Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Изучение механизмов активности неспецифических супрессорных клеток в эксперименте

На правах рукописи

Р Г 5 ОД

». Г"} ' • ' "

ЗЕМЛЯНСКАЯ НАТАЛИЯ ВИТАЛЬЕВНА

ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ НЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ СУПРЕССОРНЫХ КЛЕТОК В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

14.00.14 - окхолопга

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации ла соискание ученой. степени кандидата медицинских наук

Т0МС2 - 1996. г.

Работа еыпошшш ь> Научко-ассягдссгл-ггьсхой лаборатории экспериментального бномедишшского моделирования Томского науч-кого центра СО РАМН и Научао-исследовательскоы институте Томского научного центра СО РАМН.

Научные руководители:

академик РАМН, профессор К.В. Васильев,

кандидат медициной« тук СЛ. Кусмарцев.

Официальные оппоненты:

доктор медищшскюс наук, профессор В.Е.Голадберг, каидвдат биологических паук Н.В.Чердыкцеса.

Всдушее оргаяазадап: Институт кдтшчесЕой тшунолошн СО РАМН.

Зпиигга состоится " _ 1958 г. в "_" час. на

зассдзпкн дассертацаокЕого Совета Д 001.34.01 в Научно-исследэза-тглъехкл институте онкологии Токского научного центра СО РАМН (63'Ж)1, Телек, пгр.Коопе-рзтнвпий, 5).

С д.;ссерта12:еГ1 шкзко огвакоштля в библиотеке НИК онеологея ТНЦ СО Г'ЛМН (пгр.Ксспгрзтагиый, 5). ]

развел-то "___ 1995 г.

скрэтарг» г . у

Д2ссер1аанош:ого Совета, гишдтат гдсдхтяиисанл пауа

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Известно, что прогресс.грующий характер роста большинства опухолей тесно связан с наличием первичных и приобретенных иммунодефицкгов, которые проявляются в относительной неэффективности механизмов противоопухолевой защиты и в избыточной активации механизмов иммуносупрессии [Кароог Q.S., 1982; North RJ. et aL, 1984]. При росте химически индуцированной, спонтанной и перевивной опухоли показана активация иммуносупрессоров костного мозга и их экспансия в селезенку {Subiza J.L. et aL, 1989; Кусмарцев С.А., 1990; Young M.R.I. et aL, 1992; Young M.R.I. et aL, 1994]. Эти иммуносупрессоры (так называемые естественные супрсссорные клетки, ECK) имеют нулевой фенотип, способны действовать дистантно через растворимые факторы, неспецифичсски, без предварительного контакта, не рестрихтировано по антигенам тстосовместимосга. Кроме ингибиции ответа Т-, B-клеток [Maes L.Y. et al., 1988; Subiza J.L et al., 1989], натуральных киллеров {Fu Y.X., 1991; Young M.R., 1992], ECK участвуют в регуляции гемо-поэза, подавляя колониеобразование стволовых кроветворных клеток (СКК) и выработку стромальными элементами ростовых факторов (Young M.R., 1988; Moore S.C., 1992]. В ряде работ пог казано наличие цитосгатического действия ECK на опухолевые клетки in vitro jSugiura К. et aL, 1990; Setedtsov V.l. et al., 1995].

С другой стороны, опухолевые клетки обладают независимостью от ко!ггрол1гругащих пролиферащпо сигналов и способностью к постоянному автономному росту, в частности, за счет способности продуцировать факторы роста {Блинов М.Ы., 1590]. Одной из возможных причин иммунодефицита является активация ростовыми факторами ECK костного мозга. Показано, что продуцируемые опухолевой тканью ростовые факторы, такие как, шггерлейкин-3 (ИЛ-3), гранул оцитарно-макрофатальный коло-нисстимулирующий фактор, активируют ECK {Sotomayor Е.М. et al.. 1991. Young M.R. et al., 1992, Young M.R. et al., 1994].

Еще одно обстоятельство привлекает внимание к ECK: применение химиопреггаратоа и гемопозтичесгсих ростоаых (факторов для лечения больных со злокачественными новообразова-шгями приводит к глубокому вмешательству а гемопоэз, а соответственно, и к вмешательству в систему, регулирующую пролиферацию кроветворных клеток. Данные о результатах применения

б клинике рскомбикшгпюго человеческого фанулошггарно-мак-рофагалыюго кадониестгс^/ларузошего ф&асра (рчГМ-КСФ) для устранения мислосупрессзш, развившейся после лечения высокими дозами щггостатиков, неоднозначны: одни авторы показывают неэффективность и даже токсичность препарата {Носктап К. е! а1., 1991; Ва]огш О.К с1 а!., 1995]„ другие, иапропш, рскоме;щуют его доя ускорения сссстаноапешш количества нейтрофотов и снижения частоты свя^нных с нейтропекией инфекционных осло^нешш |Вс)шсг Т. с! а!.. 1991). Использование ИЛ-3 и рчГМ-КСФ или рчГ-КСФ (гранулощггарного) в качестве индуцирующих дифференщгровку факторов при миелоидных лейкемиях до химиотерапии не было успеипшм {Бехиг М., 1992). Показана эффективность прпменстшя рчГМ-КСФ при подготовке больных к ауголопгческой транешшггашш костного мозга, препарат значительно увеличивает кол!кество СКК в периферической крови больных после аысокодозовой химиотерапии [Но АО. е1 а!., 1991), Описано успешное лечение анемии, разв5тающе'йся после алдогенной трансплшггащш костного мозга, а также у больных со злокачесгаешгымя новообразованиями разной локалташог при помощи зршропоэпша (ЗП) {РкОаш^ 1-.С. е1 а!., 1991, Бутапп М., 1992].

Та;."^; образом, в ситуации экспериментального бластомо-генсза и б клинике наблюдается вмешательство опухоли в гомео-стаз §фовстворной ткшш. активация естественных супреосорон. которые, б свою очередь. способны подавлять как противоопухолевый отпет. так и штймгровать гемопоэз. Пршленснпе и;гго-слтиИчссгаЫ препаратов п роётоных факторов может также усеивать генерацию естественных супрессороа, приводя к снижению :ффсктт»и*гти лечения. В спичи с кшисипозкенным приобретают ;;?гл-гль-н> »опросы, касающиеся мгхашгзмов рефляции ЬСК при исиользоиакии химиотсрапсвтическт: и ге-<.л ?;\гул*фу к>пшх препаратов.

.цст!ч> и задачи ксследоват'я. Целью данной работы яьлястси печение регуляции активности сстесчъенных супрессорггкх гсл рсгстсаиаш ¿здггорзди ¡л \'п*> и т Г1тпк внутриклеточных <лс-хдшпмоь кх актняални. а 'шже влияния шггосгатиков на кось ног.озгоглю иопулкшпо суиргссорнш клеток В работе плгта»-л-ны еяеауюшиг гидачи:

I. Изучить влияние на ЕСК коло;шсст1;мул;яп-ю-;.ц-[о фактора ГМ-!ССФ и эритропоэг»Ш2 ¿я \-ivo и т ун'го.

2. Исследовать взаимосвязь клеточного метаболгама, синтеза ДНК, РНК и активности ECK. Оценить роль ионов водорода в регуляции активности естественных супрессорных клеток in vitro.

3. Охарактеризовать влияние ахтиномицина Д на супрес-сорнуго активность костного мозга, его зависимость от дозы препарата и генотипа животных

4. Изучить механизм действия индуцированных актиноми-цином Д супрессоров на клетки-мишени, определить некоторые характеристики растворимой супрессорной активности (зависимость от цшетооксигеназы, видоспецифичность, чувствительность к нагреванию, кипячению, заморозке и оттаиванию). •

5. Охарактеризовать клетки-продуценты растворимой супрессорной активности, реагирующие на акшномицин Д.

6. Сравнить дейстзие актиномицина Д, оливомицина и винкристина на естественные супрессорные клетки костного мозга.

положения, ринрсимнс, нозтиту;

1. Стимуляция гемопозза in vivo на уровне гранулощггарно-макрофагальных и эритроидкых предшесгоетшков ростовыми факторами (ГМ-КСФ и ЭП) сопровождается усилением как иммуносупрессорной, так и противоопухолевой активности естественных супрсссорных клеток.

2. Противоопухолевые цигостатические препараты с разным механизмом действия (актшгомицпн Д, оливошщнн и вин-кристин) способны in vitro усиливать естественною супрессорную акпгоность через усилешге продукции супрессорного фактора (ов), который нмее^ небелковую природу, не принадлежи1 к про-стагландинам, не обладает вндоспецифичносгыо.

Научная новизн?.- В результате проведенных исследований получены новые данные о влиянии ростовых факторов на активность ECK. определены некоторые аспекты внутриклеточного механизма активации ECK, а такхе показано действие противоопухолевых препаратов на естественносунсессорную активность (ЕСА).

Впервые показано влияние ГМ-КСФ, вводимого in vivo, не только на пммуносупрессорнуго, но и на противоопухолевую активность естествешгых супрессорных клеток костного мозга. Впервые показано, что экзогенный зритропоэтин усиливает иммуносупрессоркуго и противоопухолевую активность костного

мозга и индуцирует появление ЕСЛ в селезенке. Показано, противоопухолевая активность ECK несколько снижалась, 1Шмуносупрессорная не изменялась гюи блокировании цитохр< моксидазного комплекса азидом натрия, ингибирование синте; ДНК мигомшданом С Ttu-se несколько снижало противоопухол зое, но не влияло на иммуносупрессорное дейсшие ECK.

Впервые показано, что акпшомицин Д способ« значительно усиливать ЕСА костного мозга. Эффект зависит < дозы препарата и не зависит от генотипа экспериментально; животного. Подобное действие, хотя и в значительно меныхн степени, оказывают оливемзшин и винкрисгин. Антипролифср тивное действие активированных актиношшином Д супрессори проявляется как при контакте с клетками-мишенями, так и до тантно через растворимый супрессорный фактор(ьг). Охарактер: зована природа растворимой супрессорной активности: факторО обладает видонеспецифичностью, не принадлежит к просгагла динам и не является белком. Показали, что под влиянием акт номицина Д появляется растнорнмая iгммугroc^Tipeccopi 1ая акта ностъ у клеток шмуса и селезенки, хотя и не столь значительна как у костного мозга. Индуцируемая актиношшином Д иммун супрессорная активность частично связана со зрелыми Т-клстк ми, т.к. удаление ТЬу-1.2-позитивных клеток из костного мо: несколько пошс£2ло уровень су1фессш1.

Теоретическое и' ггоакткчсское значение работы. Теор тическос значение полученных результатов состот' в расширен! представлений о механизмах иммунодефгшита н снижения прот воопухолеаой резистентности, что 1смеет- место при отболев» рэсге. Проведенные исследования позволяют глубже понять вс нох:кнс пути развития устойчивости к противоопухолевым аш Г-ii'.,:- -,:,< ц причины неоднозначных результатов применен Pv.: факлхэров в целях восстановления гемоггозза после х

г»г>:г/1хгра1иш. Изучение способов воздействия на активность е<г стенных супрессорных клеток может служить основой для сох шш козых мелхэдов лечения злокачественных заболеваний с не мк кроветворения. например, для пре ду ггре ;;сд с:шя РТПХ п дллогенной трансплантации костного мозга, для предогврашен контаминации опухолевыми клетками аутологического тра! плантата костного мозга при его восстановлении после г-ысокс; зовой химиотерашш.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены и обсуждены на расширенном заседашш Томского общества иммунологов (Томск, 1993), на 12-ой Европейской иммуго-логической конференщт (Барселона, 1994), на ежегодном Конгрессе иммунологов Великобритании (Брайтон, 1995).

Публикация результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Структура и объем диссертанта. Диссертационная работа изложена на 156 сгратщах машинописного текста, иллюстрируется 33 риеункаш!, 15 таблицами и состоит из введения, 5 глав, заключения и выводов, списка литературы из 167 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Естественная супрессор-ная активность как вариант регулящги иммунитета и гемонета. Регуляция активности ECK. Механизмы регуляции естественно-супрессорной актшшости (ЕСА). Влияние цитостатикоз на организм. Актиномицин Д как представитель группы противоопухолевых анпгбиотикоа.

В обзоре литературы рассматриваются следующие вопросы: феномен естествештой суярессорной актшшосш, генез клеток с естественной суппессорной активностью при нормальном гемопоэзе, при мо.тудяхщи зритропоэза, при стимуляции мпелопогм азастграном, после тотального лимфеидкого облучай:.:. сшппгаой и аллоплшой трансплантации, при 1УГПХ. при неонатгльном 'емопоэзе, после введения циклофсефана, при беременности, а также при опухолевом росте:

- регуляция активности ECK (влишше ГМ-КСФ, ннтерлей-кинов 3. 4 и 6. у-интерферона. фактора некроза опухоли а);

- механизмы рауляции активности ECK (влияние антител irpoTim трансформирующего фактора роста ß на ЕСА. чувствительносп» к индометашшу, у-гагтерферону, облучению и »ппибиторам с:::пса белка);

- влияние шггосгатиков на организм на npirMepe актиномн-шша Д. его химическое строение и биолошческие свойства, противоопухолевое действие в эксперименте и гтрнмснешге в клинике, чеиствие актинокишша Д на клеточный цикл, »гммушсый ответ и Зоохимические внутриклеточные процессы, мехагагзм

взаимодействия актиномицина Д с клеткой (взаимодействие актшюмицииа Д с молекулами ДНК, специфичность его влияния на синтез разных типов РНК, влияние на редупликацию ДНК).

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовано 290 мышей, полученных из коллекционного фонда НИЛ ЭВМ ТНЦ РАМН, обоего пола в возрасте 8-14 недель следующих линий: BAlb/c (H-2<i), C57B1/6J (H-2b), CBA/CaLac (H-2k), DBA/2J (H-2.d), CC57W/MvY (H-2b), AKR/J (H-2^), F1 (СВАхС57В1/6) (Н-2ЬД). Для цитостатичеекого теста использовались клетки асцитного варианта карщшомы Эрлиха (Н-2d) и масготггомы Р815 (Н-2<*), поддерживаемые in vivo на самцах линии ВА1Ь/с и DBA/2 соответственно методом внутри-брюшинной трансплантации.

Для выделения и отмывки использовали среду 199. Культу-ральная среда состояла из: RPMI 1640 и 10% инахшвированной эмбриональной телячьей сыворотки (ИЭМ им. Гаматеи АМН' СССР, Москва), 2 тМ L-глюгашша ("Flow"), 5xl0"¿ М 2-мер-кагггоэтанола ("Fluka"), 40 мкг/мл гентамицина ("Pharmachim"), 20 тМ НЕ PES. Культивирование клеток проводили в атмосфере, содержащей 5% СО2 и 95% воздуха при 37^С и 100%-ой влажности.

Рекомбинантный мышиный ГМ-КСФ вводили внутрибрго-шшпга по 2 мкг/мышь, а рекомбинантный человеческий ЭП -подкожно по 6 ЕД/мышь. Оба препарата шгьецировали в объеме 0,2 мл дважды с интервалом в 2 дня. Контрольным группам животных вводили в аналогичных условиях в том же объеме изотонический раствор хдорнда натрия. Животных забивали па 1, 3 и 7 сутки после второй инъекции. Препараты любезно предоставлены коллегах:;г из лаборатории иммунохимии института канцерогенеза ОИЦ РАМН.

Кровь дяя мазков получали из хвостовой вены. Препараты костного мозга и селезенки готовили путем выдавливания карио-¡ tiгго". из грудины, a спленощггов - из свежевыделенных селезенок. затем клетки суспендировали в оингенной сыворотке крови на стекле. Мазки фиксировали с метаноле 5 минут, после промывки окрашивалш препараты периферической крови по Романовскому, костного мозга vi селезенки - азур II-эозином.

Клетки костного мозга выделяли in бедренных и больше- -берцовых костей методом перфузии. Суспензию одиночных клеток получали пропусканием через иглы уменьшающегося диаметра. Для получения суспензии епленощегов селезенки гомогенизировали стеклянным гомогсшпатсром и фильтровали через 1етырехслойный капрон. Опухолевые клетки получали из асцит-той жидкости. Мононуклеары из периферической крови здоровых доноров выделяли на одноступенчатом градиенте фкколл-пака ;"Pharmacia") [Гольдберг Е.Д. и др., 1992}. Подсчет общего ко-шчества и числа жизнеспособных клеток проводили в тесте с TP плановым синим.

Для удаления адгезивной фракции суспензию клеток поме-дали в пластиковые чашкп Петри на 10-12 ч. Затем неприлипшие слетки собирали, используя теплую среду. В дальнейшем для всех ■естов в качестве эффекторов использовали только неадгезизную [)ракцшо.

Для получения супрессорного фактора (СФ) клетки- эффек-оры культивировали 48 ч. (6 х 10^ клетск/ыл). Затем надоса-;очную жидкость собирали, удаляли клетки и хранили при -2v®C.

Активность ECK определяли по подавлению пролиферации шшеней {Holda J.H. et al., 1986J. Подготовка мишеней осуществилась следующим образом: сплеиоцигы инкубировали 22-24 ч. в рисутствш! либо 4 мкг/мл Кокканавашша А (Кон A) ("Sigma"), ибо 50 мкг/мл липополисахарида (ЛИС) ("Диагностикум"), затем [итогсны были удалены. Эффекторы к мишени культивировали 8-52 ч. За 16-18 ч. до о кончал пгя инкубации вносили ЗН-тамидин о 0,5-1,0 мкКю/лунку. Контрольные лунки содержали только пще:ш. За 16-18 ч. до окончания культивирования вносили ^К-имидин по 0,5-1,0 мкКю/лунку. Затем содеряимое лунок пе-еносили на стекловолокнистые фильтры ("Titertek"), промывали зотоническим расгвором хлорида натрия, 5% раствором ТХУ и Зсолютным этанолом. Фильтры высушивали и переносили в цпгпсигашонную жидкость ЖС-8, включение изотопа гмпульсы/микуту) оцешшали на ß-счетчике "ivJark-Ш". Супрес->рную активность выра;хали в виде индекса иншбицни (%), ко->рый вычисляли по следующей формуле:

ИИ = (1 - о/к ). хЮО, [с о - количество имп./мкн. в лунках (клетки-эффекторы + тетки-мишени), к - колтество имп./мин. в лукках с клеткамк-ншенями.

Активность СФ оценивали по подавлению индуцированной митогенами или антигенами в смешанной культуре лимфоцитов (СКЛ) пролиферации клеток, культивируемых в присутствии су-пернатанта эффекторов [Сидорович И.Г. и др., 1987]. Однонаправленную реакцию в СК1 проводили как описано [Лефковитс и др., 1981], в качестве стимуляторов использовались спленошггы гибридов F1 (СВАхС57В1/6) (Н-2ЬД), отвечающими клетками выступали спленощггы мышей лишш C57B1/6J (Н-2Ь). Сплено-циты-стимуляторы обрабатывали шггошшюм С ("Serva") (25 мкг/мл, 1 ч.), затем триады отмывали. Клетки культивировали 4,5-5 суток. Контрольные лутки содержили только клетки-рес-пондеры. К предварительно подготовленным мишеням добавляли СФ в различных разведениях и культивировали 60-64 ч. В контрольные лунки вместо СФ вносили адекватное количество куяьтуральной среды. За 16-18 ч. до окончания инкубашш вносили ЗН-тимидин по 0,5-1,0 мкКю/лунку. Дальнейшие манипуляции описаны выше. Супрессорную активность СФ выражали в виде индекса иншбишш (%).

Противоопухолевую активность ЕСК и СФ оценивали в ци-тостатическом тесте по методу (Богдашин И.В. и др., 1986]. Для этого опухолевые клетки культивировали 16 ч. либо с клетками-эффекторами либо с СФ. Контрольные лунки содержали только клетки-мишени без эффекторов или СФ. За 4 ч. до окончании культивирования добавляли по 0,5-1,0 мкКю/лунку Зн-тимидина и по стандартной методике определяли пклточснис метки на р-счегчике. Индекс ингибицни (%) определяли по формуле, указанной выше.

Активность синтеза ДНК и РНК определяли по включению печенных нуклеотндов: Зн-тимиднна или Зн-урцдшш. По вс-личине попечения Зн-тимщщна оценивали также нролнфератив-нук> активность клеток. Для этого к исследуемым клеткам добавляли 18 ч. до окончания культив!фовашш по 0,5-1,0 мкКю ^Н-шмиаина или Зн-уридина и по стандартной методике определяли включешю метки на р-счетчнке "Mark-ИГ. Результаты представ-

б шшульсах/минуту.

Для определения чувспинсльности супрессорнон активности к нндометашпту мишени культивировали с индомсташшом в конечной концеюрадии Ю"5 н \Q-b j>4 (Young M.R.l. et al. 1988]. Препарат npiicyicmoBaa в течении бссго срока ш-шубацни.

Контрольные лунки содержали адекватный объем культуральной среды.

Для определения чувствительности супрсссорной активности к азиду натрия, митошгцину С и актиномнцину Д клетки-эффекторы инкубировали с препаратами 1 ч., четырехкратно отмывали и определяли БСА либо помещали в 24-луночные платнеты для наработки супрессорного фактора.

Зрелые Т-лим(|юшп*ы удаляли в микрощгготокснческом тесте in vitro с использованием специфической антисывороткп [Г.Фримель, 1987|. Лнтисыворотку против Thy-1.2-aimirena получали иммушгзацией ,\гышей лшпш AKR (Н-2Ц Thy-1.1) тимо-цнтами мышей лшпш CBA/CaLac (H-2'<-, Thy-1.2).

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использовалшем пакета прикладных профамм Statgraph. Для всех выборок данных проверяли гипотезу нормальности распределения. Проверка гипотезы о равенстве средних проводилась с использованием t-крштрия Стьюденга.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА 3. Взаимосвязь активации гемопоэза и ЕСА

В ряде работ, посвященных изучению естественных супрес-сорных клеток, показано, что стимуляция гемопоэза сопровождайся активацией ECK. Нами ситуация усиленного гемопоэза была смоделирована двукратным введением рГМ-КСФ экспери-м с! ггальны J1 жгаотным.

Анализтфуя уровень включения тимидина и мазки костного мозга и периферической крови, можно заключить, что двукратное введение препарата привело к усилению длфференцирозочлых, но не пролиферативных процессов в костюм мозге: на 1 сутки повысилось количество сегментоядерных нейтрофилов (с 3,1±2,1 до 29,6±1,1, р<0,005), на 3 сутки - палочкоядерных пейгрофилов (с 5,8.-0,9 до iO,7rl,5. р<0,02). Известно, что большие концентрации ГМ-КСФ (in vitro) вызывают дифферекцировку преимущественно в направлении нейтрефшопоэза, в то время как малые способствуют образованию макрофагоз (Афанасьев Б.В. и др., 1985]. На ('роке умеренной епшуляшш югелопоэза мы наблюдали повышение антипро-лиферативной активности неадгезивной фракщш клеток костного мозга спустя 1 супос ИИ повышался с

48,5±1,3 до 68,0±5,0 (р<0,01), однако в селезенке никаких изменений зафиксировано не было.

Другими авторами, использовавшими другие модели активации миелопоэза in vivo, получены аналогичные результаты. Так, при росте опухоли, продуцирующей ГМ-КСФ, наблюдали увеличение колшества ГМ-предшественников и усиление нмму-косупрессорной активности костного мозга [Young M.fLI. et al., 1994]. При длительном (в течении 3 недель) введении животным ргм-ксф также наблюдали стимуляцию гемопоэза и иммуносу-прессии [Fu Y.X. et al., 1991]. Показано, что действие ГМ-КСФ на иммуносуггоессоры костного мозга прямое [Sugiura'K. et al., 1990;. Moots S.C. et al., 1992].

Таким образом, стимуляция гемопоэза in vivo, сопровождающаяся усилением дифференцировочных процессов клеток гранулоцитарного ряда, приводит к активации неадгезивных <-у-прессоров костного мозга. Не искщочено, что наблюдаемый эффект рГМ-КСФ связан с увеличением пула иммуносупрессоров.

Изучетшая нами стимуляция эритропоэза, происходящая посте введения рЭП, также активирует иммуносупрессорные клетки. Известно, что ЭП является основным регулятором эритропоэза. действует на унипотешные коммипгрованные клетки эршрондного ряда, начиная с поздних БОЕ-Э (эритроидная бурстобразующая единица) находящиеся в S-фазе - БОЕ-Э4 ¡Чертков И.Л. и др., 1977]. Наиболее чувствительны к ЭП КОЕ-Э (эрнгроидная колониеобразующая едишща). Введешге экзогенного ЭП экспериментальным животным вызывает пролиферацию поздних БОЕ-Э. а вторая штьекщгя rrpt сводит к терминальной дифференцзгровке КОЕ-Э с последующей волной эритропоэза [Павлов А.Д. и др., 1987].

В результате двукратного введешея животным рЭП мы на-, блюдали незначительные изменения пролиферативной активное™ костного мозга, из чего заключили, что зыбрашгая нами схема введения и доза ЭП вызывает активацию самых, зрелых отделов эритрона. "Известно, что стимулирующие эффекты небольших доз ЭП обнаружить практически невозможно, поскольку у интактных животных эритропоэз происходит с высокой и вариабельной скоростью [Пашюв А.Д. и др., 1987]. На фоне такой умеренной стимуляции эритропоэза. наблюдается усиление ЕСА лишь в ранние сроки, поэтому, возможно, костномозговые эффекторы, взятые на 3 день после введения ЭП, не проявляли

и

противоопухолевое действие. Достоверное усиление иммуносу-прессорной активности наблюдали спустя 1 сутки после введения ЭП (р<0,02), к 7 дшо зга разница исчезала. При использовании з качестве эффекторов ненршпшшощих спленощггов в контрольной группе супрессии против тех же мишеней не наблюдали, а в опытной группе на 3 день после инъекции наблюдалась супрессия, индекс ингибиции составил 47,5% и 42,7% при соотношении 1:1 и 2:1 соответственно.

Введение ЭП может приводить к инициации эритропоэза вне костного мозга (Udupa К.В. et al., 1979J. Наличие супрессор-ной активности у спленощггов, возможно, связано с усилением эр:ггропоэза и/или инициацией его в селезенке.

Таким образом, наблюдаемая нами активация эршропоэза под действием экзогенного ЭП приводит к усилению in vivo ЕСА как костномозговых, так и селезеночных супрессоров. Реализация усиливающего ЕСА действия ЭП осуществляется, вероятно, на уровне клеток такой степени зрелости, как КОЕ-Э. Эти результаты не противоречат данным других авторов, показавшим, что МАЕ+ клетки, относящиеся к зрелому отделу эритрона, начиная с поздних КОЕ-3, обладают ЕСА {Чеглякова В,В. и др., 1989; Кусмарцев С.А. и др., 1993] и блокирование дифферентхровки на уровне БОЕ-Э отменяет ЕСА {Цырлова Й.Г. 19S7J.

Мы получили, что ростовые факторы, действующие как на стволовые кроветворные клетки (гранулощгго-эртроидно-моно-цито-мегакариощггарные и бшютентные малодпфференцкрован-яые КОЕ) в случае использования ГМ-КСФ, так и на зреяus элементы зршроидного ряда (типа КОЕ-Э, прозршробластов, эритробластов, «нормоцитов) при введешш ЭП, активируют ЕСА костного мозга. Эти факты позволяют предполагать наличие клеток с супрессорной актизноегью, которые прш-хадяежат хс миелоидному и зритроидному росткам и имеют разную степень зрелости. Возможно, что при ачиянии факторов, стимулир>ющпх гемопоэз, параллельно с усиление",! ярелиф-хращщ и дифференцирован кроветворных клеток генерируются ссютзетсгвующкс каждой стадии созревания супрессоры данного ростка н данной степени зрелости, которые осуществляют контроль над балансом процессов деления и созреваши.

ГЛАВА 4. Внутриклеточные мехашгзми регулятш активности

ECK

Поскольку антипролиферативное действие ECK проявляется через растворимые факторы, было изучено состояние клеточного метаболизма, уровень синтеза ДНК во время наработки его э<|>фекторнымн клетками. Для этого клетки неприлинаюшей фракции костного мозга мышей подвергли воздействию блокатора щггохромокендазного комплекса (азид натрия - 0,00S%) [Сграйер Л. 1984], ДНК (митомищш С - 10 мкг/мл) [Плонсюпг U.M. и др., 1991] и РНК (актиномицин Д - 1 мкг/мл) [Ашмарин И.П., 1975]. Обработанные клетки тестировали на противоопухолевую и иммуносупрессорную активность, а также исследовали их пролиферацию параллельно проявлению супрессорной активности.

Противоопухолевая активность супрессоров снижалась, хотя и не достоверно, азидом натрия и митомицином С (с 75,8x0,5% до 6,0±25,7 и 14,3±29,6% в случае азида и митошшина соответственно) и значительно повышалась актиномнцином Д (ИИ повышался с 75,7±0,5 до 98,0±0,4%, р<0.001). Иммуносуирессорная активность по отношению к активированным Т- и В-лнмфоцптам не изменялась после воздействия азидом натрия и митомишша С. Актикомищш Д достоверно и значительно усаливал сунрессорную активность эффекторов, ИИ повышался: а) в случае использования в качестве мишеней стимушгроаашшх Кон А сплсноци-тов с 69.816.2 до 95,3+0,3% (р<0,05); б) в случае B-клеток с 49.3г ¿,9 до 92,3+0.1% (р<0,01).

Пролиферация костномозговых клеток во время тсстирова-киз супг.сссорной активности достоверно понижалась после npe-nmo. олиш с азидом натрия, митошщином С и акткномшшном Д.

Таким образом, на фоне угнетения митотической активности самих зффекторнкх клеток азид натрия и мито.\сицин С снижают их пропшмпухопевую акпшноегь, актиномишен Д. напротив, значительно сс усаливает. Иммуносуирессорная активность повышалась после воздействия акпшомшшна Д, не изменялась после обработки азидом натрия и митомишпюм С. Противоопухолевое действие ксспецифичсских супрессоров костного мозга ¿пишется, в некоторой степени, энергозависимым процес-

сом, требующим синтеза ДНК. Для реализации нммуносупрес-сорного эффекта наработки энергии и синтез ДНК не требуется.

ГЛАВА 5. Влияние актиномицина Д на ЕСА

Как показано в главе 4, акпшошгцнн Д усиливает ЕСА костного мозга. При использовании в качестве эффекторов клеток костного мозга мышей различных линий (CBA/CaLac, CC57W/Mv и BAlb/c) этот эффект сохранялся. Кроме того, акгиномпщш Д вызывал лозозависимое достоверное повышение противоопухолевой и иммуносупрессорной активности костномозговых клеток и наблюдался при концентрациях 0,1, 1,0 и 10,0 мкг/мл. Меньшие концентрации препарата (0,001 и 0,01 мкг/мл) не изменяли ЕСА (рис. 1).

60000

бОООО

J. 40000

зоооо --

г?

а сп

2DCCO -

10СШ --

М К 1

м к. 1 2 3 4 5

В

М К 1 2 3 4 5

Рис Л. Влилние актинолшшша Д на 1тммуносупрессорную и про-тивсопухолевую активности клеток костного мозга. Мишени: сингенные сгпеноциты (соотношение 5ффсктор:м1Ш1ень 0,5:1), стимулированные Кон А (А) или ЛПС (Б), и мастоцитома Р315 (соотношешге эффектор:мишень 5:1) (В). Эффекторы: клетки костного мозга, предварительно культшнгрованные 1 час с культуральной средой (К - контроль) или с актшгомнцнном Д в концентрации (мкг/мл) 0,001 (1), 0,01 (2), ОД (3), 1,0 (4), 10,0 (5). М - мишени без эффекторов. в р < 0,05; "*р< 0,02.

Определяли также уровень синтеза ДНК и РНК в клетках-эффекторах, происходящего параллельно проявлению ими су-прессорной активности: в наблюдаемые сроки (через 22-24 ч.) после культивирования с актиномицином Д в концентрациях 1 и 10 мкг/мл происходит достоверное угнетение (более чем на 60% от исходного уровня) сщггеза РНК и ДНК.

Таким образом, акгиномицин Д на фоке угнетения синтеза ДНК и РНК значительно повышал противоопухолевую и имму-iiocyiгрессорную активность супрессоров костного мозга. Эффект зависит от дозы препарата и не зависит от генотипа животных.

Супернатант клеток костного мозга тестировали на наличие супрессорного фактора (ов). Прсдваршельное воздействие актнномищша Д приводило к увеличеншо продукции супрессорного фактора (ов) (табл. 1). Противоопухолевое действие суперна-танта в контроле было значительным и дозозависнмым, после обработки актшюмицином Д супернатант почти полностью подавлял рост опухолевых мишеней во всех тестируемых разведениях. Иммуносуггрессорное действие супсрнатанта шггактных ' клеток в данных разведениях не проявлялось, однако в опыте иммуносупрессорная активность супсрнатанта была высокой и дозозавнеимо сшжалась по мере повышения разведения.

Можно заключить, что подавлешк пролиферации 'мишеней опосредовано выработкой эф<{юкторами растворимых факторов.

Для выяснения роли простагландинов в проявляемой су-прсесорной активности клеток костного мозга, обработанного актиномицином Д, изучили влияние шедометашша (10"6 M и 10~5 М) на супрессорную активность эффекторов по отношению к трем мишеням: опухолевым клеткам Р815, енленощггам, стимулированным Кон А и ЛПС (рис. 2). Клетки шггактного костного мозга проявляли значителыгую гтроп гвоопухолевую акптность, после обработки актиномицином Д противоопухолевая активность повышалась и не изменялась с увеличением, концентрацшш инлометанина, практически не зависела от соотношения эффекторов и мишеней. Иммуносупрессорная активность шггактных костномозговых клеток зависела от индометацина. Однако активированные акпшомицшюм супресеорные клетки не реапгровали на возлействне индометашша. сохраняя высокий ИИ (90-97%).

Таким образом, актиномишш Д активирует супрессорные клетки костного мозга, действие которых значительно по ве

Таблица 1.

И ммуносуп рессорная и противоопухолевая активность супернатанта клеток костного мозга мышей линии ВА1Ь/с, предварительно обработанных актнномициноы Д

Разведение С + Кон А С + ЛПС Р81 5

супернатанта Контроль >0пит Контроль Оиыт Контроль Опит

М*ш М±га М*гп М*ш М*т М*т

1/4 18183*917 1883 ±4а3 (в) 9100*1700 644*144 (а) 25871 ±874 216*50 (г)

(-10,5) (88,4) (9,3) (93,6) (57,5) (59,6)

1/8 14118*2149 3720 ±574 (а) 11463*111 1216*216 (д) 34323*193 366*33 (г)

(13,2) (77,1) (-14,3) (87,9) (43,8) (99,4)

1/16 17390* 159 9316*1316 (а) 13025*1413 1483*183 (а) 50067 *3536 500*100 (в)

(-6,9) (42,7) (-29.8) (85,2) (17,8) (99,2)

1/32 17466*1433 11049*483 (а)] 9066* 733 1633*167 (б), 60306*1332 1266*166 (д)

(-7,4) (32,1) (9,6) (83,7) (1,0) (97,9)

Примечание: активность супернатанта изучали по подавлению пролиферации сингшных силено-

цнтов, епшулпроиаипих Коа А шш ЛПС (С+Кон А, С+ЛПС) либо опухолевых клегок Р815; пролиферацию оценивали по включению радиоактивной метка, данные представлены в имп./мнн., а та хае в скобках указан индекс ингпбпцпн (%). Контроль - сунериатант интактпего костного мозга, опыт - супернатанг костномозговых клеток, проинкубированных с актшюмицнном Д (1 мкг\ш1). (а) р < 0,05; (б) р < 0,02; (в) р < 0,01; (г) р < 0,002; (д) р < 0,001; и=6.

Рис. 2. Влияние индометацина на шшуносупрессорную и противоопухолевую активности интакшых (светлые столбцы) и обработанных акпшомицином Д (заштрихованные столбцы) клеток костного мозга.

Мишени: сингениые силеношгш (соотношение эффектор-.мишень 2:1), стимулированные Кок А (А) или Л ПС (Б), и мастоцитома Р815 (соотношение эффектор-.мишень 10:1) (В). Тест проводился в средс без ицдомстацина (1), с индомегадинон 10-6 М (2) и 10" 5 М (3). * р < 0,01; **. р < 0,001.

лiKiale и опосредовано растворимыми факторами, не являющимися* прсстаглаШщнамк. Нагревание (5б^С, 1 ч.), кипячение (ЮСРС, 2-3 мин.), заморозка и разморозка не изменяли супрес-сорную .-л-ивность исследуемого еупернатанта. Супсрнатект клеток костного мозга мыши, необработанных ашшюшщиком Д, подавлял индуцированную фитогематглюти-ккком (ФГА) пролиферацию моконуклеаров периферической хроап здоровых, доноров ниже уровня спонтанной пролиферации мопонуклеаров, культивированных без ФГА. Снижение когшенхрации еупернатанта вплоть до разведения 1/64 почт не уменьшало его активности: ИИ составлял 92 к 88% (для 1 п-2 пулов соответственно). Эта дагагые показьпшот отсутствие виде специфичности СФ, вырабатываемых актквировашшми акхикомищшом Д супрессорами костного козга.

Для характеристики природы клеток, продуцирующих су-прессорные факторы после воздействия актиномицииа Д, изучили иммуносупрессорную активность супсриатаитов клеток костного мозга, тимуса и селезенки. Супернатанты интакгных клеток тимуса и селезенки не обладали способностью подавлять пролиферацию мишеней. Под влиянием ахтиномицина Д тимоцигы, спленсциты и костномозговые клетки продущгровали значительное количество супрессорного фактора (ов), действие которого проявлялось в разведениях 1/2, 1/4, 1/16 (данные статистически достоверны во всех разведениях). Для выяснения роли зрелых Т-клеток в продукции СФ, индущфованного акгиноми-щшомД, из клеток непршшпающей фракцией костного мозга перед наработкой супернатанта были удалены ТЬу-1.2-позитивные клетки. Полученный супернатант сохранял свою активность в раззедешш 1/4 и значительно снижал (в случае стимул1фовашшх Кон А лимфоцитов с 63,9±2,6 до 24,3±3,8%, р<0,002) либо терял ее в разведении 1/16. Можно предположить, что акгиномицин Д кроме акгивации естественных супрессорных клеток индуцирует

к

а 5

- >у.'* К*

л

-г-у

Г':

! !

к "Ч ' I >- ' : -; ;

-¥4

М !

Б

Рис. 3. Естественная супреесорная активность супернатанта. (разведение 1/16) клеток костного мозга мышей, предварительно тисублгрованных со q>cдoй (1-контроль), акппшмицином Д (2), оливомицлном (3) и винкристином (4). М - мишени культивированные без костномозгового супернатанта

Мишени: шггеакыс силеноциш, стимулкровлзшые КонА (А) или ЛПС (Б). * р < 0,01; ** р < 0,001.

продукцию супрессорного фактора также и Т-клетками костного мозга, тнмуса и селезенки.

Нами также было проведено сравнение иммуносупрессорной активности супернатанта клеток, обработанных актин омши гном Д (1 мкг/мл), оливомицином (10 мкг/мл) и винкрисгином (10 мкг/мл). Как видно го рис. 3, в разведениях 1/4 и 1/16 пролиферация стимулированных Т-лнмфоцитов достоверно подавлялась всеми супернатантами. Пролиферация стимулированных В-лимфощггов достоверно подавлялась супернатантами клеток, обработанных актиномишшом Д и ешжрисгином. Оливомишш не изменял ингибиторной активности супсрнатанта в отношении В-клеток. Можно заключить, что актиномицин Д, винкрисгин и оливомицин вызывают усиление продукции факторов (а) с иммуносупрессорными свойствами, наибольший эффект оказывает актиномицин Д, наименьший -оливомшщн.

Обобщая полученные результаты можно заключить, что, во-первых, актиномицин Д активирует продукцию супрессорного фактора, который видонеспецифичен, не простагландин, не интерферон (т.к. синтез интерферона ингибируется акпшомици-ном Д), не белок, во-вторых, вырабатывается неадгезивными клетками разных . органов (костный мозг, селезенка и тимус), частично и зрелыми Т-клетками (Пгу-1.2-позитивными). в-фсгьнх. этот супрессорный фактор действует на атттген- и мнто-геппндуцированную пролиферацшо, а также на опухолевые клетки. причем, для реализации эффекта досгаточно кратковременного ко:паста фактора с мишенями. В-четвертых, кроме актиноми-цннаД оливомицин и вшпфнетин способны усиливать выработку супрсссорпого фактора костным мозгом, однако, только в отношении Кон Л-стимулированных спленощггов, в отношении ЛПС-индуцированнсго бластогенеза оливомицин не эффективен.

ВЫВОДЫ

1. Введение рекомбинантного гранулоцитарно-макрофа-галъного коло1шестимулируюшего фактора приводит к усилению активности естественных супрессорных клеток костного мозга. Введение рекомбинантного эр:ггроноэттша пртюдит к появлению в селезенке и повышению в костном мозге естестветюи супрес-сорной активности.

2. Иропгооопухолевая и иммуносупрессорная активность костномозговых естествешшх супрессорных клеток снижается при блокировании шггохромоксидазного комплекса. Ишнбнрованпе синтеза ДНК не влияет на иммуносупрессорную и противоопухолевую активность естественных супрессорных клеток костного мозга.

3. Актиномишш Д существенно усиливает иммуносунрес-сорную и противоопухолевое активность естественных супрес-сорш*х' клеток костного мозга через увеличение продукции су-прессорного фактора (ов). Подобное действие олнвомшпша и взгнкрнепш менее выражено.

4. Супрсесорный фактор (ы), тщушгруемый актшюмшш-ном Д, имеет небелковую пр1гроду. не является ггростагла; ишном, не обладает вилоспеш1фичносп>ю.

5. Удаление га костного мозга Т-лимфошггов приводит к некоторому еннжению инлушфованной актиномишшом Д продукции супрессорного фактора (ов). Тимошггы .и сплсношгга посте воздействия актиномицнна Д приобретают способность вырабатывать фактор (ы). обладающий иммуносупрессорной и прогн-гчкмтухолевои активностью.

Основные положения диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Землянская Н.В., Кусмарцев С А Влияние рекомбинант-ного ГМ-КСФ на активность естественных супрессорных клеток// Сборник трудов молодых ученых СО РАМН, Новосибирск.-1993.-С.125-128.

2.Kusmartsev S.A., Belsky Y.P.,.Zemlyanskaya N.V.Increasing activity of natural supressor cells and production suppressor factor by bone marrow cells in aging of mice of high-tumor strain//Abstr. 2nd Int. Congr. ISNIM, Paestum (Salemo), Italy.-1993.-P.248.

3. Кусмарцев C.A., Вельский Ю.П., Агранович И.М., Землянская Н.В. Естественные супрессорные клетки (обзор)//Успехи современной биологии.-1994.-Т.114.-Вьш. 6.-С.705-714.

4. Belsky Y.P., Zemlyanskaya N.V., Agranovitch I.M. An increase of natural suppressor cell activity in mice following the injection of GM-CSF in vivo//Abstr. 12 Europ. Immunol. Congr., Barcelona, Spain. 1994.-P.520.

5. Kusmartsev S.A., Zemlyanskaya N.V., Belsky Y.P.' Characteristics of suppressor factor produced by bone marrow cells after DT treatment//Immunology.-1995.-V86.-Suppl.l.-P.126.

6. Землянская H.B., Кусмарцев C.A. Влияние экзогенного эртропоэтина на супрессорную активность клеток костного мозга и селезенки мышей//Сборник: "Экспериментальная и клшшческая иммунология", Томск, 1995.-С.31-38.

7. Лимарева Т.Д., Плотников В.М., Кусмарцев С.А, Ермаков Г.Ф., Землянская Н.В. Синтез и изучение цииггоксических свойств иммунотоксинов на основе бактериального токсина фос-фолилазы С//Иммунология.-1995.-№ 5.-С.60-62.

8. Землянская Н.В., Кусмарцев С.А. Индукция супрессор-ного фактора, обладающего выраженными интиггролиферативны-ми свойствами in \тьго//Клиничсскис и экспернметальные исследоватш молодых учёных СО РАМН./Сб. тезисов, посвященных 25-летию СО РАМН, Новосибирек.-19%.-С.44.