Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Использование бета-каротина для иммунокоррекции при комбинированной терапии злокачественных новообразований

рт Ь У»

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МШГОНСКИХ НАУК ОНКОЛОГИЧЕСКИ! НАУЧНЫЙ ЦЕ!ТР им. Н.Н.БЛОЙ/МА

На правах рукописи УДК 616-006.04-059-09Т

РАМАНАУСКАПТЕ РЕГИНА ЮОЗАПОВНА

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БЕТА-КАРОТИНА ДЛЯ ИШУНОКОРР2КШШ ПРИ КОМБИНИРОВАННОЙ ТЕРАПИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАХВАНИП

специальность 14.00.14 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой стегони кандидата медицинских наук

М')ГКГ:Я. 1934

<?/ и 1 ' /

Работе выполнена в Онкологическом Научном Центре им.Н.Н.Блохина Российской Академии Медицинских Наук (директор - академик РАМН Н.Н.Трапезников)

Научный руководитель: доктор медицинских наук'А.В.Сергеев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Ю.В.Букин доктор медицинских наук, профессор Б.С.Утешав

Ведущее учреждение - Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А.Герцена МЗ РФ

Защита состоится " 3? " 1994 г. в 1Ъ часов

на заседании Спзцглхдзгроаанвого совета К.001.17.01. Онкологического Езучнолэ центра ем. Н.Н.Евохина РАШ {Цзсква, 12547В, Кширское воссо. 24)

С диссертацией ксето ознакомиться в ОиОлпотеке Онкологического научного центра пи. Н.Н.Блохнна РАШ

Автореферат разослан * Ъ • QK.T9 G|>9 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного совета доктор медицинских наук, профессор

В.С.Турусов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одним из побочных эффектов радио- и химиотерапии злокачественных новообразований является ослабление иммунологической резистентности организма вследствие токсического воздействия этих видов лечения на функциональную активность иммунокомлетентных клеток (Кадэгидзе З.Г., 1977; В1aglow J.E. et al.. 1992; Cronle L., 1992; Franklin R.A. et al., 1993).

Решение проблемы снятия иммунотоксичлости облучения и цитостатиков значительно зависит от поиска и подбора стимуляторов, способных активировать клеточный и гуморальный иммунитет.

3 последнее время накапливаются данные об отчетливом ■ иммуностимулирующем действии бета-каротина, - широко распространенном в природе растительном пигменте и з ряде случаев являющемся метаболическим предшественником ретинола. Воздействие бета-каротина на функциональную активность иммунокомпетентшх клеток во многом основано на антиоксидантных свойствах этого Еещества, проявляющихся снижением иммунотоксичности свободных радикалов и перекисных соединений (Burton G.M. et al., 1984; Zhang L.X. et al.,1991), образующихся при росте опухоли, воздействии облучения, применении некоторых цитостатиков (Tsuchlga et al.,1991), а также способности водорастворимых фор:.: этого каротиноида самостоятельно проникать . в клетку и модифицировать внутриклеточный метаболизм ли.фоцитов (Warner W.G. et al., 1993).

Проникая в клеточные, межклеточные и субклеточные структуры, ' бета-каротин активирует иммунную систему человека и зсиеотных на уровне лимфоидных органов и созревания лимфоцитов (Seirter E.G. et al., 1.981), клеточного (Alexander M. et al., 19S5)' и гуморального иммунитета (Буюклинская О.В., 1992), а также Фагоцитарных функций макрофагов и нейтрофилов (Gruner S. et al., 1986), приводя в некоторых с.г-,чаях к торможению роста опухоли вследствие усиления процесса генерации противоопухолевых киллеров (Tomlta Y. et al., 198T).

По последним данным, воздействие бета-каротина на иммунную систему осуществляется сразу после активации Т-лимфоцитоь, моноцитов и Ж-клеток, а не на ранних этапах клеточной, дифференцировки (Abr.ll E.R. et al., 1984) и сопровождается усилением экспрессии этими «летками мембранных р-зцептороп для

распознавания антигена н высвобовдением лигаадных производных (простагландина и лейкотриенов), обладавдих иммуномодулируодими свойствами (Bendich А., 1989). Стимулирующее влияние бета-каротина, можно объяснить, по-видимому, особенностями структуры молекулы этого каротиноида и лишь частично оно может быть связано с конверсией бета-каротина в ретинол (Rundhaug J.E. et al., 1988). Имеющиеся данные по иммунофзрмакологии и фармакокинетике при однократном и многократном приеме препарата относительно здоровыми людьми и онкологическими больными позволяют сделать вывод, что в повышвшша дозах (до 200 isr) лвтв-кярптин может рассматриваться как нетоксичный иммуномодулятор, однако, необходимы дальнейшие исследования возможности использования для этих целей меньших доз (Сергеев A.B. и др., 1992).

Цаль и задачи исследования. Целью исследования являлось изучение возможности использования бета-каротина в качестве имму номо ду лиру ще го препарата в схемах экспериментальной химиотерапии опухолей- у животных, а также в период предоперационного гамма-облучения больных раком толстой кишки.

В ходе работы были поставлены следующие задачи;

1. изучение действия бета-каротина ka показатели клеточного иммунитета нормальных мышей;

2. оценка влияния бета-каротина на реакции клеточного иммунитета при экспериментальной хвшютерашп злокачественных новообразований;

3. определение Еыыунокогичо ского с антвоксвдавтного ста ту coa больных раком толстой квакл. влияние на бтп пазвззтехз предоперационного гамма-облучения. проведанного ез Ссез иммунокоррекции бета-каротином."

Научная новизна работы. Описана стимуляция бета-каротинв вффекторных популяций лимфоцитов в сочетании о дозозавнсашын снижением Т-клеточной супрессии на модели активации клеточного иммунитета у мышей введением аллоантигена.

На двух моделях роста опухоли In vivo (клетки лимфолейкоза EL-4r введенииэ интраперитонеально; аденокарцинома яичников CaOv, имплантированная под капсулу почки) при проведении химиотерапии (циклофэсфан, араноза, метотрексат, адриамицин) на фоне иммунокоррекции показано усиление бета-каротином пролиферативного ответа лимфоцитов на конкэнавалин А и возрастание активности специфических противоопухолевых Т-киллеров, коррелировавшие с

б

увеличением средней продолжительности жизни животных-опухоленосителей и торможением роста опухоли.

Впервые проведено изучение иммунологического и антиоксидантного статусов Сольных раком толстой кишки, а также изменение показателей при проведении курса дистанционной гамма-терапии и назначении препарата бета-каротина. После курса иммунокоррекции у больных отмечена стимуляция функциональной активности лимфоцитов на фоне снижения эндогенной супрессии; уменьшение концентрации малонового диальдегида в плазме крови и увеличение активности каталазы.

Практическая значимость. Работа выполнена в рамках программы ГКНТ СССР 02.03.03. "Разработать препараты, обладающие антиканцерогенным действием".

Данные клинических исследований, являющиеся логическим продолжением проведенной нами экспериментальной работы, являются обосновыванием рекомендаций по применению бета-каротина (суточная доза 30 мг) в качестве нетоксичного иммуномодулиругацего агента в период предоперационного гамма-облучениия онкологических больных, а также в группах населения, подвергающихся повышенным радиационным нагрузкам.

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на Ученом Совете НШ ЭДиТО ОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН (апрель 1994), а также на Международном симпозиуме "Каротиноиды в онкологии" (Москва, 1992), Международной конференции . "Антиоксидант" "(Москва, 1992), II Международной конференции "Химиопрофилактика рака" (Берлин, 1993), . XVI Международном противораковом конгрессе ХНыьДели, 1994).

Публикации. Результаты исследований, рассмотренных в диссертации, изложены в 5 публикациях, приведенных в конце автореферата.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, методического раздела, 4 глав, включающих результаты собственных исследований и их обсуждение, заключения, выводов. В тексте содержится 150 ссылок на зарубежные и отечественные источники. Работа излояена на 115 страницах машинописного текста, включая 15 рисунков, 1j таблиц, 4 схемы.

Выражаю искреннюю признательность доктору биологических наук

И.Ф.Аброниной за постоянную консультацию и критические замечания, высказанные во время выполнения работы и при обсуждении результатов исследования.

Список сокращений; ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота; Кон А - конканавалин А, МДА - малоновый диальдегид, Мит С - митомицин С, МКАТ - моноклоналъные антитела, МНК - мононуклеарные клетки, ПОЛ - перекисное окисление липидов, РБТЛ - реакция бласттрансформации лимфоцитов, РТК - рак толстой кишки, СКЛ -смешанная культура лимфоцитов, СОД - супероксиддисмутаза, ТЭС -т^чячья эмбриональная сыворотка, i-ГА - ф;;тогс1:ггглгтинин.

\

МАТЕР/АЛЫ И МЕТОДЫ ИССЯЗДОВАНИЯ

Хивотные, В работе исполъсовали мышей линий С57В1/6 (Н-2В), BALB/c (Н-2), СЗН (Н-2 к) и F,(СВА.С5ТВ1/6) (Н-2 к"в) в возрасте 2-4 месяцев, весом 18-20 грамм. Животных получали из питомника "Столбовая" (Московская область) и ОНЦ РАМН.

Онкологические болыде. В исследование по проведению предоперационной иммунокоррекции включен^ 43 больных РТК, которые находились на лечении в отделении проктологии ОНЦ РАМН. Рак прямой кишки диагностирован у 32 пациентов (средний возраст 58,3*2,44; из них 18 мужчин и 14 женщин). рак ободочной кишш - у II (средний возраст 53,6x6,10; из них 7 мужчин и 4 хешданы). Вторая стадия процесса была у 3. третья - у 31, четвертая - у 9 больных. Для срЕвзшша был изучен иммунологический и антиоксвданткыа станут у II практически здоровых лиц (6 мужчин и 5 генщин) в возраста от 37 до 50 лет.

В предоперационном периоде все пациенты прошли дистанционную гамма-терапию в суммарной очаговой доза 25 Грей. В целях иммунокоррекции больным назначали препарат бета-квротина (перорально, суточная дозировка - 30 мг, курс - 10-14 дней).

Объектами исследования служили сыворотка крови, плазма крови, лимфоциты перифорической крови. Наблюдение проводили в динамике, сраь:швая показатели до и после курса иммунокоррекции.

Препараты. В работе использован бета-каротин (производство НПО "Витамины") в следующих фор,tax :

1. суспензия препарата в оливковом масле;

2. новея оригинальная пищевая форма бета-каротина - сухой молочный продукт "Солнечный", производимый в НИИКИМ,

г.Ставрополь;

3. масляная суспензия бета-каротина в желатиновых капсулах.

В экспериментальных исследованиях суспензию бета-каротина в оливковом масле добавляли в стандартную диету животных.

Цитостатики растворяли в физиологическом 0,9% растворе NaC.l и вводили животным внутрибрппинно, однократно в следующих дозах: аргноза 500 мг/кг весв, циклофосфан 200 мг/кг веса, метотрексат 20 мг/кг веса и адриамицин 7,5 »лг/кг веса.

Опухоли. В работа ' использованы следующие опухолевые клеточные линии, поддерживаемые In vitro: клетки мышиных фибробластов L-929 (Sanforl K.K. et al., 1948), клетки лимфомы мышей YAC-1 (KleBSllng R. et al., 1975), клетки тимомы человека Iíolt-4 (Bubenik et al., 1973), клетки аденокарциномы яичника человека CaOv' (Добрынин Я.В. и др., 1974).

Имплантация клеток аденокарциномы яичника под капсулу почки производилась согласно описанию (Локшин А. и др., I9SO). Лимфолейкоз EL-4 перевивали интраперитонеально (5«10б клеток) на мышах С57В1/6. '

Часть клеток, растущих., как in vitro, так и in vivo заморакивали в аидком азоте для последующего использования в цитотоксическом тесте в качестве клеток-мишеней.

Получение лдцфоздных клеток. Суспензии спленоцитов мыши получали с помощью гомогенизаторов Поттера. Выделенные клетки культивировали в Среде RPMI-I640, содержащей 10 % ТЭС, I % 200 пМ L-глютаимна и 40 Ей/мл гентамицина. Т-лимфоциты получали нвнесением 2,5-5«107 спленоцитов на колонку с нейлоновой ватой с последующей 30-минутной инкубацией при 37°С и элюцией экспериментальной срэдой (Julius et al., 1973). Для выделения фракции лимфоцитов, обогащенных макрофагами, клетки, прикрепившиеся к пластику после 45-минутной инкубации (37°С) в чашках Петри, удаляли 0,25 % раствором трипсина (Kumagal et al., 1979).

МНК из периферической крови человека выделяли в градиенте плотности ^иколл-верографина (плотность 1,077 г/см2) (Boyum, 1968).

Специфические Т-супрессоры шегей. Т-с ,ирессоры у ' мышей индуцировали внутривенным введением 5«107 клеток селезенки аллогенной линии, облученных в дозе 15 Грей. Активность специфических Т-супрессоров оценивали по подавлению синтязя ЛИ в

однонаправленной CKJ1 п в FEIX (Бровдз Б.Д., 1984).

Реакция блдслтревсфзтцгщдд дза^оцэтоа. Для постановки РБТЛ ЫНК в когщентрацки 2«Ю5 клеток/мл инкубировали в течение трех суток при 37°С в атмосфере 5 % С02 в 96-луноч1ШХ круглодонных пластинах (Linbro, USA) без митогена и с добавлением ФГА (50 мг/л), после чего в лунки вносили по 1,0 мкКи 3Н-тимидина и через 18 часов определяли радиоактивность проб. Результаты оценивали по включению изотопа в контрольных и опытных пробах с подсчетом индекса стимулящш (ИС).

имл/мин в проое с wTA - i v. I'.ohtt^1 пя

имп/мин в контроле Индивидуальную чуствительность к индоыетацину (ИЧИ) определяли , по формуле:

ЕРзд- имп/мин в пробе (ФГА + индометацин в концентрации I мкг/мл)

имп/мин в пробе с ФГА Для тестирования уровня эндогенной супрессии (ЭС) к пролиферирукщим лимфоцитам добавляли мононуклеары, обработанные в течение 30 минут митомицином С (50 мкг/мл).

имп/мин б пробе ФГА - ида/шш в контроле

Э0=(1--'-:-)-1003

имп/мин в пробе(ФГА + Пит С) - имп/мин в пробе Ыпт С

ЦитотоксическиЯ тест. Килларную шсишность лгуДпдясз определяли в 16-часовоа тесте с игчвлтк. 51 Cr опуходЕкза клетками-мииекягли. 0.5-4.I06 клзтсх-ЬЕ^ЕЕаа, иэчанзх шатена Naö,CrO., свешивали с 5-I05. 2,5-iO5 к 1.25.10?

А

лимфоцитов в триплатшх вариантах. мишеней (цитотоксический индекс) определяла по фэрцула:

0 ~ с « 100 % , где 0 - радиоактивность супарнатанта в cizrre

(в лунки вносили киллерные клетки), Ы - максимальный выход изотопа в присутствии I % раствора додецилсульфата натрия, С -спонтанный выход изотопа без добавления эффекторов.

И'лрнофдроресценция. Экспрессию поверхностных маркеров люфацатов оценивали в реакции непрямой иммунофлюоресценции с нспользошошэм МКАТ серии ИК0, полученных в лаборатории кашической радаоиммунодопш 0Щ РАМН (А.Ю.Барышников, 1990) и напраилекнах к сладущш дафбаронцаровочным антигенам лимфоцитов: CD1b. СЮ. CD4, CD5, СШ, CD8, СВПЬ. CD16, CD22. CD25, CD37.

CD38, CD45, CDw50, CD71, ц-цепь 101, HLA-1, HLA-DR, RFB-1. 0,5«I06 ГШ инкубировали 30 мин. при 4°G с 20 мнл (ЖАТ, затем ' обрабатывали ломинесцирущей сывороткой и фиксировали. Процент клеток, экспрессируюцих дкфференцирозочше антигены, определяли на цитофлюориметре FACScan (Becton Dickinson, USA) в гейте лимфоцитов.

Хешшимнесцекция. Измерение хемилхкинесценции,

амплифицированной лхшнолом (Boehrlnger Mannhelm GmbH, Germany), проводили на приборе СЬ-3603. Суспензии спленоцитов в соотношении 1:1:1 смешивали с 20 мкМ раствором люминола на натрий - фосфатном буфере (pH = 7,0) и средой RPMI-I640 для определения спонтанной хемилшинесценции или суспензией Candida albicans в концентрация 5«I07-I«I08 частиц/мл - для определения хемилшинесценции, индуцированной фагоцитозом. Клетки Candida albicans предварительно убивали прогреванием в течение 60 мин. при 90 °С и опсонизировали сывороткой крупного рогатого скота.

Исследовашю процессов перекисного окисления липидоа. Интенсивность процессов ПОЛ определяли по концентрации МДА в плазме крови (Андреева Л.И. 'и др., 1988), для характеристики состояния антиоксидантной системы исследовали активность СОД (Beauchamp С. et al., 1974), каталазы (Веегз R.F. et al., 1952).

Ораделашге концентрации бета-каротина в сыворотке крови. Концентрацию бета-каротина в образцах сыворотки крови, .хранившихся при - 80°С, оценивали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (Vllet van Г. et al., 1991).

Сгатаспгческий анализ. При обработке результатов вычисляли значение средней величины и стандартную ошибку показателя средней. Для оценки степени достоверности полученных различий в сравшгоаемых группах при равномерном частотном распределении цифровых значений пользовались критерием Стыодента, а при неравномерном - U-критерием Вил,;оксона-Уайта.

РЕЗУЛЬТАТЫ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние бета-каротина на реакции клеточного тамунитет:, у ишей

Хроническое введение бета-каротина (15, 30 и 45 дней) в дозах 5 и 25 мг/кг ин'~актным мышам (С57В1/6) выявило положительное воздействие препарата на интегратирные показатели

схема "б"

<1

1В/С(Н2)

снутрибрюшиннэя иммунизация спленоцитами СЗН(Н2К)

1.пролиферэ цлч ' лимфоцитов в СКЛ

2.цктотоксичность киллеров

' I.цитотокси чность

макрофагов 2. хемилюгашесценция

, внутривенная 1 .лтнизация -ВАЬВ/с спленоцитами С57В1/б(Н2ь) .

и продолжительность эксперимента в днях

Т-супрессоры

подавление пролиферации в НТЛ и СМ

животные получали бета-каротин В дозе 0,07 г/кг с 0 по 10 день и с 5 по 10 день эксперимента

в течение всего эксперимента животные получали бета-каротин в дозах 0,07 и 0,14 г/кг

Рис.1, использование бота-коротекв при стимуляции клеточного

иммунитета у юдай. Схема "а" - стимуляция цитотоксичэашх лимфоцитов: Схема "б" - индукция Т-клвтаТООй супрессии.

состояния иммунной системы: способность спленоцитов и выделешшх из них Т-клеток к пролиферации, функциональная активность клеток моноцит-макрофагального ряда.

Среди антигенов клеточной поверхности, способных вызывать образование цитотоксичэских Т-лимфоцитов, наиболее существенны продукты генов главного комплекса гистосовместимости, а также опухолеспецифические антигены и Еирусы (Брондз Б.Д., 1987). В проведенных нами исследованиях для активации клеточного иммунитета у мышей BALB/c (Н-2^) в качестве антигенного стимула использовали спленоциты мышей аллогенной линии СЗН (Н-2К) Схема постановки типичного эксперимента показана на рис. I "а".

Препарат бета-каротина (доза - 70 мг/кг) способствовал усилению пролиферации реагирующих клеток в аллогенной СКЛ в 1,7 раза, цитотоксичности Т-клеток и макрофагов (рис. 2): Возрастание цитотокической активности Т-киллеров и макрофагов против L-929 и NK-клеток против YAC-1 наблюдалось при обоих режимах введения иммуномодулятора. Стимуляция бета-каротином цитотоксической активности клеток моноцит-макрофагальной природы коррел1фовала с усилением их способности адсорбироваться на колонке с нейлоновой ватой и выделять активные формы кислорода. Бета-каротин, вводимый в корм животных начиная за 5 дней до иммунизации, максимально стимулировал продукцию макрофагами активных форм кислорода л ответ на объект фагоцитоза Candida albicans.

Наиболее эффективно ограничение иммунного ответа может осуществляться с помощь: саморегуляции, для чего в иммунной системе существуют клетки-супрессоры (Брондз Б.Д., 1987)-. В напей работе для индукции Т-клеточной супрессии мышей BALB/c (Н-2*1) иммунизировали внутривенным введением 5«107 спленоцитоз линии С57В1/6 (НТ2Ь), облученных в дозе 15 Грей (рис. I, схема "б"). Супрессорную активность лимфоцитов определяли через пять суток после антигеного стимула по подавлению пролиферации в СКЛ п з РБТЛ в ответ на Кон А.

Добавление в стандартаую диету мышей BALB/c бета-каротина сопрововдалось снижением уровня супрессорной активности Т-лимфоцитов (рис. 3). Использование двух концентраций позволило выявить дозозависимый характер указанного эффекта.

Данные о снижении уровня супрессорной активности 7-, лимфоцитов на фоне усиления реакций клеточного иммунитета, индуцированных, также как и иммуносуттрессия, трансплантационными антигенами, говорят об изменении бета-кяротчном межпопулячкокнчх

[ 1-контроль _Оота-каротин 0,07г/кг цаа _ бета-каротин 0,07г/

" до иммушзации до и после иммунизв

Рис.2. Стимуляция бета-каротином цитолитической активности

макрофагов, КК-клеток и Т-киллеров, индуцированных

введением аллоантигена.

контроль ИЗ-Оета-каротин 0.07 г/кг?33- бета-каротин О.Н

Рис.3. Отмена бета-карогиком активности Г-супрессоров, подавляющ! пролиферацию лимфоцитов в РБТЛ и СКЛ.

взаимодействий в гейте лимфоцитов. По-видимому, введение бета-каротина способствует сдвигу иммунологического баланса в селезенке мышей в сторону образования Т-киллеров и макрофагов. Повышение цитотоксической активности макрофагов против клеток-мишеней L-929 можно объяснить наблюдаемым нами резким увеличением продукции активных форм кислорода клеткии макрофагального типа.

Предполагается, что наблюдаемый наш сффект стимуляции противоопухолевого иммунитета может быть связан со способностью продукта ферментативного превращения бетп-каротина - витамина А изменять - концентрацию антигена на поверхности антигенпрезентирущих клеток за счет процессов гликозилирования клеточных мембран, а также усиливать секрецию интерлейкина-2 Т-хелперами, 'способствуя тем самым преимущественному распознаванию трансплантационных антигенов специфическими Т-киллерями и их ускоренной пролиферации и дифференцировке (Галактионов В.Г.,1973; Welser М.М., 1973). С другой стороны, бета-каротин, индуцируя образование дополнительных рецепторов на поверхности активированных лимфоидных клеток, может повышать секрецию макрофагами противоопухолевых цитокинов и циготоксическую активность Т-клеток в популяции натуральных киллеров.

Коррекция бета-каротиноы реакций клзточного иммунитета при экспериментальной химиотерапии злокачественых новообразований

Схемы типичных экспериментов по коррекции бета-каротином показателей клеточного иммунитета представлены на рис. 4 и рис.5.

Комбинированная химиотерапия лимфолейкоза 7L-4-сопровождалась 1 тенденцией к увеличению пролиферативной способности лимфоцитов под действием Т-клеточного митогена Кон А при использовании следующих комбинаций: метотрексат+бета-каротин, адриамицин+бета-каротин; стимуляцией октиености специфических Т-киллеров (рис. 6). Рост противоопухолевой цитотоксичности 7'оррелировал с увеличением средней продолжительности жизни . животных после имплантации им опухоли. Наиболее выракенгао положительные изменения наблюдались при использовании циклофосфана. Следует отметить отсутствие усиления токсичности' цитостатиков при их введении в сочетай л с бетз-каротинсм.

В экспериментах по химиотерапии аденокарциномы яичника CaOv установлено усиление пролиферации сплокоцнтов под Кон

А, коррелирующее с возрастанием специфической протит.'; v/:?.

5.106 теток

СЬ'181/6

13(клофосфал 200 иг/иг иетотрексвтп2С*<гЛг

адри&шцин ли кг/кг

длительное» ооо*».

начинал с 0 дня и Д.1 охони>^я эксперимента швоттм получади бета-мротин 0,07 г/хг

вшиваеыовть тесты 1а шго:

{.прошфереом димфощтов _ * ответ и» Кон Л «.ЦПОТОХОРШОСТЬ киллере»

Рис.4, Схема использования бета-каротина при химиотерапии лимфолейгсоза ЕХ-4.

4,5 Гое» 2.105 маток С40Т

1СВА.С57В1/6)

аршвм £00 Ж'/ег

200 1с/«г

О I

н1в!нлл ев 15, 30 дне« до ныпл&кташш опухоли к до окончания експври-шш животные получали бетв-керотн:! 0,07 г/хг

ДЛИТбЛШОСТЬ

роет* опухоли (сутки)

тесты Ш тКго: I.про лифе рация Л*м£с1*тс

в ответ на Кон А г.цитотоксичность КИЛЛероЬ

тсв

Рис.Б. Схема использования бета-каротина при химиотерапии аденокарциномы СаОт.

игни-мпиенк - 0-4

1

I

цякяофос-. метотрек- адриаии-фан саг цин

без

" хт

| I - бвв бета-каротика П - » сочетали» о ввтвтаротнои

ЧИклофое- иетотрек- адриа-<1ш1 сат иицик

Вис.6. Коррекция" Свта-каротином пролиферативной активности лимфоцитов и цитотоксичности Т-киллеров при химиотерапии лимфолейкоза ЕЬ-4.

5 »>

X

гот 1в 18 1« 12 10 8 в д-X

о

А

клетки -штеки - СаОт

II П ^ П*

баз XI . си£офоо}ан араноэа

| | - без бета-каротина

- введение бега-каротина за 15 дней до имшмнтацин опухо.-м

I" 'Ч - введение бета-«аротина за

30 дней до имплантаим опухоли

ЕЯхифюфаа . араноза

Рис.7. Коррекция бета-каротином пролиферативной * активности лимфоцитов и цитотоксичности Т-киллеров при химиотерапии аденокарциномы СаОт.

цитотоксичности при использовании.комбинации араноза+бета-каротин (рис. 7). В этой .комбинации отмечено наиболее интенсивное торможение роста опухоли.

Поскольку в наших экспериментах торможение роста опухоли сопровождалось усилением противоопухолевой цитотоксичности, можно предположить, что эффект комбинированной терапии помимо цитостатического действия химиопрепаратов на опухолевые клетки также связан с активацией бета-карот"ном генерации Т-киллеров в птият на воздействие опухолеспецифических антигенов. Известно также, что использование низких дез циглофоефяня сопровождается стимуляцией противоопухолевого иммунитета вследствие элиминации Т-с^агрессоров из популяции иммунокомпетентных клеток (Chen J1-Hslang et al., 1985).

Показатели клеточного иммунитета больных роком толстой кишки и их изменение

при включении бета-каротина в схему комбинированной терапии

Обобщая показатели клеточного иммунитета обследованных нами больных РТК, следует отметить изменение регуляторных процессов в сторону супрессии иммунного ответа: увеличение . супрессорной активности клеток моноцит-макрофагапьного . ряда вследствие гиперпродукции простагландина Е2 (тест на индивидуальную чуствительность к индометацину) (таблица I); снижение количества клеток, эксрассируодих рецептор к трансферину (CD71), контакт которого с соответствующим белком запускает пролиферацию; уменьшение численности регуляторной популяции фенотипа CD4 (Т-хелперы/индукторы); падение такого интегрального показателя состояния иммунной системы, как пролиферация в ответ на митогенный с имул (ФГА) (таблица I). Уменьшение в гейте лимфоцитов количества клеток, . експрессирующих маркер CDT, сочеталось с гипоактивностью натуральных киллеров в функционально?- тесте против клеток-мишеней Molt-4 (таблица 2). Параллельно с уменьшением количества Т-зависимых лимфоцитов отмечено снижение клеток, несущих В-клеточный маркер CD22.

Таблица I.

Пролиферативная активность, чуствительность к индометацину и эндогенная супрессия МНК у больных РТК и у здоровых лиц, (М » т).

| псТтзатёль | „доровые, п=11 | больные РТК, n=40 |

17

индекс стимуляции в РБТЛ 4.29±1.05 1.23*0.27*

швд сс чустви-тельности к индо-метацину в РБТЛ 0.48±0.12 . 1.7910.46*

эндогенная супрессия 155.2±105.1 240.3116.7

*-Р<0.01

Различив по сравнению с контрольной группой здоровых лиц.

Таблица 2.

Цитотоксическая активность натуральных киллеров у больных РТК и у здоровых лиц, (И 1 и). .

эффекторы : кл. -мишени цитотоксический индекс (Ж)

здоровые, п=5 больные РТК, п=27

50:1 33,4±3,70 22,712,49* Р<0,02

25:1 20;4*5,19 10.112,44

12,5:1 . 9,312,16 0,5910,14* Р<0,001

* - различие по сравнению с контрольной группой здоровых

лиц.

На рис. 8 представлена схема включения бета-каротина в прздоперационную подготовку больных РТК.

- Дпнаюческое наблвдение за пациентами в процессе дистанционного гамма-облучения выявило 2-кратное уменьпепиэ содержания бета-каротина в сыворотке крови во время предоперационной подготовки (с 0.08310.01 до 0.044*0.01 мкг/мл).

Гамма-терапия на фоне ежедневного приема 30 мг препарата в течение 10-14 дней сопрс^с далась повышением в 1,6-2,7 раза концентрации этого вещества в сыворотке крови больных РТК по сравнению с исходным значением и в 3-5,1 раза по сравнению с контрольной группой пациентов, предоперационная подготовка которых не включала иммунокоррекции. Это позволяет сделать вывод о форсированном использовании бета-каротина при радиационном воздействии (контрольная груша пациентов). Эндогенные резервы .бета-каротина утилизируются, очевидно, для нейтрализации

<3 больных ptKOM юл стой юшек в возрасте от ^ до 69 лет

4ета-к»ротин 30 ыг/дань

5-9

6 сеансов гейма-облучения (СОД 25 Грей)

тесты 1л тиго:

1.пролиферация лимфоцитов > ответ на ша

2.индивидуальная чу ствитальность к мндоиатацину

3.андогенная супрессия

4.цит.)токси1!ность натуральных киллеров

5.акслр есоия дефференцировочных шркеров на лин5оцитах

6.концентрация вета-каротина ■ сыворотке крови

7.антиоксидантныЯ статус

длительность 10-14 предоперационной подготовки (сутки)

оперефя

Рис.8. Схема использования бета-каротина для иммунокоррекции при комбинированном лечении больных раком толстой кишки.

супероксиднетс радикалов и продуктов переписного окисления липидов. Назначение препарата совместно с гамма-терапией ликвидирует вышеупомянутый отрицательный баланс.

В контрольной группе больных воздействие гамма-терапии, проведенной без назначения бета-каротина, проявилось снижением показателей РБТЛ (таблица 3). Подобное однонаправленное изменение интегральных показателей состояния иммунной системы, очевидно, связано с прямым и опосредованным воздействием гамма-облучения на иммунокомпетентную ткань (Яр™лин Л.А., 1988).

Таблица 3.

Изменечие пролиферативной активности, чуствительности ь индометацину и эндогенной супрессии МНК у больных РТК в ходе комбинированной терапии, (М ± ш).

показатель исходное значение п=40 . после курса 7-терапии 11=14 после курса 7-тера-шга в сочетании с р-каротином

микрогранулы п=18 капсулы П=1 1

индекс стимуляции в РБТЛ 1,23*0,27 П.62*0,13* Р<0,05 1,93*0,58* Р<0,05 2,24*0,22* Р<0,001

индекс чуствиг тельности к индо-метацину в РБТЛ 1,7910,46 0,78*0,06* Р<0,05 * 0,99*0,07* Р<0,02 0,86*0,СЬ

эндогенная супрессия 240,3*16,7 181,0*10,61 Р<0,01 181,0*18,47 108,0*Т,Э.06 Р<0,001

* - различив по сравнению с исходным значением;

** - различия по сравнению с предоперационной 7-терапией.

Напротив, лучевая терапия, проведенная в сочетании с использованием препаратов бета-каротина на сопровоздалась столь неблагоприятными изменениями. Отмечено увеличение индекса стимуляции лимфоцитов. в РБТЛ и сникенив уровня эндогенной супрессии №.

На фоне активации пролиферативных свойств ИНК и снижения уровня их супрессорной активности цитотоксичность натуральных киллеров против клеток-мишеней Но11-4 под действием бета-каротин? возрастала (таблица 4).

Таблица 4.

Изменение цитотоксической активности натуральных киллеров у больных РТК в ходе комбинированной терапии, (II ± т).

эффектора / кл. цитотоксичег-ий индекс (%)

исходное значение 11=27 ' после курса 7-те^ятггт после курса 7-тошпии в сочзтгпзп с р-каротазп (капсула) 11=14

50:1 25:1 12,5:1 22,7*2,49 10,1*2,44 0,59*0,14 28,6*2,90 12,3*2,53 6,6*1,32* Р<0,001 *» 38,5*3,60 Р<0,05 24,8*2,55* Р<0,002 6,7*1,16

* - различие по сравнению с исходным значением;

** - различие по сравнению с предоперационной 7-тераггаеП.

После курса ггмма-терапии в сочетании с бета-каротином у больных происходило увеличение количества клеток, экспрессируадих

антигены CD7, CD25, CD45, CDw50 и HLA-1, из 17 анализированных нами диффернцировочных маркеров лимфоцитов.

Среди больных, получавших для иммунокоррекции микрогранулы -комплексный препарат бета-каротина и концентрата натурального казеина, обладающего высокой биологической ценностью, частота осложнений в послеоперационном периоде (постлучввой цистит, нагноение операционной раны) была минимальной (5,55 %) по сравнению с контрольно!, группой (28,54 %) и пациентами, в схему комошшриианкой торги™ которых был включен препарат бета-каротина в виде желатиновых капсул (27,27 %).

Стимуляция пролиферации лимфоцитов периферической крови под действием ФГА на фоне снижения супрессорной активности Т-ликфоцитов и клеток моноцио-макрофагальной природы, усиления цитотоксичности натуральных киллеров, а также увеличения экспрессии обг лейкоцитарных маркеров CD45, CDw50, и HLA-1, которые также являются молекулами адгезии и принимают участие в презентации антигена и межклеточных взаимодействиях, маркеров Ти Ж-клеток (CD7), рецепторов к интерлейкину-2 (CD25) свидетельствовало о том, что 1,6-2,7 - кратное возрастание концентрации бета-каротина в сыворотке крови больных РТК в ходе предоперационной гамма-терапии имело стимулирующее влияние на реакции клеточного иммунитета и способствовало тем самым повышению резистентности организма человека к действию радиационного облучения.

Влияние бето-квротина на показатели антиоксидонтного статуса больных раком толстой кишки при проведении предоперационной гамма-терапии

В плазме крови обследованных нами больных РТК отмечено снижение активности СОД и возрастание концентрации МДА по сравнению со здоровыми лицами контрольной группы.

Курс предоперационной гамма-терапии не вызывал изменений рассматриваемых показателей.

Гамма-терапия, проводимая на фоне насыщения тканей бета-каротином, сопровождалась снижением концентрации МДА в плазме крови больных (таблица 5). Активность исследованных нами ферме: :ов, ответственных за нейтрализацию супероксидных радикалов и перекиси водорода, имела тенденцию к увеличению. Достоверность различий отмечена для ката..азы.

Таблица б.

Изменение активности суперокси^цисмутазы и каталазы, концентрации малонового 'диальдегида е плазме крови больных РТК в ходе комбинированной терапии, (М i га).

показатель после гамма-терапии п=15 посла курся гамма-терапии в сочетать, с р-нарогшгом

микро."ранулы капсулы п=13

СОД, мкг/мл эр 64,9*3,95 71,1i3,67 7I.5i4.03

каталаза, ЕД/МЛ 38.5i2.42 43,5i3,62 48,8t3,14* Р<0.02

№. мкмоль/л 10,2t0,73 8,74±0,26 8,0i0,62* Р<0,02

- различия по сравнению с гледоперационной гамма-терапией.

Получешше нами данные по стимуляции бета-каротином пролиферативного ответа лимфоцитов больных РТК, цитотоксической активности натуральных киллеров, а также увеличению количества клеток, экспрессирупцих общелейкоцитарше маркеры (CDw50, CD45, HLA-1), маркер Т- и NK-клеток (CD7) й маркер рецепторов к интерлейкину-2 (CD25), на фоне действия гамма-облучения, возмокно, объясняются не только известными иммуномодулирукщими свойствами этого препарата, но и его i лчюксидантным потенциалом, нивелирующим иммунотоксическое действие перекисных соединений и свободных радикалов (Cronie Ь., 1992; ErcztUn R.A. et al.,

Езгодц

1. Препараты бета-каротина усиливали пролгфзргцяю пефракционированных лимфоцитов селезенки мышей и выделанных из нее Т-клеток в ответ на воздействие конканавалина А;

2. Бета-каротин сткдулировал продукцию макрофагг.чл активных форм кислорода в ответ на объект фагоцитоза Candida albicans;

3. Препарат бета-каротина вызывал сннкенса индуцированной введением аллоантигена Т-клеточпой супрессия п возрастание цитотоксичности естественных киллеров и макрофагов;

4. Экспериментальная химиотерапия лззфолейкоза EL-i и

аденокарциномы яичника CaOv ва фоне иммунокоррекции препаратом бета-кароти..а сопровождалась усилением пролиферации лимфоцитов селезенки в ответ на воздействие конканавалива А и стимуляцией активности-специфических противоопухолевых Тткиллеров;

5. Возрастание противоопухолевой цитртоксичности коррелировало с увеличением средней продолжительности жизни мышей с лимфолейкозом EL-4 и аденокарциномой яичников CaOv;

6. Наиболее выраженный аффект стимуляции активности противоопухолоиых. Т-кгллсров и торможения роста опухолей EL-4 и СаОт In vivo наблюдался при сочетании циклофосфана с оета-каротином и аранозы с бета-каротином;

7. Дистанционная гамма-терашш (суммарная очаговая доза 25 Грей) вызывала 2-кратное падение концентрации бета-каротина в сыворотке кров\. больны! раком толстой кишки. Использование бета-каротина (30 мг/день) в период предоперационного облучения приводило к увеличению в крови концентрации препарата в 1,6-2,7 раза;

8. Дистанционная гамма-терапия больных раком толстой кишки на фоне иммунокоррекции бета-каротином сопрововдалась стимуляцией пролиферации лимфоцитов периферической крови в ответ на действие фитогемагглютинина, снижением эндогенной супрессии, усилением цитотоксичности натуральных киллеров и увеличением количества клеток, экспрессирующих дифференцировочные маркеры GD7, Cb25, CD45, CDw50, HLA-1;

9. Гамма-терапия рака толстой кишки, проводимая на фоне насыщения тканей бета-каротином, характеризовалась снижением концентрации малоновсч даальдогида и увеличением активности каталазы в плазме крови больных;

10. Бета-каротин мог т быть использован для иммунокоррекции при комбинированном лечении злокачественных новообразований.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Сергеев A.B., Ананьев B.C., Вакулова Л.А., Жидкова Т.А., Мухам"9джанов Ш.К., Раманаускайте P.D., Толкачев В.Н. Иммунофармакокинетика синтетического бета-каротина. Вопр. мед. химии - 1992, Т.38, 6, 27-°9.

2. Абронина И.Ф., Раманаускайте Р.Ю.. Андрейчук Т.Н..

Рытенко А.Н., Коростелев С.А. Стимуляция бета-каротином реакций клеточного иммунитета у мышей. Бюлл. вкспер. биол. и мед. - 1993, T.CXVI, 9, 295-297. V

3. Сергеев A.B., Раманаускайте Р.Ю., Ананьев B.C., Мухаммедаанов Ш.К. Влияние бета-каротин" на иммунологические показатели онкологических больных. Материалы симпозиума "Каротиноиды в онкологии" - Москва, 1Э92, I07-III.

4. Раманаускайте P.D., Горожанская Э.Г., !1ихаевич О.Д., Ананьев B.C., Цухаммеджанов Ш.К., Сергеев A.B. Влияние бета-каротина на некоторые биохимические и гематологические показатели онкологических больных. Материалы симпозиума "Каротиноиды в онкологии" - Москва, 1992, 132-135.

5. Syrkln A.B., 'Buyukllnskaya O.V., Xorostelev S.A., Mkrtchan Т.V., Ramanauskalte R.Yu., Sergeev A.V., Shashklna M.Ya. Immunopliarmacology of beta-carotene. Cancer Chemo Prevention Conference (Berlin Germany) - April 28-30, 1993, p.12T (abstract).