментом в регуляторной функции нейтрофилов является не исходно низкая цитогоксичность эффекторов, а совокупность всех супрессивных изменений, имеющих место при развитии онкологического процесса, которые и определяют направленность действия нейтрофильных фанулоцнтов и продуктов их активации. Следовательно, именно патологический процесс, развивающийся в организме, является основным пусковым механизмом, контролирующим выбор и реализацию клетками программ кооперации.

Основные положения, выносимые на защиту

I При ра «витии я темной болезни желудка функциональная активность cvTcciucHHbix кнлерныч клеток, 'лимфокин-активированных киллеров и

антитоксических Т-лимфошпов местного и системного и ммупи(с!л практически не подвергается каким-либо выраженным изменениям, тогда как при шокпчсстпснном процессе, в частности при распространенных ею формах, вес изучаемые вилы антитоксических клеток подвержены значительному ингибированию.

2 1-лпеетпенные киллерные клетки и лимфокин-активированные киллеры в условиях in vitro проявляли способность лизнровать аутологичные опухолевые клетки, сопоставимую по индексу киттоксичности с литической активностью данных эффекторов в отношении классических линий опухолевых клеток.

3. Сунернатанты интактных и зимозан-активированных нейтрофилов доноров и больных язвой желудка ограничивали эффекторпый потенциал естественных киллеров, тогда как в группах больных раком желудка и прямой кишки происходило изменение регуляторной направленности нейтрофилов с ограничивающей литические свойства киллеров на усиливающую, как в опытах со стандартными, так и с аутологичными линиями клеток-мишеней.

4. В условиях здорового организма сунернатанты нейтрофильных (ранулоцитов, как интактных, так и стимулированных, выполняют функцию ингибирования питотоксичности лимфокин-активированных киллеров. При тгом, с развитием злокачественного процесса также не наблюдалось стимуляции активности данных эффекторных клеток.

5. В группе доноров не происходило достоверных изменений литичсских свойств цитотоксических Т-лимфоцитов при влиянии на них супернагантов интактных и активированных нейтрофильных лейкоцитов, тогда как с развитием злокачественного процесса сниженные показатели киллинга достоверно повышались при их совместной инкубации с супсрнатантами инактных и зимозан-активированных нейтрофилов.

6. Нейтрофильные гранулоциты проявляли выраженную антате-лонезависимую цитотоксичность в отношении классических и аутологичной линии опухолевых клеток, сопоставимую по полученным параметрам с соответствующей функцией естественных киллеров. У пациентов с язвой желудка показатели цитотоксичности нейтрофилов сохранялись на уровне средних значений доноров, однако с развитием опухолевого процесса литические свойства нейтрофильных граиулоцитов активировались, в отличие от соответствующих показателей изучаемых популяций лимфоилнмх эффекторных клеток.

7. Способность Т-клеток пролиферкровать при действии митогена резко снижалась с развитием злокачественного процесса, однако при ко-стнмуляиин супернатантом нейтрофилов способность к властной трансформации восстанавливалась, что указывает на обрэшмость нарушения

пролиферации лимфоцитов, а также переключение с ограничивающей на стимулирующую регуляцию нейтрофилами данной функции Т-клеток.

8. Способность к рецепции экзогенного ИЛ-2 лимфоцитами сохранялась на значительном уровне при язвенной болезни желудка и снижалась при развитии злокачественного процесса, при этом только сунернатанты интактных нейтрофилов способсгвошли восстановлению рецепции ИЛ-2, тогда как сунернатанты активированных не йтрофилов таким эффектом не обладали.

9. Интактные и митогенстимулированные лимфоциты оказывали выраженное дозозависимое ( от митогена) влияние на цитотоксичность нейтрофильных гранулоцитов. Сунернатант лимфоцитов, обработанных оптимальной дозой митогена, значительно повышал литическую активность нейтрофилов, в отличие от сулернатанта лимфоцитов, обработанных высокой дозой митогена, действие которых на нейтрофильные гранулоциты проявлялось в качестве «отрицательного сигнала».

Аиробации работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на Научной конференции с международным участием «Региональные проблемы питания» (Алма-Ата, 1992 г.), научно-практической конференции «Актуальные проблемы лабораторной медицины» (Алматы, 1997 г.), на съезде онкологов Таджикистана (Душанбе, 1997 г.), IV Международном конгрессе «Медицина и иммунореабилигация» (Сочи, 1998 г.), межлабораторном научном семинаре Института питания МН-АН РК.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 33 научных работы

Структура и объем диссертации. Работа изложена на ^^страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, материалы и мегоды исследований, результаты собственных исследований, заключение, выводы и список использованной литературы, содержащей 465 источника ( 80 отечественных и 365 - иностранных), иллюстрирована 32 рисунками и 28 таблицами.

Авгор выражает глубокую благодарность: - старшему научному сотруднику отделения абдоминальной хирургии Научно-исследовательского института онкологии и радиологии МЗОиК РК Стамкулову. Т.С. за консультативную помощь, а также за содействие в сборе клинического материала.

Материалы н методы исследования Характеристика обследованных групп. Иммунологические исследования были проведены у 220 больных (151 мужчин и 69 женщин) в возрасте от 35 до 65 лег Контрольную группу из 40 человек составляли доноры (практически здоровые лица). Опытная группа подразделялась на 1ри подгруппы: первая сооояла и< человек - больных язвенной болезнью жел>дка ( средний

возраст больных - 40,5 лет), вторая состояла из 84 пациентов (средний возраст

- 46,5 лег) - больных раком желудка 3-4 стадий ( аденокарцинома таза желудка) и третья из 74 человек ( средний возраст 42,3 сода) - больных раком прямой кишки 3-4 стадий (аденокарцинома). Больные находились на лечении в Казахском НИИ онкологии и радиологии. Диагноз язвенной болезни, рака желудка и рака прямой кишки устанавливались на основании клинических, эндоскопических и морфологических данных.

Иммунологические исследования проводились только у больных, не получавших химио- и лучевую терапию.

Получение лимфоцитов и нейтрофилов из периферической крови

проводили методом по Boyum А.(1968) и Фримелю Г. (1987).

Нейтрофилы были подразделены на три пробы Первая - нейтрофилы в полной культуральной среде, вторая - нейтрофилы с добавлением зимозана (20 мг/мл) для стимуляции продукции свободноперекисных радикалов, третья

- нейтрофилы с добавлением индометацина (50 мкг/мл) для ингибировапня циклооксигеназного пути окисления арахидоновой кислоты. Инкубация нейтрофилов длилась в течение 1 часа при 37 С. Затем клетки центрифугировали в течение 5 минут при 400 g, отбирали супернатант и производили фильтрование. Полученный супернатант добавляли к мононуклеарным лимфоцитам.

Культивирование клеток-мишеней. В качестве стандартных клеток-мишеней использовали: ЕКК-чувствительные линии - К-562 - клетки ортро-миелолейкоза человека и ОЯ (клетки опухоли яичников крыс); ПКК-резистентную лииню - Raji (клетки лимфобластомы человека и P8I5 (клетки мастоцитомы мыши). Клетки опухоли яичников поддерживали путем внутрибрюшинных пассажей каждые 10 дней на крысах линии Wistar. Жизнеспособность культуральных клеток поддерживали их инкубацией при 37 С в СО: -инкубаторе ГПИ-01 в полной культуральной среде.

Получение аутологичных опухолевых клеток осуществляли методом Stuile К. et.al. (1994).Для выделения аутологичных (собственных) опухолевых клеток использовали кусочки опухолевой ткани (операционный и биопсийный материал) от пациентов, составляющих опытную группу (клегки аденокарциномы желудка и прямой кишки). Кусочки операционного и биопсийного материалов разрезати ножницами, раздавливали на стеклянной поверхности, пропускали через 100 цт сеть из нержавеющей стали и отмывали в среде RPMI-1640, согласно методике Vose М. (1982) . Далее остатки опухолевой ткани (для выбивания опухолевых клеток) обрабатывали коллагеназой («Sigma», Germany) путем встряхивания на шейкере («F.lpan», Польша) в течение трех часов /293/. Затем клеточную суспензию наслаивали

ш

на двухступенчатый градиент фиколлмипак (60% 1'к.оИ и 33% Гю>11 н К1'М1-1640), цен фифугиропали в течение 30 минут при 40()у Опухолевые клетки обнаруживались в интер<|)аче 33% раствора фиколла /294/. Кольцо опухолевых клеток трижды отмывали в среде И 1'М 1-1640 путем центрифугирования при 400^ в течение 5 минут.

Получение инф.тижтелиальных лимфощпов , лимфоцитов собственной пласт инки слизистой желудка и околожслудочных лимф;пическнх у шов осуществляли но (лЬьо» Р.К. (1985).

Определение активности естественных киллеров (1-КК) проводили метдом Рыковой МЛ. и соавт. (1981).

Определение активности лимфокии-активированных киллерных клеюк (ЛАК) проводили по методике ЫЫипшга Т. ега1. (1986).

Исследование активности цигогоксичсскнх Т-лимфоциюн (ЦТЛ) выполняли методом, предложенным \Vhitesiile Т. е( а!.(1988).

Ре1уляторное влиянне исследуемых еупернапштов реакцию бластфанс<1>ормацни лимфоцитов и способность лимфоцитов к рецепции ИЛ-2 изучали, используя меюдику Фримеля Г. (1987).

Пигоюксическук) активность иейтрофильныч фанулоцитов исследовали согласно методике Рыковой МП. и соавт.(1987).

Сравнительный анализ основных цнтотокснческих с)Г)пону.лииий местного и системного иммунитета при пшенном болезни, раке желудка и примой кишки

Изучение логической активности основных киллерных субпопуляцин лимфоцитов больных злокачественными новообразованиями офаничиважкь на данном этапе результатами по исследованию иммунокомпстентных клеток лимфатических узлов. Данные же о комплексном исследовании клеточных иммунных механизмов в месте локализации процесса, в регионарных лимфатических узлах и периферической крови практически не встречаются в доступной нам научной литературе.

В таблице I представлены результаты исследования цигогоксической активности Г.КК, выделенных из периферической крови, лимфоузлов, ишрл)лителиальныч лимфоцитов (ЮЛ), лимфоцитов собственной пластинки (ДСП) больных язвой желудка, раком желудка и раком прямой

кишки 3-4 стадии по отношению к ЕКК-чувствительной линии мишеней К562 и ЕКК-резистентной клеткам-мишеням Яа^'.

На рисунке видно, что ЕКК, полученные из ИЭЛ, ЛЛУ, ЛСГ1 и ЛПК больных язвой желудка, характеризовались более высокими показателями киллерной активности, нежели у пациентов со злокачественными опухолями. В данном случае наглядно представлено негативное регуляторное влияние супрессорных факторов, накапливающихся непосредственно в опухолевой ткани..При злокачественных процессах ЕКК расходуются в повышенных количествах с целью элиминации опухолевых клеток. Следовательно, для восстановления популяции происходит повышенный приток клеток-предшественников, которые, несмотря на экспрессию на своей поверхности маркеров, характерных для ЕКК, не подготовлены к выполнению литической функции. Они образовывают коньюгаты эффектор/мишень, но гге способны осуществлять основную стадию летального удара - непосредственно лизис мишени (ТаЬага е! а1, 1990; Оуеки; О. й а1.,1991)

Изучая функциональную активность лимфоцитов по отношению к ЕКК-резистентной линии клеток-мишеней, получили, что цитотоксический ответ на данную мишень значительно ниже, чем в случае с ЕКК-чувствительной мишенью (Таблица 2). Как известно, ЕКК считается гетерогенной популяцией, в состав которой причислены и естественные цитотоксические киллеры, обладающие спонтанной литической активностью к широкому спектру мишеней, включая аутологичные опухолевые клегки и резистентные к лизису ЕКК мишени. При этом их количество соответственно ниже и .следовательно, осуществляемый ими киллинг также ниже. Помимо этого, сами ЕКК-резистентные мишени способны ускользать от воздействия эффекторов из-за отсутствия на их поверхности структур, характерных для К 562, распознающихся ЕКК(МогеНа Ь,1995).

Далее, изучая изменения функциональной активности лимфокин-активированных киллеров при язвенной болезни, раке желудка и прямой кишки, мы также использовали две мишени К562 и Яар. Цитотоксическая активность ЛАК всех локализаций сохранялась на гораздо более высоком уровне, нежели ЕКК. При этом в большей степени под действием ИЛ-2 активировались лимфоциты лимфатических узлов (Таблица 3).

Оценивая изменения функционального состояния ЛАК в исследуемых группах пациентов, отчетливо выявлено-Снижение литической функции ЛАК местного иммунитета у онкологический больных по сравнению с язвенниками. -35,9% (43,84+3,87% и 28,08±2,7%). Такая же закономерность продемонстрирована и в отношении ЕКК резистентной мишени (Таблица 4). Подводя итог, можно отметить, что цитотоксическая активность ЛАК клеток выше, чем естественных киллеров, в отношении обеих мишеней, при этом недостоверное повышение киллерных свойств ЛАК по отношению к ЕКК-чувствительной

Таблица 1. Цитотоксическая активность естественных киллерных клеток, выделенных из слизистой желудка, собственно пластинки слизистой оболочки, лимфатических узлов и периферической крови, к ЕКК-чувствительной линии клеток-мишеней у больных с язвой желудка, раком желудка и прямой кишки

Локализация клеток " Индекс китотоксичности (%) Язв*.б-нь (а) Рак жел-ка (б) Рак пр.к-ки (в)

1 Интраэп. лимфоциты п=35 30,6±2,44 19,6± 1,78 ра-б<0,01 18,35± 2,63 ра-в ¿0,01

2 Лимфоциты собств. пластинки ( п =35) 33,3± 2,36 22,3± 3,13 ра-б<0,01 21,4±2,98 ра-в <0,01

3 Лимфоциты лим.узлов п = 35 27,6± 2,2 17,5±1,64 16,5±2,98 ра-в <0,01

4 Лимфоциты пер. крови п = 35 38,1± 2,03 р м<0,05 р 3-450,01 24,4±1,92 ра-6<0,01 р 3-4<0,01 23,1± 1,95 ра-в <0,01 р 3-4^0,05

Таблица 2. Цитотоксическая активность естественных киллерных клеток, выделенных из слизистой желудка, собственно пластинки слизистой оболочки, лимфатических узлов и периферической крови, к ЕКК-резистентной линии клеток-мншеней у больных с исследуемыми патологиями

Локализация клеток Индекс китотоксичности (%) Язв.б-нь(а) Рак жел-ка (б) Рак пр.к-ки (в)

1 Интраэп. лимфоциты п=35 8,66+1,03 8,2±2,04 6,1111,13

2 Лимфоциты собств. пластинки ( п =35) 9,8±1,06 7,32±1,13 6,0411,44

3 Лимфоциты лим.узлов п = 35 6,4211,3 4,59 ±1,5 4,0211,04

4 Лимфоциты пер. крови п = 35 12,43±1,84 рз-4<0,01 8,13±1,14 р а-б<0,05 7,1411,56 р а-в<0,05

Таблица 3.

Функциональная активность лимфокин-активированных киллеров, выделенных из слизистой желудка, собственно пластинки слизистой оболочки, лимфатических узлов и периферической крови, к ЕКК-чувствительной линии клеток-мишеней у больных с язвой желудка, раком желудка и раком прямой кишки

Локализация клеток Индекс китотоксичности (%) Язв.б-нь (а) Рак жел-ка (б) Рак пр.к-ки (в)

1 Интраэп. Лимфоциты п=35 38,5512,55 р а-б <0,01 22,9612,44 23,0112,56 р а-в <0,01

2 Лимфоциты собств. пластинки (п =35) 41,54±3,44 24,4±3,1 р а-б <0,01 24,512,91 ра-в <0,01

3 Лимфоциты лим.узлов п = 35 38,2814,1 22,3213,01 р а-б £0,01 21,7111,57 ра-в <0,01

4 Лимфоциты пер. крови п = 35 43,8413,87 28,0812,71 р а-б <0,01 27,0111,57 ра-в ¿0,01

Таблица 4. Цитотоксичность лимфокин-активированных киллеров в отношении ЕКК-резистентной линии клеток-мишеней при язве желудка, раке желудка и прямой кишки

Локализация клеток Индекс китотоксичности (%) Язв.б-нь (а) Рак жел-ка (б) Рак пр.к-ки (в)

1 Интраэп. лимфоциты п=35 24,1213,71 р а-6<0,05 р а-в<0,01 14,3511,3 р 1-420,01 13,711,22 р 1-4<0,01

2 Лимфоциты собств. пластинки (п =35) 27,9612,34 р а-б<0,01 р а-в<0,01 16,8211,32 15,111,47 р 2-4<0,01

3 Лимфоциты лим.узлов п = 35 25,2613,18 ра-б<0,01 р а-в<0,01 14,1111,03 р 3-4^0,01 13,112,17 р 3-4<0,01

4 Лимфоциты пер. крови п = 35 29,4212,33 р а-6<0,01 р а-в<0,05 20,1111,66 21,1511,53

мишени по сравнению с не активированными лимфоцитами, вероятно, свя зано с возможными функциональными повреждениями иммунных клеток в ходе-развитая злокачественного процесса. При этом значительная разница в отношении мишени Яар свидетельствует о существенном увеличении числа лимфоцитов, способных в резулыате стимулирующего влияния ИЛ-2 приобретать высокий литический потенциал.

Ц'ГЛ также лидируют опухолевые клетки, однако только после предварительной их инкубации с последними, то есть при развитии соответствующей сенсибилизации. Цитотоксические Г-лимфоциты были получены к ЕКК-резистентной мишени Ка^'. Интересно отметить, что И')Л больных язвой желудка проявляли большую способность преобразовываться в высокоактивные ЦТЛ, нежели ЛАК, и соответственно индекс цитотоксичности ЦТЛ из ИГ)Л был выше по сравнению ЛАК из ИГ)Л (Рисунок 1). Известно, что итри шителиальные лимфоцит ы в значительной степени представлены популяцией Т-лимфоцитов, способных под влиянием активирующих стимулов, которыми в данном случае являются сами опухолевые клетки, приобретать цитотоксическую направленность. Предшественники ЛАК среди интрачпителиальных лимфоцитов представлены в меньшем процентном отношении. Во всех других локализациях функциональный потенциал ЛАК и ЦТЛ отличался незначительно.

В группах пациентов со злокачественными процессами желудка и прямой кишки разница эффекторной способности данных популяций лимфоцитов также незначительна. Учитывая, что исходная цитотоксическая активность ЦТЛ из ИЭЛ была выше таковой у ЛАК, прослеживается большая депрессия ЦТЛ при развитии опухолевого процесса, нежели ЛАК. Очевидно, Т-клеточный механизм как более поздний в филогенетическом отношении более подвержен действию ингибирующих факторов.

Подводя итог данному разделу работы, основной вывод, полученный нами, состоит в том, что во всех исследуемых группах цитотоксичность изученных эффекторных популяций периферической крови выше данного параметра эффекторов остальных локализаций, причем приблизительно в равной степени. Например, для ЕКК разница составляет 27,6%; 28,6%; 24,2%. Таким образом, существует взаимосвязь между изменениями функциональной активности киллерных клеток локального и системного иммунитета при развитии опухолевого процесса.

Все выявленные нами изменения функционального состояния иммунокомпетенгных клеюк требуют изучения возможных механизмов коррекции цнтогоксической активности эффекторных популяций больных хтокачесгвсн ны ми новообразован иям и.

И связи с этим, следующий этап работы был определен, как изучение возможности гуморального влияния интакных и активированных нейтрофильных гранулонитов на нитотоксические популяции ЬКК, ЛАК и ЦТЛ периферической крови доноров, больных язвой желудка, раком желудка и прямой кишки.

Нлнянне сукернатантон интактных и активированных нейгрофнлои на цитотоксмчсскуго активность естественных киллеров у больных нзвой желудка, раком желудка и примой кишки

Мы остановили свой выбор именно на этом виде иммунокомнетенгных клеток по следующим причинам: во-первых, это наиболее многочисленная популяция иммунонигоп, во-вторых, они осуществляют свои функции гораздо быстрее остальных клеток, и в-третьих, помимо фагоцитоза, нейтрофилы характеризуются и другой не менее важной, регуляторной функцией за счет продукции большого числа медиаторов. Для определения наличия таких регуляторных функций в отношении активности ЕКК инкубировали данные эффекторы с тремя пробами нейтрофильных супернатантов: 1) супернатант интактных нейтрофилов; 2) супернатант нейтрофилов, активированных зимозаном; 3) супернатант индометацин-обработанных нейтрофилов.

Инкубация естественных киллерных клеток, выделенных из крови доноров, с супернагантом интактных нейтрофилов ( НФ культивировали в полной культуральной среде в течение 2 часов, без активаторов) проявлялась в значительном угнетении цитотоксической активности ЕКК на 39% по сравнению с исходной активностью (Таблица 5). Полученные результаты сопоставимы с данными, имеющимися в научной литературе, в которых указывается на ингибирующее влияние нейтрофилов в отношении цитотоксической активности ЕКК по отношению к ЕКК-чувствительным мишеням. Характер угнетающего воздействия, возможно, опосредован следующими факторами: выработкой активных радикалов кислорода, секрецией простагландинов, а также влиянием через цитокины. Большинство исследователей склонны считать наиболее важным -повреждающее действие радикальных форм кислорода (Кудрявцев И.А., 1988, Громыхина Н.Ю. и соавт., 1992). Наши дальнейшие эксперименты согласуются с данным предположением, так как при активации нейтрофилов зимозаном, стимулирующим выработку ими активных форм кислорода, и при последующем добавлении полученного супернатанта в культуру ЕКК доноров нами была зарегистрирована более значительная супрессия исходной цитотоксичности, составляющая 49%. Неожиданные результаты были получены нами при изучении эффекта воздействия супернатанга нейтрофилов, обработанных индометацином, на литическую активность ЕКК. Индомстанин, как известно, блокирует выработку простагландинов, при этом арахилоновая

Сравнительный анализ активности ЦТЛ и ЛАК, выделенных из ИЭЛ, ЛСП, ЛЛУ и ЛПК, при изучаемых патологиях в отношении ЕКК-резистентной мишени

Рак желудка

Таблица 5.

Влияние супернатантов нейтрофильных гранулоцитов здоровых доноров, пациентов с язвенной болезнью желудка, раком желудка и прямой кишки на цитотоксичеекую активность естественных киллеров вотношении ЕКК-чувствительной линии клеток-мишеней

№ Диагноз Индекс цитотоксичности (%)

безсупр-та + суп-т инт. + суп-т зим. + суп. инд.

(а) нф. (б) акт.нф.(в) обр.нф.(г)

1. Доноры 38,9±3,3 23,713,15 20,012,08 24,312,27

п=40 р 1-з<0,01 р 1-з<0,05 р 1-з<0,01 р 1-2<0,01

ра-б<0,01 рав<0,01 р а 1^0,01

2. Язвенная бо- 32,18±2,69 21,414,3 20,513,8 36,211,1

лезнь р 2-320,01

п=32 Р а-б20,05 р а-в<0,05 р б-г50,01

р в-г20,01

3. Рак желудка 24,48±2,92 32,312,18 33,212,31 27,111,95

п=34 Р'а-в<0,05 р 2-з<0,05 р а-в<0,05 р в-г<0,05

4. Рак прямой 24,0513,71 34,113,18 34,712,47 29,312,4

Кишки р а-6<0,05 р 1-4:20,01 р 2-420,01

л=34 р м<0,01 р 1-4<0,05 р а-в<0,05

кислота расщепляется по липооксигеназному пути с образованием лейкотриенов, в частности, лейкотрисна В4 (Kunkel S. et al, 1986). Настоящий медиатор характеризуется преимущественной стимуляцией иммунокомпетентных клеток. Однако и в данном случае мы регистрировали угнетение функциональной активности естественных киллеров, полученных из периферической крови здоровых доноров, в отношении ЕКК-чувствителыюй лини мишеней К562. Депрессия составляла 37% от исходного значения цитотоксичности в контроле. Возможно, что при блокировании цик-лооксигеназного пути метаболизации арахидоновой кислоты, помимо, липооксигеназного, может активироваться и монооксигеназный. В литературе указывается на снижение функциональных свойств иммунокомпетентных клеток под влиянием Р 448-зависимой мопооксигеназной активности (Balsinde Jetai, 1994).

Далее рассмотрим воздействие супернатантов не активированных и активированных нейтрофилов на функциональную активность ЕКК в опытах но отношению к ЕКК-чувствителыюй линии мишеней К562 у пациентов в опытных группах (Таблица 5). В группе больных язвой желудка нами была установлена та же тенденция к угнетению изучаемого параметра, что и в группе доноров, за исключением проб с индометашш-обработанными нейтрофилами.

Исходная цитотоксическая активность ЕКК в данной группе пациентов под действием иитакгных нейтрофилов подвергалась значительной депрессии, тогда как в группах больных раком обеих изучаемых локализаций была зарегистрирована достоверная стимуляция эффекторного потенциала.. В данных группах отмечается обратная закономерность по сравнению с группой контроля и язвенными больными. По-видимому, развитое такой патологии, как злокачественная опухоль, приводит к усилению секреторной функции нейтрофилов с целью регуляции гоместаза и как результат - нейтрофильные гранулоциты частично компенсируют депрессию иммунного ответа за счет продукции факторов, стимулирующих функции иммунокомпетентных клеток.

Инкубация лимфоцитов больных раком обеих локализаций с супернатантом ннтактных нейтрофилов выразилась в наличии следующей закономерности: если у больного в исходной пробе цитотоксичность сохранялась на высоком уровне, то влияние нейтрофильного супернатанта выражалось в снижении показателя, что наблюдалось и в контрольной группе и группе пациентов с язвенной болезнью. Однако, если в исходной пробе ИЦ изначально был низким , то мы наблюдали эффект оппозитного действия супернатантов нейтрофильных гранулоцитов. В группах онкологических больных обеих изучаемых локализаций совместная инкубация с зимозан-активированным нейтрофильным супернатантом характери ювалась

значительным повышением цитотоксической активности НК-клеюк но отношению к мишеням К 562. Здесь так же, как и в первой пробе (интакшые нейтрофилы), наблюдается изменение направленности действия нейтрофилов с сунрессорной на активирующую Как считают некоторые авторы, действие активных форм кислорода в большей степени направлено на лизис быстрорастущих опухолевых клсКж и кроме того, зимозанетимудированные нейтрофилы выделяют фактор, активирующий лимфоциты, влияние которою носит доэозависимый характер ((¡arrido М et а), 1990, Carson W.el al, 199-)).

Обработка нейтрофилов нндометацином не сопровождалась каким-либо выраженным действием на >ффекгорный потенциал естественных киллеров в обеих группах онколе» ичсских больных. Уровень цитотоксичности в обеих ipynnax больных для данной пробы был на уровне исходных показаний. Следовательно, простai ландиноный механизм супрессии функции Г.КК при рашитии злокачественною процесса либо не имеет определяющею характера, либо является неодно шачнм.м. естественных киллеров в группах больных со злокачественными новообразованиями. Наиболее важным представлялось определение лнтичсской активности 1гКК но отношению к собственным аугологичным опухолевым клеткам-мишеням Как и в предыдущих экспериментах, лимфоциты больных стимулировали супсрнашнтами иитактных и активированных нейтрофильных гранулоциюв. Полученные параметры по своим средним значениям практически не окшчались oi показаний цитотоксичности ЬЖК по отношению к ККК-чувсгвительным клеткам-мишеням. Карцинома желудка и прямой кишки представляет собой высокодифферснцированный жп опухолей, следовательно, на своей поверхности . они экснрессируют значительное количество онухолсассоцнированных антигенов, которые распознаются ККК, чю является одной из причин высокой киллерной активности эффекторов.

Таблица 6

Функциональная активность естественных ки.шерных клешк в отношении аутологнчных клеюк аденокарциномы желудка и прямой кишки

№ Индекс цитотоксичности (%) Диагноз безеуперн-та +супер.интакт. +зим.-актив. + ннд.-обраб. (а) нф. (б) суперн.(в) сунерн.(д)

1 1 Рак жел-ка 20,1±2;14 27,4±3,18 30,1 ±4,4 Рис <0,05 24,17±3,02

Рак прямой кишки 22,8±3,12 26,68±4,98 29,3±5,51 1\д<0,05 17,8±2,71

Исходные значения индекса цитотоксичности ЕКК против аутологичных опухолевых клеток у больных раком желудка составляли 20,1+2,14%, а у больных раком прямой кишки - 22,8±3,12%. При инкубировании лимфоцитов пациентов в исследуемых группах с пробами супернатантов мы наблюдали динамику изменения показателей цитотоксичности аналогичную предыдущим опытам с различными видами мишеней. То есть супернатанты иитактнмх нейтрофильных гранулоцитов проявляли стимулирующие свойства в отношении литических свойств ЕКК. Наиболее показательным модулирующий эффект был в группе больных раком желудка, выражающийся в увеличении ИЦ на 26,6%.Наиболее вероятным является то, что положительная регуляция интактным супернагантном опосредуется выделением нейтрофилами определенных цитокинов, наиболее важными из которых являются ФНО-а, ИНФ-у, ИЛ-1. Однако не столь значительная активация киллинга ЕКК свидетельствует о том, что помимо стимулирующих медиаторов, нейтрофилы способны вырабатывать и ингибирукндие цитокины, обуславливая <1о\\ть эффект. К таким веществам относятся РАИЛ (рецепторный антагонист ИЛ-1), трансформирующий фактор роста и простагландины (Рнп Р. е1 а1.,1991 ;Ап В. е1 а!.. 1994).

Завершающей стадией данного раздела работы явилось проведение перекрестных экспериментов цитотоксического теста. Если действительно нейтрофилы изменяют направленность своих функций при развитии патологического процесса, следовательно, в перекрестных реакциях должно быть выявлено соответствующее изменение показателей цитотоксичности естественных киллеров. Мы инкубировали ЕКК здоровых доноров с нейтрофкльными супернатантами больных всех изучаемых групп и, наоборот, изучали влияние нейтрофильных супернатантов здоровых пациенюп на активность ЕКК больных язвой желудка, раком желудка и прямой кишки (Рис.2,3).

Супернатанты нейтрофилов больных язвой желудка несут такую же функциональную нагрузку, что и у условно здоровых людей. Следовательно, у нейтрофилов больных язвой желудка ведущей остается функция фагоцитоза и ферментативная функция, связанная с повреждением тканей при воспалительных процессах. Значит можно заключить, что именно патологический процесс, развивающийся в организме, является основным триггерным механизмом, контролирующим выбор и реализацию клетками программ реагирования.

Рассмотрим далее изменение ЕКК под действием супернатантов больных онкологическими процессами. Согласно существующей гсорнн, нейтрофилы при развитии злокачественных новообразований осуществляют переориентировку основных функции с ограничивающей на активирующую.

Сравнительный анализ влияния нейтрофил ьных супернатантов доноров и больных на активность ЕКК доноров

Ось ординат-индекс цитотоксичности.(%); ось абсцисс-пробы: а - лимфоциты доноров без супернатанта; Ь - инкубация с супернатантом интактных нейтрофилов; с - с зимозан-стимулированными нейтрофильными супернатантами; с! - индометацинобработанные нейтрофильные супернатанты; 1 - сулернатант доноров; 2-супернатант нейтрофилов больных язвой желудка; 3 - нейтрофильный супернатант больных раком желудка; 4 - нейтрофильный супернатант больных раком прямой кишки.

Рисунок 2

Изучение влияния нейтрофильных супернатантов доноров и больных на активность ЕКК пациентов исследуемых групп

1234 1 2 3 4 1 2 34

Язаа Рак желудка Рак прямой кишки

Ось ординат-индекс цитотоксичности (%); ось абсцисс-пробы; 1- супернатант интактных нейтрофипоа; 3 - суперната "лимазан-стимулированных нейтрофилов;4 - супернатант индометацин-обработанных нейтрофилов.

Рисунок 3

Результаты проведенных нами опытов полностью подтверждают данную гипотезу. Культивирование естественных киллеров доноров с супернатантами больных раком желудка и прямой кишки проявилась в значительном усилении исходных показателей ЕКК доноров. Такая же Модуляция литической активности ЕКК происходит и во второй пробе при действии зимозан-стимулированных нейтрофильных сунернатантов. Если сравнить эти результаты с опытом, где мы к ЕКК доноров добавляли аутологичпые же нейтрофилы, то увидим прямо противоположный эффект угнетения активности ЕКК.

Проведение обратного опыта, состоящего в добавлении нейтрофильного супернатанта от здоровых доноров к лимфоцитам больных показало следующие результаты . Как и в случае с донорской группой, при инкубировании ЕКК больных язвой желудка с супернатантом интактных нейтрофилов доноров, цитотоксический индекс подвергался супрессии. Дальнейшая инкубация естественных киллеров пациентов со злокачественными опухолями желудка и прямой кишки с нейтрофилами здоровых доноров показала следующие результаты. Супернатант интактных нейтрофилов доноров практически не оказывал влияния и мы не наблюдали какого-либо изменения литической активности ЕКК в обеих группах больных раком, хотя супернатантны аутологичных нейтрофилов стимулировали угнетенный литический потенциал данных больных. Вероятно, нейтрофилы доноров, не получивших активирующего сигнала, находятся в неактивном состоянии и их воздействие на эффекторы минимально. Обработка нейтрофилов доноров зимозаном и влияние данного супернатанта на ЕКК больных раком проявилось дальнейшим угнетением уже сниженных показателей цитотоксичности. В данном случае не наблюдался эффект переориентировки действия нейтрофилов, опять же в результате отсутствия сигналов, необходимых для осуществления такого действия.

В последней пробе инкубация супернатантов индометанин-обрабоганных нейтрофилов доноров с ЕКК больных раком обеих групп привела к значительному повышению цитотоксической активности ЕКК. Здесь, вероятно, имеет место положительная лейкотриеновая регуляция цитотоксичности естественных киллеров.

Цнтотокснческая функция лимфокнн-активированных киллеров больных язвой желудка, раком желудка н прямой кишки под действием супернатантов интактных и стимулированных нейтрофилов

Изучая активность ЛАК клеток доноров в отношении ЕКК-чувствителыюй и ЕКК-резистентной линий мишеней, можно отметить, что исходная литическая активность данных клеток была выше цитотоксичности Г:КК доноров. Однако в дальнейшем нами наблюдалось ингибирование цитотоксичности ЛАК по отношению к ЕКК-чувствителыюй мишени ОЯ под действием нейтрофильных супернатантов, что также было характерным и для популяции ЕКК (Таблица 7). В данном случае, как и в экспериментах с ЕКК,

супернатанты интактных нейтрофилов Офаничивают лизис в условиях здорового организма как за счет выработки простагландинов группы Е, угнетающих функциональную активность иммунных клеток, так и за счет экспрессии рецепторов на поверхности фагоцитов, с которыми связываются цигокнны, вырабатываемые самими пейтрофилами, а также и окружающими клетками. Обработка нейтрофилов' зимозаном также выразилась в негативной регуляции активности ЛАК но отношению к мишени ОЯ. Влияние суиренатантов индометацин-обработанных нейтрофилов также носило ингибирующий характер, при этом снижение показателя киллинга было незначительным .

Таким образом, в здоровом организме нейтрофилы преимущественно шрают роль ограничивающих регуляторов гомеостаза и контролируют активность эффекторов и ЕКК, и ЛАК. Естественно, мы предполагали наличие такой же закономерности и в отношении ЕКК-резистентной линии клеток-мишеней Р 815. Однако в опытах с клетками Р815 нами было получено расхождение результатов. Было показано, что супернатант интактных нейтрофилов усиливал активность ЛАК в отношении резистентной линии мишеней (Таблица 8). Полученное нами увеличение активности ЛАК клеток доноров против Р815 объясняется возможной выработкой интакшыми нейтрофилами цитокинов с выраженными иммуномодулирующими свойствами. Инкубирование ЛАК донорской группы с сунернатантом зимозан-стимулированных и индометацин-обработанных нейтрофильных лейкоцитов не выразилось достоверным изменением показателей литической активности против резистетной линии опухолевых клеток. Следовательно, продукты активации нейтрофилов здоровых людей практически не оказывают влияния на лизис JlAK-клетками данного вида опухолевых клеток.

Рассмотрим группы больных. Исходные значения параметра цитоюксичности ЛАК больных язвой желудка были на уровне показателей контрольной группы для обоих видов клеток-мишеней. При развитии язвенной болезни не выявляется значительных изменений активности э<}>фекторных популяций лимфоцитов, включая ЕКК, ЛАК и ЦТЛ- По-видимому, данное заболевание не является процессом значительно влияющим на функциональные свойства данных клеток.

В опытах с ЕКК-чувствительной линией мишеней ОЯ литическая активность ЛАК больных раком желудка и прямой кишки подвергались выраженной депрессии ' соответственно. Сравнивая показатели снижения цитотоксической функции, становится очевидным, что ЕКК и ЛАК подвергаются супрессии при развитии злокачественного процесса в одинаковой степени. Уменьшение активности ЛАК может быть обусловлено нарушением ответа на ИЛ-2, которое в свою очередь является следствием блокады ренешороп к ИЛ-2, нарушением процесса передачи сш нала с

Таблица 7.

Влияние на цитотоксичность ЛАК клеток доноров, больных с язвой желудка, раком желудка и прямой кишки нейтрофильных аутосупернатантов в отношении ЕКК-чувствительной линии клеток-мишеней

№ Диагноз Индекс цитотоксичности (%) без супр-та + суп-т инт. + суп-т зим. + суп. инд. (а) нф. (б) акт.нф.(в) обр.нф.(г)

I. Доноры п=40 45,8 ±2,4 р |-з<0,01 р а-6<0,05 38,1 ±2,7 35,212,78 р а-с<0,01 39,711,3

2. Язвенная боЛезнь п=35 43,84±1,87 ра-б20,01 36,212,14 рб-д<0,01 33,813,01 ра-с<0,01 р с-д<0,01 50,112,17 р 2-320,01

3. Рак желудка п=35 28,08±2,71 ра-6<0,01 37,611,98 34,612,01 35,412,74

4. Рак прямой Кишки п=35 31,0312,14 р 1-420,01 р2-4<0,01 38,412,3 р а-б<0,05 35,111,89 36,512,91 р 2-420,01

Таблица 8. ■

Регуляторная роль супернатантов интактных и активированных нейтрофилов на цитотоксичность ЛАК доноров и пациентов изучаемых групп в отношении ЕКК-резистентной линии клеток-мишеней

№ Диагноз Индекс цитотоксичности (%) без супр-та + суп-т инт. + суп-т зим. + суп. инд. (а) нф. (б) акт.нф.(в) обр.нф.(г)

1. Доноры п=40 44,0712,41 р 1-з<0,01 р а-б<0,05 54,913,05 р 1-з<0,01 50,512,34 р !-3<0,01 48,812,46 р 1-320,01

2. Язвенная болезнь п=35 41,311,84 Р2-3<0,01 . 48.5212,7 р 2-3 <0,01 р а-б<0,05 45,412,11 р 2-320,01 49,113,08 р а-л20,05 р 2-320,01

3. Рак желудка п=35 30,92+3,84 Р а-д<0,05 32,112,1 р б-л<0,05 34,112,8 39,211,98

4. Рак прямой Кишки п=35 35,0+3,56 р м<0,01 34,7+2,96 р 1-4<0,01 Р 2-4<0,01 37,712,96 р 1-420,01 р 2-420,05 36,4+2,14 р 1-420,01 р 2-420,01

рецептора в клетку или же недостаточностью экспрессии рецепторов к ИЛ-2 на поверхности лимфоцитов больных. При применении супернатанта интакгных нейтрофилов была выявлена значительная стимуляция их активности в обеих группах больных со злокачественным процессом по отношению к ЕКК-чувсгвителышй линии в сравнении с исходной пробой. Однако по отношению к резистентной мишени стимуляция цитотоксической активности ЛАК под влиянием супернатанта интактных нейтрофилов была незначительной. Активация нейтрофилов зимозаном и образование ими активных форм кислорода выразилось в повышении цитотоксической активности изучаемых эффекторов против обоих типов мишеней. В эксперименте с резистентными клетками Р815 показатель литической активности ЛАК клеток под влиянием супернатанта зимозан-обработанных фанулоцитов было незначительно выше исходных в обеих опытных фуппах. Возможно, получив активирующий сигнал через ИЛ-211, ЛАК определенное время находятся в стадии рефрактерности или анергии и не могут отвечать на дополнительные регуляторные сигналы нейтрофилов.

Таблица 9.

Влияние нейтрофильных супернатантов на цитотоксичность ЛАК больных раком желудка и прямой кишки по отношению к аутологичным опухолевым клеткам

№ Диагноз Индекс цитотоксичности (%) безеуперн. + суперн.инт. +зим.-актив. 1 индом.-обр. (а) нф.(б) суперн.(с) суперн.(д)

1. Рак жел-ка 27,2±2,14 21,03±2,54 24,3+2,56 23,8+2,75

2. Рак прямой -кишки 29,8±1,7 Раб<0,05 22,21±2,45 25,8±2,9 21,8±3,2 Рад< 0,05

При использовании в качестве клеток-мишеней аутологичных опухолевых клеток нами было установлено, что ЛАК периферической крови больных раком желудка и прямой кишки обладают более выраженной литической активностью в отношении собственных опухолевых клеток по сравнению с ЕКК. Супернатанты интактных нейтрофилов оказывали отрицательное регуляторное влияние на эффекторный потенциал ЛАК в отношении аутологичных опухолевых клеток у больных злокачественными новообразованиями рассматриваемых локализаций. Наиболее вероятной причиной негативного влияния является секреция нейтрофилами простагландинов и растворимого термостабильного фактора - ингибитора протеазы, угнетающего активность киллерных клеток Использование в качестве активатора нейтрофилов зимозана показало, что совместная инкубация ЛАК эффекторов и эимозан-стимулированного супернатанта не

вызывает достоверных изменений цитотоксических функций ЛАК в отношении аутологичных опухолевых клеток в обеих группах больных со злокачественным процессом. Инкубация ЛАК клеток с супернатантом индометацин-обработанным нейтрофилов сопровождалась небольшой депрессией активности ЛАК клеток больных в отношении аутологичных опухолевых клеток, при этом в группе больных раком желудка снижение показателя цитотоксичности в данной пробе было недостоверным. Полученные нами данные не являются противоречивыми, так как между определенными показателями прослеживается наличие логики их изменений. Однако множественность функций одного и того цитокина, медиатора значительно затрудняет поиск оптимальных механизмов регуляции функций цитотоксических популяций иммуиокомпетентных клеток.

Межклеточная кооперация в системе нсйтрофилы-цитотокспческне Т-лимфоцнты в норме и при развитии патологии

Полученные в ходе исследований данные выявили значительную цитотоксическую активность ЦТЛ здоровых доноров в отношении стандартной ЕКК-резистентной линии опухолевых клеток Р 815 (Таблица 10). При этом инкубирование цитотоксических лимфоцитов с супернатантом как интактных, так и активированных нейтрофилов не выявило статистически достоверных изменений функциональных свойств ЦТЛ, то есть в условиях здорового организма полиморфноядерные лейкоциты не влияют на эффекторный потенциал Т-лимфоцитов. У пациентов с язвенной болезнью желудка показатель цитотоксичности ЦТЛ сохранялся на относительно высоком уровне, тогда как в группах больных раком желудка и прямой кишки была установлена выраженная супрессия показателя цитотоксичности. Как известно, триггирование литической активности ЦТЛ обеспечивается определенными рецепторами на поверхности ЦТЛ ( Павлюк A.C. и соавт., 1993;Kuwano К. et al.,1994). В условиях патологии происходит блокирование активирующих рецепторов опухолеассоциированными антигенами, в результате чего преобладает ингибирующий путь регуляции активности цитотоксических Т-лимфоцитов. Если в донорской группе совместная инкубация ЦТЛ и интактных нейтрофильных лейкоцитов не приводила к каким-либо изменениям функционального потенциала ЦТЛ, то в опытных группах наблюдалась положительная регуляция активности ЦТЛ. Так, для пациентов с язвенной болезнью желудка отмечено усиление цитотоксичности ЦТЛ при действии на них супернатантов не активированных нейтрофилов на 13,8% по сравнению с исходной пробой. В группах пациентов со злокачественными новообразованиями стимуляция составила 22,6% и 22,1% -для рака желудка и прямой кишки соответственно. Полученные результат указывают на то, что нейтрофильные гранулоциты за счет пролукции

большого спектра пептидов, названных нейтрофилокинами, выступают в качестве регуляторных клеток, осуществляя взаимодействие в системе нейтрофил- цитотоксические лимфоциты. В данном случае происходит оптимальная индукция цитотоксичсских Т-лимфоцитов.Последующее добавление в культуру ЦТЛ супернатанта полиморфонуклеаров, стимулированных зимозаном, о целью определения регуляторной роли активированных нейтрофилов, показало'усиление функциональной активности ЦТЛ во всех группах пациентов. Дальнейшая инкубация ЦТЛ с супернатантом индометацин-обработанных нейтрофилов приводила к получению неоднозначных результатов в группах пациентов с язвенным процессом и у онкологических больных. Среди больных язвой желудка отмечалась положительная регуляция активности ЦТЛ Очевидно, что отмена негативного влияния нростагландинов, как и в случае с ЕКК- и ЛАК-эффекторами, приводила к значительной индукции киллинга цитотоксическими Т-лимфоцитами, тогда как в группах пациентов со злокачественными новообразованиями не были выявлены статистически достоверные изменения функциональной активности изучаемых киллеров против стандартной линии клеток-мишеней.

Установление четкого потенциирующего эффекта в отношении основных эффекторных популяций противоопухолевого иммунитета нейтрофильными гранулоцитами представляет данный вид иммунокомпетентных клеток как потенциальный объект-для более глубокого изучения в целях применения в адоптивной терапии. Однако, необходимо уточнить, что нейтрофильные гранулоциты обладают как рядом преимуществ, так и определенными недостатками. Основным преимуществом нейтрофилов является их большое количество, так как это самая многочисленная популяция иммуноцитов, следовательно возможно проведение массированного курса терапии, В то же время большим недостатком данной популяции является их короткий срок существования, и невозможность культивирования данных клегок in vitro длительный отрезок времени. Возможно, что преодоление данных трудностей приведет к созданию наряду с существующей ЛАК-терапией и нейтрофило-терапии больных со злокачественными опухолями для индукции ослабленного противоопухолевого иммунного ответа.

Изучение цитотоксической активности стимулированных и не стимулированных нейтроф ильных гранулоцитов

В дальнейших экспериментах была изучена цитотоксическая активность нейтрофильных лейкоцитов с помощью мембранотоксического теста при использовании различных типов опухолевых клеток. Результаты, полученные в ходе проведенных опытов, выявили значительный уровень цитотоксической активности ингактных нейтрофилов, полученных от здоровых доноров в

Таблица 10.

Циготоксическая активность ЦТЛ доноров, больных язвой желудка, раком желудка и прямой кишки, инкубированных с нейтрофильными

№ Диагноз Индекс цитотоксичности (%) без супр-та + суп-т инт. + суп-т зим. + суп. инд. (а) нф. (б) акт.нф.(в) обр.нф.(г)

1. Доноры п=40 48,7±2,41 55,1±3,25 47,5±3,15 40,4±3,98 рб-д50,01

2. Язвенная болезнь п=35 44,2±2,04 р 2-3<0,01 р а-б<0,05 51,3±2,43 52,6±3,02 р а-с<0,05 54,1±3,01 р а-д<0,01 Р 1-250,01

3. Рак желудка п=35 32,09±2,6 р ьз<0,01 р а-б<0,05 41,5±3,11 р 1-350,01 р 2-350,05 44,5±2,07 р 2-350,05 р а-с<0,01 35,7±2,44 р 2-3<0.0] р с-|<0,01

4. Рак прямой кишки п=35 37,1±3,27 р Ы<0,01 р а-с<0,05 47,6±2,05 р 1-450,05 ра-б<0,01 51,07±4,5 36,3 ±3,21 рс-л<0,01 р2-4<0,01 рб-д<0,01

Таблица 11.

Цитотоксическая активность нейтрофилов доноров, больных язвой желудка, раком желудка к прямой кишки в отношении ЕКК-чувствительной линии мишеней,_

№ Диагноз Индекс цитотоксичности (%) интакт.нф.(а) зим.-акт.нф (б) инд.-обр.нф. (с)

1. Доноры п=40 34,6±3,27 р 1-450,05 28,8±3,01 32,214,78

2. Язвенная болезнь п=40 32,3±2,56 р 2-350,01 р 2-450,01 30,05±1,56 р 2-4<0,05 39,6+2,13 р а-с<0,05

3. Рак желудка п=40 41,3±2,04 р а-б50,01 28,14±2,5б 35,2±2,17 р »-<50,05 р б-с50,05

4. Рак прямой Кишки п=40 45,2±3,6 р а-б50,01 22,9±2,41 34,16±2,8 р а-с50,05 р б-с<0,05

отношении ЕКК- чувствительной линии мишеней (Таблица И). Различия между этими показателями статистически недостоверны, следовательно, уровень литнческой способности как интактных, так и стимулированных нейтрофилов доноров оказался практически одинаковым. В отсутствии патологии в организме функция данных иммуноцитов заключается в сохранении постоянства гомеостаза с преимущественным включением механизмов фагоцитоза. Однако подверженность клеток опухоли яичников литическому действию со стороны нейтрофилов указывает на возможность осуществления нейтрофилами и быстрого киллерного воздействия. Стимуляция зимозаном не приводила к усилению цитотоксического ответа. Однако из этого не следует делать вывода, что радикалы кислорода не принимают участия в цитото кс и ч ее ко м эффекте, оказываемом нейтрофилами.

Обработка полиморфвоядерных гранулоцитов здоровых доноров индометацином также не выражалась какими-либо изменениями их цитотоксичности. Сохранение литических свойств нейтрофилов на уровне исходных значений указывает на то, что синтез простагландинов не является определяющим фактором воздействия на эффекторные функции нейтрофилов.

При изучении цитотоксичности нейтрофилов по отношению к резистентной линии мишеней Р 815 обнаружено понижение исходного уровня данного показателя (Таблица12). Стимуляция зимозаном полиморфнонукле-аров в дозе 20 мг/мл в течение 2 часов приводила вопреки нашим предположениям не к стимуляции, а к угнетению цитотоксичности лейкоцитов против Р 815. Предварительная инкубация полиморфноядерных лейкоцитов с индометацином и последующая постановка цитотоксического теста против клеток мастоцитомы Р 815 не выявил различий по сравнению с интактными нейтрофилами.

В группе пациентов с язвенной болезнью желудка литические свойства нейтрофилов по отношению к ЕКК-чувствительным мишеням сохранялись практически на уровне соответствующих показателей доноров. При язвенной болезни нейтрофилы преимущественно ответственны за продукцию провоспалительных медиаторов, в то время как цитотоксическая активность остается без изменений.

Киллерная активность нейтрофилов в отношении резистентных мишеней изменялась в меньшей степени, чем в опытах с опухолевыми клетками линии ОЯ . При этом характер изменений цитотоксичности был таким же как и в предыдущем опыте, то есть стимуляция зимозаном не отразилась на киллинге мишеней, тогда как обработка индометацином оказывала положительное регуляторпое влияние на цитотоксичность нейтрофильных гранулоцитов. Подводя итог, можно отметить практически полное сохранение зффекторного

потенциала нейтрофилов при развитии язвенной болезни на уровне показателей здоровых доноров.

Цитогоксичность нейтрофилов в группах онкобольных в отношении F.KK-чувствительной мишени оказалась повышенной по сравнению с показаниями доноров. Присутствие в организме опухолевых антигенов является характерной чертой злокачественных новообразований, они могут являться пусковым моментом активации нейтрофилоз и возникновения праиминг-эффекта (увеличение уровня и скорости активации нейтрофилов). При этом они активно включаются в процесс формирования эффекторногр клона клеток и определяют величину иммунной реакции.

Одновременно с повышением цитотоксической активности нейтрофильных гранулоцитов у больных со злокачественными новообразованиями изучаемых локализаций, нами было установлено наличие негативной регуляции зимозаном цитотоксичности нейтрофилов. То есть значения кнллерной способности фанулоцитов в результате обработки значительно снижались по сравнению с исходной цитотоксичностью в обеих группах, стимуляция зимозаном приводила к парадоксальному на первый взгляд снижению эффекторного потенциала в отношении мишени ОЯ. Такие же изменения были получены нами и в группе доноров, но в отношении ЕКК-резистентной линии опухолевых клеток. Возможно, в данном случае имело место плейотропное действие метаболитов кислорода, которые сами по себе являются агрессивными молекулами и выступают в качестве негашеных аутокринных регуляторов функции нейтрофилов.

При обработке нейтрофильных гранулоцитов индометацином их цитотоксическая активность в отношении мишени ОЯ была снижена по сравнению с исходной пробой не стимулированных лейкоцитов.

Далее рассмотрим, изменяются ли функциональные показатели киллинга нейтрофилов больных со злокачественным поражениями при использовании ЕКК-резистентной линии опухолевых клеток Р 815 (Табл.12). Полученные результаты указывают на меньшую литическую способность нейтрофилов больных раком желудка и прямой кишки в отношении дайной линии клеток, чем в опытах с F.KK-чувствительной мишенью, но при этом достаточно выраженную но сравнению с показателями донорской группы Изучение влияния супернатантов зимозан-стимулированных и индометацин-обработанных нейтрофильных лейкоцитов у больных в данных группах в отношении Р 815 показало отсутствие достоверных различий по сопоставлении с пробами шгтактных нен1рофилов.

11аиболее важным нам представлялось определение уровня цитотоксического потенциала по отношению к собственным аутологичным опухолевым клеткам (Рисунок 4) Проведенные опыты выявили значительный литический

Таблица 12.

Цитотоксическая активность кейтрофилов доноров, больных язвой желудка, раком желудка и прямой кишки в отношении ЕКК-резистентной линии мишеней

№ Диагноз Индекс цитотоксичности (%) интакт.нф.(а) зим.-акт.нф (б) инд.-обр.нф. (с\

1. Доноры п=40 20,8±3,21 р а-«20,О5 р 1-з<0,01 11,1±2,87 р б-с£0,05 р 1-2^0,01 20,8±3,05 р 1-2^0,01 р 1-з<0,05

2. Язвенная болезнь п=40 23,25±3,01 р а-с£0,05 21,4±2,53 рб-с<0,01 32,4±2,46

3. Рак желудка п=40 33,08±2,42 р 2-з<0,05 28,712,85 р 2-з<0,05 30,1 ±2,71

4. Рак прямой Кишки п=40 26,9±2,11 р м£0,05 23,1±4,13 28,5±3,01

Показатели киллинга нейтрофильными гранулоцитами больных аутологичных опухолевых клеток

Рак желудка [ | Рак прямой кишки

н

иц,<%) -1—

О 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Осьординат-индекс цитотоксичности; осьординат-пробы: а - интактныенейтрофилы; Ь - зимозан-активированные; с - индометацин обработанные гранулоциты.

Рисунок 4

потенциал нейтрофилов в отношении аутологичных клеток. Показатель киллипга в фуппс больных раком желудка против аутологичных мишеней был сопоставим с уровнем лизиса F.KK-чувствительных мишеней . Полученная в ходе эксперимента относительно высокая цитотоксичность нейфофильных фанулоцитов против собственных опухолевых клеток в условиях in vitro указывает на то, что либо в условиях in vitro эффекторный потенциал данной популяции клеток остается невостребованным, :5а счет блокирования доступа активирующих сигналов к рецепторным структурам нейтрофилов, либо в условиях in vivo вступают в действие механизмы защиты опухолевых клеток от повреждающего воздействия эффекторов.

Обработка нейтрофилов зимозаном практически не изменила величины показателей цитотоксичности фанулоцитов в отношении аутологичных опухолевых клеток. Это указывает на функциональную напряженность нейтрофилов и их неспособность реагировать на дополнительные сигналы. Интересно, что обработка ингибитором синтеза простагландииов нейтрофилов больных раком приводила к снижению уровня цитотоксичности по сравнению с интактными клетками. Можно предположить, тто решающую роль индометацин ифает не как ингибитор продукции простагландииов, а как фактор, влияющий на экспрессию поверхностных рецепторов, что и ведет к снижению лизиса опухолевых клеток.

Таким образом, получено, что при злокачественных новообразованиях цитотоксическая активность нейтрофилов остается менее подвергнутой депрессивному воздействию опухолевого процесса и может являться резервным механизмом восстановления эффекторного потенциала. При развитии злокачественного роста во всех цитотоксических популяциях прослеживается закономерное угнетение цитотоксичности в сравнении с контролем. У нейтрофильных фанулоцитов киллерные свойства либо не изменялись, либо отмечалось повышение киллинга опухолевых клеток. Изменение нролифера гивнои способности лимфоцитов доноров и больны* под влиянием супернагангов »штатных и стнмулнрованных нейтрофилов

Одним из показателей функциональных свойств лимфоцитов является усиление синтеза ДНК и РНК, способность к бластной трансформации под воздействием специфических и неспецифических митогенов. Чувствительность лимфоцитов к неспецифической стимуляции характеризует их иммунологическую компетенцию (Мельникова Л.А. и соавт., 1994; Conti Р. etat., 1991).

Изучение бласпрансформации лимфоцитов доноров в присутствии нейтрофильных супернатантов и без них выявило значительные изменения функции лимфоцитов в зависимости от конечных продуктов активации нетрофилов. Добавление к лимфоцитам доноров супернатанта ньтактных

нейтрофилов сопровождалось резким снижением индекса стимуляции. Наши результаты свидетельствуют о регулировании иммунных функций с целью поддержания иммунного гомеостаза при отсутствии патологического процесса. Инкубация лимфоцитов с супернатантом зимозан-стимулированных нейтрофилов также сопровождалось снижением пролиферативного ответа по сравнению с нулевой пробой. Однако средние значения индекса стимуляции были выше, чем в опытах с супернатантом интактных фагоцитов. 11собходимо отметить, что при добавлении максимальной дозы митогена (10,0 мкг/мл X значение параметра стимуляции достигало показателей нулевой пробы (Таблица 13 ). Установлено, что зимозан-активированные нейтрофилы, помимо перекисных радикалов, продуцируют и фактор, стимулирующий лимфоциты (ФАЛ). Показано, что действие данного фактора носит дозозависимый характер (Погодина О.Н. и соавт.,1997). Возможно, именно при использовании митогена в дозе 10 мкг/мл создаются оптимальные условия для выработки данного фактора, и за счет этого уровень пролиферации в данной пробе поднимается до исходных значений.

При инкубации лимфоцитов с супернатантом индометацин-обработанных нейтрофилов, отмечается достоверное усиление пролиферации по сравнению с 1-ой и 2-ой пробами, данный эффект , очевидно, связан с усилением образования лейкотриенов, стимулирующих функциональные свойсгва лимфоцитов.

Полученные в первой части работы результаты подтверждают наличие регуляторного влияния нейтрофилов на функцию властной трансформации лимфоцитов, при этом нейтрофил выступает в качестве регулирующей клетки. Следующим этапом работы было исследование характера воздействия нейтрофильных лейкоцитов и продуктов их секреции на лимфоциты в условиях патологии. Пашей задачей явилось определение закономерностей изменения пролиферации Т-клеток у больных язвой желудка, раком желудка и прямой кишки , проведение сравнительного анализа данных с соответствующими параметрами донорской группы.

Показатель пролиферативной способности лимфоцитов в группе пациентов с язвенной болезнью желудка подвергался депрессии по сравнению с соответствующими данными доноров (Таблица 14). Характерно, что активность цитотоксических популяций лимфоцитов у больных с данной патологией практически не отличалась от параметров доноров, тогда как способность клеток пролиферировать снижалась. Добавление считающейся максимальной дозы -10 мкг/мл в наших опытах отменяло ингибирующее действие супернатанта на способность клеток пролиферироватъ.

У пациентов с язвенной болезнью желудка бласпрансформация не изменялась под влиянием супернатанта интактных нейтрофилов при

Таблица 13.

Изучение бласттрансформации лимфоцитов доноров в присутствии нейтрофилышх супернатантов и без них

№ Пробы Индекс стимуляции(%) лимфоцитов 2,5 мкг/мл ФГА 5,0 мкг/мл 10,0 мкг/мл

1. Без супер-натанта 2,26+0,25 р 1-220,01 р |-з<0,01 2,81 ±0,27 р 1-2<0,01 р 1-320,01 2,38±0,22 р 1-220,01

2. С супернат-ом интак. нф. 0,79+0,21 р 2-420,01 1,05±0,17 р 2-420,05 0,98±0,19 р 2-320,01 р 2-420,01

3. С супери-том зим.-акт. нф. 1,05+0,11 р 3-420,05 1,06±0,16 р 3-420,05 1,96±0,21 р б-с20,01 ра-с20,01

4. С суперн-том иид.обр. нф. 1,6±0,2 р 1-420,05 2,04±0,36 2,03±0,21

п = 30 а б с

Таблица 14.

Изменение пролиферативной активности лимфоцитов больных язвой желудка в присутствии нейтрофильных супернатантов и без них

№ Пробы лимфоцитов Индекс стимуляции (%) 2,5 мкг/мл ФГА 5,0 мкг/мл 10,0 мкг/мл

1. Без супер-Натанта 1,6±0,12 1,8+0,16 2,0±0,14

р 1-4<0,05 р м20,01 р 1-420,01

2. С супернат-ом 1,48±0,25 2,1 ±0,22 2,06±0,25

интак. нф. р 2-420,05 р 2-320,01 р 2-420,01

3. С суперн-том 1,52±0,2 1,58±0,28 1,22±0,! 7

зим.-акт. нф. р 3-420,05 р 3-420,01 р 3-420,01

4. С суперн-том инд.обр. нф. 2,5±0,34 р а-с20,05 2,7±0,26 3,74±0,52

п = 30 а б с

сравнении с нулевой пробой .Инкубация лимфоцитов с супернатантом зимозан-стимулированных нейтрофилов также не приводила к увеличению пролиферативного ответа в данной исследуемой группе, хотя в некоторых работах имеются данные о стимулирующем эффекте нейтрофилов, обработанных зимозаном. Показатели пролиферативного ответа не имели достоверных отличий от параметров И С в нулевой и первой пробах. Лить в последней пробе с супернатантом - индометацин-обработанных нейтрофилов проявлялось четко выраженное модулирующее воздействие на пролиферацию Т-лимфоцитов. При применении оптимальной дозы митогена был зарегистрирован наибольший пролиферативный ответ. Отмена супрессирую-щего влияния простагландинов сочеталась с потенциирующим влиянием оптимальной дозы митогена, чем и определяется повышение пролиферативного ответа лимфоцитов.

В группах больных раком желудка и прямой кишки исходная способность клеток пролиферировать под влиянием митогена была гораздо ниже, чем в донорской труппе и группе пациентов с язвенным процессом (Таблица J 5, i 6 ). Согласно W. Adler et.al. , более низкая способность лимфоцитов больных со злокачественным процессом отвечать бласттрансформацией на введение ФГА связана с тем, что лимфоциты этих больных, будучи стимулированными опухолевыми антигенами, уже находятся в состоянии активации и поэтому не способны реагировать на другие раздражители, каким и является ФГА. Таким образом, пониженная способность Т-клеток отвечать трансформацией на введение ФГА является скорее показателем напряженности иммунологических функций лимфоцитов, чем их иммунологической недостаточности.

Достаточно важным нам представляется факт значительного повышения пролиферативной активности больных раком изучаемых патологий при добавлении супернатанта интактных нейтрофилов. Действительно лимфоциты сохраняют достаточный резервный потенциал и способность к дифференцировке даже при запущенных стадиях заболевания, проявление которого может зависеть и от состояния кооперативных взаимоотношений между изучаемыми звеньями иммунной системы.

Дальнейшее изучение регуляторного воздействия зимозан-активированного супернатанта, вопреки нашим ожиданиям, не выявило наличие положительного эффекта. Определялась однонаправленность изменений средних величин показателя пролиферации в опытной и контрольной группах. Однако, если в контроле угнетение наблюдалось в сравнении с пулевой пробой ( без предварительной инкубации с супернатантом нейтрофилов), то в группе пациентов с онкоиоражениями депрессия была установлена при сравнении с первой пробой (инкубация с супернатантом интактных

Таблица 15.

Пролиферативиая активность лимфоцитов больных раком желудка при их инкубации с супернатантами интактных и стимулированных нейтрофилов

№ Пробы лимфоцитов Индекс стимуляции (%) 2,5 мкг/мл ФГА 5,0 мкг/мл 10,0 мкг/мл

1. Без супер- 0,79±0,14 0,84±0,13 0,96±0,15

натанта р 1-250,01 р 1-:<0,01 р 1-250,01

р 1-450,05 р 1-450,01 Р 1-450,01

2, С супернат-ом 2,2±0,24 2,8±0,17 3,12±0,25

ннтак. нф. р2-з<0,01 р 2-450,05 ра-с<0,01

р а-й<0,05 р г-з<0,01 р 2-3<0,01

3. С суперн-том 1,3+0,21 1,58±0,2 1,5±0,23

зим.-акт. нф. р з-4<0,01 р |-з<0,01 Р 3-4<0,01

4. С суперн-том инд.обр. нф. 2,2+0,25 2,1 ±0,24 2,7±0,31

| п = 30 а б с

Таблица 16.

Пролиферативиая активность лимфоцитов больных раком прямой кишки в присутствии нейтрофильных супернатантов и без них

№ Пробы Индекс стимуляции(%) лимфоцитов 2,5 мкг/мл ФГА 5,0 мкг/мл 10,0мкт/мл

1. Без супер-натанта 0,84±0,27 р 1-2<0,0| р ы<0,05 1,36±0,3! р |-2<0,05 р м<0,05 0,9210,25 р 1-2<0,01 р м<0,01

2. С супернат-ом Интак. нф. 2,0±0,18 2,1410,22 р б-с<0,05 2,710,16 р 2-350,01 ра-с<0,01

3. С суперн-том зим.-акт. нф. 1,5610,14 р 1-з<0,05 1,710,2 1,7510,19 р 1-350,01

4. С суперн-том инд.обр. нф. 2,0910,21 2,0510,13 2,1510,22

п = 30 а б с

гранулоцитов). В наших исследованиях регуляторной роли нейтрофильных фанулоцитон и продуктов их активации отчетливо проявляется данный оппозитиый э<|)фект при проведении сравнительного анализа изменения бласттрансформации лимфоцитов доноров и больных.

Наряду с этим, отмечено снижение положительного регуляторного эффекта зимозан-активированного супсрнатанта по сравнению с супернатантом иитактиых нейтрофилов в фуппах онкологических больных. Полученные данные, вероятно, являются результатом проявления двоякого действия зимозан-активированных нейтрофилов. С одной стороны, увеличивается выработка псрекисных радикалов (ОН-), угнетающих пролиферацию, с другой стороны, как уже указывалось выше, активация нейтрофилов стимулирует выработку ИЛ-1, усиливающего бластогенез (Симбирцев A.C., 1998; Маянский А.Н. и соавг., 1998). При развитии опухоли происходит перераспределение активирующей и супрессорной функций нейтрофилов с преобладанием первой, чем и объясняются более высокие показатели индекса стимуляции пролиферации у больных с онкопатологией над соответствующими показателями доноров.

В последней, третьей пробе добавление индометацина блокировало продукцию проетагландинов нейтрофилами. Было получено достоверное повышение бласттрансформации по сравнению с нулевой пробой. Следовательно, выработка проетагландинов в условиях злокачественного процесса является одним из основных механизмов депрессии пролиферативной активности Т- лимфоцитов.

Влияние супсрнатантов иитактиых и стимулированных нейтрофильных гранулоцитов на рецепцию ИЛ-2 лимфоцитами допоров ц больных

Согласно полученным результатам, показано снижение способности лимфоцитов у больных со злокачественными новообразованиями связывать экзогенный ИЛ-2 за счет уменьшения экспрессии ИЛ-2р при стимуляции всеми дозами митогена по сравнению с донорской фуппой. При язвенном процессе снижение данного параметра не достоверно. Используя в предыдущих экспериментах сурернатанты интактных и активированных нейтрофильных гранулоцитов было решено также изучить возможность их влияния на рецепцию ИЛ-2.

Исходя из. полученных данных, было установлено достоверное усиление рецепции ИЛ-2 в донорской группе при ко-сгимуляции лимфоцитов супернатантом интактных нейтрофилов (Таблица 17 ). Увеличение рецепции при ко-стимуляции супернатантом интактных нейтрофилов может характеризовать усиление экспрессии рецептора к ИЛ-2 именно на Т-сунрессорах и, следовательно, приводить к пролиферации последних, что и

подтверждается полученными данными об ингибируюшем цитотоксическую активность НКК, ЛАК и ЦТЛ эффекте в донорской группе.

Инкубация лимфоцитов с сунерндтантом не/профилов, стимулированных зимозаном приводила к снижению рецепции ИЛ-2 по сравнению с первой пробой (супернатант интактных нсйтрофилов) и незначительному, но достоверному уменьшению показателя восстановления относительно значений неходкой пробы Усилением генерации непрофильными лейкоцитами перекисных радикалов, супероксиданиона, которые наряду с литическим действием, способны угнетать многие функции иммунокомпетентных клеток, и объясняется снижение рецепции ИЛ-2 в данной пробе.

Сочетаиная стимуляция Т-личфоцитов доноров митогеном совместно с супернагангом индомстацин-обработанных гранулоцнтов не определялась какими-либо знлчтельнмми изменениями показателя восстановления рецепции ИЛ-2.

Рассматривая (руину пациентов с язвенной болезнью желудка, следует отметить изменение показателя восстановления, соответствующее таковым в донорской группе.

Рассмотрим далее способность связывать экзогенный ИЛ-2 лимфоцитами больных со злокачественными новообразованиями при их совместной инкубации с сумсрнатантами нейтрофилов. Сниженная способность лимфоцитов к рецепции ИЛ-2 в результате опухолевого процесса восстанавливалась при ко-стимудируюшем влиянии интактных нейтрофилов.

Восстановление способности Т-лимфоцитов связывать ИЛ-2 обуславливается несколькими механтмами. Нейтрофилы под действием опухолелссониированных антигенов усиливают продукцию таких цитокинов, как ИЛ-1, ИЛ-2, ФИО и т.д., при этом действие ИЛ-1 соответственно стимулирует экспрессию рецепторов к ИЛ-2.

Однако не следует забывать, что другие, также продуцируемые нейтрофнлами факторы могут влиять на снижение экспрессии рецепторов на иммуноцитах либо )д счет их интернализации, либо за счет их слущивания. Появление 1аких растворимых рецепторов отмечается при онкопатологиях, при этом они выступают в качестве ловушек для цитокинов, регулируя таким образом уровень цитокинового воздействия непосредственно на клетки. Представленные механизмы ингибирования рецепции экзогенного ИЛ-2 объясняют уменьшение рецепторной способности лимфоцитов под влиянием зимозан-активированных нейтрофилов по сравнению с интактными супернатантами.

Инкубация лимфоцитов с индомегацин-обработанным нейтрофнльным суперна танIом не приводила к изменениям способности Т-клеток связывать ИЛ-2. (1ок,1 >,.ч 1С.1И |х.'цсппии и обеих группах больных раком оставались па

уровне исходных значений. Вероятнее всего, здесь имеет место нлейотропное воздействие самого просгагландина, выражающееся в расщеплении направленности влияния. И как результат такого расщепления, мы регистрируем внешнюю неотвечаемость лимфоцита на регуляцию супернатантом индометацин-обработанных нейтрофилов. Хотя под видимой арсактивпостью возможно наличие множества перекрывающих друг друга в конечных проявлениях реакций.

В заключении, проведем сравнительный анализ влияния супернатантов на реакцию бластной трансформации и рецепцию ИЛ-2. Эти два параметра взаимосвязаны, так как возрастание рецепции ИЛ-2 ведег к активации лимфоцитов, а значит и к усилению пролиферации и, наоборот, увеличение пролиферативной активности лимфоцита при стимуляции митогеном выражается в образовании большего числа активированных Т-клеток и к усилению рецепции ИЛ-2. Однако при анализе полученных результатов было обнаружено расхождение направленности изменений показателей обеих функций. Так, в донорской группе влияние интактных нейтрофилов выражалось в ингибировании пролиферации Т-клеток, в то время как способность к рецепции наоборот активировалась . Зимозан-стнмудированные нейтрофильные супернатанты осуществляли негативную регуляцию обеих функций, тогда как действие индометацин-обработанного супернатанта нейтрофилов не вызывала изменения показателей обеих изучаемых функций в донорской группе. Отсутствие патологического процесса требует сохранения всех функций иммуноцитов в определенных границах, что и наблюдается в эксперименте.

Среди пациентов со злокачественными опухолями желудка и прямой кишки происходит однонаправленное изменение параметров РБТЛ и рецепции ИЛ-2, воздействие интактных нейтрофилов способствует усилению пролиферации и рецепции . Можно сделать вывод, что регуляция происходит по одному и тому же механизму, то есть активация ТСИ., последующая ко-активация адгезивных молекул, влияющих на поверхностную перестройку рецепторов лимфоцитов, что приводит к усилению экспрессии ИЛ-2Р, активации Т-лимфоцитов и стимуляции их пролиферативной активности.

Влшпше супернатантов интактных и митоген-стнмулированных лимфоцитов на цитотоксичность нейтрофилов

Исследования были бы незаконченными без определения возможного обратного влияния популяции лимфоцитов на полиморфноядерные лейкоциты.

С этой целью лимфоциты, выделенные из периферической крови , помещали в культуральную среду, не содержащую митоген (ФГА) - проба А; содержащую ФГА в концентрации 5,0 мкг/.мл - проба В; с концентрацией

митогена 10,0 мкг/мл - проба С. Лимфоциты инкубировали в течение 12 часов.. Полученные супернатанты добавляли к свежевыделенным нейтрофилам, как интактным, так и обработанным зимозаном и индометацином , инкубировали в течение 2 часов. Затем определяли функциональную активность нейтрофилов в цитотоксическом тесге по отношению к ЕКК-чувствительной и ЕКК-резнстентной линиям мишеней

Полученные данные свидетельствуют о наличии влияния лимфоцитов на нейтрофильные гранулоциты, которое опосредуется выработкой ряда цнтокинов. Наличие на Т-лимфоцитах и нейтрофилах гомологичных поверхностных рецепторов также свидетельствует о вероятности межклеточного взаимодействия с помощью рецепторного аппарата. Результаты указывают на то, что супернатанты интактпых и митоген-стимулированных лимфоцитов ( в обеих дозах) оказывали положительную регуляцию на цитотоксическую активность нейтрсфильных гранулоцитов доноров в отношении чувствительной мишепия ОЯ.

В условиях здорового ор)анизма обработка гранулоцитов зимозлном оказывала отрицательное влияние, а индометацин практически не оказывал воздействия на цитотоксичность нейтрофилов. Однако добавление второго активационного сигнала в виде гуморальных факторов, продуцируемых лимфоцитами включает в действие прайминг-эффект, характеризующийся увеличением уровня и скорости активации нейтрофилов, отсюда и значительное повышение показателя цитотокснчности данных клеток. Обработка лимфоцитов доноров ФГА в дозе 5,0 мкг/мл также выражалась достоверным увеличением литического потенциала всех исследуемых проб нейтрофилов по сравнению с исходными показателями. Ожидалось, что супсрнатант митогенобработанных лимфоцитов окажет большее влияние на функциональные свойства нейтрофилов, нежели интактные лимфоциты. Однако уровень положительной регуляции в обоих рассматриваемых случаях был практически одинаковым. В данном случае играет определенную роль плейотропное действие самого митогена на лимфоциты. С одной стороны, ФГ А потенцинрует экспрессию поверхностных рецепторов к ИЛ-2 на лимфоцитах и таким образом способствует их пролиферации и секреции ими гормонов и медиаторов, которые активируют нейтрофилы. Однако с другой стороны, установленным является факт преимущественной пролиферации в пуле Т-лимфоцитов клеток с супрессорным фенотипом, именно под действием ФГА. Следовательно, происходит частичное погашение активаторной функции Т-лимфоцитов за счет возрастания количества Т-супрессоров. При этом факторы, продуцируемые супрессорным и клетками, сами по себе также являются вторичным триггером и в определенной степени также влияют на функциональные свойства нейтрофилов. Реакции, ограничивающие чрезмерную активацию, необходимы

Таблица 17.

Способность лимфоцитов доноров и больных, инкубированных с нейтрофильными супернатантами связывать на своей поверхности ИЛ-2

№ Диагноз Индекс восстановления (отн.ед.) без супр-та + суп-т инт. + суп-т зим. + суп. инд. (а) нф. (б) акт.нф.(с) обр.нф.(д)

1. Доноры п=30 2,79±0,23 р 1-з<0,01 3,4410,18 р 1-220,05 2,0210,14 р а-с20,01 р 1-220,05 2,810,21 р с-д20,01 р м<0,01

2. Язвенная боЛезнь п=30 2,25±0,24 р 2-320,01 р 2-420,05 2,810,2 р 2-420,05 1,3210,11 р а-с20,01 2,9810,23 р с-д20,01 р а-д20,05

3. Рак желудка п=30 1,13±0,12 2,5510,25 р |-з<0,05 0,9610,11 р 1-320,01 р б-с<0,01 1,1310,24 р 2-320,01 р б-д<0,01

4. Рак прямой кишки п=30 1,4510,22 р 1-420,01 2,2710,18 р 1-420,01 ра-620,01 1,2910,14 р 1-420,01 Р б-с20,01 1,7610,22 р 1-420,01 р 2-420,01 р б-д20,01

Таблица 18.

Изменение цитотоксичности интактных и стимулированных нейтрофилов больных раком желудка в отношении мишени ОЯ при их инкубации с

Индекс цитотоксичности (%)

Проба Интакт.нф. (а) Зим.акт. нф.(б) Инд.обр. нф. (в)

1. Без инкуб-ции с лимф-ми 41,312,04 28,1312,56 35,212,17

2. + суп-т интак. лим-тов 41,112,36 41,413,2 30,312,48

3. + суп-т ФГА-стимуллф. (5,0 мкг/мл) 51,512,74 48,012,61 40,812,11

4. + суп-т ФГА-стим.лф. (10,0 мкг/мл) 36,212,17 38,512,14 32,0613,01 ; ..

Р п=35 р 1-320,05 р 1а-б20,01 р 1-220,01 р 1-320,01 р 1-420,05 р 1б-в<0,05 р 2-320,05 р 3-420,05

для обеспечения сбалансированного функционирования клеточных популяций в условиях нормы.

Показательно, что инкубирование лимфоцитов с высокой дозой митогена (10,0 мкг/мл) не выражалось сохранением стимулирующего влияния на активность нейтрофилов. Необходимо уточнить, что цитотоксичность нейтрофилов в данной пробе была все же выше, чем исходные значения, но ниже, чем после обработки супернатантом интактных лимфоцитов и обработанных средней дозой митогена. Определено, что умеренные концентрации митогена до 8,0-10,0 мкг/мл вызывают ди(|х{>еренцировку ,и пролиферацию клеток, однако применение более высоких концентрации (свыше 10,0 мкг/мл) прекращают данные процессы .

Ингибирующий эффект супернатантна лимфоцитов, активированных высокой доюй митогена, составлял 16,7% при сравнении с влиянием супернатанта интактных лимфоцитов и лимфоцитов, обработанных умеренной дозой митогена, Супрессорное воздействие на зимозан-обработанные нейтрофильные гранулоциты уже составляло 20,6% , но максимальным оно было для индометацин-обработанных нейтрофилов -38,2%.

В предыдущих главах было указано на необходимость в условиях нормы существования механизмов, ограничивающих функциональную активность клеток, была показана способность нейтрофильных гранулоцитов оказывать подобного рода влияние. Логично было бы предположить, что и функциональные свойства нейтрофилов должны быть под определенным контролем со стороны друг их популяций иммунокомпетентных клеток. Ингибирующий э<}х))ект супернатантна лимфоцитов, активированных высокой доюй митогена, составлял 16,7% при сравнении с влиянием супернатанта интактных лимфоцитов и лимфоцитов, обработанных умеренной дозой ми имена. Супрессорное воздействие на зимозан-обработанные нейтрофильные гранулоциты уже составляло 20,6% , но максимальным оно было для индометацин-обработанных нейтрофилов -38,2%.

Рассмотрим далее изменения функциональных свойств нейтрофильных фанулоцитов в группах больных злокачественными новообразованиями (Таблица 1<У). Исследование влияния супернатанта интактных лимфоцитов на не стимулированные иейтрофилы уже не сопровождалось значительным усилением киллерной активности микрофагов. Показатели индекса цитотоксичности нейтрофилов в опытах с ЕКК-чувствителыюй и ЕКК-резистентной линиями мишеней практически не отличались от исходных значений. Г)ти результаты были получены в обеих фуппах больных. Такое повышение обусловлено исходно низкими значениями показателя ципчоксичности. По-видимому, митогенный стимул вызывает эффект

экранирования нейтрофилов от повреждающего действия радикальных форм и, следовательно, увеличение показателя лизиса.

Уровень лизиса индометацин- обработанных фагоцитов при их обработке супернагантом интактных лимфоцитов также остается без видимых изменений. При развитии злокачественного процесса лимфоциты активно участвуют в формировании противоопухолевого иммунитета. При этом происходит резкое увеличение образования циготоксических лимфоцитов, которые практически не секретируют. Стремительный расход цитотоксических клеток требует их пополнения, однако при дальнейшем прогрессировании опухолевого роста это становится трудновьшолнимой задачей. Также формирование лимфоцитов с супрессорным фенотипом и секреция ими супрессорных медиаторов приводит к тому, что супернатант интактных лимфоцитов больных в отличие от донорской группы уже либо не содержит медиаторов, активирующих нейтрофилы, либо их влияние перекрывается действием супрессорных компонентов.

При этом супернатант ФГА-обработанных лимфоцитов ( в дозе 5,0 мкг/мл) сохранял активирующее влияние на нейтрофилы в обеих группах больных раком и в случаях использования обеих мишеней.

Циготоксичность зимозан-активированных нейтрофилов также увеличивалась под действием супернатанта митоген-обработанных лимфоцитов, но не столь значительно, как в предыдущей пробе. Однако активные формы кислорода, образующиеся при обработке фагоцитов зимозаном, повреждают рецепторы и вызывают, таким образом, нарушение связывания молекул адгезии.

В пробах с индомстацин-обработанными гранулоцитами активация цитогоксичности под влиянием супернатантов ФГА-обработанных лимфоцитов составила 25,7% и 15,5% при раке желудка и прямой кишки..

Ответ гранулоцитов на супернатанты лимфоцитов, обработанных высокими дозами митогена, в обеих группах больных и при использовании обоих видов опухолевых клеток выражался снижением функциональных свойств нейтрофилов до уровней исходных показателей.

В опытах с ЕКК резистентной мишенью параметры цитогоксичности. нейтрофилов при их совместной инкубации с супернатантами лимфоцитов характеризовались той же направленностью изменений, что и в Опытах с ЕКК-чувствительной линией мишени .

Таким образом, проведенные опыты подтвердили наличие регуляции цитотоксичности нейтрофилов популяцией лимфоцитов, которая осуществлтется цитокинами. Действие самих цнтокинов реализуется посредством рецепторов, расположенных на поверхности иммуно-компетоггных клеток. Многие повторяющиеся активности различных

циюкинов снизаны с использованием общих субьединиц рецептора, то1дл как специфичность и уникальность их дейетия обусловлена другими частями межкомпонентных репешорон. Отсукчвне цитокиноиич рецешорон ни клегках или модификация их экспрессии в результате воздействия каких-либо агентов приводят к и тиснению функциональных свойств иммунных клекж или же способствуют развитию паюло! ическо! о процесса.

ныкоды

I. Цигоюксические популяции лимфоцитов местного и системною иммуншета ( ест ее 1 венные киллерные клетки, лимфокин-актинироиаини^ киллеры и цитогоксические Т-лимфоциты) сохраняют пока «пели лиIнческих свойств на уровне донорских значений при рашитии ятенной бииемш желудка, тогда как при злокачественных новообраюнаннях происходит ранионапраяиснное по показателям цитотоксичности снижение киллерных свойств изученных популяций эффекторов. 2 Естественные киллерные клегки проявляли способность к киллннгу аугологичных опухолевых клеток, практически одинаковую по индексу цитотоксичности с показателями лизиса в отношении ККК-чувстншедьнон линии опухолевых клеток.

3. Пока ип ель лижческих свойств личфокии-активированных киллерон по отношению к аутолошчным опухолевым клеткам был сравним по своей величине с ни го токсичностью ЛАК клеток против ЕКК-резистентнон линии клеток-мишеней.

4. Блокирование синтеза простапшнлинов стимулировало функции естественных киллерных клеток, ЛАК и Ц'ГЛ при язвенной болезни желудка, чк> укай,тает на особую регуляториую роль простагландинов при данной патологии.

5. Циэотоксичность нейтрофильных фанулоиитов в отношении классических и аутшогичных линий опухолевых клеток по' средним значениям адекватна ечннветовуюшим показателям естественных киллерных клеток. При язвенной болезни желудка показатели цитотоксичности нейтрофнлов сохранякися на уровне средних значений донорской (руины, а при ранштии опухолевого процесса литичсскис свойства нейтрофильных фанулоцнтов активируются, что выражается в увеличении их индекса цитотоксичности по сравнению с донорами.

6. Супернатанты интактных и активированных нейтрофилов доноров и больных язвой желудка офаничивапи лизис ЕКК и ЛАК, тогда как у больных раком желудка и прямой кишки супернатанты интактных нейтрофилов стимулировали пониженную цитотоксичность изученных 'х{х|к:кторных популяций иммуноцитов. При злокачественном росте происходит переключение регуляторной способности нейтрофилов в

отношении цитотоксических субпопуляций лимфоцитов с ограничивающей на стимулирующую.

7. Логические свойства цитотоксических Т-лимфоцитов доноров не изменялись при воздействии сунернатантов интактных и стимулированных нейтрофилов, а при язвенной болезни, раке желудка и прямой кишки показатели цитотоксической активности данных эффекторов повышались по сравнению с показателями исходной пробы, тогда как для ЕКК и ЛАК клеток стимуляция лизиса наблюдалась только в группе пациентов со злокачественными новообразованиями.

8. Супсрнатанты интактньгх и стимулированных нейтрофидов снижали пролиферативный ответ лимфоцитов донорской группы, при этом добавление супсрнатанта интактных нейтрофилов к лимфоцитам больных со зло'.ачественным процессом сопровождалось значительным повышением индекса стимуляции пролиферации, в то время как супсрнатанты активированных гранулоцитов таких свойств не проявляли.

9. В донорской группе наблюдалось достоверное усиление рецепции ИЛ-2 при ко-стимуляции лимфоцитов супернагантом интактных нейтрофилов. Ингибированная в результате опухолевого роста рецепция ИЛ-2 лимфоцитами больных раком обеих изученных локализаций восстанавливаюсь под влиянием супернатаитов интактных нейтрофилов, однако сунернатанты активированных гранулоцитов такой способностью не обладали.

10. Характер гуморальной регуляции лимфоцитами цитотоксичности нейтрофильных лейкоцитов зависит от исходного состояния фагоцитов, степени активации лимфоцитов и различается в условиях нормы, при раке желудка и прямой кишки:

• супернатанты интактных лимфоцитов активируют цитотоксичность нейтрофилов доноров, тогда как в группе больных раком желудка и прямой кишки данный эффектг отсутствует.

• Супернатанты ФГА-стимулированных лимфоцитов в дозе 5,0 мкг/мл способствовали повышению литических свойств нейтрофилов как у доноров, так и у больных раком. _ ;

• Супернатанты лимфоцитов, обработанных высокими дозами митогена (10 мкг/мл) снижали показатели цитотоксичности нейтрофильных гранулоцитов в контроле и во всех опытных группах .

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Сапаров A.C., Булсгенова М.Г., Джумагулова А.Б. Активность естественных киллеров и ЛАК-клеток при предраке и раке желудка // Материалы научно-

практической конференции «Нутрициональные аспекты проблемы «Экология и здоровье», Ургенч, 1991,- С.254-256.

2. Сапаров A.C., Булегенова М.Г., Джумагулова А.Б..Сексенбаев Б Д. Естественная киллерная и лимфокип-активированная активность инграэпителнальных лимфоцитов и лимфоцитов собственной пластинки желудка у больных раком желудка // Материалы Междун.симпозиума по аллергологии и клин, иммунологии, Алма-Ата, 1992.-С.266.

3. Булегенова М.Г., Сапаров А С , Джумагулова A.B., Сексенбаев Б Д. Влияние кисломолочных продуктов на основе кобыльего молока на цитотоксичность естественных киллеров и синтез у-интерферона в эксперименте in vitro U Материалы научной конференции с междун. участием «Региональные проблемы питания», Алма-Ата, 1992,- С.21.

4. Джумагулова А.Б., Булегенова М.Г., Сапаров A.C., Тимофеева И.К., Сексенбаев Б.Д. Вдияиие различных штаммов кисломолочных бактерий на активность естественных киллеров в эксперименте in vitro // Материалы научной конф с междун. участием «Региональные проблемы питания», Алма-Ата, 1992-С.24.

5. Булегенова М.Г., Джумагулова А.Б., Сапаров A.C., Даутбаев Е.К. Особенности изменения активности киллерных субпопуляций лимфоцитов локального иммунитета у больных раком желудка // Патоморфологнческие основы иммунных дисфункций. КазИУВ, Алматьг, I993.-C.25.

6. Джумагулова А.Б., Булегенова М.Г., Сапаров A.C., Даутбаев Е.К., Калиева Н.А Функциональная активность Г: К К и продукция интерферона в месте локатизлции опухоли у больных раком желудка // Патоморфологнческие основы иммунных дисфункций. КазИУВ, Алмазы,1993.-С.31.

7. Сапаров АС., Цой И.Г., Джумагулова А.Б., Булегенова М.Г., Тимофеева И.К., Сексенбаев Б.Д. Влияние кисломолочных бактерий на активность ЕКК и продукцию у-интерферона // Здравоохранение Казахстана, 1994.-№1 .-С.44-46.

8. Сапаров A.C., Цой И.Г., Булегенова М.Г., Джумагулова А.Б., Сексенбаев Б Д., Даутбаев Е.К. Функция естественных киллеров и ЛАК клеток местного и системного иммунитета при раке желудка // Известия АН PK, сер.биол,-1993.-3.-С.77-81.

9. Сапаров АС, Булегенова М.Г., Джумагулова А.Б., Калиева H.A. Интерферон-продуцируюгцая способность лимфоцитов и естественная киллерная активность при действии кисломолочных бактерий // В кн. «Медико-биологические аспекты разработки продуктов питания», Киев, Наукова Думка, 1993,- С.7-10.

10. Сапаров A.C., Булегенова М.Г., Джумагулова А.Б., Сексенбаев Б Д. Функциональная активность субпопуляций локального, и системного иммунитета при раке и язвенной болезни желудка// Иммунология, 1994 - 4 -С.43-45.

4f>

11.Сапаров A.C., Тимофеева И.К., Джумагулова А.Б., Булегенова Ml"., Сексепбаев Б Д. Иммуномодулируюшее действие лактобактсрий па цнюнжсичности НКК и продукцию интерферона // ЖМЭИ, I994 - 6,- С. 112114.

12. Булегенова М.Г., Даугбаев F..К., Сапаров A.C., Цой И Г. Сравнительный анализ функциональной активности эффекторных субнонуляций ;1им(|н)цитов местного и системного иммунитета у больных раком желудка // В кн. «Вопросы питания и регуляция гомеосгаза», выпуск 4, Душанбе, 19%.- С.124-132.

13. Медведе кий С.М., Талбаев Т.Д., Подобед И.С., Булегенова М.Г., Сахарова В.Ю. Исследование свойств синтетических пептидов, соответствующих некоторым фрагментам стафилококкового энтсротоксина Л (ОЛ).-Алматы. (Дсп. В Казгос ИНТИ,1б. 1096, №7903 - Ка97(12).

14. Цой И.Г., Булегенова М.Г'., Джумагулова Л.Б., Сапаров A.C. Интсрферон-иродуцнрующая способность и естественная киллерная активность лимфоцитов местного и системного иммунитета при язвенной болезни и раке желудка // Иммунология, 1997.-6,- С.40-43.

15. Булегенова М.Г., Избасарова С.К., Цой И.Г., Мустафаев Т.У., Стамкулов Т.Т. Влияние продуктов активации нейтрофилов на цитотоксическую функцию ГКК при язвенной болезни желудка, раке пищевода и желудка // Известия AM PK, сер.биол - 1997.-1.-С.27-31.

16. Избасарова С.К., Булегенова М.Г., Цой И.Г., Мадьяров В.М., Турекеев Б.А. Окислительный метаболизм нейтрофилов при онкологической патологии желудочно-кишечного тракта // Здравоохранение Казахстана, 1997.-10.-С.51-54.

17. Булегенова М.Г., Цой И.Г., Избасарова С.К., Даутбаев Е.К. Количественно-функциональные различия параметров цитотоксических механизмов при предраковых и раковых заболеваниях верхних отделов ЖКТ // Материалы научно-практич. конференции «Актуальные проблемы лабораторной медицины», Алматы, 1997,-С. 15.

18.Булегенова М.Г., Цой И.Г., Избасарова С.К. Регуляторная роль нейтрофилов в отношении пролиферативной активности лимфоцитов // Среднеазиатский медицинский журнал, 1997,- 3(6).-С.22-25.

19. Булегенова М.Г., Избасарова С.К., Цой И.Г., Синявский Ю.А. Кисломолочные продукты и противоопухолевый иммунитет // Клиницист; 1997.-3 .-С. 16-19.

20.Булегенова М.Г., Цой И.Г., Избасарова С.К. Коррекция цитотоксической активности лимфоцитов и продукции интерферона новыми видами кисломолочных продуктов // Intern.Joumal of Immunoreabilitation, 1997.-4,-Р.147.

21.Избасарова С.К., Булегенова М.Г., Мустафаев Т.У., Турекеев Б.А. Сравнительная характеристика изменений функциональной активности нейтрофилов при злокачественных новообразованиях ЖКТ различной

локализации // 1-й конгресс медработников республики Таджикистан «Медицина и здоровье», Душанбе, 1997.-С.66.

22.1>уле1енова М.Г., Избасарова С.К., Стамкулов ТТ., Цон И.Г., Турекееи Б.Л. Регуляция функциональной активности Т-лимфоцитов нейтрофнльными лейкоцитами при раке ЖКТ // Съезд онкологов Таджикистана, Душанбе, 1997 -С.38.

23.Булегенова М.Г., Избасарова С.К., Цой И.Г., Стамкулов Т.Т. Изучение влияния продуктов активации нейтрофнлов на функциональную активное!ь киллерных клеток у больных раком прямой кишки // 1-й конгресс медработников республики Таджикистан «Медицина и здоровье», Душанбе, I997.-C.37.

24.Булегенова М Г., Цой И.Г'., Быкыбаева С.Л., Стамкулов ТТ., Турекеев Б.Л. Участие нейгрофилов в продуктов их активации в регуляции бластогенсза лимфоцитов у больных раком прямой кишки // Акмолинский медицинский журнал, 1998.-2.-С.32-35.

25.Буле! снова М.Г., Цой И.Г., Стамкулов Т.Т. Секреция и рецепция ИЛ-2 при раке прямой кишки // IV Междунар. Кошресс «Медицина и иммуно-реабилитация», Сочи, 1998,-С.147.

26 Булегснова М.Г., И)басарова С.К , Стамкулов Т Т., Турекеев Б.А. Изучение влияния стимулированных нейтрофнлов на пролиферацию лимфоцитов больных злокачественными новообразованиями ЖКТ // О кн. «Актуальные вопросы современной онкологии», Бишкек, 1998,- С.20&-211.

27.Булегснова М.Г, Цой И.Г., Калкуяова Б.Б., Быкыбаева С.А , Каракулова А.Р. Характер действия продуктов активированных нейтрофнлов на нроли<[к;рацию лимфжитов и рецепцию ИЛ-2 при язвенной болезни и раке желудка//Акмолинский медицинский журнал, 1998.-3.-С.31-34.

28.Булегснова М.Г, Цой И.Г. Проблемные аспекты противоопухолевого иммунитета органов желудочно-кншесного тракта // В сб.»Актуальные вопросы нутрициологии, 1998.-вьш.1.-С.207-213.

29. Нуле/снова М.Г. Регуляторная роль нейтрофнльных грану лоци гов в отношении основных цитотоксических субпопуляций лимфоцитов у больных раком прямой кишки // Материалы 1-й международной конференции но проблемам формирования здорового образа жизни в рамках стратегии «Казахстан-2030», Астана,1998,- С.233.

30.Быкыбаева СЛ., Булегенова М.Г., Стамкулов Т.Т. Изучение влияния супсрантигснов на функциональную активность ЕКК у больных раком прямой кишки // Там же, С.234.

ЗГКалкулова Б.Б. , Булегенова М.Г., Каракулова А.Р., Турекеев Б.А. Сравнительная характеристика изменений иитотоксической активности клеточного звена противоопухолевого иммунитета при злокачественных новообразованиях ЖКТ различной локализации // Там же, С.256.

32.Калкулова Б.Б., Булегенова М.Г. Влияние нейтрофнлов и продуктов их активации на цитотоксическую активность естественных киллерных клеток

Н V-! Между«, конгресс «Реабилитация в медицине и иммунореа-билитация», Тенерифе, Испания, 1999-С. 148.

ЗЗ.Быкыбаева С.Д., Будегенова М.Г. Исследование влияния стафилококковых энтеротоксинов А,В и их синтетических аналогов на бластогенсз лимфоцитов больных раком прямой кишки //Там же, С. 149.

Bulugenova Minira Guseinovna

Interaction of the cell cytotoxical immune mechanisms in patients with malignancy of the different organs of digestive tract

Dissertation for conferment of doctor's degree of medical science 14.00.36/- allegology and immunology

Resume

In this investigation was studied the depression of the functional activity of tho cytotoxic populations, especially of local immune system, in tlie presence of tumor. Despite the fact of the inhibition the main cytotoxic cells NK.LAK maintained capacity to kill aytologic tumor cells. Neutropfil supcrnatants limit cytotoxic function of effector cells in donors, but stimulated them in patients with cancer. So, the opposite fuction of neutrophils was determined.

Neutrophil granulocytes showed the cytotoxic activity against either the standart species or aytologic tumor cells. The paramètres of lysis in patients with stomach ulcer were not significantly differ from those in donors, although in presence of malignancy, the fuctional activity of neutrophils increased sharply.

The capacity of T-cells to proliferate "were depressed in patients with tumor, but incubation with supematnns of the neutrophils restored histogenesis, that is indicated on the reversion of this function of T-cells.

'Hie capacity of T-lyniphocytes to chain on their surface II,-2 was also decreased during the malignancy and only supcrnatants of intact neutrophils assisted to enhance reception of 1L-2, whereas supcrnatants of activated granulocytes were not able to do that.

The influence of intact and mitogen-stimulated lymphocytes on the lytic activity of neutrophils was determined. Supernatant of lymphocytes stimulated by average dose of mitogen increased cytotoxic function of neutrophils, whereas the high doses of mitogen acted as negative signal.

Белегенова Минира Гусейн-кызы

«1шск- »угры к жолдарыны^ ксйГ)1р органдарында 1$атерл1 ескш пайда бодганда клеткалы^ цитотоксикалы^мсхпнизмдерти}эрекетгесуп>

Медицина гылымдарыиыцдокторы гылыми дэретесж алу уин'н усынылган

диссертация

14.00.36 - аллергология мен иммунология ТУЖЫРЫМ

Усынылган жумыста ас^азан мен тж ¡шекте $атерл1 ескт пайда болгаи ксз|'нде Гмр жерлж жэне жуйелж иммунитет клеткалары цитотоксикальи^ популяцияларыны»$ функционалы^ белсендштни^ депрессиясы керсеп'лген. Г.КК мен Лак-тьн^ аутологияльп^ 1С1К клеткапарына $арай лизис кабшеттиип аньп^гатган. Нейтрофиддер супернатанты эффекторлар цитотоксикалыгына доиорлы^ гобыида ^ысым кврсеткеи, ал ас^азаи мен тек ¡шекте 1^гтерш ¡еж болган жагдайда - дем берген.

Нейгрофилдж гранулоциттер аутологияльп^ гак клеткалары мен кпассикапык, клетка-нысакаларды лизис ету жекпще кврнекп ^бтетш бглдфген. Ас^зан ойы£ жаралы болганда нейтрофил цитотоксикалыгы донорльи^ тобына ^зраганда айтарльл^ айырмашыльп^ керсетпсгсн, ал обыр ауруы жагдайында бул керсетю'ш жогарылаган.

Т-клсткалардьи^ пролиферация ^бие-п ас^заи мен -пк инек обыр ауру болганда депрёссияга ушырагаи, 61'рак, нейтрофил супериатаиттары лимфоцитгердн^ бершген функциясыи (^йта калпына келпргсн-бул Т-клеткаларды^ бластыль:^ трансформациям бузылуыньп^ крйтымдылыгын кврсетедт

Лимфоциттерд'и1, вз сыртына Ш1-2 байластыру ^абшетз ^терл! процесс кез('нде 1$ысымгак ушырагаи, тишмегеи нейтрофил супернатаитыньи^. эсер» иэтижесисде ^алпына келген, ал белсендщенне болмаган.

Тшлмегеи жэне митоген-стимулдадаан лимфоцит супериатаиттары ньп^ нейтрофил цитотоксилыгына к^рай реттеутш poлi аны^галган.