Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Исследование механизма действия цитолитических лимфоцитов: идентификация цитотоксических белков, характеристика процессов в клетках-мишенях, индуцированных действием лимфоцитов

с ^

^ а ^

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И ВДИЦИНСКОП ПРОМЫШЛЕННОСТИ российской ФЕДЕРАЦИИ ИНСТИТУТ ИММУНОЛОГИИ

На правах рукописи

ГНУЧЕВ НИКОЛАИ ВАСИЛЬЕВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ ЦИТОЛИТИЧЕСКИХ ЛИМФОЦИТОВ: ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ БЕЛКОВ,ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОЦЕССОВ В КЛЕТКАХ-МИШЕНЯХ, ИВДУЦИРОВАННЫХ ДЕЙСТВИЕМ ЛИМФОЦИТОВ.

14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 1994

.Работа выполнена в .Институте биологии гена Российской -Академии.Наук

Официальные оппоненты: Член-корреспондент РАЕН, доктор биологических наук, профессор В.Я. Арион

Доктор биологических наук, профессор О.Л. Поляновский Доктор-медицинских наук, профессор Л.П. Алексеев

Ведущая организация - Научно-исследовательский институт — вакцин и сывороток 'им. И. И. Мечников а РАМН

Защита состоится "Ж." _ 1994 года

в часов на заседании диссертационного совета Д 074.09.01 ,

при Институте иммунологии Министерства здравоохранения и медицинской промышленности К& по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24, корп. 2

С диссертацией моашо ознакомиться е библиотеке Института иммунологии Министерства здравоохранения и медицинской промышленности №.

Автореферат разослан "_" _ 1994 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Л.С. Оеславина

Актуальность проблема. В деструкции опухолевых клеток ютвувт макрофаги, полиморфлоядерные лейкоциты, тромбоциты, Т- и шуфшпты, естественные киллеры, ео ведущая роль в этс:( процессе юдится цитолптическим лимфоцитам. 3 современной юыунологки шланг три типа цитолитическнх лгфэцитов: жген-сгоцифическив ЬШС-рестриктированные цитологические ПЕ.фзшггы 1ЦТЛ), МНС-нерестриктированные цитоЕгтичоские пшфоцнты и естественные киплерныо клетки ШИК Клетки 1-го га отвечают зе. так называемую "классическур" цитотокскчность -чггэн-спецЕфшгескуга и зависящую от коекспрессии • антигенов шного комплекса гпотосовмэстимости на шверхпости ■ток-кишеней (ЮЛ. МНС-нерестриктишванные ЦЕЛ и ЕКК опосредуют ¡классическув" цитотоксичность - Ентиген-веспецифическув и не запяченную по антигенам главного комплекса гистосовместкмсстп.

Описание действия НЕтерьчейкипа-г 1ИЛ-2) на цитаток- ' iqckeíí потенциал лимфоцитов периферической крови человека 'озенбэргом ! 19321 и лечение злокачественных новообразований •одом адоптивной шялуЕСТ9рапии привлекло пристальное Енималие >ных к еше одному типу клеток - лимфокив-активпрованных иероЕ (ЛАК-кнеток), обладакцкх высокой противоопухолевой ■шшостьа как In vitro, так и in vivo.

Все эти типы клеток имеет существенные различия в щохоздеиии ¡дифференцируются из различных предшественников!, в ¡прэссии антигенов на клеточной мембране, в специфичности по гашению к спектру КЫ, но практически не отличается по своей пщиональной активности.

Предполагается существование единого механизма лизиса гтлевых КМ посредством этих трэх типов эффекторов и взаимо-ícTBHe цитолитических лимфоцитов (ЦП) с КМ метано описать сле-зщей схемой:

„ 2+

_> Са-

ЦЯ * КМ <— цл - КМ -> ВД - КМ1->ЦЛ + КМ'

Как видно из этой схемы, цитолиз состоит из нэс-

[ьких дискретных стадий. Первая стадия этого процесса,

затимая, представляет собой узнавание соответствующих

(вптороЕ и связывание лимфоцита на мембране КМ. Пии отсутствии е 2+

)до ионов Са наблвдается диссоциация образованных конъшгатов и

2+ _

цитолиз прорывается. Наличие в среде ионов Са обеспечивает развитие процесса цитолиза во времени. Наступает стадия, получившая название "летальный удар", ео время ■ которой о существ лявтся "программирование" КМ к лизису. После диссоциации конъюгатов происходит лимфоцит-независимый цитолиз КМ, "запрограммированный" на 2-ой стадии.

' ' Существует ряд серьезных проблем в исследовании механизма противоопухолевого действия цитолитичесюпс лтфэцнтов, Однако из анализа вышеприведенной схемы наиболее принципиальны! представляется выяснение двух вопросов:

1. Какие биохимические процессы происходят на стада программирования ЮЛ к лизису?

2. Какова роль КМ в процессе цитолиза?

К настоящему времени накоплен обширный материал по биологии цитолитических лимфоцитов и установлено, что 5ф£екторны( лимфоциты содержат в цитоплазме цитолитические гранулы повреждение которых прерывает лизис КМ. В связи с этим широкое распространение получила секреторная модель лизиса. Согласно ето] модели после связывания ЦЯ на мембране КМ происходит освобождение в зону контакта содержащихся в' гранулах цитотоксических белкой которые, в свою очередь, взаимодействуют с. мембрана КМ, обуславливая тем самым ее лизис. Очевидно, что выделение эти белков и исследование их функциональной активности моаёт послугит: юшчевым моментом в исследовании механизма противоопухолевого действия цитолитических лтфэцитоЕ. В решении > этой проблем наиболее перспективными представляются два подхода. Первый подход закатается в выделении цитолитических грану, еффекторных лимфоцитов и изучение белкового состава втих гранул Так одновременно и независимо несколькими группами е разнн: странах в гранулах ЕКК и ЩШ был обнаружен белок с молекуляряо: массой 67-70 кДа, получивший название перфорин.Было показано : присутствии ионов Са2+ этот белок упорядочений псишмеризуется н мембране аратроцитов с образованием пор - полых цилиндров с внутр ним диаметрам 5-20 нм. Образование таких трансмембранных канало: приводит- к нарушению коллоидно-осмотического равновесия и быстром гемолизу эритроцитов. Кроме перфорина в цитолитических гранула было обнаружено семейство сериновых протеаз - ВП-эстераз. Эт

руппа высокогомологиченх белков, роль которых в цитолизо оконча-вльно не установлена. Недавно [ 1991 i был проклонировнн ген и □лучена одна из Б1.т-8стераз грушш В. Этот белок, с молекулярной ассой 30 кД, получивший название фр^гянн^тин, вызывает цитолиз леток в пшсутствгЕ пврфорина по типу апоптоза. Этим практически счерпывается иЕфорлация о белках цитолитических гранул.

Второй подход к исследовании цетотокахчесхих белков яшшчается в стимуляции секреции этих белков из лшлфацигов в зону внтакта с КМ и получении после центрифугирования суспензии клеток :упернатаЕта, обладавшего цитотоксическим действием на спекие КМ. 'нкнм образом были получены супернатанты ЕКК и ЦГЛ, оОладагсде шсоксй цитатокскчвостью в отношении широкого спектра опухолевых иеток. Хрсматографзчесхий и электрофоретический агализ этих зупернатаптсв распирал существовавшие рэлээ представления о бел-шх, • обладавших цитотоксическим действием на клетки. Кк наряду с 1 ззвестными ростовыми факторами, способными тшие лизировать клетей, такими как THF. ЛТ, ИЛ-1, г-интерферон, в суперкатанте ЦЛ эбнаруяены не описанные ранее белки с молекулярной кассой 60 кД. 45-30 кД, 12 кД, 5 кД. Однако эти цитотоксические белки до настоя- . дэго времени недостаточно полно охарактеризованы. Возжэено, что спектр этих балков не ограничен перечисленными.

Многое остаэтся неясным и относительно участия КМ в процессе цитолиза. До недавнего времени в иммунология господствовала коллоидно-осмотическая гипотеза гибели клеток. Согласно этой гипотезе активная роль отводится только о$фекторзым клеткам, КМ являшея пассивными участниками цитолиза. В результате контакта с лимфоцитом возникают поврзндения в плазматической мембране КМ, образуются поры, через которые вытекают ионы К+, низкомолекулярные и высокомолекулярные компоненты цитоплазмы, которые замещаются ионами Na" и водой, что ведет к осмотическому разбухании и лизису КМ по типу некроза.

Однако, в литературе накоплены многочисленные экспериментальные данные, противоречащие этой гипотезе. Методом цен-траферной микрокиносъемки было показано, что гибель КЫ наступает внезапно и начинается с цейза-пузырения и вспенивания цитоплазмы, соправокдапцегася клазмотозом. Осмотический лизис наступает post mortem. В 1983 г. были опубликованы данные Дыжа и Ковна о

. ^ , . . - ■

том, что после диссоциации кофактора с поверхности КМ, в КМ с неповрезденной мембраной наблщцается фрагментация ДКК на нук-леосомяые фрагменты 180-200 пйр оснований, и гибель клеток происходит по типу апоптоза. Эти результаты привели к создании новой гипотезы, согласно которой НЫ представляется активным участником процесса цитолиза. При взаимодействии с лт.фэцптом в КМ, по-видижзму, активируются регуляторные процессы, запускающие каскад собственных ферлентных систем деградации, приводящих к гибели клеток по типу апоптоза.

Обнаружение в цитолитичаских гранулах эффекторннх лмфацитов пэрфорина, способного образовывать поры в мембранах клеток и иаещвго структурное и функциональное сходство с Сд-компонентом системы комплемента явилось весомым аргументом в подчеркну коллоидно-осмотической гипотезы. Однако в литературе продолжают появляться факты, свидетельствующие о гибели клеток по типу апоптоза.

Суммируя вышеизложенное, следует отметить, что в настоящий момент нет четкого представления о том, какие факторы определяет механизм гибели клеток.

Таким образом, несмотря на очевидный успех в характеристике белковых факторов, секретируемих при взаимодействии 'ЦЯ с КМ, много вопросов относительно роли этих* белков остается " невыясненными.

Цель и задачи исследования. Главной целью настоящего исследования явилось расширение представления о свойствах и функциях цитотоксических белков, секретируемих ЦЛ, и механизма взаимодействия этих белков с опухолевыми клетками. Конкретными задачами были:

1) изучение белков, секретированных ЕКК при их взаимодействии с КЫ. Установление функциональной активности в тих белков -в процессе цитотоксического действия.

2) выявление биохимических процессов в КМ, обуславливать их лизис под действием ЦГЛ.

3) изучение ферментных систем, участвущих в регуляции процесса цитолиза.

Научная новизна и практическая ценность. Охарактери-

ван состав секрэтированных НКК (NKCF) белков и установлена

акциональная связь мэзду секратируемыми и гранулярными белками. В

ставе HKCF обнаружен белок с молекулярной массой 67 уД,

алогичный гранулярному порообразущему белку перЬорину. Получены-

касательства зависимости цитотоксичвской активности NKCF от

0+ _

зсутствия среди белков NKCF Са" связыващего белка кашгадулина и

уппн сериновых ггротеаз. Установлено, что лизис клеток под

йствием NKCF-Ca2* - зависимый двухстадийный процесс. 3-я стадия

ратимая, наступает через 30 кинут взаимодействия NKCF с. КМ,

язана с временным поврекдением мембран КМ. 2-я стадия

едставляет собой необратимую гибель клеток через 24 часа.

арактврззоЕаны белки, ответственные за различные стадии цитолиза.

1казано, что белок NKCF, аналогичный по электро- форетической

¡двиэяасти п тиуиаре активности гранулярному порфоргпгу, обладает

¡ратикым' цитотоксическим действием на клетку. Его функциональная

шь заклачаотся в модуляции процесса лизиса, обусловленного

¡йствием других белков. Установлены молекулярные массы этих

untos. Показано, что кявтки-?.шшэни - активные участники процесса

гголкза, н их гибель обусловлена активацией лазоссм и ядерннх

гклэаз, приводящих к фрагментации ДНК. Показано, что в клетках-

ппенях индуцируется смепанный тип цитолиза, в котором присутствует

и;-апоптотические,' так и некротические -хнрщста—-ристшта. Проведено

130б1дение некротического и апоптотичаского путей гибели. Показано,

со некрттячвский процесс, зависит от активации лизосом. Показано

;астие ферментов аденилатцихлазной системы в регуляции цитолиза

неток-мишоней по типу некроза."

Учитывая ту роль, которую играет цитологические э.фэциты в противоопухолевом иммунитете, мсхно считать, что мученные данные представляют как практический, так и теорети-эскей ЕЕтерос. Описание цитотоксическкх белков, входящих в □став NKCF, открывает перспективу получения этих белкаЕ в гоио-внном состоянии и, в дальнейшем, получения реютгбишштних елкс-в, обладающих противоопухолевым действием, что позволит спользозадь их в клинической практике. Выявление ферментах систем, участвудстх в процессе' цитолиза, представляет путь вправленной регуляция цитолитического действия лимфоцитов.

направленной регуляции цитсиштичеокого действия лимфоцитов.

¿гробацая работы. Основные результаты работы диссертации докладывались на 16-й конференции ФЕБО (Москва, 1934), на совещаша "Механизмы интерфазной гибели клатск" I Пущино-ыа-Окэ, 1984), на всесоюзном совещании "Актуальные вопросы клеточной биологии" «Ленинград, 1984), 14-м Международном биохимическом конгрессе I Прага, 1988), 17-м совещании УКЛА симпозиума по молекулярной и клеточной биологии < Лоо-Анжелес, 1988), 2-й Международна конференции по фактору некроза опухолей и связанным цитокинам (Кала, Калифоршш, 1989), Всесоюзном симпозиуме по хемии белка (Тбшкси, 1990), Всесоюзном симпозиуме по молекулярной и клеточной шкобиологии (Львов, 1990), симпозиуме "Структура и функция рагуляторных полипептидов" (Москва, 1992), на 8-м Мввдународнги иммунологическом конгрессе (Будапешт, 1992).

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ I. ЦИЮТОЮЗНЕСКИЕ БЕЛКИ, СЕКРЕТИРУШЕ ЕКК.

Наличие цитотоксических гранул в цитоплазме всех типов цитолитичесгах лимфоцитов позволило создать секреторную модель лизиса опухолевых клеток. Возмопность выделения гомогенной фракции гранул привала к описанию белков, участвующих в цитолизе. Основными балками гранул были перфорин и группа свриновых протеаз -ВЬТ-эстераз. Однако до настоящего времени не было попытки установить функциональную связь меяду гранулярными белками и белками, освобождающимися в зону контакта при взаимодействии лимфоцитов с" КМ. Бонавида [1981] продемонстрировал наличие цитотоксичесхой активности в супернатанте ЕКК после их инкубации с ■линией клеток К-562. Этот супернатант получил название ЫКСР.

Езвестна, что ЕКК принадлежат к супергранулярным лимфоцитам и их активность находится в прямо пропорциональной зависимости ог количества азурофильных гранул в клетках. Исследование функциаЕвльнай роли белков, входящих в состав ИКСР, представляется удобным подходом -для установления корреляции менду активностью гранулярных и с акре тируемых белков.

б

НКСР - ПОЛКфУНКЦИОШЛЬНШ ЕЕЛКОЙИ КШЕЛЕКС

Электрофаретический анализ секреторных белков показал, то ККСР представляет собой сумму белков с молекулярными массами 6-62, 42; 38, 30-28, 24, 12 кД^ Аналогичные' результаты были поучены ранее при исследовании белкового состава гранул. Хенкартом : Чопом ! 19841 были определены для гранулярных белков слэдупдие галекулярные массы: 70-60, 40-38, 30-28, 24 цД. Такое совпадение шектрсфорэтической подвижности гранулярных и секреторных белков юслуашш основанием для сравнительного изучения функциональной исгивности этих белков.

На рис Л приводится скорость гидролиза тиоСензилового ¡фира Н-а-С02-Ь-лизина (ВИ) препаратом ККСР, на рис.2 приводится содавление НКСР-зависимого лизиса клеток РЖР-ипгибиторам ¡ершовых протеаз.Приведенные данные демонстрирует не только грисутствие ЗИ-встераз в составе ЖСИ, но и участие этой группы ^ гротеолитических ферментов для проявления цитотокоическога ;ействия ИКСР.

Как уке упоминалось выше, цитолитическое действие гранул в осеовном связывается с активностьв перфорина, белка с голекул'ярпой массой 66 кД, способного образовывать поры на лембрэне клеток в присутствии 5 шМ . Поэтому мы псследозали ззеимодсйствие балков НКСР с антителами к гранулярному перфорину, пзбезно прэдоставлепному нам проф.Чопом (Швейцария). Икяуноферкен-гный' анализ препарата 'ККСР с поликлональной сывороткой к перфорину -: см.рис.3) показал присутствие пммунореактивного материала в ИКСР. Лсяшо видеть, что антитела к перфорину взаимодействует только с эдшзм белкам НКСР, электрофоретическая подвиеность которого совпадает с электрафоретической подвикеЗстью гранулярного перфорина (67 кЦ). Из результатов, приведенных на рис.4, очевидно, что взаимодействие этого белка с антителами к перфорину приводит к кн-гаоировапию цитатоксического действия НКСР. Обнаружение в препарате НКСР белка, аналогичного по алектрофоретической подвиееости и Емиунореактнвносст с гранулярным перфорином, позволило перейти к

выяснении влияния ионов Са па активность НКСР. Из данных рис.5

р+ _

следует, что увеличение концентрации ионов Са до 5 е.4 приводит к проявлению значительной активности МКСР в течение 20 мин. взаимодействия с КМ. Такая высокая активация цитотоксичности ИКСР

А(405 нм)

0,3-0,2_ 0,110 20 30 40 50

нг. МКСР

Рис.1 ВЬТ-эстеразная активность ИКСБ в зависимости от концентрации белка.

48

время (час.)

Рис.2 " йнгнбирование цитотоксического действия МКСИ .РМСК

ЖСИ (100 иг. белка)

---ИКСР в присутствии 10"'М РМСР

9

(

Рис.3 Взаимодействие белков ЫКСБ с антителами к гранулярному перфорину.

1. Электрофорез белков NK.CE в 16% акриламидном'геле в присутствии БОБ. Белки окрашены ^N0].

2. Обработка белков ИКСИ после переноса на нитроцеллюлозную пленку сывороткой кролика, содержащей антитела к гранулярному перфорину (разбавление 1:100).

Разведение антител

Рис.4 Зависимость цитотоксйческого действия НКСР от концентрации антител к гранулярному перфорину.

«

о я в*

0

1 й

30 -

20

ю-

10

15

20

25

I (глин.)

Рнс.5 Кинетическая кривая изменения активности ИКСБ в присутствии 5 мМ Са и антител к калмодулину

.1. активность ИКСЕ (100 гщ белка),

2. активность ИКС? в присутствии 5 мМ Са",

3. активность ЫКСБ в присутствии антител к калмодулину.'

ионами Са подразумевает такае . участие в ККСР-завиотмом лизисе клеток известного модулятора действия кальция на клетки калмодулина. Обычно для обнаружения микроколичестЕ калкодулина в тканях успешно применяется радаоиммунологический метод детекции. Используя этот метод, мы определили, что в препарате ИКС? со-деркится белок, реагирущий с антителами калмодулина (рис.6). Так ив, как и увеличение ионов Са в среде, добавление к препарату ЖСР антител . к калмодулину приводит к росту цито-токсической активности КЮТ (рис.5,кривая 3).

Вышеприведенные результаты демонстрируют наличие корреляции мевду цитолитическим действием гранулярных белшв и Ь'КСР. Цитолиз клеток под действием ЖСГ зависит от присутствия в препарате НКСР группы ВИ-эстераз калмодулина и белка, аналогичного по ряду свойств гранулярному перфорину.

[I. ЦИТОЛИЗ КЛЕТОК ПОД ДЕЙСТВИЕМ НКСР - КАЛВДШ-ЗАВШЕЗШ МНОГОСТУПЕНЧАТЫЙ ПРОЦЕСС.

Детальное исследование активности МКСР от концентрации

2+

ионов Са позволило выявить многостадийный характер ЖСТ-зависи-

кого лизиса. На рис.7 приведена кинетическая кривая изменения

цитотоксического действия ИКСР при различной конценттации иснов 2+ * 2+ .. Мокно видеть, что ЖСР не обладает активность!) Са ,И пМ 2+

ЭГТА). При концентрации Са 1 шМ цитолиз развивается медленно, постигая максимума через 48. часов инкубации (рис.7,кривая 1). Зовышение концентрации ионов кальция вдвое практически вдвое увеличивает цитолитическуи активность ИКСР (кривая 2). Дальнейшее увеличение концентрации ионов кальция до 5 тМ приводит не только к ускорении процесса цитолиза, но и к изменении форш кинетической кривой. В этих условиях наблвдавтся два максимума цитолитической активности НКСР (кривая 3). Первый максимум проявляется через 15-30 минут инкубации и достигает 35* цитолиза. Затем следует патентный период, во время которого метки утрачивают способность экрашиваться тришновым синим, через 24 часа наблюдается второй лаксимум цитолитической активности. За 24 часа инкубации под 1бйствибм ИКСР погибает в среднем 70-80« клеток. Как видно из зис.7, добавление ЭГГА в концентрации 5 пМ через 1,5 часа

ng калмодулииа / образец

Рис.6 Определение количества калмодулина в NKCF.

t

&

т

л н о

о ^

о н о н

I (час.)

Рис.7 Кинетическая кривая изменения активности ЫКСР

2+

в зависимости от концентрации ионов Са .

1. ИКСР в присутствии 1 мМ СаС1 ^ >

2. ЫКСБ в присутствии 2 мМ СаС12 ,

3. ИКСБ в присутствии 5 мМ СаС1 ^ ■

4. NK.CE в присутствии 5 мМ СаС12 >

при добавлении ЕвТА через 1,5 часа после начала инкубации цитотоксичности.

инкубации и палноэ связывание кальция на влияет на акгивност: второго пика. Кривые 3 и 4 на рас.7 практически совпадаю По-видимому, в течение 1,5 чесов взаимодействия МСР с 1Ш ггроис-^ ходит программирование клеток для-лизиса.

Дискретный характер кинетической кривой лизиса клеток, обусловленного действием НКСР, предполагает апьтернативноЕ объяснение существования двух максимумов активности. С одно! стороны, это могут быть два независимых процесса лизиса, протекающих с различной скоростью, с другой стороны - две взаимосвязанные стадии одного процесса. Для выяснения зтого вопроса мы исследовали кинетику изменения цитотоксической активности ККСР в присутствии антител к гранулярному перфарину я калмодулину.

На рис.8 показана, что добавление антител к перфарину приводи к практически полному ингибированшо первого, Двадцатиминутного максимума активности НКСР. При этом наблвдается значительное снижение активности и через 24 часа. Обработка препарата МСР антителами к калмодулину приводит к дискретности процесса цитолиза 11 тМ> даже при низкой концентрации кальция. Как и в присутствии 5 еМ ионов Са2+, через 30 минут появляется первый пик активности, второй - через 24 часа (рис.9). Таким образом, ■изменение активности второго пика Зависит от модуляции'активности первого пика, что однозначно указывает на взаимосвязь двух втапав ЛКСР-зависимаго лизиса.

На рис.10 приводится график зависимости цитолктической активности от концентрации ИКС? для первого и второго пиков. Можно видеть, что активность первого пика практически не зависит от концентрации белка. Кривая выходит на плато ухе при концентрации 50 мг/мл. В то не время активность второго пика увеличивается прямо пропорционально концентрации белка. На основании етих результатов можно предположить,' что^за различные стадии цитолиза под действием ИКОР, по-видшому, ответственны различные белки, отличающиеся сродством к рецептарам на мембране КМ. Интересен тот факт, что при концентрации 50 мг/ыл клетки достигают максимальной, активности через 30 мин., а их 24-часовая активность близка к .. нулю. Клетки остаются гивыми, несмотря на то, что они прошли стадию повреждения в течение первых 30 минут взаимодействия с

2 80 с

о

2 « о 60

м о н о Й

3 40

20

24

30 1 (час.)

Рис.8 Влияние антител к перфорину на цитотокснческое действие МКСР.

1. МКСР в присутствии 5 мМ СаС1 2 ,

2. ИКСИ в присутствии 5 мМ СаС^ и антител к гранулярному перфорину.

« 80.1 л

Б

0

1

о м о и о

Е 404

20-

12

24

30 1 (час.)

Рис.9 Влияние антител к калмодулину на цитотоксическое. ! действие ИКСЕ

1. ТЖСБ в присутствии 1 мМ СаС^,

2. ЫКСБ в присутствии 1 мМ СаС^ и антител к калмодулину.

[МХСР]

Рис.10 Зависимость активности ИКСИ от концентрации белка

1. активность 1ЧКСР через 30 мин. взаимодействия с КМ.

2. активность МКСР через 24 часа взаимодействия с КМ.

с

ИКСР. Иг гибель возможна только при увеличении концентрации белков, ответственных за активность второго пика. Следовательно, 1-я стадия лизиса обратимая, на атой стадии происходит временное повревденЕэ клеток. Эти повреждения не является достаточным условием для гибели клеток, хотя, по-видимому, оказывает влияние на скорость -процесса цитолиза.

Можно предположить, что на первой стадии происходит поврвЕдевзщ мембран клеток, в результате чего в клетку проникает краситель - трипановый синий. Клетка выглядит "мертвой". Затем наступает латентный период, в течение которого клетки не окрашиваются. Видимо, в это время КМ восстанавливает целостность плааматической мембраны, сбрасывая поврезденные фрагменты. ГиОвль клеток связана со вторым этапом- цитолиза и наступает через "24 часа. . ;."*"•'

Вышеприведенные данные позволяют сделать рад серьезных обобщений относительно действия ЫЮТ на клетки:

1. ИКСЯ-зависимый лизис опухолевых клеток является Са^*~зависЕмым процессом. Увеличение концентрации ионов кальция значительно ускоряет процесс цитолиза.

. 2. Так яе, как и для ЕКК-зависимого лизиса, для НКСЕ-зависЕиого лизиса можно выявить стадии "программирования лизиса".

3. Лизис клеток под действием ЯКСР представляет собой двухстадийный процесс. 1-я стадия, обратимая, наступает через. 30 минут взаимодействия ИКСБ с КМ. 2-я стадия связана с необратимой гибелью клеток через 24 часа.

4. По-видимому, разные балки ответственны за различные этапы лизиса.

3. ХАРАКТЕРИСТИКА БЕЛКОВ, ОТВЕТСТВЕННЫХ ЗА РАЗЛИЧНЫЕ СТАДИИ НКСр- . -ЗАВИСИМОГО ЛИЗИСА КЛЕТОК.

Ны проводили гельфюгьтрацию препарата НКСг на колонке ТЗК-4000 3¥ в условиях, аналогичных для выделения гранулярного перфорина . Как видно из результатов, приведенных на рис.11, ШСР характеризуется присутствием двух фракций, обладающих цкто-токсичностью и отличающихся скоростью цитолитического действия на клетки. Во фракции N 19 злшрушся балки, проявляпцие Са2+-зависи-

н о .

§ 60-] г

0

1 40

20

____ ^

ч

I. I_I

> ) I

-1_■ ' ■

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

NN фракций:

Рис.11 Цитолитическая активность фракций ШССР после гельфильтрации на колонке ТБК-4000 SW

-----активность через 30 шт. взаимодействия с КМ

в присутствии 5 мМ СаС1^

- активность через 48 чае. взаимодействия с КМ

в присутствии 2 мМ СаС1

---активность через 24 час. взаимодействия с КМ

в присутствии 2 мМ СаС1

Колонка (0,75x30) уравновешивалась 10 мМ ацетатным буфером рН4,5 , содержащим 1 М "МаС1 и 1 мМ ЕБТА, наносили 10 мкг белка, белок элюировали тем же буфером со скоростью 5 мл/мин.

мую активность только в течение 20 минут взаимодействия с клетками и нэ оОладаждо цитотоксичностьв ни через 24 часа, ни через ¿8 часов. Эта белки вызывают временное поврекдение клеток. Во фрсжции N 4 олширугхск белки, цитотоксичвскоз действие которых не зависст от ионов С£?+ и достигает максикальнаго через 48 часов .Не было

9ч-

обнаружено белков, обладающих высокой Са -зависимой активностью

через 24 часа, характерной для исходного препарата NKCF. Этот

эффект, по-видахому, связан с " отделением на колонке _ 2+

Са -зависимого модулятора, ускорящего лизис клеток.

Электрофоретический и иммуноферментпый анализ фракции N 19 показал, что она представлена практически одним белком с мол.массой 66 кДа, реагирующим с антителами к гранулярному перфорину. Этот балок алшруется в том же объеме, что и перфорин, после выхода солевой фракции, что характерно для высокогидрофоОных белков. Сходство этого белка с перфарином по физико-химическим и иммунологическим характеристикам позволяет предполокить наличие функциональной аналогии. Возможно, что, как и при действии перфорина, на 1-й стадии NKCF-зависимого лизиса е мембране клеток образуются поры, и.этот процесс повышает скорость лизиса клеток под действием других цитотоксических белков.

Для характеристики Сс?+ -независимых цитотоксических белков использовали ионообменную хроматографию препарата NKCF на . колонке DHAE-Toyopearl !рис. 12). Можно вццеть, что цитотоксической активностью обладали фракции, апшрушциеся с колонки при 0,3 М концентрации NaCl. Максимум активности проявлялся через 48 часов, взаимодействия с клетками, активность не зависела от добавления в среду ионов Са' . Эти фракции также обладали BLT-встеразной активностью. Электрофоретический анализ этих фракций показал, что цитотоксичвским действием обладали белки с мол.массой 59-52, 37, 32-30, 20-18, 14-17 вДа (рис.13).

Для моделирования цитотоксической активности исходного препарата NKCF объединили фракцию N 19 с колонки TSK-4000 3W и цитотоксичаские фракции с колонки DEAE-Toyoperl. Фракция N 19 обладала ппрообразущей,

-зависимой активностью, проявляющейся через 20 минут взаимодействия с КМ и не проявляла заметной активности через 24 i4aca ijmc.14). Цитотоксическое действие фракций с колонки DEAE Toyopearl через 24 часа проявлялось слабо

Рис.12 Хроматографическое разделение ИКСЕ на колонке БЕАЕ-Тоуореаг! 6505 (1x4 см), уравновешенной 0,01 М ' Трис-НС1, рН 8,0.' Белок элюировали в градиенте ИаС1

-А (280 нм.)

-------концентрация №С1

---- цитотоксическая активность фракций

. _ _ .. зцт-эстеразная активность фракций

ох «

л !-

О

н о н

30'

20'

ю-

90 67

4 I

43 !

v

30 .

4

20 14

10

15

И

!_

■ 20

2^

N

Рнс.13 Анализ фракций с колонки ОЕАЕ-Тоуореаг1, обладающих цитотоксичгской активностью, с ПOOJMOЩЫO электрофореза с последующим переносом на мембрану 1ттоЫ1оп и элюцией. Указаны положения белков - маркеров молекулярной массы.

X (час.)

Рис. 14 Моделирование цитотоксического действия МКСИ.

- активность фракции 19 после гельфильтрации в

присутствии 5 мМ СаС13

----- активность цитотоксической фракции после

хроматографии NKCF на колонке ОЕАЕ-Тоуореаг1 в присутств1ш 5 мМ СаС12

____активность объединенных фракций после

гельфильтрации и хроматографии в присутствии 5 мМСаС1г

I 155 ЦИТОТОКСИЧНОСТИ) И Нв аКТИЕИрОВаЛОСЬ при повый6еш1 концентрации ионов Са^+ . При соединении этих белковых фракций в одной инкубационной пробе (рис.14) возникает цитолитический эффект, аналогичный- действии исходного препарата NKCF: гибель клеток представляет собой двухэтапный процесс, первый пик возникает через 20. минут взаимодействия с клетками, второй пик цитотоксичности формируется через 24 часа инкубации в присутствии 5 шМ СаС12.

Таким образом, было установлено, что цитолитическое действие NKCF связано с участием в процессе цитолиза двух групп белков, обладащих различной функциональной активностью:

1. Белки, входящие в состав 1-й группы, не обладают прямым цитотоксическнм действием на клетку. Физиологическая роль этих белков заключается в ускорении процесса цитолиза, обусловленного действием других цитотоксических белков. Скорость взаимодействия белков 1-й группы с клеткой очень высока ( минимальная активность проявляется через 20 минут). Для проявления функциональной активности этих белков требуются дополнительные факторы (повышение концентрации ионов Са2+). Действие этих белков па клетку обратимо: клетка способна к репарации -повреждений, вызванных этими балками. Среди белков этой группы нами был выявлен белок с мол.массой 6S

• кД, аналогичный ш ряду физико-химических и иммунологических свойств "гранулярному "перфорину. Первая стадия HKCF-зависимого ' " лизиса, по-видимому, связана с действием этого белка, хотя нв исключено присутствие и других, модуляторных белков.

2. Цитолиз клеток под действием NKCF обусловлен активностью другой

группы белков. Белки этой группы способны лизировать клетки в

отсутствии дополнительных факторов t высокая концентрация ионое 2+

Са , белки-модуляторы). Однако, в этих случаях процесс гибели клеток развивается очень медленно. Добавление в реакционную среду белков 1-й группы значительно ускоряет процесс цитолиза.

ГЛАВА 2

МЕХАНИЗМ ЦИТОЛИЗА КЛЕТОК-ШПЕНЕЙ, БЗШЭДЕИСТЕУЩИХ С ЩШШТНЧЕСКИШ Т-ЛШЖЩИАШ Как упоминалось выиэ, одним из важных вопросов в понимании ■ механизма действия цитолитичесяих лимфоцитов является ■ вопрос, участия ЮЛ в процессе цитолиза. Становится ли КМ шссиееой нертвой Ш*Л ш в них осуществляется активация собственных ферментов деградации, приводящих хлет к у к ли з ясу? Такими фарментами, в первую очеродь, могут быть:

1. фергенты лизосом:

2. фэрленты, участвующие в деградации ядерного аппарата клетки;

3. фарменты, регулирующие энергетический баланс клетки.

Описаны два основных пути гибели клеток: некроз и апоптоз. Некроз начинается с быстрого поврездения мембраны с, последующим коллоидно-осмотическим лизисом, в то время как ядра на ранних стадиях остаются интактны. Апоптоз характеризуется фрагментацией ДНК до нуклеотидных фрагментов на ранних стадиях процесса, тогда как скорость швреядения мембран значительно нике. Тип гибели клеток определяется по двум критериям:

1. Сравнительные исследования фрагментации ДНК и лизиса клеток. Если отношение деградации ДНК к количеству мертвых клеток <.1, то клетки гибнут некротически: целостность мембраны нарушается быстрее, чем происходят изменения в ДНК. В случае, когда отношение деградации ДНК к количеству мертвых клеток > 1, внутриядерные изменения В' гибнущих клетках оперенавт процессы, происходящие с мембраной, т.е. метки гибнут апоптотически.

2. Электрофоретический анализ, позволяющий выявить упорядоченную специфическую фрагментацию ДНК.

Мы исследовали кинетику накопления фрагментов ДНК в КМ, взаимодействующих с ЦТЛ, в сравнении с окрашиванием клеток таниновым синим, свидетельствущим о проницаемости мембран. В качестве ЦТЛ использовали смешанную культуру лимфоцитов селезеночных клеток мыией ВАЬВ/с и СЗН, обладающую высокой цитотоксичностью на 5-ые сутки культивирования. КМ служили клетки пинии фибробластоЕ мыши - 1.-92Э. Поскольку лизис клеток является -зависимым процессом, мы определяли активность фарментоз

деградации в присутствии и в отсутствии ионов C¿* . Такой

постадийный подход перспективен для разграничения двйстепя

ферментов, связанных с начальным и конечным этапом цитолиза и

позволяет выявить процессы, ответственные за лизис клеток. Из

результатов, приведенных на ркс.15, видно, что в присутствии 2*

ионов Са развивается как окрашивание клеток, так и накопление фрагментов ДНК, придам фрагментация ДНК протекает с более медленней скоростьзс, чем процесс повреждения мембран. Мембрана становится проницаемой через 45 минут взаимодействия КН с ЦТЛ, число фрагментов ДНК достигает максимального значения через 70 млзут .В бескальциевой среде клетки не окрашивается трипа-еовыы синем и практически не наблвдается фрагкетация ДНК. На основании полученных результатов кошо предположить, что КМ гибнут под действием ЦТЛ по типу некроза. Однако, является ли КМ пассивным участником цитолиза? Как уке упогяшалось выше, метаболически активный путь гибели не ■ ограничивается активацией фешентоЕ, катализпрущях деградации ДНК. Принципиально ватное значение в атом случае имеет активация лпзосокных ферментов.

Поэтому мы последовали изменение аетивЕости маркера фергента лизосом - кислой фосфатазы в КМ, взаимодействущих с ЦТЛ. С этой цельв ш инкубировали ИЛ с лимфоцитами 10 кинут в среде, содержащей-( 1 M CaClj ) и не содерка^ей I 1 ем EGTA> ионы Са2*., затем неадсорбированные лимфоциты сливали, а адсорбированные отделяли от КМ е градиенте плотности Бмбрпональной сыворотки телят ( рис.16).

Как Еззестно, оценка стабильности лкзосошшх мембран основана на дифференциальном определенна обдай 1е условиях, обеспечиваниях кнксимальнув сохранность лизосом) активности каркврешх ферментов лизосом. Считается общепринятым, что повышение свободной активности лизосо^еых ферментов свидетельствует об увеличении проницаемости катран лизосом для -низко:лэлекулярш1х субстратов и выходе их фергентав в цитоплазму. В табл.1 приводятся результаты кз^арапия активности лизосселюй кислой фзефотазы после 10 минут Енкубацаи ЦТЛ и КЫ на стадиях "связывание" и "пезависп-1Л12. лизис" KU. 11з приведенных ттттттт видно, что свободная активность атаго фермента, выраженная в процентах от обцай 1в от-

Рис.15 Прснлшемость мембраны л фрагментация ЛНК з-

КМ, взаимодействующих с Ц1Л.

окрашивание клеток трипановьтм синим;

___ фрагменация ДНК.

Номера фракций

Рис.16 Разделение клеток в градиенте телячей эмбриональной сыворотки

- КМ

лимфоциты

Таблица 1

Активность лизосомной кислой фосфатазы в контрольных клетках и клетках-мишенях при их взаимодейств™ с Т-киллерами.

Стация взаимодействия клеток Клетки Общая *) активность Свободная *) активность Свободная активность от общей

Стадия Контрольные 31+2 ' 18+3 56+8

"связывание" клетки

Клетки-мишени 36+4 24+2 " 68+8

Стадия Контрольные 29+4 16+3 57+8

"независимый клетки

лизис" Клетки-мишени 28+1 27+1 97+2

*) Общая и свободная активности кислой фосфатазы выражены в мкг неорганического фосфата, отщепленного" за 1 мин, ' на 1 мг белка. Приведены усредненные результаты четырех параллельных опытов. Условия определения активности описаны в разделе "Условия эксперимента". Инхубационная проба содержала 300 мкг общего белка.

отсутствие Са ) составляет 57*, в КМ па стадии "связывание" - 68Х.

на стадии "независимый лизис клеток" (в присутствии Ca2_f I - 972. Высокую активность кислой фосфатазы в контрольных клетках, очевидна, моего объяснить механическим разрушением мобильных лкзо-сомных структур. На стадии "связывание" свободная активность фосфатазы изменяется незначительно по сравнению с контрольными клетками, увеличение составляет 12%, что только на 4£ превышает среднее квадратичное отклонение в опыте ( & ). На стадии "независимый лизис" КМ свободная активность кислой фосфатазы увеличивается иа 4СК по сравнению с контрольными клетками, что является доказательством активации КЫ па этой стадии. Тот факт, что свободная активность фосфатазы достигает 972 от. общей, свидетельствует о максимальной проницаемости лизосомной мембраны к о максимальном вкходе кислой фосфатазы в цитоплазму. Таким образом, в нашем эксперименте фрагментация ДНК наступает после увеличения проницаемости мембраны, что свидетельствует о некротической гибели. Однако КМ не пассивна в процессе цитолиза, в этих клетках нарушению целостности мембран предшествует активация лизосомных ферментов.

Для подтверадения получения результатов ш исследовали кинетику накопления фрагментов ДНК и активацию лизосом в сравнении с изменением проницаемости мембран в КМ, взаимодействующими с ЛАК-клетками на 6-е сутки инкубации с интеряейкином-2. Нами было установлено, что эти клетки обладают фенотипом, характерным для ЦТЛ ICD3"*, CDS+, CD16"). Мохно видеть (рис. 17!, что ЛАК-клетки индуцируют смешанный тип цитолиза КМ, в котором присутствуют как некротические, так и алогические характеристики. В течение первых 2-х часов скорость поврендения мембран превышает скорость фрагментации ДНК, что характерно для некроза, однако через 3 часа деградация ДНК резко возрастает и значительно превышает количество мертвых клеток, что свидетельствует об апоптаческом механизме гибели клеток. По-Еидиггому, цитолитические лимфоциты при взаимодействии с КЫ секретируют широкий спектр цитотоксических белков, взаимодействует, с различными рецепторами и системами вторичных мессендЕвроЕ КМ, активируя тем самым различные механизмы гибели.

40-

Рис.17 Проницаемость мембраны и фрагментация ДНК в линии клеток 1.-929 после взаимодействия" с ЦТЛ

- окрашивание клеток трипзновым синим

----- фрагментация ДНК

---- окрашивание клеток трипановым синим в •

присутствия 10 М >Ш4С1

Для выяснения роли лизосом в этих процессах мы исследовали гибель КЫ под действием вффзкторных лимфоцитов в присутствии ингибитора лизосом- NF^Cl, блокирущцего активность лизосокных ферментов. Можно вздеть (ряс.17), что, в течение 2-х часов инкубации КМ с лимфоцитами лизис КМ, обработанных предварительно Ni^Cl, значительно шгибируется, ипгЕбирование составляет 75*.эти данные свидетельствуют о тс:.!, что нокроз -лизосомозависимый процес. Ингиоирование снижается по море накопления параметров, характерных для апоптоза, и через 4 часа составляет 38£. Эти результаты позволяют прэдполоаить, что епоптоз в меньшей степени, чем ' некроз зависит от актквнцпи лизосом.

Поскольку лезис клеток опосредован действием цитотоксичвсккх белков, секретированных лимфоцитами, мы исследовали, по какому пути происходит гибель КМ под действием этих белков. Для выделения цитотокскческих белков лимфоциты инкубировали с км в течение 18 часов, отделяя сыэсь iuïbtok центрифугированием, как описано для получения NKCF.

На pic.18 приводятся • результаты по исслодопелео

кинетики накопления фрагментов ДНК в сравнении с онрашзванием

трипнновым синим линии клеток K-5S2 в присутствии 5вМ концентрации

СаС12- Из этих результатов видно , что в контрольных клетках (i йМ

СаС12 > "А" окрашивание клеток и деградация ДНК развивается очень

медленно. Гибель клеток через 24 часа не превышает ios,

фрагментация ДНК характеризуется более высокой скоростью, что

свидетельствует об апсптотическом пути гибели. При увеличении в

среде концентрации ионов Се~ до 5 шМ "В" через 4 часа инкубации

клеток с цктотоксическими балками набладается увеличение

деградации ДНК, число фрагментов ДНК через 24 часа инкубации на ЗСВ

превышает число фрагментов в контрольных клетках. При достижении

степени фрагментации ДНК 5СК наблюдается разков увеличение

цитолиза клеток, что свидетельствует о гибели клеток по пути апоп-

_ 2+

тоза. Ранее при исследовании елияния ионов Са на цитотоксическов действие NKCF мы показали, что NKCF-зввисекый лкзис является двух-стадийным процессом и что в течение 1,5 часов инкубации NKCF с КМ происходит программирование клеток для лизиса. Это программирование, по-видимому, заключается е активации регуляторных процессов в

70 40-

А

6 12 24 30

часы

Рис.18 Проницаемость мембраны и фрагментация ДНК линии клеток К-562, взаимодействующих с цитотоксическими белками ("А" - в 1 тМ СаС12 "Б" - в

5 тМ СаС12).

окрашивание клеток трипановым синим

---- фрагментация ДНК

35

КМ, приводящих к упорядоченной фрагментации ДНК, что является причиной лизиса клеток.

1 Изучение процесса лизиса клеток линии 1-923, взаимодействующих с цитотоксичвскими' белками ' ЛЛК-клеток, позволило разобщить процессы некроза и апоптоза. Результаты, приведенные на рис.19 демонстрируют наличие деух максимумов цитотоксдчностк, первый максимум наблвдается через 3 часа, затем цитолиз клеток несколько снижается и вновь возрастает через 48 часов. Фрагментация ДНК проявляется через 4-5 часов инкубации клеток с цитотоксическими белками, т.е. после достижения 1-го максимума окрашивания клеток трипнновым синим, что свидетельствует о связи этого пика активности с некротическим механиачом цитолиза.На рис.20 приводятся данные электрофоретического анализа ДНК КМ, взаимодействующих с цитотоксическими балками. Ыокно видеть, что е течение 5 часов инкубации нв наблвдается фрагментация ДНК, первые фрагменты появляются через 9 часов инкубации, максимальное число фрагментов достигается через 24 часа, т.е. пик активности связан с вкладом апоптотических характеристик в лизис клеток. Предварительная инкубация клеток с.ингибиторам лизосом показывает, что ингибирование наблвдается только в течение 5 часов инкубации и через 3 часа достигает 10СВ, т.е. ингибируется некротический тип цитолиза и хлорид аммония нв влияет на уровень фрагментации ДНК, характерной для апоптога.Полное блокирование окрашивания клеток . тршановым синим в присутствии ингибитора лизосамнай активности подтверздает результаты, приведенные выше, свидетельствущие о той, что некротический механизм цитолиза КМ, индуцированный ЦГД, не связан с коллоидно-осмотической гибелью клеток, а является активным процессом, зависящим от активации лизосомных ферментоЕ в КМ.

Суммируя вышеизлсшенаое, можно отметить, что: Ч. цитолиз КМ, взаимодействующих с ЦТЛ, является активным процессом, опосредованным активацией собственных ферментов деградации: лззосомных ферментов и адерных нуклеаз, катализирущих фрагментацию ДНК.

2. активация ферментных систем деградации и лизис клеток

„ 2+

зарегистрированы только в присутствии ионов С& . ■

3. ЦТЛ индуцируют смешанный тип цитолиза КМ, в котором

Рис.19 Проницаемость мембраны и фрагментация'ДНК' в КМ, индуцированные взаимодействием с щгготоксическими белками, секретированными ЛАК- клетками.

- окрашивание клеток трипановым синим

------ фрагментация ДНК

----7 • окрашивание клеток трипановым синим в

присутствии ЮМ N11,0

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис.20 Электрофоретический анализ фрагментов ДНК в КМ под действием цитотоксических белков, секретированных ЛАК-клетками.

1. 1 час взаимодействия КМ с цитотоксическим супернатантом.

2. 3 часа. 6. 18 часов.

3. 6 часов. ' 7. 24 часа.

4. 9 часов. 8. 30 часов.

5. 12 часов.

присутствуют кик некротические, так и апоптотические характеристики.

4. описанный нами некротический тип гибели клеток не связан с нарушением коллоидно-осмотического равновесия, а является активным процессом, зависящим от активации лизосом в КМ.

5. некротический и апоптотический вклад в цитолиз возможно разобщить : некроз - быстротекущий процесс активно развивающийся во времени, так как выход лизосомных ферментов в цитоплазму характеризуется высокой скоростью, уже через 5 часов взаимодействия КМ с цитотоксическими белками клетки практически не окрашиваются трипановым синим и не ингибируются хлоридом аммония. Апоптоз начинается с последовательной активации ряда регуляторных систем, приводящей к упорядоченной фрагментации ДНК, и медленно развивается во времени, первые фрагменты ДНК появляются через 9 часов, максимальная фрагментация достигается через 24 часа, а максимальный цитолиз - через 48 часов.

ГЛАВА III

ПРОЦЕССЫ, УЧАСТВУЮЩИЕ В РЕГУЛЯЦИИ ЦИТОЛИЗА КМ, ИНДУЦИРОВАННОИ ЦЛ

Как упоминалось выше, в современной иммунологии достигнуты определенные успехи в понимании противоопухолевого действия ЦЛ. К настоящему времени накоплен обширный материал по биологии ЦТЛ и ЕКК: получены многочисленные клоны ЦТЛ, охарактеризованы многае поверхностные антигены этих клеток, получены моноклональные антитела к этим антигенам, предложены некоторые модели лизиса опухолевых клеток, описан ряд белков, участвующих в цитолизе. Однако поразительно мало известно о регуляторных механизмах процесса цитолиза, индуцируемого ЦЛ, хотя выяснение этих вопросов перспективно для понимания взаимодействия эффекторных лимфоцитов с КМ. Выявление ферментных систем, участвующих в модуляции процесса цитолиза и избирательное воздействие на эти ферменты представляет путь направленной регуляции действия цитолитических лимфоцитов.

В настоящей работе мы исследовали роль . эндогенного фосфорилирования •■в ■ активации ■ лизиса КМ .. под ; действием цитолитических лимфоцитов, -а также влияние протеинкиназ на

цитотоксическув активность белков, секретируемых этими лимфоцитами.

УЧАСТИЕ ФЕРМЕНТОВ АДЕНИЛАТЦШШЗНОИ СИСТЕШ

в регулящи цитолиза км под дкастшва ЦП

В предыдущей главе нами было показано, что гибель клеток под действием ЦГЛ - активный процесс, обусловленный действием собственных ферментов деградации. Поэтому несомненный интерес представляло выяснить, какие регуляторные системы участвуют в передаче трансмембранного сигнала и активации этих ферментов.

На стадии "связывание" рецепторы лимфоцитов взаимодействуете антигенными детерминантами мембраны клеток-мишеней. Следствием такого взаимодействия может яеиться изменение уровня внутриклеточных "вторичных мессенджеров", действие которых обеспечивает изменение важнейших клеточных функций.

При изучении регуляторных процессов при апоптотическом пути гибели было установлено, что фрагмвнтации ДНК в клетках предшествует .активация протеинкиназы С. Однако регуляторная роль эндогенного фосфорилирования практически не исследовалась. Существуют данные об изменении уровня сАМР, одного из универсальных "вторичных мессенджеров", при активации лизосом в клетках. Поэтому в данной работе мы исследовали, как изменяется активность-ферментов-аденилатциклазной системы в процессе цитолиза КМ, индуцированного взаимодействием с ЦГЛ и как эти изменения связаны с активацией лизосом и лизосомозависимым лизисом клеток.

На рис.21 привадятся изменения уровня сАЫР, а также активностей аденилатциклазы и фосфодиэстеразы сАЫР в КМ при их взаимодействии с ЦГЛ. Как видно из этих результатов, наблвдается сникение уровня сАМР в клетке в 1,6 раза по сравнению с контрольными клетками.

Известно, '. что внутриклеточный уровень сАЫР поддергивается согласованным действием двух ферментов аденилатциклазы и фосфодиэстеразы. Биосинтез сАМР осуществляется при помощи аденилатциклазы, необратимый гидролиз этого циклического нуклеотида - при 'помощи фосфодиэстеразы.' Ыогно видеть (рис.21), что на стадии связывания эффектора с КМ

Ш

1 2

1 2

1 2

1 2

Рис.21 Изменение уровня сАМР, активности аденилатциклазы и фосфодиэстеразы, фосфорилирования клеточных белков в КМ, взаимодействующих с ЦТЛ.

□

уровень сАМР аденилатциклаза фосфодиэстераза уровень фосфорилирования клеточных белков 1-контрольные клетки, 2- КМ после взаимодействия с ЦТЛ

активность аденилатциклазы снижается в 2 раза, а активность фосфодиэстеразы увеличивается примерно в 2,1 раза по сравнению с контрольными клетками. Полученные результаты показывают, что изменение уровня сАМР коррелирует с изменением активности аденилатциклазн и фосфодиэстеразы - уровень сЖР снижается при ингиОировании адвнилатциклазы и активации фосфодиэстеразы. Тот факт, что снижение уровня оШР на начальном этапе цитолиза КМ обусловлено одновременным направленным действием двух ферлентов, регулирующих содержание этого нуклеотида в клетке, позволяет предположить, что уменьшение сАМР в КМ существенно важно на этой стадии. . Регуляторное действие с MP в основном связано с активирущим влиянием на сШР-зависиму® протеинкиназу и с фосфорилированием соответствующих белков-акцепторов, выполняющих различные клеточные функции. Изменение уровня эндогенного с ¿MP соответствует изменению внутриклеточного фосфорилирования. Как видно из результатов на рте.21, на стадии "связывание" при

инкубации клеточных лизатов с r-p-АТР наблвдается снижение

32

включения р -фосфата в клеточные белки в 1,8 раза по сравнению с контрольными клетками. Изменение фосфорилирования клеточных белков может быть обусловлено различными факторами: изменением скорости гидролиза ASP, изменением активности пратеинкиназ 4 и протеинфосфатаз в клетке. Как показано на рис.22А при связывании лимфоцитов с КМ активность кислой фосфатазы в КМ практически не изменялась по сравнению с контрольными клетками. На рис.22Е приводятся даЕные, которые демонстрируют изменение активности сАМР-зависимых пратеинкиназ на этой стадии. Наблвдается корреляция между изменением фосфорилирования клеточных белков и активностью протеишшназ - активность уменьшается е 1,7 раза.

Таким образом, на стадии "связывания" обнаружено снижение уровня эндогенного сАМР и изменяется активность ферментов, -обуславливавших -его регуляторный механизм.

Для выяснения связи между снижением внутри клеточной концентрации сАМР на стадии "связывания" и активацией лизосомных ферментов npz гибели клеток мы поставили своей задачей исследовать, как влияет повышение уровня сАМР в клетке на дестабилизацию лизосомных мембран на модельной системе. Повышение содержания с!М? достигалось инкубацией клеток в среде с высокой

А(405)

мин.

- 10

15 . 20 .

мин.

Рис.22 Изменение активности фосфатазы (А) и

с-АМР-зависимой протеиназыТв КМ, взаимодействующих с ЦТЛ.

контрольные клетки

КМ после взаимодействия с ЦТЛ

концентрацией дибутирильного аналога сАМР.

Активация лизосом представляет собой слозшый многоэтапный процесс, вклшащий отделение первичной лизосомы от мембраны аппарата Гольдки, передвиаеше ее по системе шкротрубочек, образование вторичной лизосош, увеличение проницаемости лизосомной мембраны и выход лизосомных ферментов в цитоплазму. Чтобы активировать все ферлентные системы, участвущие в атом процессе, мы использовали в качестве объекта исследования Ь-фибробласты, инкубированные в растворе 2 иМ Ме>С12. Известно, что высокая концентрация ионов оказывает неблагоприятное

воздействие на клетку и активирует защитные системы клетки, в том числе и лизосомы.

Как. видно из результатов, приведенных в табл.2, свободная активность лизосомной кислой фосфатазы в клетках, инкубированных в растворе 2 иМ НеС12, увеличивается по сравнению с контрольными. Предварительная инкубация клеток с дибутприл сАМР ингибирует свободную активность кислот фосфатазы (т.е.выход этого ферлента в цитоплазму на 29%. Предварггельная инкубация КМ с дибутирил САМ? также снижает последущий циголиз этих клеток под действием ЦГЛ на 23£ (табл.З). Мы установили, что в регуляции некротичвского пути цитолиза участвует сАНР-зависимые протеинкиназы. На стадии " связывание" наблэдается снижение концентрации сАМР е КМ, что. способствует максимальному . выходу. . ферментов лизосом на стадии цитолиза.

2. ВЛИЯНИЕ КАТАЛИТИЧЕСКОЙ СУб [ЕДИНИЦЫ сАМР-ЗАШО&ЮИ ПРОТЕШШНАЗЫ НА АКТИВНОСТЬ НКСР.

При хранении препарата ИКСР (4°С) резко уменьшается его

цптолитичвская активность, главным образом, перфорирующая. Мы

предположили, что это связано с полимеризацией аналогичного

перфоршу белка ЫКСР и с уменьшением числа активных мономеров

этого белка, поскольку ранее было установлено , что инку-

2+

бация перфорина в растворе 1 шМ Са приводит к его неупорядоченной полимеризации с образованием конгломератов с мол.массой 1 МЮй, неспособных взаимодействовать с мембраной

клзтке.

Известно, что фосфоршшрование белков изменяет их функциональные сзойства. Ярким примером является фосфоршшрование

Таблица 2

Влияние дибутирил-сАМР на активность лизосомной кислой фосфатазы.

Клетки Вещество Свободная активность *) Ингибирование актив ности фосфатазы в %

1. Ъ фибробласгы - 29±8 -

2. Ь фибробласгы, инкубирование в присутствии ионов 39±5

3. То же. дибутирил -сАМР 28+4 29+8

*) Свободная активность выражена в мкг неорганического фосфата, отщепленного за 1 мин. на 1 мг белка. Результаты 4" усредненных опытов.

Таблица 3

Влияние дибутирил-сАМР на цитатоксическое действие ЦТЛ.

Клетки Цитотоксичность в % *) Ингибирование цитотоксичности

1. Клетки-мишени, не инкубирование с дибугарил-сАМР 2. Клетки-мишени, предварительно инкубированые с дибутирилсАМР 92+5 ' 68+5 23%

*) Цитотоксичность определялись через 4 часа инкубации с ЦТЛ. ■

4Г

тубулинозыг мономеров в составе микротрубочек, приводящее к изменению константы диссоциации тубулина и к деполимеризации трубочек. Поэтому для диссоциации белков МКСИ мы выбрали ковапентную модификацию этих белков с помощью каталитической субъединицы сШР-зависимой протеинкиназы. Па рис.23 приведены результаты фосфорилирования белков ЖОР и суммарных клеточных гистонов, являющихся стандартным субстратом протеинкиназ. Можно видеть, что включение р в белки N КСР увеличивается пропорционально времени инкубации и достигает максимума через 20 мин. после начала инкубации. Максимум включения 1?2на 1 мкг белка е ИКСР выше, чем в гистоны. Эти данные говорят о том, что белки ИЮТ являются хорошим субстрактом каталитической субъединицы сАМР-зависимой протеинкиназы.

Обработка препарата ИКСР протеинкиназой приводит к полному восстановлению его парообразующей и цитолитической активности (кривая 1 и кривая 3 на рис.24 практически совпадают). По-видимому, это связано с освобождением активных мономвроЕ, способных встраиваться в клеточную мембрану.

Таким образом, мы рассмотрели цепь последовательных изменений каталитической активности компонентов аденилатциклазной системы в КМ от изменения уровня сАМР при связывании с ликфоцитом до изменения эндогенного фосфорилирования. Установили, что снижение активности сАМР-зависикых протеинкиназ существенно васто дая активации лизосом и последующего лизиса КМ. Однако регуляторная роль роль фосфорилирования процесса цитолиза зтим нэ ограничивается, сАМР-зависимые протеинкиназы могут принимать также участие в поддержании в активном состоянии цитотокскчасхих белков, секретируемых лимфоцитами при контакте о КМ.

вывода.

1. Охарактеризован белковый состав ЖСР и установлена функциональная сеязь мэгду секретируемыми и гранулярными белками. Показано, что ИКСР представляет собой слоеный белковый комплекс, состоящий, как минимум, из 7 белков. В составе ИКСР обнаружен белок с кол.массой 67 по электрофоретической подвинности и нммунореактивности аналогичный гранулярному пороооразуищему белку-перфорияу. Получены доказательства зависимости цитотоксичас-кой активности ИКСР от присутствия среди белков ИКСР

Рис.23 Включение "Р в белки ЫКСР

белки МКСИ в качестве субстрата протеинкиназы;

------фракция суммарных гистонов в качестве

субстрата протеинкиназы;

----контроль: инкубация белков ]ЧКСР с ["Р]ЛТР .

без добавления протеинкиназы.

час.

Рис.24 Влияние фосфорилирования белков НКСР на его цитотоксическую активность '

^-исходная активность Т^КСИ;

2..------активность ИКСР при хранении при 4сС в

течении 15 дней;

3.----активность ЫКСР хранившегося при 4°С

после фосфорилирования протеинкиназой.

Са" -связывапцего Оелка-калмодулина и группы сериновых протеаз-БЬТ-эствраз.

2. Исследовано влияние Са2+-ионов на МСР-зависимый лизис опухолевых клеток. Показано, что увеличение концентрации ионов кальция значительно ускоряет процесс цитолиза. Установлено, что . лпзлс клеток под действием МКСР представляет собой двухстадийный процесс. 1-я стадия, обратимая, наступает через 30 минут взаимодействия ЖСР с КМ, связана с временными повреждениями ме?«бран КМ. 2-я стадия представляет собой необратимую гибель клеток через 24 часа. Получены доказательства взаимосвязанности этапов ИЮТ-зависимого лизиса.

З.Обнаруяено, что разные Оелни ответственны за разные этапы цитолиза. Показало, что 1-я стадия ЛКСЕ-зависимого лизиса связана с активностью белка ЖОР с мол.массой 67 кДа, аналогичного перфорину из гранул ;ЕКК. Этот бэлок не обладает прямым цитотоксическим действием на клетку. Его физиологическая роль заключается в модуляции процесса цитолиза, обусловленного действием других белков. Скорость взаимодействия этого белка с клеткой очень высока. Для проявления функциональной активности перфориноподобного белка требуется повышение концентрации ионов Са^+. Действие .этого регулятора., на. клетку .обрацмо -.клетка, способна к репарации поврехдений, вызванных этим белком.

4. Установлено, что цитолиз клеток под действием ЖСР обусловлен действием группы белков с мол.массой 59, 37,. 32-30, 20-18, 14-17. кДа, обладающей БЬТ-эстэразной активностью. Эти белки способны ли-зировать клетки с низкой скоростьп без дополнительных факторов. Добавление в реакционную среду перфориноподобного белка-регулятора значительно ускоряет процесс цитолиза.

5. Обнаружена потеря цитолитической активности белков МКСР при длительном хранении препарата. Показано, что фосфорилирование одного из белков ЖСИ каталитической субъединицей цикло-АМФ-зависимой киназы приводит к полному восстановлении способности - МКСР лизироЕагь клетки.

6. Выявлены некоторые биохимические изменения, происходящие в клетках-мишенях под действием цитолитических лимфоцитов. Показано, что клетки-мшени - активные* участники цитолиза и их гибель происходит в результате активации собственных ферментов

деградации. Такими ферментами являются лизосомные ферменты и ядерные нуклеазы, приводящие к специфической фрагментации ДНК.

7. Установлено, что эффекторные лимфоциты индуцируют смешанный тин цитолиза клеток-мишеней, в' котором 'присутствуют как апоптотические, так и. некротические характеристики. Проведено разобщение процессов некроза к алоптоза во времени при взаимодействии клеток-мишеней с цитотоксическими белками. Показано, что некротический процесс зависит от активации лизосом, а при алоптотическом процессе выявлена специфическая мехнуклеосомная фрагментация ДНК.

8. Исследованы процессы, участвующие в регуляции некротического пути лизиса клеток. Установлено . участие фаркентов аденилатциклазной системы, в регуляции цитолиза клеток-мишеней. Показано, что на начальном этапе лизиса происходит снижение уровня цикпо-ШС, обусловленное направленным действием двух ферментов: адэнилатциклазы и фосфодиэстеразы. Установлена корреляция мевду изменением уровня эндогенного цикло-АМФ и изм е нением фосфоршшрования клеточных белков. Выявлена связь между изменением внутриклеточной концентрации цикло-АМФ, освобождением в цитоплазму лизосомных ферментов и ингибированием цитолиза.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации:

1". Сащенко Л.П., Куприянова Т.к., Мэмелова Л.В., Быковская С.Н., Гнучев. Н.В.- Активация ферментоЕ аденилнт-циклазной системы и лизосомной кислой фосфатазы в клетках-мишенях, взаимодействующих с Т-киллерами. - Молекулярная биология, 1985, т. 19, N 1, стр.119-131.

2. Быковская С.Н., Куприянова Т.А., Шевелев A.A., Сащенко Л.П., Гнучев Н.В. - Д и фференцировка Т-киллеров и механизм их взаимодействия с клетками-мишенями. - Цитология, 1984, т.26, N 9, стр.1063.

3. Сащенко Л.П., Гнучев Н.В., Кириллова U.A., Ребизова Т.В., Лукьянова Т.К., Луканидин Е.М. - Влияние ионов кальция на активность питотоксического фактора естественных киллеров. -Доклады АН СССР, 1987, T.2G, N 5, стр.1278-1280.

4. Гнучев Н.В., Сащенко Л.П., Лукьянова Г.И., РебизоЕа Г.В., Кириллова М.А., Луканидин Е.М., Ревазова Е.С. - Обнаруаениэ перфориноподобного ■ белка в составе растворимого цитотоксического фактора натуральных киллеров. - Молекулярная биология, 19S7, т.21, N 4, стр. 1117-1123..

5. Chertov О.Уа., Gnuchev N.Y., Sashchenko L.P., Klrlllova М.А., LukyanovaT.I., Reblzova T.V., Lukanldln E.M. - Cytotoxic protein of natural Killers. - Journal of Cellular Biochemistry, 1983, v.106, p.165.

6. Чертов O.D., Красносельский А.Л., Луканидин E.M., Сащенко Л.П., Гяучэв Н.В., Кириллова М.А., Ревазова Е.С. - Выделение цитотоксического фактора из сыворотки голых мыией. - Епллетень экспериментальной биологии и медицины, т.CYII, N 3, 32Э-331, 1989.

7. Sashchenko L.P., Gnuchev N.V., Klrlllova М.А., Lukyanova T.I.. Reblzova T.Y.; Chertov O.Yu., Lukanldln E.M. - Effect of ' antibodies to granular perforin and caloodulln on the activity of natural killer cytotoxic factor. - Blonedlcal Science, 1990, v.i, p.291-294.

8. Редченко И.В., Сащенко Л.П., Гнучез Н.В., Лукьянова Т.Н., Кабанова О.Д., Хайдуков С.Б., Луканидин Е.М. - Некоторые свойства перевиваемой линии клеток человека, обладавших активностью ЕКК.-- Экспериментальная оикология, 1991, т.13, N 4, стр.36-39.

9. Сащенко Л.П., Гнучвв Н.В., Кабанова О.Д., Лукьянова Г.И., Редченко И.В., Савцова З.Д., Блищенко Е.Ю., Чертов О.В., Луканидин Е.М. - Функциональные изменения лпм5окин-активираЕанных лимфоцитов в .зависимости от времени инкубации с ИЛ-2. - Доклады РАН, 1992, Т.324, стр.475-479.

10. Сащенко Л.П., Гнучев Н.В., Лукьянова Т.И., Кабанова О.Д., Редченко И.В., Блищенко E.D., Сатпаев Д.М., Хайдуков С.В., Чертов О.Ю., Луканидин Е.М. - Влияние ИЛ-2 на цитолитическуп активность, экспрессии поверхностных маркеров и секреции цитотоксических белков ЛАК-клетками. - Экспериментальная онкология, 1992, т. 14, N 5, стр.54-5В.

11.. Sashchenko L.P., Gnuchev N.Y.. Klrlllova М.А., LukyanovaT.I., Reblzova T.V.. . Revazova E.5., Lukanldln E.M. - Separation of pore-fomlng and cytotoxic activities from natural cell cytotoxic factor. - FEBS Letters, 1968, v.226. N 2, p.261-264.

12. Сащенко Л.П., Ееучве Н.В., Кирилллова М.А., Лукьянова Т.К., Ребизова Т.Е., Луканидин Е.М. - Влияние каталитической субъединнцк с AMP-зависимой протеишшназы на .активность цитотоксического фактора натуральных киллеров. - Молекулярная биология, 19SS, т.23, N 6, стр.1711-1715.

13. Sashchenko L.P., Kabanova O.D., Lukyanova T.I., Satpaev D.K., Chertov O.Yu., Gnuchev N.Y. - The role of apoptotlc and necrotic processes In cytolysls mediated by LAK cells with different phenotypes. - FEBS, 1993, v.335, N 2, p.270-272.

14. Sashchenko L.P., Gnuchev N.Y., Lukyanova T.I., Redchenlra I.Y., Kabanova O.D., Lukanldln E.M.. Bllshchenko E.Yu. ,-D.K.Satpaev, Khaldukov S.Y., Chertov O.Yu. - Time-dependent changes of LAK cell phenotypes correlate with the secretion of different cytotoxic proteins. - Imaunology Letters, 1993, v.37, p.153-157.

15. ГнучеЕ H.В., Сащенко Л.П., Кабакова О.Д., Лукьянова Т.К., Блищенко Е.Е., Быковская С.Н. - Исследование фрагментации ДНК е клетках-мишенях, взаимодействующих с цитолитическими Т-лимфоцитами. - ДАН РАН, 1994, т.335, N 4, стр.522-524

16. Гнучев Н.В., -Сащенко Л.П., Лукьянова Т.И.,' Кабанова "О.Д., Влищенко Е.Ю., Сатпаев Д.К., ЧертоЕ О.Ю. - Характеристика цитотоксическиг балкоЕ, секретируемых естественными киллерами из селезенки голых мышей. - ДАН РАН, 1994, т.338, N 5, стр.

17. .Sashchenko L.P.., Gnuchev N.Y. .Redchenko'I .Y., Kabanova 0-P-;. Lukyanova T.I..Bllshchenko E.Yu., D.K.Satpaev, Chertov O.Yu. -Contribution of nembrane-assoclated cytoxlc proteins to cytolysls of L929 and K562 target cells with different phenotypes.-Immunology Letters, 1994, v.39, p.243-247.