Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Роль полиморфизма генов иммуноглобулинподобных рецепторов киллерных клеток, их лигандов и генов HLA в патогенезе и прогнозе множественной миеломы

005014994

На правах рукописи

УДК: 575.113:612.017.12-089.843:616-006.448-07

СОКОЛОВА ЮЛИЯ ВАЛЕРИЕВНА

РОЛЬ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ ИММУНОГЛОБУЛИНПОДОБНЫХ РЕЦЕПТОРОВ КИЛЛЕРНЫХ

КЛЕТОК, ИХ ЛИГАНДОВ И ГЕНОВ НЬА В ПАТОГЕНЕЗЕ И ПРОГНОЗЕ МНОЖЕСТВЕННОЙ МИЕЛОМЫ

14.01.21 - гематология и переливание крови 14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 2 МАР Ш

Санкт-Петербург 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства»

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Людмила Николаевна Бубнова Станислав Семенович Бессмельцев

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Наталия Михайловна Калинина доктор биологических наук Сергей Игоревич Капустин

Ведущая организация: ФГБУН «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства»

Защита состоится «19» марта 2012г. в_часов на заседании

диссертационного совета Д 208.074.01 ФГБУ «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства» (191024, Санкт-Петербург, ул. 2-ая Советская, д.16).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского НИИ гематологии и трансфузиологии.

Автореферат разослан «_»_2012г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Татьяна Валентиновна Глазанова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Множественная миелома (ММ) — одна из наиболее часто встречающихся и хорошо изученных злокачественных неоплазий, характеризующаяся клональной экспансией малигнизированных плазматических клеток, продуцирующих аномальные иммуноглобулины или их фрагменты (Bergsagel P.L., 2003; Anderson К.С., 2011). Однако, несмотря на достигнутые в последние годы успехи в изучении патогенеза ММ и разработке новых схем терапии, это заболевание до сих пор остается некурабельным.

Развитие ММ является следствием сочетанного действия генетических изменений в плазматических клетках, нарушения адекватного функционирования костно-мозгового микроокружения и потери иммунного контроля над заболеванием (Бесмельцев С.С., Абдулкадыров K.M., 2004; San Miguel J.F. et al, 2005).

Чрезвычайная гетерогенность ММ, разнообразие ее клинических проявлений, вариабельность течения заболевания во многом обусловлены индивидуальными особенностями клеток опухолевого клона и их взаимодействием с защитными системами организма больного, в том числе участвующими в метаболизме ксенобиотиков, репарации ДНК, регуляции клеточного цикла и процессов апоптоза, иммунном ответе (Vangsted A et al., 2011). Вследствие этого актуальным является поиск дополнительных факторов, которые позволили бы прогнозировать особенности течения ММ в зависимости от индивидуальных особенностей опухолевого клона и организма-«хозяина», разрабатывать дифференцированные подходы к терапии (Fonseca R, et al., 2004; Brown E.E. et al„ 2007).

В последнее время значительное внимание уделяется изучению факторов прогноза, связанных с индивидуальными генетически детерминированными особенностями иммунной системы, которые могут определять эффективность предотвращения трансформации нормальных клеток в опухолевые, а также своевременной элиминации измененных клеток (Abazis-Stamboulieh D. et al., 2007; Birmann B.M. et al., 2009).

HLA-система играет ключевую роль в развитии иммунного ответа, в том числе и противоопухолевой защиты, обеспечивая презентацию чужеродного антигена — важнейшего процесса в развитии иммунного ответа. Молекулы HLA I класса представляют пептиды цитотоксическим Т-лимфоцитам (CTL), что приводит к прямому лизису клеток-мишеней, а молекулы HLA II класса — Т-хелперам, стимулируя клеточный, либо гуморальный иммунитет в зависимости от преобладания Т-хелперов 1 или 2 типа. Эффективность презентации пептида антигенами HLA может различаться, формируя, таким образом, индивидуальные особенности иммунного ответа.

Естественные киллеры (NK), наряду с CTL, являются важнейшими эффекторными клетками, осуществляющими цитолиз опухолевых клеток, в том

числе и миеломных. Известно, что активность естественных киллеров отрицательно коррелирует с опухолевой массой при ММ, при этом эффективность NK-клеточного цитолиза зависит от уровня экспрессии антигенов HLA I класса на опухолевых клетках (Osterborg А. et al., 1990; Wieten L. et al., 2011). Также показано, что один из современных противоопухолевых препаратов — бортезомиб снижает экспрессию молекул HLA I класса на миеломных клетках (Lundqvist А. et al., 2010).

В середине 90-х годов XX века было установлено, что классические HLA-антигены I класса участвуют в регуляции функциональной активности NK-лимфоцитов, взаимодействуя с иммуноглобулинподобными рецепторами киллерных клеток (KIR) (Dohring С. et al., 1996; Carrington М., Norman P., 2003). К настоящему времени идентифицировано 15 KIR-генов, которые кодируют ингибирующие (iKIR) и активирующие (aKIR) рецепторы. iKIR имеют длинный цитоплазматический участок (L), a aKIR — короткий (S). Число KIR-генов у индивидуума может варьировать от 5 до 15. В зависимости от количества и типа генов выделяют две группы гаплотипов: А и В. А-гаплотип имеет постоянный состав и содержит только один активирующий ген (KIR2DS4), пять ингибирующих (KIR2DL1/3, 3DL1/2/3) и KIR2DL4, который обладает как активирующими, так и ингибирующими свойствами (Shilling H.G. et al., 2002). В-гаплотипы вариабельны по количеству генов и характеризуются присутствием более чем одного активирующего KIR-гена (Uhrberg М. et al., 2002). KIR-рецепторы осуществляют свою функцию, взаимодействуя с лигандами — антигенами HLA I класса. Двухдоменные (2D) рецепторы взаимодействуют с антигенами HLA локуса С (Colonna М. et al., 1992), а трехдоменные (3D) — локусов А и В (Gumperz J.E. et al., 1995).

Для KIR-генов, также как и для HLA-системы, характерен высокий уровень полиморфизма. Поскольку функциональная активность естественных киллеров регулируется балансом активирующих и ингибирующих сигналов, генетически детерминированное преобладание того или иного сигнала определяет развитие NK-клеточного ответа и обуславливает предрасположенность и/или устойчивость к различным заболеваниям (Vilches С., Parham Р., 2002). В настоящее время активно изучается роль KIR-системы в патогенезе, прогнозе и терапии онкогематологических заболеваний (Verheyden S., 2008; Shahsavar F. et al., 2010).

Учитывая вышеизложенное, оценка индивидуальных генетически детерминированных особенностей противоопухолевого иммунитета у больных ММ и их роли в развитии заболевания на основе изучения комплекса генов, ответственных за процессы тонкой регуляции как врожденного, так и адаптивного иммунного ответа, представляется актуальной.

Целью настоящего исследования явилось определение значимости полиморфизма КШ-генов в сочетании с генами их НЬА-лигандов и генов НЬА I и II классов в патогенезе, клинических особенностях множественной миеломы и прогнозировании эффективности терапии.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить распределение генов, кодирующих КШ-рецепторы и их лиганды, в восточно-славянской популяции Северо-Западного региона Российской Федерации.

2. Установить роль КШ-генов в сочетании с генами их лигандов в развитии ММ и оценить их влияние на клинические особенности заболевания.

3. Изучить ассоциативные связи НЬА-генов I и II класса с риском возникновения и клиническими особенностями ММ.

4. Исследовать влияние генетически детерминированных особенностей регуляции цитолитической активности естественных киллеров на эффективность лечения больных ММ при использовании бортезомибсодержащих режимов терапии.

Научная новизна исследования.

Впервые получены новые научные данные о распределении генов иммуноглобулинподобных рецепторов киллерных клеток и их лигандов в восточно-славянской популяции Северо-Запада России. Установлено, что данная группа сходна с другими европейскими популяциями по частоте встречаемости генов, кодирующих КШ-рецепторы, однако отличается по распределению лигандов для них, что приводит к различиям в частоте функционально значимых пар лиганд-рецептор.

Впервые показано, что КШ-генотип больного относится к числу факторов, влияющих на возникновение, клинические особенности и эффективность терапии ММ. Генетически детерминированная сниженная активность 1ЧК-лимфоцитов является фактором риска развития ММ, особенно в возрасте старше 65 лет. Выявлены КШ-гены и функционально значимые сочетания КШ/НЬА, ассоциированные с иммунохимическим вариантом ММ и возрастом начала заболевания.

Проведено молекулярно-генетическое типирование пяти локусов системы НЬА: А, В, С, ОЛВ1 и БС)В у больных ММ. Получены новые научные данные о наличии ассоциативных связей НЬА-специфичностей с возрастом начала заболевания, иммунохимическим вариантом ММ. Показано, что НЬА-ОКВ1*15, определяющая слабый тип иммунного ответа, является фактором риска развития заболевания у лиц пожилого возраста, тогда как НЬА-1ЖВ1*04, связанная с сильным типом иммунного ответа, — в молодом возрасте.

Выявлены ассоциативные связи КШ-генов, КШ-генотипов и сочетаний КШ/НЬА с эффективностью терапии. Впервые показано, что наличие

АА-генотипа и преобладание ингибирующих KIR-генов ассоциировано с достижением объективного ответа и является фактором прогноза высокой эффективности терапии бортезомибом.

Практическая значимость. Данные о распределении KIR-генов и их лигандов в популяции Северо-Запада России могут быть использованы как база данных для региональных, федеральных и международных антропологических исследований, в качестве группы сравнения для исследований по проблеме «KIR и болезни», а также для выбора предпочтительных доноров с целью улучшения терапевтического эффекта трансплантации ГСК.

На основании данных исследования доказана целесообразность типирования KIR-генов и их лигандов при ММ, результаты которого могут быть использованы в клинической практике в качестве дополнительных диагностических и прогностических критериев.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Распределение KIR-генов у восточных славян Северо-Запада России имеет основные черты сходства с другими европеоидными популяциями, отличаясь по частоте встречаемости отдельных активирующих генов, и наиболее выраженные отличия от монголоидов и австралоидов. Обследованная группа отличается от других популяций европеоидов по частотам встречаемости генов лигандов для KIR-рецепторов, что приводит к различиям в частоте функционально значимых пар двухдоменных рецепторов с их лигандами, предрасполагающим к большей активности естественных киллеров.

2. Полиморфизм KIR-системы, играющей ведущую роль в регуляции цитолитической активности естественных киллеров, является одним из факторов, определяющих предрасположенность к развитию ММ. Выраженное подавление активности естественных киллеров, связанное с гомозиготностью по функциональному сочетанию KIR2DL1 со своим HLA-лигандом группы С2, является фактором риска развития ММ. Наличие функционального рецептора KIR2DL2/3 (KIR2DL2/3+/HLA-C1+), для которого характерно меньшее подавление активности NK-лимфоцитов, обладает протективным эффектом.

3. Выявлены особенности полиморфизма KIR- и HLA-систем в зависимости от иммунохимических вариантов ММ: развитие миеломы Бенс-Джонса ассоциировано с генетически обусловленной повышенной активностью естественных киллеров и наличием HLA-DRB1*04, тогда как HLA В*27 и HLA-DRB1 *15 ассоциированы с миеломой А.

4. Развитие заболевания в пожилом возрасте ассоциировано с генетически детерминированной сниженной активностью NK-лимфоцитов и присутствием в генотипе HLA-DRB1*15, определяющей слабый тип иммунного ответа. Развитие ММ в возрасте до 50 лет характеризуется преобладанием активирующего воздействия на функциональную активность

естественных киллеров и наличием HLA-DRB1*04, связанной с высоким уровнем иммунного ответа. 5. Генетически детерминированные особенности регуляции цитолитической активности естественных киллеров оказывают влияние на эффективность лечения бортезомибом: объективный ответ ассоциирован с преобладанием ингибирующих KIR-рецепторов, что, вероятно, связано со снижением экспрессии HLA-молекул на миеломных клетках под действием этого препарата, которое способствует активации NK-опосредованного контактного цитолиза. Это позволяет использовать определение KIR-генотипа для прогнозирования эффективности лечения бортезомибом.

Апробация и внедрение результатов исследования. Основные положения диссертационной работы представлены на рабочем совещании «Актуальные вопросы тканевого типирования и трансплантации гемопоэтических стволовых клеток» (СПб, 2010), 7-ой Международной летней школе по иммуногенетике (Греция, 2010), Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Современные проблемы гематологии и трансфузиологии» (СПб, 2011), Международном рабочем совещании по KIR-системе (Швеция, 2011), 5-ом Международном симпозиуме по трансплантации гемопоэтических стволовых клеток памяти P.M. Горбачевой (СПб, 2011).

В работу лаборатории иммуногематологии РосНИИГТ внедрен метод молекулярно-генетического типирования генов, кодирующих KIR-рецепторы и их лиганды, с помощью полимеразной цепной реакции с сиквенс-специфическими праймерами.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, из них 3 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 181 странице машинописного текста и состоит из введения, 7 глав собственных исследований, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, который включает 323 источника. Диссертация иллюстрирована 48 рисунками и 67 таблицами.

Личный вклад автора. Автором лично выполнено молекулярно-генетическое типирование KIR-генов и генов их лигандов, генов HLA I (локусов А, В и С) и II (локусов DRB1 и DQB1) классов методом полимеразной цепной реакции с сиквенс-специфическими праймерами (PCR-SSP), включая выделение ДНК, проведение амплификации и разделение продуктов в агарозном геле, у всех обследованных больных ММ и доноров. Проведен клинико-лабораторный анализ, статистическая обработка, анализ полученных данных и обобщение результатов исследования.

ОБЪЕКТ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика обследованных больных. Под нашим наблюдением находились 78 больных ММ в возрасте от 26 до 84 лет, среди них - 19 мужчин и 59 женщин, которые проходили обследование и лечение в гематологической клинике и поликлиническом отделении Российского научно-исследовательского института гематологии и трансфузиологии в период с 2009 по 2011 гг. Диагноз симптоматической ММ был верифицирован на основании критериев Международной рабочей группы по изучению миеломы (IMWG, 2009).

Среди обследованных пациентов G-миелома наблюдалась у 45 (57,7%), А-миелома — у 17 (21,8%), миелома Бене-Джонса — у 14 (17,9%), миелома D — у 1 (1,3%), несекретирующая форма — у 1 (1,3%) больного. В зависимости от возраста начала заболевания все больные ММ были разделены на три группы: в возрасте до 50 лет диагноз был установлен у 14 (17,9%) пациентов, от 51 до 64 лет — у 30 (38,5%) и от 65 до 80 — у 34 (43,6%).

Терапию с использованием ингибитора протеосом бортезомиба получали 64 пациента. Бортезомиб (велкейд) назначался как в режиме монотерапии, так и в сочетании с другими препаратами. Результаты лечения оценивали с использованием критериев Европейской группы по трансплантации стволовых клеток и костного мозга (ЕВМТ, 2006). Объективный ответ в целом в группе больных составил 76,6 %. При этом у 15 (23,4%) больных достигнут полный ответ, у 11 (17,2%) — почти полный ответ, у 8 (12,5%) — очень хороший частичный ответ, у 12 (18,8%) — частичный ответ и у 3 (4,7%) — минимальный ответ.

Группу сравнения составили 100 здоровых, не связанных кровным родством потенциальных доноров Республиканского регистра доноров гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) Российского НИИ гематологии и трансфузиологии (Санкт-Петербург) в возрасте от 20 до 60 лет, из них 45 мужчин и 55 женщин.

Материал исследования. В качестве материала исследования использовали геномную ДНК, которую выделяли из мононуклеаров периферической крови протеиназным методом с использованием колонок с силикагелевой мембраной («Protrans», Германия). Оценка количества и качества выделенной ДНК осуществлялась с помощью спектрофотометрии (спектрофотометр Smart Spect Plus, BioRad; одноразовые кюветы Truview Cuvette, BioRad). Измерение оптической плотности каждого образца ДНК проводилось при 260 nm и 280 nm. Концентрация выделенной ДНК составляла 50-100 нг/мкл.

Для решения поставленных задач были использованы следующие методы исследования:

Молекулярно-генетическое типирование локусов А, В и С HLA I класса и локусов DRB1 и DQB1 HLA II класса осуществляли методом полимеразной цепной реакции с использованием стандартных коммерческих наборов реагентов

(PROTRANS Ceclerplate System Protrans HLA-A*, В*, C*; HLA-DRB1 *; HLA-DQB1*).

Титрование генов KlR-системы осуществляли методом полимеразной цепной реакции с сиквенс-специфическими праймерами, с использованием наборов «KIR Genotyping SSP Kit» (Invitrogen). Данные наборы позволяют определять наличие или отсутствие всех известных на настоящее время KIR-генов: 2DL1, 2DL2, 2DL3, 2DL4, 2DL5A, 2DL5B, 2DS1, 2DS2, 2DS3, 2DS4, 2DS5, 3DL1, 3DL2, 3DL3, 3DS1, 2DP1, 3DP1, а также полные и делетированные аллельные варианты 2DS4 и 3DP1.

Группы HLA-лигандов определяли при помощи наборов «KIR HLA ligand kit» (Olerup-SSP). Этот набор позволяет определять 5 групп лигандов для KIR-рецепторов:

1. аллели, входящие в группу HLA-C1, кодирующие молекулы с остатком аспарагина в позиции 80;

2. аллели, входящие в группу HLA-C2, кодирующие молекулы с остатком лизина в позиции 80;

3. аллели, входящие в суперспецифичность HLA-Bw4(Thr80), кодирующие молекулы с остатком треонина в позиции 80;

4. аллели, входящие в суперспецифичность HLA-Bw4(Ile80), кодирующие молекулы с остатком изолейцина в позиции 80;

5. аллели HLA-A, кодирующие рецепторы, имеющие эпитоп Bw4. Статистическая обработка была выполнена на персональном компьютере с

использованием ряда современных статистических программ: Microsatellite Tools for Excel (http://animalgenomics.ucd.ie/sdepark/ms-toolkit/ ), Arlequin (http://cmpg.unibe.ch/software/arlequin3/), Genepop (http://ftp.cefe.cnrs.fr/PC/MSDOS/GENEPOP), STATISTICA 6.

Анализ результатов распределения KIR-генов и групп HLA-аллелей был выполнен методами популяционной генетики, включающими определение следующих показателей: частоты встречаемости антигена (F), частоты встречаемости гена (аллельная частота - AF), соотношения числа активирующих и ингибирующих KIR-генов (aKIR/iKIR), величины относительного риска заболевания (RR). Статистическая значимость выявленных ассоциативных связей с заболеванием выполнялась с помощью критерия у2 с поправкой Йетса и точного критерия Фишера. Для анализа количественных признаков использовали непараметрические методы статистики. Уровень доверительности р<0,05 рассматривали как статистически значимый.

Распределение потенциальных доноров на группы в соответствии с их влиянием на терапевтическую эффективность трансплантации («best», «better», «neutral») проводили при помощи калькулятора http://www.ebi.ac.uk/ipd/kir/

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Распределение генов, кодирующих KIR-рецепторы и генов их HLA-лигандов в восточно-славянской популяции Северо-Западного региона России

Сопоставительный анализ распределения KIR-генов у восточных славян Северо-Западного региона России с рядом других популяций выявил выраженное сходство частоты встречаемости ингибирующих KIR-генов в исследованной группе с европеоидными популяциями Европы, Северной и Южной Америки.

Наиболее значимые различия в сравнении с европеоидными популяциями обнаружены в распределении активирующих KIR-генов. Установлена более высокая частота KIR2DS3 и сниженная — KIR2DS5.

Гораздо более выраженные отличия обнаружены при сравнении изученной нами группы с австралоидной и монголоидными популяциями: более высокая частота гаплотипа В и ассоциированных с ним генов. Частота ассоциированных с этим гаплотипом ингибирующего (KIR2DL2) и активирующих (KIR2DS2, KIR2DS3) генов была значительно выше, чем в популяциях Японии и Южной Кореи. Также в исседуемой группе отмечалось повышение частоты ассоциированных с гаплотипом А ингибирующих генов KIR2DL1, KIR2DL3 и KIR3DL1, и снижение — ассоциированных с гаплотипом В активирующих генов KIR2DS3 и KIR3DS1, в сравнении с аборигенами Австралии, у которых практически не встречается гаплотип А.

Как известно, функционирование конкретного KIR-рецептора зависит от наличия соответствующего HLA-лиганда. Поскольку HLA- и KIR-гены локализованы на разных хромосомах и наследуются независимо, совпадение лигандов и рецепторов является случайным, что приводит к большому разнообразию комбинаций KIR/HLA у отдельных лиц. Этот процесс образно назван «KIR-HLA лотерея» (С. Witt, 2010),

Анализ частоты встречаемости KIR-генов и пар KIR/HLA в обследованной группе здоровых лиц показал, что частота встречаемости KIR-гена и функционального KIR-рецептора существенно различаются (рис. 1). Так, частота встречаемости активирующего трехдоменного рецептора KIR3DS1 составила 35%, частота встречаемости соответствующего лиганда - 31%, но только 8% лиц имели и лиганд, и рецептор одновременно. Частота встречаемости гена KIR2DL1 составляет 96%, а пары KIR2DL1+HLА-С2 — 63% (х2=33,41; р<0,0001); гена KIR3DL1 — 96%, а комбинации KIR3DL1+ HLA Bw4 — 60% (/2=37,76; р<0,0001); гена KIR3DL2 — 100%, а сочетания KIR3DL2 + HLA АЗ/11 — 35% (Х2=96,30; р<0,0001).

KIR3DL2/HLA^3/11

___L_

KIR3DS1/HLA-Bw4 Не ВО К ^L- (27%) ■ R+L+ ■ g(8%> | R-L+ (23%) R-L- (42%)

KIR3DL1/HLA-BW4

K1R2DL1IHLA-C2

KIK3DI,2(10fl%)

A

R+L-(65%)

Ш.Л-3/П (35%)

KIR3DS1 (35%)

niA-ltw4 He 80 (31%)

KIR3DI.1 (96%) _A

R+L- (36%)

КийВ

Y

IILA-Bw4(61%)

ШШ (96%) A

ИМИ»

R+L- (33%)

R+L+ (63%)

V

ULA-C2 (66%)

10 30 10

50 SO 70 SO

Рис. 1. Частота встречаемости генов, кодирующих KIR-рецепторы и их лиганды, и пар KIR/HLA у здоровых лиц

Таким образом, частота встречаемости функционального KIR рецептора значительно ниже, чем кодирующего его гена, что необходимо учитывать при оценке вклада KIR-системы в развитие иммунного ответа, определении предрасположенности или резистентности к заболеваниям.

Анализ частот встречаемости групп HLA-лигандов для двухдоменных KIR рецепторов выявил значительные отличия восточно-славянской популяции Северо-Запада России от других европеоидов (табл. 1).

В обследованной нами группе обнаружена более высокая частота встречаемости лигандов - аллелей как группы HLA-C1, так и группы HLA-C2, что обусловлено высокой гетерозиготностью по этим группам.

При сходном с другими европеоидными популяциями распределении ингибирующих двухдоменных KIR-рецепторов, нами обнаружена значительно более высокая частота аллотипов лигандов HLA-C1, что приводит к повышению частоты встречаемости пар KIR2DL2/3+/HLA-C1+, что предрасполагает к большей активности естественных киллеров.

Таблица 1

Популяции HLA-лиганды

HLA-C1 HLA-C2 HLA-Bw4

Россия(п=100) 93,0 66,0 61,0

Чехия (п=125) 63,2* 36,8* 66,9

Португалия (п=38) 48.7* 51,3 68,4

Италия (п=50) 50,0* 50,0 72,0

Норвегия (п=363) 65,8* 34,2* 54,4

США (европеоиды) (п=255) 59,8* 40,2* 57,6

Испания (п=100) 60,0* 40,0* 58.0

Северная Ирландия (п=223) 68,9* 31,1* 50,8

Англия (п=99) 58,6* 41,4* 66,7

Дания (п=50) 82,0 62,0 50,0

Финляндия (п=35) 77,1 62,9 51,4

Примечание: * - различия в сравнении с восточно-славянской популяцией Северо-Запада России статистически значимы (р <0,001)

В ряде исследований было показано, что клиническая эффективность аллотрансплантации ГСК зависит от KIR-генотипа донора. S. Cooley et al. (2010) разработали алгоритм выбора предпочтительного донора для трансплантации при остром миелоидном лейкозе на основе особенностей строения центромерных и теломерных участков KIR-локуса, в соответствии с которым все доноры могут быть разделены на три группы: «наилучшие» («best»), «лучшие» («better») и «нейтральные» («neutral»).

Китай Южная Корея Таиланд Япония (популяция 3) Япония (популяция 2) Япония (Токио) Португалия Италия Франция Англия Чехия

США (европеоиды) Россия

□* 3*

Рис. 2. Частота встречаемости KIR-генотипов группы «best» в различных популяциях

Примечание: * - различия в сравнении с обследуемой группой статистически значимы (р <0,001)

В соответствии с этой классификацией в группе доноров ГСК Республиканского регистра обнаружена более высокая по сравнению с европейскими и азиатскими популяциями частота встречаемости КШ-генотипов, группы «Ьев1» (рис. 2). Это различие наиболее выражено при сравнении с азиатскими популяциями.

Особенности распределения КШ-генов, КШ-генотипов, функциональных пар ЮИ/НЬА и специфичностей НЬА I и II класса при ММ

Частоты встречаемости отдельных ингибирующих и активирующих КЖ-генов у пациентов с ММ не имели статистически значимых отличий от контрольной группы. При анализе распределения КШ-генотипов не было выявлено различий в частоте встречаемости групп генотипов АА (гомозигот по гаплотипу А) и Вх, а также отдельных КШ-генотипов в сравнении с группой практически здоровых лиц.

Сравнительный анализ распределения пар двухдоменных ингибирующих рецепторов со своими лигандами выявил повышение частоты встречаемости сочетания КШ2ЭЬI+/НЬА-С2+/НЬА-С1оказывающего сильный ингибирующий эффект на функциональную активность ИК-клеток у больных ММ: 16,7% по сравнению с 7,0% у здоровых лиц (1*11=2,57) (рис. 3). Частота встречаемости более слабой функциональной пары КШ2ВЬ2/3+/ НЬА-С1+ была ниже, чем в контрольной группе (82,0% ув. 93,0%, соответственно; 1*1^=0,36).

Усиление ингибирования

20 15 10 5 0

КЩ2ШЛ+/ Н1.Л-С2+/Н1А-С1-Г<0,05; №=2,57 .-*--

16,7

7,0

Здоровые

Здоровые ММ

Рис. 3. Особенности распределения функциональных КШ2БЬ генов в сочетании с генами, кодирующими их НЬА-С лиганды при ММ

К1К2Ш.2/3+/ Ш.ЛС1+ Р<0,05; КК-0,ЗЛ

Установленные нами различия позволяют предположить, что при преобладании ингибируюицего сигнала цитолитическая активность естественных киллеров подавлена, и это способствует ускользанию малигнизированных клеток от иммунного ответа и развитию ММ.

Сравнение иммунохимических вариантов ММ выявило выраженные отличия миеломы Бенс-Джонса, как от группы здоровых лиц, так и от других вариантов заболевания. Эти отличия характеризуются повышенной частотой активирующих КЖ-генов: КЖ2Б81 (71,4% уб. 40,0% в группе контроля; =4,93; ГЖ=3,49) и КШ20Б2 (78,6% уб. 47,0% в контрольной группе; х2 =4,90; Ю1=3,70) и самым высоким соотношеним аКШЛКШ среди всех проанализированных групп (рис. 4). Кроме того, при этом варианте установлено повышение частоты встречаемости НЬА-С*07 (42,9% уй. 26,5% у здоровых лиц; х,2 =5,36; 1Ж=4,44) и ОЯВ1*04, ассоциированной с «сильным» типом иммунного ответа, (21,4% ув. 8,0% в контрольной группе; %2=5,69; 1111=4,16).

аКЖЛКЖ

0,65

0,60

0.55

0,50 0.45 0,40 0,35 0,30

ММ О ММ А ММ М Здоровые

лица

Рис.4. Соотношение аКШЛКГК у больных ММ с различными иммунохимическими вариантами.

Развитие миеломы А ассоциировано с НЬА-В*27 (11,8% уя. 2,5% в группе контроля; х~ =7,02; ЯЯ=5,79) и 011В1*15, которая связана со «слабым» типом иммунного ответа, (29,4% ув. 12,5% в контрольной группе; х2 =9,91; ЯЯ=4,88).

Эти данные свидетельствуют о наличии генетически обусловленных различий в регуляции иммунного ответа, в том числе и функциональной активности NK-лимфоцитов. в зависимости от иммунохимического варианта ММ: для болезни легких цепей характерна более высокая генетически детерминированная активность как естественных киллеров, так и иммунного ответа в целом.

Множественная миелома, как известно, является «болезнью пожилого возраста», и развитие заболевания до 50 лет нетипично. Поэтому мы сравнили по изученным показателям выделенные нами три возрастные группы.

Обнаружено, что, в отличие от большинства пациентов, у больных с развитием заболевания в возрасте до 50 лет преобладают генотипы с высоким числом активирующих генов (рис. 5). Как видно из этого рисунка, величина соотношения aKIR/iKIR в этой возрастной группе наибольшая.

0,75

аКШЯКШ

0,70

0,65

0,60

3:

о: 0,85

0,50

0,45

0,40

0,35

Рис.5. Соотношение аКШЛКШ у больных ММ в зависимости от возраста начала заболевания.

При изучении особенностей распределения пар лиганд-рецептор было установлено, что у лиц с началом заболевания в возрасте до 50 лет комбинация КШ3081+/НЬА-В\у4(11е80)+ встречается в 5 раз чаще, чем у здоровых, и в 6 раз — чем у лиц с дебютом ММ в возрасте старше 65 лет (рис. 6).

26-50 л. 51-64 г. 65-80 л. Здоровые

лица

65-80 лет 51-64гсда 26-50 лет Здоровые

В+Ь-

(3-1.+

В+Ь- 6,67 в-ь-

1

В+Ь- в-ь+ вь

1

В+Ь- 8,00 ЯЬ+ ВЬ

ю

20

ЭЭ

40

50

70

90

100

Рис.6. Частота встречаемости функционального КШЗОвЬрецептора в зависимости от возраста на момент начала заболевания.

Исследование особенностей распределения генов НЬА и межлокусных сочетаний у больных с развитием ММ в возрасте до 50 лет позволило выявить положительную ассоциативную связь с НЬА-А*25, НЬА-ОЛВ1 *04 и сочетанием НЬА-А*25-В*18ЧЖВ1*04 (табл. 2).

Таблица 2

Некоторые особенности распределения специфичностей НЬА при развитии ММ

Здоровы Больные ММ

е лица 26 - 50 лет 51 - 64 года 65 - 80 лет

НЬА (п=100) (п= 14) (п= 30) (п= 34)

АЯ АР Г АР Г АР X"

(%) (%) Р RR (%) р RR (%) Р

7,10 1,32 <1 >0,05

НЬА -А*25 5,00 17,86 <0,05 4,99 1,67* >0,05 0,44 7,35

5,69 <1 >0.05 2,23

НЬА-ОЯВ1*04 8,00 25,00 <0,05 3,92 10,00 2,94* >0,05 0,18

НЬА-А*25- В*18- ОКВ1*04 3,00 21,42 8,36 <0,05 8,48 0,00* <1 >0,05 0,00* <1 >0,05

Примечание: * - различия в сравнении с группой больных с началом заболевания в возрасте от 26-50 лет статистически значимы (р<0,05)

У лиц с развитием заболевания в возрасте старше 50 лет выявленные для ММ особенности в распределении функционально значимых пар двухдоменных ингибирующих рецепторов с их лигандами проявились наиболее ярко (рис.7).

КШ2ШЛ+/ HLA-C2+/HLA-C1 - P<0,05;RR=3.40

Здоровые 25-50 п 51-64 г 65-80л

Рис.7. Частота встречаемости KIR2DL1+/HLA-C2+/HLA-C1- у больных ММ в зависимости от возраста начала заболевания.

В группе больных с началом заболевания в возрасте старше 65 частота встречаемости гомозигот по сочетанию KIR2DL1+/HLA-C2+, обладающему ( выраженным ингибирующим действием на функциональную активность естественных киллеров, была в 3 раза выше, чем у пациентов с дебютом ММ в возрасте младше 50 лет и у здоровых лиц.

В этой же группе обнаружено повышение частоты встречаемости HLA-DRB 1*15 и межлокусного сочетания HLA-B*07 - HLA-C*07 - HLA-DRB1*15, и снижение — HLA-C*12 (табл. 3).

Таблица 3

Некоторые особенности распределения специфичностей НЬА при развитии ММ в возрасте старше 50 лет__

HLA Здоровые лица (n=100) Больные MM

26 - 50 лет (n=14) 51 - 64 года (n=30) 65 - 80 лет (n=34)

AF (%) AF (%) x1 P RR AF (%) t1 P RR AF (%) f P RR

HLA -DRB1*15 12,50 7,14 <1 >0,05 20,00* 3,87 p<0,05 2,36 16,18* 1,47 p>0,05

HLA-B*07-C*07-DRB] *15 8,00 0,00 1,20 p>0,05 30,00* 9,83 p<0,05 6,27 14,71* 1,30 p>0,05

HLA -C*12 11,50 17,86 1,07 p>0,05 3,33* 3,96 p<0,05 0,29 8,82 <1 >0,05

Примечание: * - различия в сравнении с группой больных миеломой 26-50 лет статистически значимы (р<0,05)

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что для лиц с более поздним развитием заболевания характерно генетически детерминированное снижение функциональной активности естественных киллеров, обусловленное повышением частоты встречаемости функциональных лиганд-рецепторных пар, обладающих наиболее мощным ингибирующим воздействием. В отличие от этой группы, у больных с началом заболевания в возрасте до 50 лет обнаружен выраженный активационный потенциал KIR-системы, обуславливающий более высокую активность естественных киллеров.

Особенности распределения генов, кодирующих КШ-рецепторы и их лиганды, в зависимости от эффективности терапии бортезомибом

Несмотря на высокий уровень общего ответа при использовании бротезомибсодержащих программ терапии, у части больных ответ на лечение отсутствует. Одним из механизмов действия бортезомиба является способность снижать экспрессию антигенов HLA I класса на миеломных клетках, повышая, таким образом, их чувствительность к контактному цитолизу, опосредованному NK-лимфоцитами (Shi J. et al., 2008).

Анализ эффективности терапии у больных с различными KIR-генотипами представлен на рисунке 8.

Генотип АА Генотип Вх

Рис. 8. Эффективность терапии бортезомибом в зависимости от КШ-генотипа

В группе больных с АА-генотипом, для которого характерно наименьшее число активирующих генов, объективный ответ достигнут в 100,0%, тогда как у трети пациентов с генотипом Вх терапия была неэффективна.

Также установлено повышение частоты встречаемости генотипов с высокими значениями соотношения аКШЛКШ. (0,61-1,00) в группе больных с отсутствием ответа на терапию (73,3%) по сравнению, как с группой здоровых

лиц (36,0%; х2 =7,52; RR=4,52), так и с больными, ответившими на терапию бортезомибом (34,7%; х2= 6,97; RR=4,75) (рис 9.).

Н ет отв ета

Объективный ответ

Здоровые лица

26,7 73,3

-

22,5 40,8 0 1 3 ш

23,0 30,0 11,0 36,0

80

90

100

□ 0,2 □ 0,33-0,50 □ 0,51-0,60 НО,61-1,00

Рис.9. Распределение KIR-генотнпов с различным соотношением aKIR/iKIR у больных ММ в зависимости от эффективности терапии

В группе больных с объективным ответом на терапию, установлено усиление ингибирующего сигнала от КЖ-рецепторов за счет повышения частоты гомозиготности по сочетанию КШ2ЭЫ с НЬА-С2 (рис. 10). ШШ+/Ш-С2+/Ш-С1

Р<0,05

А

25 20 15 10 -5 О

Г

7,0

6,7

iliilllt

Здорзеэи

Объемней ответ

Отсутствие ответа

Рис.10. Частота встречаемости сочетания KIR2DL1+/HLA-C2+/HLA-C1- в зависимости от эффективности терапии

Отсутствие ответа на терапию ассоциировано с повышением частоты встречаемости комбинации трехдоменного активирующего рецептора КГО3081 и его лиганда НЬА-Ви4(11е80) (рис. 11). Как видно из рисунка у больных, не ответивших на терапию бортезомибом, данная пара встречается 3,4 раза чаще, чем у здоровых лиц, и в 2,6 — раза чаще, чем в группе пациентов, у которых был достигнут объективный ответ.

Р<«,05

ШОШАМПей) л

20

г? 15 11

10

5 -

8.0

Здоровые

Объективный ответ

Отсутствие ответа

Рис.11. Частота встречаемости сочетания KIR3DS1+/HLA-Bw4(lle80)+ в зависимости от эффективности терапии

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что при преобладании у больного функциональных ингибирутощих рецепторов, снижение экспрессии соответствующих HLA-молекул — лигандов к этим рецепторам на потенциальных клетках-«мишенях», делает возможным реализацию NK-опосредованного контактного цитолиза. В то время как при развитии ММ на фоне достаточно выраженной генетически обусловленной активности NK-клеток, снижение экспрессии лигандов для ингибирующих рецепторов не всегда оказывается эффективным.

Таким образом, KIR- и HLA-системы играют ведущую роль в определении индивидуальных генетически детерминированных особенностей регуляции противоопухолевого иммунного ответа у больных ММ. Нами впервые выявлены особенности распределения генов KIR-рецепторов и их лигандов в восточнославянской популяции Северо-Запада России. Показано, что KIR и HLA-генотипы больного относится к числу факторов, влияющих на возникновение и клинические особенности ММ. Определены KIR-гены и функционально значимые сочетания KIR/HLA, ассоциированные с отдельными иммунохимическими вариантами ММ и возрастом начала заболевания. Установлено, что преобладание ингибирующих KIR-генов ассоциировано с достижением объективного ответа при лечении бортезомибом.

Выводы

1. Распределение КЖ-генов в восточно-славянской популяции Северо-Запада России имеет как выраженные черты сходства с другими европеоидными популяциями, так и характерные особенности, обусловленные различиями в частоте встречаемости активирующих генов: более высокой для КШ2083 и более низкой для КШ2085, а также большей частоте встречаемости комбинаций КШ20Ь2/3+/НЬА-С1+, обладающих слабым ингибирующим влиянием на цитолитическую активность естественных киллеров.

2. У больных ММ повышена частота встречаемости сочетания КШ2БЫ с его лигандами группы НЬА-С2, оказывающего наиболее выраженное ингибирующее влияние на функциональную активность ЫК-лимфоцитов, и снижена — КЖ20Ь2/3+/НЬА-С1 +.

3. Развитие ММ у пациентов в возрасте старше 50 лет ассоциировано с гомозиготностью по сочетанию КШ201Л+/НЬА-С2+, оказывающему выраженное ингибирующее действие на функциональную активность естественных киллеров.

4. У больных с началом заболевания в возрасте до 50 лет преобладают КГО-генотипы с высокими значениями соотношения аКГОЛКШ, и повышена частота встречаемости функциональной пары КШ3081+/В\у411е80+, что обусловливает большую активность естественных киллеров.

5. Частота встречаемости сочетания КШ20Ы+/НЬА-С2+ повышена в группе больных миеломой в. Высокие значения аКШЛКШ, а также наличие НЬА-С*07, НЬА-Б11В1*04 ассоциированы с миеломой Бене-Джонса. У больных с наличием НЬА-В*27 и НЬА-ЭЯВ1*15 выше риск развития миеломы А.

6. Развитие ММ у лиц моложе 50 лет ассоциировано с НЬА-А*25, НЬА-ОИВ1 *04 и межлокусным сочетанием НЬА-А*25 - НЬА-В*18 - НЬА-ОКВ1*04, тогда как при развитии заболевания в старшем возрасте повышена частота встречаемости НЬА-ОИВ 1*15 и межлокусного сочетания НЬА-В*07 -НЬА-С*07 - НЬА-ОЯВ1*15, а наличие НЬА-С*12 обладает протективным эффектом.

7. Повышенная частота встречаемости генотипов с высокими значениями соотношения аШИЛКЖ (0,61-1,00), наличие функционально значимой пары КШ3081+/Вш411е80+ и отсутствие АА-генотипа являются маркерами генетической предрасположенности к отсутствию ответа на терапию бортезомибом. Гомозиготность по сочетанию КШ20Ы+/Ш.А-С2+ ассоциирована с достижением объективного ответа на бортезомибсодержащие программы терапии.

Практические рекомендации

1. Данные об особенностях распределения КШ-генов в восточно-славянской популяции Северо-Запада России рекомендуется использовать в качестве

группы сравнения при проведении исследований по проблеме «KIR и болезни».

2. Типирование KIR-генов у доноров гемопоэтических стволовых клеток рекомендуется проводить в дополнение к HLA-генотипированию для выбора наиболее предпочтительных доноров с целью повышения эффективности аллогенной трансплантации ГСК. 3.Обнаруженные ассоциации KIR и HLA генов с ММ могут быть использованы для формирования групп риска и прогнозирования эффективности лечения больных.

4.Молекулярно-генетическое тестирование необходимо проводить перед началом терапии бортезомибом.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Соколова Ю.В. Строение и функции иммуноглобулинподобных рецепторов киллерных клеток в норме и при патологии / Ю.В. Соколова, JI.H. Бубнова, С.С. Бессмельцев // Медлайн.Ру (Medline.Ru) (электронный журнал). - 2010. - Т. 11.-С. 635-657.

2. Соколова Ю.В. Роль KIR и HLA в регуляции функциональной активности NK-клеток у человека / Ю.В. Соколова // Вестник гематологии. - 2011. - №1. С.77-78. 3.SokoIova J.V. KIR genes in Russian population of the Northwest region / J.V. Sokolova, L.N. Bubnova, I.E. Pavlova, S.S. Bessmeltsev // 2011 KIR Workshop, 2011. Tammsvik, Sweden. June 15-17, 2011. - Abstract book. - B-6. - P.20

4. Соколова Ю.В. Генетические особенности иммуноглобулинподобных рецепторов киллерных клеток у доноров стволовых гемопоэтических клеток / Ю.В. Соколова //Вестник гематологии - 2011. - №2. - С.68.

5. Соколова Ю.В. Сравнительная оценка методов HLA-типирования доноров гемопоэтических стволовых клеток / И.Е. Павлова, Ю.В. Соколова, Е.В. Беляева, Н.В. Реутова// Вестник гематологии. - 2011. - №2. - С.67.

6. Sokolova J.V. Inhibitory KIRs and their HLA ligands in Russian population from Northwest region / J.V. Sokolova, L.N. Bubnova, I.E. Pavlova // Human Immunology. -2011,-Vol. 72., S. l.-P. S128.

7. Sokolova J. The KIR profile of potential donors of the Republican Register of bone marrow/hematopoietic cell donors / J. Sokolova, L. Bubnova, I. Pavlova, S. Bessmeltsev // Cellular Therapy and Transplantation. - 2011. - Vol. 3., No. 12. - P. 102.

8. Соколова Ю.В. Генетические особенности иммуноглобулинподобных рецепторов киллерных клеток у доноров стволовых гемопоэтических клеток / Ю.В. Соколова, JI.H. Бубнова, И.Е. Павлова, С.С. Бессмельцев // Онкогематология. - 2011. - №4. - С. 33-38.

9. Соколова Ю.В. Особенности распределения иммуноглобулинподобных рецепторов киллерных клеток и их HLA-лигандов в русской популяции / Ю.В. Соколова, Л.Н. Бубнова, И.Е. Павлова, С.С. Бессмельцев // Фундаментальные исследования. - 2012. - №1. - С. 115-120.

Подписано в печать «17» февраля 2012 г. Формат 60x84/16 Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 489

Отпечатано в цифровом копировальном цетре «Восстания -1» 191036, Санкт-Петербург, Восстания, 1.