Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Некоторые механизмы влияния опухоли на иммуносупрессорные и противоопухолевые свойства клеток костного мозга в эксперименте

ТРОФИМОВА ЕВГЕНИЯ СЕРГЕЕВНА

НЕКОТОРЫЕ МЕХАНИЗМЫ ВЛИЯНИЯ ОПУХОЛИ НА ИММУНОСУПРЕССОРНЫЕ И ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ СВОЙСТВА КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

14.00Л6 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ТОМСК- 2002

Работа выполнена в научно-исследовательском институте фармакологии Томского научного центра СО РАМН.

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

профессор Агафонов В.И.

Научный консультант:

кандидат медицинских наук Вельский Ю.П.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук

доктор биологических наук

Шерстобоев Е.Ю. Чердынцева Н.В.

Ведущая организация: Сибирский государственный медицинский университет (г. Томск).

Защита состоится «_»__2002 г. в_час. на заседании

диссертационного совета Д 001.031.01 при НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (634028, г. Томск, пр. Ленина 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (634028, г. Томск, пр. Ленина 3).

Автореферат разослан «_

2002 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

. £ £

Амосова Е.Н.

/О

Общая характеристика работы

Актуальность. Известно, что опухолевый рост сопровождается значительными изменениями в системе крови и нарушениями в иммунной системе онкологического больного. Одной из причин развивающейся при бластомоге-незе иммунодепрессии может быть активация неспецифических иммуносупрес-соров костномозгового происхождения [Subiza J.L. et al., 1989; Young M. R. et al., 1987; Кусмарцев С.А., 1990]. В норме физиологической функцией этих клеток (естественных супрессорных клеток - ECK) является негативная регуляция кроветворения, а также предотвращение активации иммунных процессов на территории костного мозга [Córvese J.S. et al., 1980; Moore S.C. et al., 1992; Slavin S. et al., 1979]. Активирование ECK в костном мозге с последующей их миграцией в селезёнку наблюдается при стимуляции гемопоэза, в частности, после облучения, введения циклофосфана, фенилгидразина, некоторых жирных кислот, а также при росте злокачественных опухолей [Deruysscher D., Sobis Н., Vandeputte М. et al., 1991; Sykes M., Sachs D.N., 1988; Brooks-Kaiser J.C., Borque L.A., Hoskin D.W., 1993; Кашлакова H.B., 1987; Кашлакова H.B., Лисуков И.А., Цырлова И.Г. и др., 1988; Кусмарцев С.А., Огреба В.И., 1989; Nicoletti G., Brambella Р., De Govanni С. et al., 1985].

В эксперименте показано, что ECK оказывают свое антипролиферативное действие через секрецию супрессорных факторов (СФ). Так, при опухолевой прогрессии ECK, продуцирующие антипролиферативные медиаторы - трансформирующий фактор роста ß (ТФР-ß) и оксид азота (OA), обнаруживаются в селезенке, а также в самой опухоли [Young M.R. et al., 1992, 1994, 1996; Вельская Н.В. и др., 2000; Kusmartsev S.A. et al., 2000]. Они оказывают выраженное иммуносупрессорное действие: подавляют митоген- и антиген-индуцированную пролиферацию Т- и B-лимфоцитов, активность НК, ингиби-руют продукцию ФНО макрофагами и т. д. [Subiza J.L. et al., 1989; Young M.R. et al., 1991] В серии работ [Young M.R. et al., 1992, 1994] показано, что элиминация ECK приводит к появлению противоопухолевых Т-лимфоцитов, замедлению опухолевого роста и снижению метастазирования.

В комплексный механизм опухоль-опосредованных нарушений миелод-ного ростка вовлечены простагландины (ПГ), ТФР-ß, OA и его индукторы (ИФ-у, ФНО-альфа), а также, возможно, ИЛ-10, ИЛ-4, ИЛ-12, протеазы и молекулы адгезии, принимающие активное участие в регуляции кроветворения [Alleva D.G. et al., 1995; Assoian R.K. et al., 1985; Hemler M.E., 1990; Maeda H. et al., 1996].

Факторы, опосредующие иммуносупрессорную активность, могут быть различными в зависимости от состояния клеток-продуцентов и от наличия ци-токинов, стимулирующих выработку этих факторов. Известно, что медиатором иммуносупрессорного действия ECK интактного костного мозга является OA [Angulo I. et al., 2000]. Причем ИФ-у стимулирует продукцию OA костномозговыми клетками, а добавление ГМ-КСФ значительно усиливает ее [Arai К. et al., 1990; Punjabi C.J. et al., 1994]. Дексаметазон, подавляя секрецию ИФ-у, блокирует активность ECK [Rodrigez R. et al, 1994]. В тоже время длительное воздей-

ствие ГМ-КСФ или ИЛ-3 на миелокариоциты вызывает интенсивную продукцию ими ТФР-ß [Moore S.C. et al., 1992]. Повышение иммуносупрессорной активности при росте некоторых опухолей связано с продукцией ГМ-КСФ опухолевыми клетками [Young M.R. et al., 1990] и реализуется через продукцию ТФР-Р [Young M.R. et al., 1992].

Особый интерес вызывает способность ECK подавлять in vitro пролиферацию опухолевых клеток [Seledtsov V.l. et al., 1995; Sugiura К. et al., 1990; Вельский Ю.П. и др., 1999]. То есть in vitro эти клетки осуществляют разнонаправленное действие - как проопухолевое (иммуносупрессорное), так и противоопухолевое. Более того, можно частично разделить субпопуляции противоопухолевых и иммуносупрессорных эффекторов [Seledtsov V.l. et al., 1997]. Однако механизмы, лежащие в основе индукции их противоопухолевого действия, а также супрессорные факторы, секретируемые при этом, изучены мало в отличии от иммуносупрессорного действия. Таким образом, существуют предпосылки для поиска возможностей раздельной регуляции противоопухолевого и иммуносупрессорного действия ECK. В связи с вышеизложенным представляется актуальным исследовать иммуносупрессорное и противоопухолевое действие клеток костного мозга, количественные изменения миелоидных и эрит-роидных прекурсоров, а также влияние опухолевых факторов на антипролифе-ративную и колониеобразующую активности костного мозга в различных моделях опухолевого роста.

Цель исследования. Целью настоящей работы является изучение механизмов влияния опухоли на иммуносупрессорную и противоопухолевую активности клеток костного мозга при экспериментальном опухолевом росте.

Задачи исследования.

1. Изучить влияние опухоли Эрлиха на иммуносупрессорную и противоопухолевую активности клеток костного мозга in vivo и in vitro.

2. Изучить влияние опухоли Эрлиха на колониеобразующую активность клеток костного мозга in vivo и in vitro.

3. Изучить влияние спонтанной Т-лимфомы на иммуносупрессорную и противоопухолевую активности клеток костного мозга in vivo и in vitro.

4. Изучить влияние спонтанной Т-лимфомы на колониеобразующую активность клеток костного мозга in vivo и in vitro.

5. Оценить влияние Т-лимфоцитов на иммуносупрессорную активность клеток интактного костного мозга.

6. Оценить влияние дексаметазона на противоопухолевую активность клеток костного мозга.

Научная новизна. Работа представляет собой фундаментальное исследование, раскрывающее некоторые механизмы влияния опухоли на иммуносу-прессорные и противоопухолевые свойства клеток костного мозга. В работе впервые дана комплексная оценка функционального состояния колониеобра-

зующей, иммуносупрессорной и противоопухолевой активностей костномозговых клеток в условиях роста аденокарциномы Эрлиха и Т-лимфомы. Впервые изучено влияние факторов, продуцируемых аденокарциномой Эрлиха и Т-лим-фомой, на колониеобразующую, иммуносупрессорную и противоопухолевую активности интактного костного мозга in vitro.

Выяснены некоторые механизмы повышения продукции оксида азота клетками костного мозга и селезенки в динамике развития карциномы Эрлиха. Так, в частности, получены результаты, свидетельствующие о том, что клетки опухоли Эрлиха секретируют растворимый фактор (факторы), индуцирующий продукцию оксида азота клетками костного мозга и самими опухолевыми клетками. Кроме того, выявлено, что рост опухоли сопровождается повышением секреции ИФ-у Т-лимфоцитами. Это объясняет наблюдаемое при росте данной опухоли повышение продукции клетками костного мозга оксида азота и опосредованной им иммуносупрессорной активности.

Установлено различие механизмов иммуносупрессорного и противоопухолевого действия ECK при опухолевом росте. Показана возможность дифференциально воздействовать на иммуносупрессорное и противоопухолевое действия естественных супрессорных клеток с помощью ИФ-у и дексаметазона. Продемонстрировано, что Т-клеточные факторы, в частности, интерферон-гамма, способны in vitro как увеличивать, так и снижать иммуносупрессорную активность неприлипающик клеток костного мозга. Дексаметазон in vitro усиливает противоопухолевую активность неприлипающих клеток костного мозга, а также угнетает иммуносупрессорную активность костномозговых клеток.

Практическая значимость. Полученные данные расширяют представления о клеточных механизмах нарушения иммунорегуляторных свойств кроветворных клеток в процессе опухолевого роста. Они могут явиться основой для разработки новых методов коррекции нарушений гемопоэза и противоопухолевой резистентности, имеющих место при злокачественных заболеваниях, а также патогенетически обоснованных методов противоопухолевой терапии с использованием препаратов, модулирующих функции естественных супрессорных клеток.

Основные положения выносимые на защиту.

1. Рост аденокарциномы Эрлиха сопровождается увеличением иммуносупрессорной активности клеток костного мозга и появлением её в селезёнке, что связано с продукцией оксида азота этими клетками. Противоопухолевая активность клеток костного мозга при этом не изменяется, а противоопухолевая активность селезёнки повышается. Кроме того, при росте опухоли Эрлиха не изменяется содержание колониеобразующих единиц гранулоцитарно-макрофагального ряда в костном мозге, а количество колониеобразующих единиц эритроидного ряда значительно снижается на 14 сутки роста опухоли и повышается на 21 сутки.

2. Супернатант аденокарциномы Эрлиха содержит факторы, которые в условиях in vitro стимулируют иммуносупрессорную, противоопухолевую и колониеобразующую активности клеток костного мозга.

3. У мышей линии AKR/JY в процессе роста Т-лимфомы повышается им-муносупрессорная и противоопухолевая активности клеток костного мозга. Спленоциты при этом не обнаруживают данных видов активности. Иммуносу-прессорная активность посредована оксидом азота, тогда как противоопухолевая активность - другим супрессорным фактором. При этом наблюдается возрастание числа гранулоцитарно-макрофагальных и снижение количества эрит-роидных прекурсоров.

4. Факторы Т-лимфомы in vitro снижают иммуносупрессорную и не изменяют противоопухолевую активности клеток костного мозга и не влияют на колониеобразование костного мозга.

5. Механизм повышения продукции оксида азота при росте опухоли Эрлиха обусловлен секрецией клетками опухоли растворимого фактора, индуцирующего выработку оксида азота как клетками костного мозга, так и самими опухолевыми клетками. Рост опухоли Эрлиха сопровождается повышением секреции ИФ-у Т-лимфоцитами, что также вызывает повышение продукции оксида азота клетками костного мозга и селезенки.

6. Т-лимфоциты принимают участие в регуляции активности естественных супрессорных клеток в условиях in vitro посредством вырабатываемых ими факторов. В условиях in vitro дексаметазон опосредованно угнетает иммуносупрессорную активность костномозговых клеток и усиливает их противоопухолевую активность.

Апробация работы. Основные результаты доложены и обсуждены на итоговой научной конференции НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2001 г.).

Публикация результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 5 работ в центральных журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 133 страницах машинописного текста, иллюстрирована 27 рисунками, 9 таблицами и состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов и списка литературы из 177 наименований.

Материалы и методы исследований

В экспериментах было использовано 265 мышей, полученных из коллекционного фонда НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН, разного возраста обоего пола следующих линий: AKR/YJ, C57B1/6J, DBA/2J, гибриды Fl(CBA/CaLacx AKR).

В качестве основных моделей опухолевого роста использовали: 1) Перевивной вариант аденокарциномы Эрлиха. Опухолевые клетки по ЗхЮ5 млн.

имплантировали под кожу бедра мышам линии C57B1/6J. Оценку иммуносу-прессорной, противоопухолевой и колониеобразующей активностей костномозговых клеток проводили на 14 и 21 сутки опухолевого роста. 2) Мышей линии AKR, у которых в возрасте 7 месяцев развивалась Т-лимфобластная лимфома тимуса. Массовая гибель животных отмечалась в 8-10 месяцев. Т-лимфобластная лимфома определялась морфологически. Исследование иммуносупрессор-ной, противоопухолевой и колониеобразующей активностей клеток костного мозга проводили на 2, 4 и 7 месяцы жизни.

Для выделения и отмывки клеток костного мозга и селезенки использовали изотонический раствор хлорида натрия. Клетки культивировали в среде RPMI 1640 («Sigma», США) с добавлением 10% ЭТС (ИКИ СО РАМН, Новосибирск), 20 мМ HEPES, 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола («Sigma»), 50 мкг/мл ген-тамицина и 2 мМ L-глютамина («Flow», Великобритания) в атмосфере с 5% С02 и абсолютной влажности. Подсчет числа клеток и определение их жизнеспособности осуществляли при помощи трипанового синего.

Иммуносупрессорная активность клеток костного мозга и селезенки оценивалась по их способности ингибировать пролиферацию сингенных спленоци-тов-мишеней, предварительно инкубированных в пластиковых чашках Петри 24 ч с конканавалином А (Кон А) («Sigma») в концентрации 4 мкг/мл, а затем отмытых от митогена. Неприлипающие клетки-эффекторы в различных соотношениях (0,5:1, 1:1, 2:1) инкубировали 36 ч в 96-луночных круглодонных планшетах совместно со спленоцитами-мишенями. За 16 ч до окончания культивирования вносили по 0,5 мкКю/лунку 3Н-тимидина. Содержимое лунок с помощью харвестера «Scatron» переносили на стекловолокнистые фильтры с последующим измерением уровня радиоактивности на ß-счетчике «Mark-III». Процент супрессии вычисляли по формуле ПС = (1 - О/К) х 100%, где О - число импульсов в минуту в лунках, содержащих клетки костного мозга и селезёнки; К- число импульсов в минуту в лунках, содержащих спленоциты-мишени. В части экспериментов в лунки вносили 0,5 шМ №-монометил-Ь-аргинина (NMMA) («Sigma»).

Противоопухолевая активность клеток костного мозга и селезенки определялась по способности подавлять пролиферацию опухолевых клеток (масто-цитома Р815). Для этого неприлипающие клетки костного мозга или селезенки в различных соотношениях (20:1, 10:1, 5:1) инкубировали в 9б-луночных планшетах совместно с клетками Р815 36 ч. За 16 ч до окончания культивирования вносили по 0,5 мкКю/лунку 3Н-тимидина. После чего содержимое лунок переносили с помощью харвестера на стекловолокнистые фильтры. Подсчет ради-активности проводили на ß-счетчике «Mark III». Процент супрессии вычисляли по формуле ПС = (1 - О/К) х 100%, где О - число импульсов в минуту в опытных лунках; К - число импульсов в минуту в лунках, где инкубировались одни клетки-мишени. Продукция оксида азота в супернатантах каждой лунки определялась по содержанию нитритов при помощи реактива Грейса [Green L.C. et

al., 1982] с последующим измерением оптической плотности при длине волн] 550 нм.

Клонирование клеток-предшественников грануломоноцито- и эритропс эза осуществляли по модифицированной методике в метилцеллюлозе [Голье берг Е.Д. и др., 1992]. В работе использовали метод клеточного фракционирс вания в ступенчатом градиенте плотности перколла [Holda J.H. et al., 1986].

Для получения опухолевых супернатантов опухолевые клетки (106/мл культивировали 24 ч в указанной выше среде в пластиковых флаконах «Costar» клетки удаляли центрифугированием, полученный супернатант использовал для обработки клеток-эффекторов. Свежевыделенные клетки костного мозг инкубировали 2 суток с различными разведениями опухолевых супернатантог затем отмывали и тестировали способность их неадгезивной фракции к прояв лению иммуносупрессорной, противоопухолевой активностей и к выработк оксида азота.

Колониестимулирующую активность супернатантов опухолей тестирова ли по их способности стимулировать рост колоний клеток костного мозга в ме тилцеллюлозе [Гольдберг Е.Д. и др., 1992].

Супернатант Кон A-активированных спленоцитов (КАС) получали куль тивированием спленоцитов в указанных выше условиях 24 ч в пластиковы: чашках Петри в концентрации 5х106 клеток/мл в присутствии Т-клеточного ми тогена конканавалина А (4 мкг/мл), после чего клетки удаляли центрифугиро ванием, а супернатант собирали. Полученный супернатант тестировали на на личие ИФ-у по степени стимуляции выработки оксида азота клетками костноп мозга [Migliorini Р., 1991].

Полученные результаты обработаны статистически с помощью програм мы Statistics 5.0. Для всех имеющихся выборок данных проверена гипотез; нормальности распределения. Проверка гипотезы о равенстве средних прово дилась с использованием /-критерия Стьюдента.

Результаты исследований и их обсуяедение

Нами были изучены две модели опухолевого роста: солидный вариан-аденокарциномы Эрлиха и мыши линии AKR со спонтанно развивающейся Т лимфомой.

Полученные результаты показали, что как на 14, так и на 21 сутки рост; аденокарциномы Эрлиха отмечалось повышение иммуносупрессорной актив ности клеток костного мозга (на 14-е сутки в 4, на 21 - в 4,5 раза) и появление ее в селезенке (рис. 1). При этом уровень продукции OA клетками костноп мозга и селезёнки животных с опухолью в указанные сроки превышал кон трольные значения. Для того, чтобы оценить вклад OA в иммуносупрессорно! действие клеток костного мозга и селезенки, в исследованиях применяли инги битор NO-синтазы - NMMA. При подавлении продукции OA иммуносупрес сорная активность неприлипающих клеток костного мозга на 14 сутки опухоле

вого роста хотя и снижалась, но все же оставалась достаточно высокой. Блокирование продукции ОА спленоцитами опухоленосителей не приводило к отмене супрессорного влияния.

100

s 75 •

к

ш о 50 -

с

о 25 -

X

■з 0 -

а

-25 ■

-50 ■

костный мозг

□ контроль

□ опыт

□ нитриты

100 75 ?

2

50

о

25 Ё.

н X

о 1

-з

-25 1 -50

а)

100 80 60 40 20 0 -20 -40 -60

-»- г—р— — □ контроль □ опыт □ нитриты

*

т . •

г - -1

I

КОСТНЫЙ мозг реле ¡енка

115 65

■ 15

-35 о

-85

б)

Рис. 1. Иммуносупрессорная активность непршшпающих клеток селезёнки и костного мозга и продукция ими оксида азота у мышей линии С57В1/6 на 14 (а) и 21 (б) сутки роста карциномы Эрлиха (* - достоверное различие с контролем, р<0,05)

Применение блокатора NO-синтазы на 21 сутки опухолевой прогрессии полностью отменяло иммуносупресорную активность как клеток костного мозга, так и селезёнки. Следовательно, по мере роста опухоли Эрлиха роль ОА как супрессорного фактора возрастала, и к 21 суткам иммуносупрессорная активность неприлипающих клеток костного мозга и селезенки реализовывалась практически полностью через продукцию ОА. Полученные нами данные об участии оксида азота в иммуносупрессии при опухолевом росте согласуются с литературными [Вельская Н.В. и др., 2000; Kusmartsev S.A. et al., 2000].

Что касается отсутствия полного блокирования иммуносупрессорной at тивности клеток костного мозга и селезенки после применения NMMA на 1 сутки опухолевого роста, то этот факт можно расценить как свидетельство н; линия в это период, по крайней мере, еще одного супрессорного фактора. В ч; стности, в литературе имеются данные о том, что при росте злокачественны опухолей у мышей естественная супрессорная активность опосредуется и только OA, но и рядом других цитокинов, таких как ТФР-Р и ИЛ-10 [Maeda I et al., 1996; Young M.P. et al., 1996].

Так, в работах [Tada T.S. et al., 1990; Torre-Amione G.R.D. et al., 199( Fontana A.H. et al., 1984; Kusmartsev S.A. et al., 1998; Young M.R. et al., 199: были описаны случаи увеличения естественной супрессорной активност (ЕСА) при опухолевом росте, которая опосредовалась преимущественно за сче ТФР-р. Однако в этих работах исследовался рост высокометастазирующи опухолей (рак желудка [Kusmartsev S.A. et al., 1998], карцинома Льюиса [Youn M.R. et al., 1992]). Известно, что преимущественно высокометастазирующи опухоли могут продуцировать колониестимулирующие факторы [Tsuchiya Y. < al, 1988]. Такие типы опухолей, как рак легкого LLC, рак молочной железы, ра предстательной железы и некоторые другие, вырабатывают ГМ-КСФ и ИЛ-[Ramakrishnan S. et al., 1989]. Эти факторы, в свою очередь, являются мощным стимуляторами миелопоэза, который проявляется спленомегалией, нейтрофг лией, увеличением числа незрелых миелоидных клеток в костном мозге и сел« зенке. На этом фоне происходит также активация ECK [Young M.R. et al., 1991 При этом супрессорная активность этих клеток опосредовалась ТФР-р. Карт нома Эрлиха является неметастазирующей опухолью, что в свете вышесказан ного позволяет предположить иные механизмы активации ЕСК, отличные с описанных ранее.

Полученные нами данные о появлении естественной супрессорной at тивности в селезёнке при опухолевом процессе согласуются с данными литерг туры. Так активация ЕСК в селезёнке и других органах иммунной системы бь ла получена в экспериментах на различных моделях опухолевого роста, вклк чая аденокарциному Эрлиха [Subiza J.L. et al., 1989], карциному Льюиса [Youn M.R. et al., 1987], рак молочной железы [Кусмарцев С.А., 1990] и др. [Хаито P.M., 1984; Кадагидзе З.Г., 1989; Кусмарцев С.А. и др., 1989].

Исследование противоопухолевой активности клеток костного мозга селезёнки у мышей в динамике опухолевого процесса выявило значительно увеличение данного показателя у клеток селезёнок по сравнению с контроле] во все исследуемые сроки. При этом противоопухолевая активность не был обусловлена выработкой OA, а реализовывалась, очевидно, за счёт иного С<1 поскольку продукция OA не была зарегистрирована ни в одной из исследуемы групп. В эти же сроки опухолевого роста клетки КМ не обладали противоопу холевой активностью. В то время как иммуносупрессорная активность повы шалась как в костном мозге, так и в селезенке и опосредовалась преимущест венно OA.

Проведённое изучение иммуносупрессорной и противоопухолевой активностей клеток костного мозга и селезенки при росте аденокарциномы Эрли-ха и продукции ими OA указывает на различие субпопуляций противоопухолевых и иммуносупрессорных эффекторов, а также на различие механизмов индукции и реализации иммуносупрессорной и противоопухолевой активностей этих клеток. Полученные результаты подтверждают имеющиеся в литературе сообщения о различной природе и различных механизмах действия ECK костного мозга, опосредующих иммуносупрессорный и противоопухолевый эффекты у мышей [Тарабан В.Я., 1997; Seledtsov V.l., et al., 1997].

Известно, что ECK являются гемопоэтическими предшественниками различных ростков кроветворения и активируются под воздействием гемопоэтиче-ских колониестимулирующих факторов, продуцируемых опухолью. И как правило, повышение активности ECK сопровождается повышением содержания КОЕ в костном мозге опухоленосителей. Описаны ECK миелоидной, эритроид-ной и лимфоидной природы [Чеглякова В.В. и др., 1989; Brooks-Kaiser J.C. et al., 1992; Sugiura К. et al., 1992].

В связи с этим было интересно исследовать колониеобразующую активность клеток костного мозга при росте солидной карциномы Эрлиха. Однако нами было получено, что повышение антипролиферативной активности клеток костного мозга в динамике роста опухоли не сопровождалось увеличением числа КОЕ-ГМ в костном мозге, а число КОЕ-Э даже снижалось на 14 сутки с последующем увеличением к 21 суткам опыта. Это позволяет предположить, что: 1) ECK в данной случае принадлежат к более незрелым гемопоэтическим клеткам (не к ГМ- и Эр-прекурсорам) или 2) наблюдаемое нами усиление им-муносупрессорного действия связано с качественными изменениями популяции ECK. Однако возможно и другое объяснение установленной нами особенности. Оно заключается в следующем. Проведенные исследования иммуносупрессорной активности клеток костного мозга и селезенки у мышей-опухоленосителей позволили выявить на 14 сутки роста опухоли присутствие, по-крайней мере, еще одного супрессорного фактора помимо OA, обеспечивающего иммуносу-прессорное действие этих клеток. Возможно, этим фактором является ТФР-ß либо простагландины. Известно, что ТФР-ß за счет своего мощного антипро-лиферативного действия играет значительную роль в регуляции кроветворения. Установлено, что наименее зрелые клетки-предшественники (КОЕ-ГМ, КОЕ-ГЭММ, КОЕ-Э) более чувствительны к ингибиторному действию ТФР-ß, чем КОЕ-Г, КОЕ-М, КОЕ-Э [Keller J.R. et al., 1989]. Кроме того, в работе [Young M.R. et al., 1988] установлено, что на ранних сроках роста опухоли иммуносу-прессорная активность опосредуется ПГ-Е2, который продуцируют селезёночные макрофаги. А по данным [Young M.R. et al., 1989] ПГ-Е2 обладает способностью подавлять рост макрофагальных и гранулоцито-макрофагальных колоний. Вероятно, этим можно объяснить отсутствие со стороны опухоли стимуляции образования ГМ-колоний и снижение числа КОЕ-Э на 14 сутки роста карциномы Эрлиха.

Далее мы показали, что сами клетки опухоли Эрлиха в культуре продуцируют О А без какой-либо стимуляции. Клетки интактного костного мозга, а также мастоцитомы Р815 и лимфолейкоза L1210 такой способностью не обладали. Более того, клетки опухоли Эрлиха секретировали растворимый фактор (факторы), индуцировавший продукцию ОА клетками костного мозга и самими опухолевыми клетками. Происходившее усиление синтеза костномозговыми клетками ОА после их контакта с опухолевыми факторами свидетельствует о том, что опухоль Эрлиха вырабатывает индуктор NO-синтазы (возможно, ИФ-у) и/или индуцирует его продукцию клетками костного мозга.

Нами показано, что рост опухоли Эрлиха сопровождался повышением продукции ИФ-у спленоцитами мышей-опухоленосителей, тогда как при росте меланомы В16, рака легкого РЛ-67, а так же мастоцитомы Р815 его образование снижалось. Таким образом, помимо прямого действия со стороны самих опухолевых клеток, стимулирующих продукцию ОА, рост опухоли Эрлиха (в отличие от меланомы В16, мастоцитомы Р815 и рака легких PJI67) сопровождался повышением секреции ИФ-у Т-лимфоцитами, что объясняет наблюдаемое в данном случае усиление продукции ОА клетками костного мозга (рис. 2).

Рис 2. Некоторые механизмы неспецифической иммуносу-прессии при росте опухоли Эрлиха

Значение для организма опухоленосителя такого повышения не однозначно. Данные литературы свидетельствуют об иммуносупрессорном действии OA [al-Ramadi В.К. et al., 1992; Hoffman R.A. et al., 1997; Lejeune P. et al., 1994]. С другой стороны, имеются сведения о том, что ОА индуцирует диффе-ренцировку опухолевых клеток или оказывает на них цитотоксическое действие [Martin J.H.J. et al., 1993; Stuehr D.J. et al., 1989]. По данным [Inai Y. et al., 1996] клетки опухоли Эрлиха чувствительны к продуцируемому ими О А, что может быть причиной низкой метастазирующей способности данной опухоли.

Изучив иммуносупрессорную, противоопухолевую и колониеобразую-щую активности клеток костного мозга при росте карциномы Эрлиха, мы оце-

нили лишь опосредованное влияние опухоли на эти клетки. Для изучения прямого влияния факторов, продуцируемых опухолью Эрлиха, на костномозговые клетки были проведены эксперименты с использованием супернатанта клеток этой опухоли, с которым культивировали in vitro клетки интактного костного мозга.

Нами были получены следующие данные. Факторы, секретируемые клетками опухоли Эрлиха, индуцировали усиление иммуносупрессорных свойств костномозговых клеток, а также продукцию оксида азота этими клетками. Эти результаты не противоречат данным литературы. Так, супернатант опухоли Льюиса усиливал ЕСА нормального костного мозга: при переносе предварительно инкубированных с ним клеток опухоленесущим мышам наблюдалось усиление роста опухоли, a in vitro такие клетки значительно сильнее подавляли пролиферацию стимулированных Кон А спленоцитов и активность НК-клеток интактных животных. [Young M.R. etal., 1991, 1992].

Кроме того, в условиях in vitro опухолевые факторы усиливали противоопухолевую активность неприлипающей фракции костномозговых клеток. При этом продукция оксида азота была незначительной (хотя и повышалась) и не могла объяснить выраженного антипролиферативного действия эффекторных клеток. Следовательно, противоопухолевый эффект клеток костного мозга был обусловлен, в основном, продукцией супрессорного фактора(ов), отличного от оксида азота. Различие медиаторов, опосредующих иммуносупрессорный и противоопухолевый эффекты костномозговых клеток, также косвенно подтверждает имеющиеся данные о различной природе и механизмах действия ЕСК, осуществляющих эти види активностей. Так, нами было показано что, опухоль Эрлиха вырабатывает индуктор NO-синтазы, возможно, ИФ-у, стимулировавший продукцию OA клетками костного мозга. Однако, из литературы известно, что культивирование костного мозга с ИФ-у не изменяло ЕСА по отношению к пролиферации опухолевых клеток линий EL4, Р815, Х5563, WEHI164 [Sugiura К. et al., 1990]. Возможно, в нашем случае противоопухолевый эффект, очевидно, был обусловлен супрессорным фактором, отличным от OA. Им мог быть ТФР-(3, ИЛ-10 или какой-либо иной фактор.

При изучении in vitro влияния факторов опухоли Эрлиха на колониеобра-зующую способность костного мозга было получено, что в присутствии супернатанта опухолевых клеток увеличивалось число КОЕ-ГМ, а содержание КОЕ-Э не изменялось. Вероятно увеличение ГМ-предшественников под воздействием опухолевых факторов карциномы Эрлиха является одной из причин повышения иммуносупрессорной и противоопухолевой активностей клеток костного мозга в условиях in vitro. Необходимо заметить, что добавление блокатора NO-синтазы (NMMA) в культуру клеток значительно повышало образование КОЕ-Э. Таким образом, следует предположить, что супернатант опухоли Эрлиха содержит факторы, стимулирующие образование Эр-колоний, но их действие подавляется OA, продукция которого костномозговыми клетками активируется другими факторами, содержащимися в опухолевом супернатанте. Так, в работе

[Maciejewski J.P. et al., 1995] было показано, что выделение ФНО-а и ИФ-у-индуцированного ОА клетками костного мозга человека снижало способность клеток-предшественников к колониеобразованию и вызывало их апоптоз.

В качестве друго'й модели злокачественного роста мы использовали мышей линии AKR, которые, как известно, характеризуются высокой частотой возникновения тимом, вызываемых РНК-содержащим лимфотропным ретрови-русом Гросса [Gross L., 1951; Boniver J., 1981]. Наши исследования показали, что у мышей AKR в возрасте 4 и 7 мес наблюдалось повышение иммуносупрес-сорной и противоопухолевой активностей клеток костного мозга как по сравнению с контролем, так и с 2-месячными мышами (рис. 3). Однако, в селезенке эти виды активностей не выявлены во все сроки наблюдения.

Рис. 3. Иммуносупрессорная (ИСА) и противоопухолевая (ПОА) активности клеток костного мозга и продукция ими оксида азота у мышей линии АКИЛУ в процессе роста спонтанной Т-лимфомы (* - достоверное отличие от гибридов Б!, /?<0,05; # - достоверное отличие от 2-месячных мышей, р<0,05)

Иммуносупрессорная активность костномозговых клеток в некоторой степени была обусловлена продукцией этими клетками ОА. В то же время, противоопухолевое действие костного мозга опосредовалось не ОА, а иным су-прессорным фактором, поскольку в противоопухолевом тесте продукция ОА этими клетками не была зафиксирована. Таким образом, механизм индукции и активации иммуносупрессорного и противоопухолевого действия ECK костного мозга мышей линии AKR также различен.

Согласно работе [Козлов В.А., Цырлова И.Г., Чеглякова В.В., 1984] у мышей AKR/JY наблюдаются нарушения в эритроне, что приводит к накоплению в селезенках животных эритроидных клеток, обладающих выраженными иммуносупрессорными свойствами (Эр-супрессоры). Однако в нашем случае не было зарегистрировано появление иммуносупрессорной активности в селезенке мышей AKR всех возрастов, что, вероятно, связано с различием в моделях опу-

холевого роста. Об этом свидетельствует то, что у мышей этой линии мы не наблюдали накопления Эр-предшественников в костном мозге и признаков лейкоза.

Известно, что ЕСК обладают относительно низкой плавучей плотностью (1,063-1,075 г/л) [Sugiura К. et al., 1992]. Проведенное нами фракционирование суспензии костного мозга 7-месячных мышей AKR в градиенте плотности пер-колла показало, что II и III фракции костного мозга мышей AKR с плавучей плотностью 1,060-1,070 г/л и 1,070-1,075 г/л проявляли выраженную иммуно-супрессорную активность и продуцировали значительное количество ОА по сравнению с аналогичными фракциями костного мозга гибридов F1. В отличие от II и III фракции клетки костного мозга IV фракции, обладающие плавучей плотностью >1,075 г/л, не проявляли иммуносупрессорную активность и не продуцировали оксид азота. Таким образом, эти результаты показывают, что у мышей AKR/JY с Т-лимфомой иммуносупрессорную активность в костном мозге проявляют клетки с низкой плавучей плотностью (1,060-1,075 г/л), соответствующей плотности ЕСК.

По данным [Цырлова И.Г. и др., 1987; Лису ков И. А., 1988] у мышей линии AKR/JY в процессе злокачественного роста наблюдаются глубокие нарушения на уровне стволовых кроветворных клеток. В частности показано, что в костном мозге мышей AKR 4-го месяца жизни отмечалась высокая концентрация КОЕ-Э и снижение содержания эритроидных гемопоэтических островков, что говорит, вероятно, о блоке эритроидной дифференцировки. При этом высокая концентрация КОЕ-Э у мышей AKR не сопровождалась усилением эритро-поэза, по-видимому, в результате снижения выхода эритроидных гемопоэтических островков [Гольдберг Е.Д., и др., 1998]. А поскольку известно, что ЕСК относятся к незрелым гемопоэтическим предшественникам, то с этих позиций было интересно исследовать колониеобразующую активность клеток костного мозга у мышей AKR при развитии Т-лимфомы.

При изучении содержания гемопоэтических клеток-предшественников в костном мозге нами было выявлено, что у мышей линии AKR/JY всех возрастов наблюдалось снижение числа КОЕ-ГМ по сравнению с гибридами F1. При этом у молодых мышей AKR/JY (2 и 4 месяца) выявлялось снижение числа КОЕ-ГМ, однако к 7 месяцу их количество возрастало. Следует подчеркнуть, что содержание КОЕ-ГМ у 2-месячных животных оказалось в 1,9 раза ниже такового у 7-месячных мышей. Противоположная картина наблюдалась со стороны содержания эритроидных прекурсоров. У 2-месячных мышей линии AKR было зафиксировано повышенное количество КОЕ-Э. Затем имело место резкое падение их содержания, начиная с 4-месячного возраста.

Таким образом, в динамике развития опухоли у мышей AKR/JY в костном мозге наблюдалось возрастание числа гранулоцитарно-макрофагальных и снижение количества эритроидных прекурсоров.

Нами получено, что увеличение числа КОЕ-ГМ и КОЕ-Э in vivo не совпадало по кинетике с повышением иммуносупрессорной активности (активность

ECK в костном мозге повышалась уже в 4-месячном возрасте, в то время как учелисение числа ГМ-прекурсоров наблюдалось в 7 мес, а КОЕ-Э лишь в 2 мес). Вероятно, в этой модели, также как и при росте опухоли Эрлиха, реализуется более сложный путь активирования ECK.

Для изучения прямого действия факторов, продуцируемых клетками Т-лимфомы, клетки костного мозга культивировали in vitro с супернатантом клеток Т-лимфомы, выделенной у 7-месячных мышей.

Проведённые исследования позволили выявить, что факторы Т-лимфомы приводили к отмене иммуносупрессорного действия клеток костного мозга и снижению продукции ими OA, но в меньшей степени, чем факторы клеток тимуса нормальных животных, а также повышали противоопухолевую активность костномозговых клеток в равной степени по сравнению с факторами ти-моцитов. Это также свидетельствует о различии в механизмах действия и активации ECK, осуществляющих иммуносупрессорный и противоопухолевый эффекты при росте Т-лимфомы. Не было выявлено влияние супернатанта Т-лимфомы на образование как ГМ-, так и Эр-колоний. Факторы тимуса также не обладали колониестимулирующей способностью.

Известно, что внутритимусные Т-лимфоциты мыши способны без дополнительной стимуляции вырабатывать факторы, как стимулирующие, так и ин-гибирующие колониеобразование [Talaev V.Y. et al., 1991; Yarilin A.A. et al., 1990; Dalloul A.H. et al., 1991; Le P.T. et al., 1990; Сирина Е.Г. и др., 1996; Bharti A.C. et al., 2001].

В нашем случае мы использовали супернатант нефракционированного тимуса и Т-лимфомы, в котором, вероятно, содержались как факторы-ингибиторы, так и стимуляторы колониеобразования, действие которых нивелировалось за счет их противоположных эффектов.

В силу того, что факторы, продуцируемые Т-лимфомой, снижали имму-носупрессорное действие клеток костного мозга и не влияли на колониеобразование in vitro, тогда как in vivo рост опухоли сопровождался повышением иммуносупрессорного действия клеток костного мозга и изменением содержания КОЕ, можно сделать вывод о том, что активация ECK при росте Т-лимфомы является сложным процессом, в котором задействованы не только продуцируемые опухолью цитокины, но и другие системы организма в целом.

Известно, что ECK обладают способностью оказывать выраженное цито-статическое действие на лейкемические клетки [Sugiura К., Inaba М., Ogata Н. et al., 1990; Seledtsov V.l., Avdeev I.V., Morenkov A.V. et al., 1995].

Нам представлялось практически интересным попытаться дифференцированно воздействовать на иммуносупрессорный и противоопухолевый эффекты ECK. Для разработки подходов к снижению ЕСА при опухолевом росте мы провели ряд экспериментов, позволивших оценить влияние дексаметазона на интактные клетки костного мозга.

Как показано в литературе, глюкокортикоиды (ÍO^-ICT8 М) ингибируют активность ECK по отношению к митогенстимулированным мишеням [Rodriguez R. et al., 1994]. Механизм действия глюкокортикоидов направлен на подавление способности Т-клеток-мишеней продуцировать ИФ-у, который, в свою очередь, активирует ECK [Angulo I. et al., 1995].

Проведенные эксперименты показали, что при блокировании синтеза ИФ-у дексаметазоном (1и 10~7 М) в культуре костномозговых клеток их иммуно-супрессорная активность снижалась, в то время как противоопухолевая активность повышалась (рис. 4).

80 -70 -60 -50 • 40 -30 • 20 -10 -0 ■

□ коктро/ъ

□ ♦ дексгмегазон

■

ИСА

ПОА

Рис. 4. Иммуносупрессорная (ИСА) и противоопухолевая (ПОА) активности клеток костного мозга в присутствии 10"6 М дексаметазона (* - различия с контролем, р<0,05)

. Усиление дексаметазоном противоопухолевой активности неприлипаю-щих клеток КМ связано с его прямым действием на костномозговые эффекторы. Возможно, он стимулирует секрецию противоопухолевого фактора либо повышает чувствительность костномозговых эффекторов к опухолевым продуктам, которые активируют противоопухолевые свойства клеток КМ. Более детальное исследование действия дексаметазона и других веществ, способных оказывать влияние лишь на одно свойство ECK (иммуносупрессорное или противоопухолевое), может оказаться полезным в клеточной терапии злокачественных новообразований.

Таким образом, результаты проведенного нами исследования позволяют высказать следующие предположения о возможных механизмах повышения иммуносупрессорной активности костномозговых клеток при солидном росте карциномы Эрлиха.

Факторы, продуцируемые опухолью Эрлиха, стимулируют гемопоэз и вызывают активацию ECK в костном мозге и появление их в селезенке опухо-

леносителей. Следствием этого является выраженное повышение иммуносу-прессорной активности клеток костного мозга опухоленосителей и появление этого вида активности в селезенке. Иммуносупрессорная активность как клеток костного мозга, так и селезенки опосредуется оксидом азота. Данные о том, что в костном мозге опухоленосителей не происходит накопление ГМ- и Эр-предшественников, в то время как факторы опухоли Эрлиха усиливают образование ГМ- и Эр- колоний in vitro, лишь свидетельствуют о более сложном механизме активации ECK и вовлечении многих систем организма в процесс канцерогенеза и иммунодепрессии.

Клетки опухоли Эрлиха секретируют некий индуктор NO-синтазы (возможно, ИФ-у), который, стимулируя продукцию OA клетками костного мозга, способствует повышению их иммуносупрессорной активности. Более того, развитие этой опухоли сопровождается повышением продукции ИФ-у спленоци-тами мышей-опухоленосителей, что, в свою очередь, также усиливает продукцию OA иммуносупрессорными клетками и, следовательно, способствует повышению иммуносупрессорной активности костного мозга.

Механизм повышения иммуносупрессорной активности клеток костного мозга у мышей AKR отличается от описанного выше.

При росте спонтанной Т-лимфомы также как и при росте опухоли Эрлиха происходит накопление ECK в костном мозге, что вызывает повышение иммуносупрессорной активности костномозговых клеток, которая, по крайней мере частично, обусловлена OA. Однако, факторы, секретируемые клетками Т-лимфомы, не оказывают прямого влияния на количество ГМ- и Эр-колоний in vitro и лишь в небольшой степени повышают иммуносупрессорную активность костного мозга, а увеличение числа КОЕ-ГМ и КОЕ-Э in vivo не совпадает по кинетике с повышением иммуносупрессорной активности. Вероятно, в этой модели также реализуется более сложный путь активирования ECK.

Кроме того, на вышеописанных моделях опухолевого роста наглядно продемонстрировано, что механизмы иммуносупрессорной и противоопухолевой активностей ECK при опухолевом росте различны, поскольку, во-первых, они реализуются за счёт разных СФ, во-вторых, картина изменений иммуносупрессорной активности отлична от противоопухолевой, и, в-третьих, механизмы их индукции различны.

Существует возможность дифференцированно воздействовать на имму-носупрессорное и противоопухолевое действия ECK с помощью дексаметазона, который усиливает противоопухолевую активность неприлипающих клеток КМ, что связано с его прямым действием на костномозговые эффекторы, а также опосредованно угнетает иммуносупрессорную активность костномозговых клеток, воздействуя на спленоциты-мишени.

Таким образом, иммуносупрессорная активность костного мозга при опухолевом росте различна по механизмам активации, что может быть связано с определенными свойствами опухолей: способностью стимулировать колоние-

образование, метастазировать, вырабатывать индукторы оксида азота, те или иные цитокины. Эти различия, возможно, и обусловливают образование ECK с качественно иной функциональной активностью.

Полученные результаты расширяют представление о механизмах нарушения иммунорегуляторных свойств кроветворных клеток и могут лечь в основу разработки новых методов коррекции нарушений гемопоэза и противоопухолевой резистентности, имеющих место при злокачественных заболеваниях.

Выводы

1. При росте аденокарциномы Эрлиха происходит увеличение естественной супрессорной активности клеток костного мозга и'появление её в селезёнке, что связано с продукцией оксида азота этими клетками. Противоопухолевая активность клеток костного мозга при этом с ростом опухоли не изменяется, а противоопухолевая активность клеток селезёнки повышается.

2. Клетки аденокарциномы Эрлиха продуцируют факторы, которые в условиях in vitro оказывают стимулирующее действие на иммуносупрессорную и противоопухолевую активности клеток костного мозга.

3. При росте аденокарциномы Эрлиха не наблюдается увеличения содержания гранулоцитарно-макрофагальных предшественников в костном мозге, количество эритроидных прекурсоров значительно снижается на 14 сутки роста опухоли и повышается на 21 сутки. Супернатант аденокарциномы Эрлиха содержит факторы, которые в условиях in vitro стимулируют образование коло-ниеобразующих единиц как гранулоцитарно-макрофагального, так и эритроид-ного ряда.

4. У мышей линии AKR/JY в процессе роста Т-лимфомы повышается им-муносупрессорная и противоопухолевая активности клеток костного мозга. Спленоциты при этом не обнаруживают данных видов активности. Иммуносу-прессорная активность посредована оксидом азота, тогда как противоопухолевая активность - другим супрессорным фактором.

5. Клетки Т-лимфомы продуцируют факторы, которые в условиях in vitro снижают иммуносупрессорную и не изменяют противоопухолевую активности клеток костного мозга.

6. При росте Т-лимфомы у мышей линии AKR7JY наблюдается возрастание числа гранулоцитарно-макрофагальныхиснижение количестваэритроидных прекурсоров. Факторы Т-лимфомы in vitro не влияют на колониеобразование костного мозга.

7. Механизм повышения продукции оксида азота при росте опухоли Эрлиха обусловлен секрецией клетками опухоли растворимого фактора, индуцирующего выработку оксида азота как клетками костного мозга, так и самими опухолевыми клетками. Рост опухоли Эрлиха сопровождается повышением секреции интерферона-гамма Т-лимфоцитами, что также вызывает повышение продукции оксида азота клетками костного мозга и селезенки.

8. Т-лимфоциты принимают участие в регуляции активности естественных супрессорных клеток в условиях in vitro посредством вырабатываемых ими факторов. Супернатанты Т-клеток в зависимости от содержания в них интерфе-рона-гамма способны in vitro как увеличивать, так и снижать иммуносупрес-сорную активность неприлипаюших клеток костного мозга.

9. В условиях in vitro дексаметазон опосредованно угнетает иммуносу-прессорную активность костномозговых клеток, воздействуя на спленоциты-мишени, и усиливает противоопухолевую активность, что связано с его прямым действием на костномозговые эффекторы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Супрессорная и противоопухолевая активность клеток костного мозга и селезенки мышей AKR при старении / Соавторы: Вельский Ю.П, Вельская Н.В., Данилец М.Г., Кусмарцев С.А. // Бюлл. эксп. биол. и мед. - 1999. - Т. 127,-№4.-С. 452-454.

2. Регуляция антипролиферативной активности неприлипаюших клеток костного мозга. Роль интерферона-у / Соавторы: Вельский Ю.П., Данилец М.Г., Вельская Н.В., Кусмарцев С.А. // Бюлл. эксп. биол. и мед. - 1999. - Т. 128. -№ 12.-С. 677-680.

3. Характеристика естественной супрессорной активности при росте опухоли Эрлиха / Соавторы: Вельская Н.В., Данилец М.Г., Вельский Ю.П., Кусмарцев С.А., Агафонов В.И. // Бюлл. эксп. биол. и мед. - 2000. - Приложение 1. - С. 60-63.

4. Разнонаправленная действие дексаметазона на противоопухолевую и естественную супрессорную активность клеток костного мозга / Соавторы: Вельская Н.В., Вельский Ю.П., Агафонов В.И. // Бюлл. эксп. биол. и мед. - 2000. - Т. 129. - № 4. - С. 386-388.

5. Супрессорная активность клеток костного мозга мышей с карциномой легких РЛ-67 / Соавторы: Вельский Ю.П. // Проблемы экспериментальной и клинической фармакологии. - Томск: Изд-во Том. ун-та, 2000. - С. 47-48.

6. Механизм усиления иммуносупрессорных свойств клеток костного мозга при росте карциномы Эрлиха /' Соавторы: Вельский Ю.П., Вельская Н.В., Агафонов В.И. // Бюлл. эксп. биол. и мед. - 2001. - Приложение 1. - С. 7577.

7. Характеристика противоопухолевых свойств гемопоэтических клеток / Соавторы: Вельская Н.В. // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии - Томск: Изд-во Том. ун-та, 2001. - С. 14-17

8. Иммуносупрессорная и противоопухолевая активность клеток костного мозга и селезенки при росте карциномы Эрлиха / Соавторы: Вельский Ю.П. // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии. -Томск: Изд-во Том. ун-та, 2001. - С. 157-160.

Актуальность. Известно, что опухолевый рост сопровождается значительными изменениями в системе крови и нарушениями в иммунной системе онкологического больного. Одной из причин развивающейся при бластомоге-незе иммунодепрессии может быть активация неспецифических иммуносупрес-соров костномозгового происхождения [Subiza J.L., Vinuela J.E., Rodriguez R., 1989; Young M.R., Newby M., Wepsic H.T., 1987; Кусмарцев С.A., 1990]. Описаны ECK миелоидной, эритроидной и лимфоидной природы [Чеглякова В.В., Цырлова И.Г., Козлов В.А., 1989; Brooks-Kaiser J.C., Murgita R.A., Hoskin D.W., 1992; Sugiura К., Ikehara S., Inaba M. et al., 1992]. В норме их физиологической функцией является негативная регуляция кроветворения, а также предотвращение активации иммунных процессов на территории костного мозга [Corvese J.S., Lewy Е.М., Bennet М. et al., 1980; Moore S.C., Theus S.A., Barnett J.B., 1992; Slavin S., Strober S., 1979]. Активация естественных супрессоров в костном мозге с последующей их миграцией в периферические органы наблюдается при резкой стимуляции гемопоэза и переносе эктопических очагов кроветворения в селезенку, в частности, при облучении, введении циклофосфана, фенилгидра-зина, некоторых жирных кислот, а также при росте злокачественных опухолей органов [Deruysscher D., Sobis Н., Vandeputte М. et al., 1991; Sykes M., Sachs D.N., 1988; Brooks-Kaiser J.C., Borque L.A., Hoskin D.W., 1993; Кашлакова H.B., 1987; Кашлакова H.B., Лисуков И.А., Цырлова И.Г. и др., 1988; Кусмарцев С.А., Огреба В.И., 1989; Nicoletti G., Brambella P., De Govanni С. et al., 1985].

В эксперименте показано, что ECK оказывают свое антипролиферативное действие через секрецию супрессорных факторов (СФ). Так, при опухолевой профессии ЕСК, продуцирующие антипролиферативные медиаторы - ТФР-Р и оксид азота (OA), обнаруживаются в селезенке, а также в самой опухоли [Young M.R., Wright М.А., 1992; Young M.R., Мс Closkey G„ Wright M.A. et al., 1994; Young M.R., Wright M.A., Matthews J.P., 1996; Вельская H.B., Данилец М.Г., Вельский Ю.П. и др., 2000]. Они оказывают выраженное иммуносупрессорное действие: подавляют митоген- и антиген-индуцированную пролиферацию Т- и В-лимфоцитов, активность НК, ингибируют продукцию ФНО макрофагами и т. д. [Subiza J.L., Vinuela J.E., Rodriguez R., 1989; Young M.R., Wright M.A., Young M.E., 1991] В комплексный механизм опухоль-опосредованных нарушений миелодного ростка вовлечены простагландины (ПГ), ТФР-(3, OA и его индукторы (ИФ-у, ФНО-альфа), а также, возможно, ИЛ-10, ИЛ-4, ИЛ-12, протеазы и молекулы адгезии, принимающие активное участие в регуляции кроветворения [Alleva D. G., Walker Т. М., Elgert K.D., 1995; Assoian R.K., Rob-ertz А.В., Wakefield L.M. et al., 1985; Hemler M.E., 1990; Maeda H., Shiraishi A., 1996].

Факторы, опосредующие иммуносупрессорную активность, могут быть различными в зависимости от состояния клеток-продуцентов и от наличия ци-токинов, стимулирующих выработку этих факторов. Известно, что медиатором иммуносупрессорного действия ЕСК интактного костного мозга является OA [Angulo I., Rullas J., Campillo J.A. et al, 2000]. Причем ИФ-у стимулирует продукцию OA костномозговыми клетками, а добавление ГМ-КСФ значительно усиливает ее [Arai К., Nishida J., Hayashida К. et al., 1990; Punjabi С.J., Laskin J.D., Hwang S.M. et al., 1994]. Дексаметазон, подавляя секрецию ИФ-у, блокирует активность ЕСК [Rodrigez R., Angulo I., Vinuela J.E. et al, 1994].

В тоже время длительное воздействие ГМ-КСФ или ИЛ-3 на миелока-риоциты вызывает интенсивную продукцию ими ТФР-(3 [Moore S.C., Shaw М.А., Soderberg L.S.F., 1992]. Так в работах [Young M.R., Young М.Е., Wright М.А., 1990; Young M.R., Wright M.A., Coogan M. et al., 1992] показано, что при росте карциномы Льюиса наблюдалось повышение естественной супрессорной активности вследствии того, что данная опухоль, секретируя ГМ-КСФ и ИЛ-3, вызывала повышение количества СЭ34+-клеток (полипотентных предшественников, проявлявших иммуносупрессорную активность) в костном мозге и их миграцию в селезенк\ и опухолевый узел, что приводило к развитию неэффективного противоопухолевого ответа за счет продукции ими ТФР-[3. Важная роль таких ЕСК в развитии иммунодепрессии в данной экспериментальной системе была подтверждена тем, что их удаление сопровождалось появлением в опухолевом узле и селезенке опухоленосителей цитотоксических (противоопухолевых) Т-лимфоцитов. Это приводило к замедлению роста опухоли и значительному снижению ее метастазирования [Young M.R., Wright М.А., 1992; Young M.R., Мс Closkey G., Wright M.A. et al., 1994]. Этими же авторами показана прогностическая ценность определения у онкологических больных содержания CD34+ клеток в опухолевом очаге, а также продукции ГМ-КСФ опухолевыми клетками [Young M.R., Wright М.А., Lozano Y. et al., 1997].

Особый интерес вызывает способность ЕСК подавлять in vitro пролиферацию опухолевых клеток [Seledtsov V.I., Avdeev I.V., Morenkov A.V. et al., 1995; Sugiura K., Inaba M., Ogata H. et al., 1990; Вельский Ю.П., Вельская H.B., Данилец М.Г. и др., 1999]. То есть in vitro эти клетки осуществляют разнонаправленное действие - как проопухолевое (иммуносупрессорное), так и противоопухолевое. Более того, можно частично разделить субпопуляции противоопухолевых и иммуносупрессорных эффекторов [Seledtsov V.I., Taraban V.Y., Seledtsova G.V. et al., 1997]. Однако механизмы, лежащие в основе индукции их противоопухолевого действия, а также супрессорные факторы, секретируемые при этом, изучены мало в отличии от иммуносупрессорного действия. Таким образом, существуют предпосылки для поиска возможностей раздельной регуляции противоопухолевого и иммуносупрессорного действия ЕСК. В связи с вышеизложенным представляется актуальным исследовать иммуносупрессорное и противоопухолевое действие клеток костного мозга, количественные изменения миелоидных и эритроидных прекурсоров, а также влияние опухолевых факторов на антипролиферативную и колониеобразующую активности костного мозга в различных моделях опухолевого роста.

Цель исследования. Целью настоящей работы является изучение механизмов влияния опухоли на иммуносупрессорную и противоопухолевую активности клеток костного мозга при экспериментальном опухолевом росте.

Задачи исследования.

1. Изучить влияние опухоли Эрлиха на иммуносупрессорную и противоопухолевую активности клеток костного мозга in vivo и in vitro.

2. Изучить влияние опухоли Эрлиха на колониеобразующую активность клеток костного мозга in vivo и in vitro.

3. Изучить влияние спонтанной Т-лимфомы на иммуносупрессорную и противоопухолевую активности клеток костного мозга in vivo и in vitro.

4. Изучить влияние спонтанной Т-лимфомы на колониеобразующую активность клеток костного мозга in vivo и in vitro.

5. Оценить влияние Т-лимфоцитов на иммуносупрессорную активность клеток интактного костного мозга.

6. Оценить влияние дексаметазона на противоопухолевую активность клеток костного мозга.

Научная новизна. Работа представляет собой фундаментальное исследование, раскрывающее некоторые механизмы влияния опухоли на иммуносу-прессорные и противоопухолевые свойства клеток костного мозга. В работе впервые дана комплексная оценка функционального состояния колониеобра-зующей, иммуносупрессорной и противоопухолевой активностей костномозговых клеток в условиях роста аденокарциномы Эрлиха и Т-лимфомы. Впервые изучено влияние факторов, продуцируемых аденокарциномой Эрлиха и Т-лим-фомой, на колониеобразующую, иммуносупрессорную и противоопухолевую активности интактного костного мозга in vitro.

Выяснены некоторые механизмы повышения продукции оксида азота клетками костного мозга и селезенки в динамике развития карциномы Эрлиха. Так, в частности, получены результаты, свидетельствующие о том, что клетки опухоли Эрлиха секретируют растворимый фактор (факторы), индуцирующий продукцию оксида азота клетками костного мозга и самими опухолевыми клетками. Кроме того, выявлено, что рост опухоли сопровождается повышением секреции интерферона-гамма Т-лимфоцитами. Это объясняет наблюдаемое при росте данной опухоли повышение продукции клетками костного мозга оксида азота и опосредованной им иммуносупрессорной активности.

Установлено различие механизмов иммуносупрессорного и противоопухолевого действия ЕСК при опухолевом росте. Показана возможность дифференциально воздействовать на иммуносупрессорное и противоопухолевое действия естественных супрессорных клеток с помощью интерферона-гамма и дексаметазона. Продемонстрировано, что Т-клеточные факторы, в частности, интерферон-гамма, способны in vitro как увеличивать, так и снижать иммуносупрессорную активность неприлипающик клеток костного мозга. Дексамета-зон in vitro усиливает противоопухолевую активность неприлипающих клеток костного мозга, а также угнетает иммуносупрессорную активность костномозговых клеток.

Практическая значимость. Полученные данные расширяют представления о клеточных механизмах нарушения иммунорегуляторных свойств кроветворных клеток в процессе опухолевого роста. Они могут явиться основой для разработки новых методов коррекции нарушений гемопоэза и противоопухолевой резистентности, имеющих место при злокачественных заболеваниях, а также патогенетически обоснованных методов противоопухолевой терапии с использованием препаратов, модулирующих функции естественных супрессорных клеток.

Основные положения выносимые на защиту.

1. Рост аденокарциномы Эрлиха сопровождается увеличением иммуносупрессорной активности клеток костного мозга и появлением её в селезёнке, что связано с продукцией оксида азота этими клетками. Противоопухолевая активность клеток костного мозга при этом не изменяется, а противоопухолевая активность селезёнки повышается. Кроме того, при росте опухоли Эрлиха не изменяется содержание колониеобразующих единиц гранулоцитарно-макрофагального ряда в костном мозге, количество колониеобразующих единиц эритроидного ряда значи гельно снижается на 14 сутки роста опухоли и повышается на 21 сутки.

2. Супернатант аденокарциномы Эрлиха содержит факторы, которые в условиях in vitro стимулируют иммуносупрессорную, противоопухолевую и колониеобразующую активности клеток костного мозга.

3. У мышей линии AKR/JY в процессе роста Т-лимфомы повышается им-муносупрессорная и противоопухолевая активности клеток костного мозга. Спленоциты при этом не обнаруживают данных видов активности. Иммуносу-прессорная активность посредована оксидом азота, тогда как противоопухолевая активность - другим супрессорным фактором. При этом наблюдается возрастание числа гранулоцитарно-макрофагальных и снижение количества эрит-роизных прекурсоров.

4. Факторы Т-лимфомы in vitro снижают иммуносупрессорную и не изменяют противоопухолевую активности клеток костного мозга и не влияют на колониеобразование костного мозга.

5. Механизм повышения продукции оксида азота при росте опухоли Эрлиха обусловлен секрецией клетками опухоли растворимого фактора, индуцирующего выработку оксида азота как клетками костного мозга, так и самими опухолевыми клетками. Рост опухоли Эрлиха сопровождается повышением секреции интерферона-гамма Т-лимфоцитами, что также вызывает повышение продукции оксида азота клетками костного мозга и селезенки.

6. Т-лимфоциты принимают участие в регуляции активности естественных супрессорных клеток в условиях in vitro посредством вырабатываемых ими факторов. В условиях in vitro дексаметазон опосредованно угнетает иммуносупрессорную активность костномозговых клеток и усиливает их противоопухолевую.

Апробация работы. Основные результаты доложены и обсуждены на итоговой научной конференции НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2001 г.).

Публикация результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 5 работ в центральных журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 133 страницах машинописного текста, иллюстрирована 27 рисунками, 9 таблицами и состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов и списка литературы из 177 наименований.

выводы

1. При росте аденокарциномы Эрлиха происходит увеличение иммуносу-прессорной активности клеток костного мозга и появление её в селезёнке, что связано с продукцией оксида азота этими клетками. Противоопухолевая активность клеток костного мозга при этом с ростом опухоли не изменяется, а противоопухолевая активность клеток селезёнки повышается.

2. Клетки аденокарциномы Эрлиха продуцируют факторы, которые в условиях in vitro оказывают стимулирующее действие на иммуносупрессорную и противоопухолевую активности клеток костного мозга.

3. При росте аденокарциномы Эрлиха не наблюдается увеличения содержания гранулоцитарно-макрофагальных предшественников в костном мозге, количество эритроидных прекурсоров значительно снижается на 14 сутки роста опухоли и повышается на 21 сутки. Супернатант аденокарциномы Эрлиха содержит факторы, которые в условиях in vitro стимулируют образование коло-ниеобразующих единиц как гранулоцитарно-макрофагального, так и эритроид-ного ряда.

4. У мышей линии AKR/JY в процессе роста Т-лимфомы повышается им-муносупрессорная и противоопухолевая активности клеток костного мозга. Спленоциты при этом не обнаруживают данных видов активностей. Иммуно-супрессорная активность опосредована оксидом аюта, тогда как противоопухолевая активность - другим супрессорным фактором.

5. Клетки Т-лимфомы продуцируют факторы, которые в условиях in vitro снижают иммуносупрессорную и не изменяют противоопухолевую активности клеток костного мозга.

6. При росте Т-лимфомы у мышей линии AKR/JY наблюдается возрастание числа гранулоцитарно-макрофагальных и снижение количества эритроидных прекурсоров. Факторы Т-лимфомы in vitro не влияют на колониеобразую-щую способность клеток костного мозга.

- 1127. Механизм повышения продукции оксида азота при росте опухоли Эрлиха обусловлен секрецией клетками опухоли растворимого фактора, индуцирующего выработку оксида азота, как клетками костного мозга, так и самими опухолевыми клетками. Рост опухоли Эрлиха сопровождается повышением секреции интерферона-гамма Т-лимфоцитами, что также вызывает повышение продукции оксида азота клетками костного мозга и селезенки.

8. Т-лимфоциты принимают участие в регуляции активности естественных супрессорных клеток в условиях in vitro посредством вырабатываемых ими факторов. Супернатанты Т-клеток в зависимости от содержания в них интерферона-гамма способны in vitro как увеличивать, так и снижать иммуносупрессорную активность неприлипающих клеток костного мозга.

9. В условиях in vitro дексаметазон опосредованно угнетает иммуносупрессорную активность костномозговых клеток, воздействуя на спленоциты-мишени, и усиливает противоопухолевую активность, что связано с его прямым действием на костномозговые эффекторы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом результаты проведенного нами исследования позволяют высказать следующие предположения о возможных механизмах повышения иммуносупрессорной активности костномозговых клеток при солидном росте карциномы Эрлиха.

Факторы, продуцируемые опухолью Эрлиха, стимулируют гемопоэз и вызывают активацию ЕСК в костном мозге и появление их в селезенке опухо-леносителей. Следствием этого является выраженное повышение иммуносупрессорной активности клеток костного мозга опухоленосителей и появление этого вида активности в селезенке. Иммуносупрессорная активность как клеток костного мозга, так и селезенки опосредуется оксидом азота. Данные о том, что в костном мозге опухоленосителей не происходит накопление ГМ- и Эр-предшественников, в то время как факторы опухоли Эрлиха усиливают образование ГМ- и Эр- колоний in vitro, лишь свидетельствуют о более сложном механизме активации ЕСК и вовлечении многих систем организма в процесс канцерогенеза и иммунодепрессии.

Клетки опухоли Эрлиха секретируют некий индуктор NO-синтазы (возможно, ИФ-у), который, стимулируя продукцию OA клетками костного мозга, способствует повышению их иммуносупрессорной активности. Более того, развитие этой опухоли сопровождается повышением продукции ИФ-у спленоци-тами мышей-опухоленосителей, что, в свою очередь, также усиливает продукцию OA иммуносупрессорными клетками и, следовательно, способствует повышению иммуносупрессорной активности костного мозга.

Механизм повышения иммуносупрессорной активности клеток костного мозга у мышей AKR отличается от описанного выше.

При росте спонтанной Т-лимфомы также как и при росте опухоли Эрлиха происходит накопление ЕСК в костном мозге, что вызвает повышение иммуносупрессорной активности костномозговых клеток, которая, по крайней мере, частично, обусловлена OA. Однако, факторы, секретируемые клетками Тлимфомы, не оказывают прямого влияния на количество ГМ- и Эр-колоний in vitro и лишь в небольшой степени повышают иммуносупрессорную активность костного мозга, а увеличение числа КОЕ-ГМ и КОЕ-Э in vivo не совпадает по кинетике с повышением иммуносупрессорной активности. Вероятно, в этой модели также реализуется более сложный путь активирования ЕСК.

Кроме того, на вышеописанных моделях опухолевого роста наглядно продемонстрировано, что механизмы иммуносупрессорной и противоопухолевой активностей ЕСК при опухолевом росте различны, поскольку, во-первых, они реализуются за счёт разных СФ, во-вторых, картина изменений иммуносупрессорной активности отлична от противоопухолевой, и, в-третьих, механизмы их индукции различны.

Существует возможность дифференцированно воздействовать на имму-носупрессорное и противоопухолевое действия ЕСК с помощью ИФ-у и дексаметазона. Кроме того, ИФ-у не только сам активирует ЕСК, но может также модулировать стимулирующее действие других цитокинов. Дексаметазон усиливает противоопухолевую активность неприлипающих клеток КМ, что связано с его прямым действием на костномозговые эффекторы, а также опосредованно угнетает иммуносупрессорную активность костномозговых клеток, воздействуя на спленоциты-мишени.

Таким образом, иммуносупрессорная активность костного мозга при опухолевом росте различна по механизмам активации, что может быть связано с определенными свойствами опухолей: способностью стимулировать колониеобразование, метастазировать, вырабатывать индукторы оксида азота, те или иные цитокины. Эти различия, возможно, и обусловливают образование ЕСК с качественно иной функциональной активностью.

Полученные результаты расширяют представление о механизмах нарушения иммунорегуляторных свойств кроветворных клеток и могут лечь в основу разработки новых методов коррекции нарушений гемопоэза и противоопухолевой резистентности, имеющих место при злокачественных заболеваниях.