Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Исследование на доклиническом уровне противоопухолевых эффектов флавоноидов корня солодки

На правах рукописи

005014534

Цицуашвили Майя

ИССЛЕДОВАНИЕ НА ДОКЛИНИЧЕСКОМ УРОВНЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ЭФФЕКТОВ ФЛАВОНОИДОВ КОРНЯ СОЛОДКИ

14,03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 5 МАР 2072

Москва-2012

Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздравсоцразвития РФ и фгбу «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Минздравсоцразвития РФ.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

кандидат медицинских наук, с.н.с.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, профессор кафедры молекулярной фармакологии и радиобиологии им. академика РАМН ПЛ. Сергеева ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития РФ

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории токсикологии ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН Коваленко Лариса Петровна

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет» Минздравсоцразвития РФ

Защита диссертации состоится_2012 года в_часов на заседании Диссертационного совета Д.001.024.01 на базе ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН по адресу: 125315, г. Москва, ул. Балтийская, д.8.

С диссертацией можно ознакомиться в ученой части ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН по адресу: 125315, г. Москва, ул. Балтийская, д.8.

Автореферат разослан « »_2012 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Вальдман Елена Артуровна

Козлов Иван Генрихович Павлова Светлана Ивановна

Духанин Александр Сергеевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования За последние десятилетия значительно расширился арсенал противоопухолевых препаратов. Однако в схемах противоопухолевой химиотерапии на сегодняшний день еще широко применяются, занимая лидирующие позиции, цитотоксические средства (цитостатики). Цитостатики имеют ряд недостатков, среди которых самый существенный - низкая избирательность действия по отношению к мишени (высокая токсичность не только для злокачественных, но и для нормальных клеток).

Бурное развитие молекулярной биологии и генетики опухолей во второй половине XX века открыло огромные возможности для развития новых подходов к лечению больных онкологическими заболеваниями. Идентификация молекулярных механизмов, принимающих участие в возникновении злокачественных новообразований, изменила стратегию поиска противоопухолевых препаратов. Если раньше в этой области превалировал эмпирический компонент, то в настоящее время изыскание новых противоопухолевых средств стало принимать целенапрвленный, патогенетически обоснованный характер [Абдрахманов И.Б., 2005, Имяни-тов Ё.Н., 2004, Северин Е.С., 2006, Hanahan D., 2001].

Внедрение в клиническую практику противоопухолевых монокло-нальных антител (МАТ) и низкомолекулярных ингибиторов тирозинкиназ, явилось важным шагом в направлении создания мишень-направленных (таргетных) средств [Демидов JI.B., 2009, Dancey J., 2003]. Применение «таргетных» средств в клинической онкологии явилось прорывом в лечении определенных опухолей (например, в онкогематологии), но во многих случаях их эффективность оказывается ниже ожидаемой. Внедрение новых препаратов не решило и проблему формирования лекарственной резистентности опухолей.

На сегодняшний день остаются актуальными исследования в области разработки менее токсичных, высокоспецифичных и при этом относительно «простых» для производства противоопухолевых лекарственных средств. С этой точки зрения представляют огромный интерес низкомолекулярные полифенольные соединения растительного происхождения (фла-

воноиды). Современные исследования демонстрируют широкий спектр фармакологической активности этих соединений. Изучение механизмов действия флавоноидов на молекулярном уровне показывает, что некоторые их классы (изофлавоны, хапконы) способны ингибировать фосфорилиро-вание, а, как следствие, и активацию, ключевых молекул сигнальных путей в клетках [Bharrhan S., 2011, Clere N„ 2011, Не L., 2011, Teillet F., 2007], что может лежать в основе противоопухолевого эффекта. Уже накоплен ряд экспериментальных данных, которые демонстрируют как антиканцерогенные, так и противоопухолевые эффекты отдельных представителей этого класса соединений. Кроме того, есть доказательства, что некоторые флавоноиды способны снижать токсичность цитостатиков, а также повышать чувствительность опухолевых клеток к ним [Liang G., 2010, Park D., 2009, Siddique Y.H., 2008, Velasco С., 2010].

Все эти факты обосновывают перспективность флавоноидов как основы для создания новых противоопухолевых лекарственных препаратов. В связи с этим актуальным является изучение механизмов противоопухолевой активности флавоноидов и экспериментальное обоснование их фармакологической эффективности в моделях на животных.

Цель работы

Изучить на доклиническом уровне противоопухолевые эффекты флавоноидов корня солодки (ФКС).

Задачи исследования

1. Изучить влияние ФКС на ростовые характеристики (пролиферация,

апоптоз), а также оценить их прямую цитотоксичность по отношению к различным опухолевым клеткам in vitro.

2. Оценить влияние ФКС на ростовые характеристики (пролиферация, апоптоз) опухолевых клеток, резистентных к доксорубицину in vitro.

3. Исследовать влияние комбинации ФКС+доксорубицин на ростовые характеристики (пролиферация, апоптоз) опухолевых клеток, резистентных к доксорубицину in vitro.

4. Оценить противоопухолевый эффект ФКС in vivo на модели перевиваемого лимфолейкоза Р388 у мышей.

5. Сравнить противоопухолевый эффект комбинации циклофосфа-

мид+ФКС на модели лимфолейкоза Р388.

Научная новизна

Впервые было проведено исследование фармакодинамических эффектов флавоноидной фракции экстракта корня солодки в моделях, рекомендованных для доклинического изучения новых фармакологических веществ с противоопухолевой активностью.

Впервые был продемонстрирован дозозависимый антипролифера-тивный эффект препарата ФКС in vitro в отношении человеческих и мышиных опухолевых линий с различной гистологической характеристикой (лейкозы, раки, саркомы). Было показано, что возможный механизм анти-пролиферативного действия обусловлен остановкой опухолевых клеток в 02/М-фазе клеточного цикла с последующей индукцией их апоптоза.

Показано, что комбинированное использование ФКС и доксоруби-цина в культуре опухолевой линии K-562/DOX, резистентной к данному цитостатику, дозозависимо подавляет пролиферацию опухолевых клеток за счет индукции апоптоза. Эффект комбинированного использования ФКС+доксорубицин характеризуется суммацией эффектов цитостатика и препарата ФКС.

Впервые экспериментально доказано, что введение препарата ФКС в комбинации с алкилирующим цитостатиком циклофосфамидом на модели перевиваемого лимфолейкоза Р388 у мышей потенцирует противоопухолевый эффект используемого цитостатика.

Практическая значимость

Совокупность полученных в работе данных о влиянии ФКС на опухолевую прогрессию углубляет фундаментальные представления о механизмах фармакологического действия ФКС.

Выявленные механизмы действия ФКС открывают перспективу их дальнейшего изучения в качестве новых противоопухолевых лекарственных препаратов.

Потенцирование противоопухолевого эффекта алкилирующего цитостатика циклофосфамида ФКС позволяет рекомендовать их дальнейшее изучение в качестве средств для повышения эффективности химиотерапии.

Личный вклад автора

Автор принимала непосредственное участие в создании концепции

работы, планировании диссертации. Все экспериментальные исследования проведены автором лично. В печатных работах, опубликованных по теме диссертации, имеется существенный вклад диссертанта. Все результаты, изложенные в диссертации, получены, обработаны и обобщены в виде обсуждения, заключения и выводов лично автором.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на VIII Съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Москва, Россия, 2011), V World Congress of Immunopathology and Respiratory Allergy (Тель-Авив, Израиль, 2009), VI Georgian Congress of Allergology and Immunology, VI International Congress "Health and Drug" (Тбилиси-Цхалтубо, Грузия, 2010), III World Asthma & COPD Forum, World Forum of Pediatrics (Дубай, ОАЭ, 2010), IV World Asthma & COPD Forum, XVI International Congress on Rehabilitation in medicine and Immunorehabilitation (Париж, Франция, 2011).

Работа апробирована на расширенном заседании кафедры фармакологии ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития РФ (ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова).

По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 5 статьей - в рецензируемых изданиях и журналах, рекомендованных ВАК Минобрануки России.

Использование результатов исследования

Результаты диссертации используются в учебном процессе на кафедре фармакологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова. Разработанные в диссертации модели и методы используются в экспериментальной работе кафедры и отдела иммунологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова и отдела молекулярной и экспериментальной медицины ФГБУ ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии Минздравсоцразвития РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 104 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследова-

ния, раздела собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 160 работ отечественных и зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 27 рисунками и содержит 10 таблиц.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Лабораторные животные. В экспериментах были использованы мыши-самцы гибриды BDFi (C57B1/6xDBA2) (весом 18-20 г, возраст 6-8 недель), содержащиеся на стандартном рационе вивария РАМН (Крюково, Московская область). Экспериментальные группы животных формировали рандомизированно по 8-10 мышей в каждой. Все исследования на животных проводили не менее чем в трех повторных сериях опытов, в первой половине дня. При работе с животными руководствовались правилами и Международными рекомендациями Европейской конвенции по защите животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997). Протоколы исследований одобрены этическим комитетом РНИМУ им. Н.И. Пирогова.

Опухолевые клеточные линии и штаммы. В качестве опухолевых клеточных культур использовались мышиные и человеческие опухолевые линии различного гистологического происхождения: эпителиальные (НТ-29, А-431), глиальные (U-373, GL-6), лейкозные (RAW-264.7, U-937, K-562/DOX) и саркома L-929. Данные линии были получены из банков глубокозаморо-женных опухолевых культур ГУ ПИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН и ФГБУ ФНКЦ Детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева Минздравсоцразвития РФ. Клеточные линии поддерживали культивированием в питательной среде, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина при 37°С, 100% влажности и 5% содержании углекислого газа в окружающем воздухе. При пассаже опухолевых клеток, прилипающих к подложке, культуру промывали смесью растворов Версена и 0,25% трипсина. Клеточный опухолевый штамм Р388 для экспериментальных исследований in vivo был получен из банка глубокозамороженных опухолевых культур ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН и поддерживался пассированием на мышах линии DBA2 [Софьина З.П. и соавт., 1980].

Тестируемые агенты. В опытах использованы экспериментальный образец ФКС; флавоноид сравнения дигидрокверцетин (Alfa Aesar, Великобритания); противоопухолевый антибиотик доксорубицин (Sigma, США); алкилирующий цитостатик циклофосфамид (ЦФ; циклофосфан, ОАО «Биохимик», Саранск).

Стандартизация ФКС. ФКС выделяли из экстракта корня солодки методом колоночной хроматографии на полиамидном сорбенте (Fluka, Германия) с использованием высокоочищенного этанола в качестве экстраген-та. Полученный экспериментальный образец раствора ФКС в этаноле стандартизировали фотометрическим методом Folin-Ciocalteu с использованием в качестве стандарта галловой кислоты (Acros Organics, Германия) и хранили при температуре -20°С.

Биологическая стандартизация исследуемого агента (ФКС) проводилась по угнетению пролиферации клеток человеческой гистиоцитарной лимфомы линии U937 (CRL-1593.2™, АТСС). В работе использовали партии препарата ФКС, при внесении которых в культуру опухолевых клеток в концентрации 10 мкг/мл в пересчете на галловую кислоту пролиферация соответствовала 40±2% от контрольного уровня.

В экспериментах in vivo ФКС вводили внутрибрюшинно в дозе 10 мг/кг в изотоническом растворе натрия хлорида с 5% содержанием этанола. Мышам контрольной группы вводили соответствующие объемы растворителя. Раствор ЦФ готовили ex tempore на стерильном изотоническом растворе натрия хлорида, который вводили внутрибрюшинно. В моделях in vitro в культуру клеток вносили ФКС в диапазоне концентраций 0,1-20 мкг/мл, так, чтобы финальная концентрация этанола не превышала 1%. В контрольные лунки добавляли соответствующие объемы высокоочищенного этанола. Спиртовой раствор дигидрокверцетина готовили на высокоочищенном этаноле и вносили в культуру клеток в диапазоне концентраций 1-20 мкг/мл. Доксорубицин вносили в культуру клеток K-562/DOX в диапазоне концентраций 10"8-10"5 М.

Оценка пролиферации. Исследование пролиферации клеток производили радиоизотопным методом, оценивая включение 3Н-тимидина в ДНК делящихся клеток. Клеточную суспензию разводили до конечной

концентрации 0,5-1,0х104 клеток/лунку в различных полных средах. Через 24 ч преинкубации в опытные лунки вносили ФКС (0,1-20 мкг/мл) и добавляли радиоактивную метку (3Н-тимидин, 1 мкКю/мл) во все лунки и продолжали инкубацию еще в течение 24 ч. В культуры клеток, характеризующихся низким уровнем включения 3Н-тимидина (линии А-431, GL-6, K-562/DOX), перед внесением радиоактивной метки добавляли АТФ (конечная концентрация в лунке 100 мкМ). При оценке действия препарата сравнивали значения включений 3Н-тимидина в образцах с добавлением ФКС и в контроле. Результаты выражали в процентах.

МТТ-тест. Для выявления цитотоксичности ФКС использовался МТТ-тест. Клетки человеческих прилипающих опухолевых линий преин-кубировали течение 12-24 ч, до образования монослоя. Далее заменяли полную среду в лунках на среду с низким содержанием сыворотки (1%), для стационирования роста клеток. Затем вносили ФКС (0,1-20 мкг/мл), по 4 лунки на каждую концентрацию, и инкубировали следующие 24-48 ч. За 4 ч до окончания инкубации вносили МТТ, после чего супернатант заменяли на ДМСО и считывали показания оптической плотности при длине волны 492 нм с использованием микропланшетного детектора (Zenyth 1100, США).

Оценка апоптоза. Количественные исследования апоптоза опухолевых клеток проводили методом проточной цитометрии с использованием ДНК-специфичного флуорохрома пропидиум йодида (Sigma, США) [Новик A.A. и соавт., 2004]. Культуру клеток преинкубировали в течение 24 ч. После чего вносили тестируемый агент и продолжали инкубацию еще в течение 2448 ч. По окончании инкубации, клетки двухкратно отмывали холодным раствором фосфатно-солевого буфера. Для анализа использовали аликвоту, содержащую 10б клеток. Отмытые клетки ресуспензировали, фиксировали и окрашивали раствором, содержащим пропидиум йодид. Образцы анализировали на проточной цитометре Cytomics FC 500 (Beckman Coulter, США).

Модель перевиваемой опухоли. Для моделирования гемобластоза Р388 мышам BDFi перевивали внутрибрюшинно по 0,3 мл суспензии лей-козных клеток, полученной разведением асцитной жидкости культураль-ной средой [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ под ред. Хабриева Р.У., 2005].

Стандартная прививочная доза составляла 106 клеток/мышь. День перевивки клеток считали нулевым днем развития опухоли. Прогрессирование лейкоза регистрировали по накоплению жидкости в брюшной полости и гибели животных.

Оценка противоопухолевой эффективности ФКС на модели перевиваемой опухоли. Противоопухолевый эффект ФКС оценивали на модели лимфолейкоза Р388 по следующим параметрам: средней продолжительность жизни (СПЖ), показателю увеличения продолжительности жизни (УПЖ, % к контролю) и индексу ингибирования роста опухоли (Т/С). Подсчет числа полных ремиссий производили через 30 дней, подсчет числа излеченных через 90 дней после окончания терапии. Эффект препарата также оценивали сравнивая кривые выживаемости по методу Kaplan-Meier. Используемый в работе метод оценки противоопухолевого эффекта соответствовал принципам экспериментального изучения новых фармакологических веществ, установленным фармакологическим комитетом.

Использование модели перевиваемой опухоли для оценки влияния ФКС на противоопухолевый эффект ЦФ. Изучение влияния ФКС на противоопухолвый эффект ЦФ проводили на модели перевиваемого лимфолейкоза Р388 в параллельном сравнении:

• контрольной группы;

• группы, которой вводили ЦФ внутрибрюшинно через 24 ч после перевивки опухолевого материала (1-й день развития опухоли);

• группы, получавшей комбинацию препаратов ЦФ+ФКС.

Для оценки влияния ФКС на противоопухолевый эффект ЦФ строили кривые Kaplan-Meier, рассчитывали СПЖ, УПЖ и терапевтический выигрыш (ТВ, изменение продолжительности жизни в % к группе, получающей ЦФ).

Статистическая обработка результатов. Обработку экспериментальных данных проводили с использованием программы Excel для Windows ХР, путем расчета средней арифметической (М) и средней ошибки средней арифметической (т). Дня оценки достоверности выявленных различий в группах использовали t-критерий Стьюдента, разницу считали достоверной при р<0,05.Для сравнения динамики гибели животных в раз-

ных группах использовали статистический комплекс программ GraphPad Prism для Windows. Для оценки достоверности различий кривых выживаемости использовали logrank тест.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Изучение влияния ФКС на пролиферацию опухолевых клеток in vitro

Одной из задач настоящего исследования явилось изучение влияния

ФКС на пролиферацию опухолевых культур клеток различной видовой и гистологической принадлежности. На первом этапе исследования использовали мышиные клеточные линии RAW-264.7, L-929. Внесение ФКС в опытные лунки дозозависимо снижало пролиферацию опухолевых клеток обеих линий. Исследуемый препарат флавоноидов уже в концентрации 1 мкг/мл достоверно (р<0,05) подавлял пролиферацию клеток линии RAW-264.7 более чем на 30% (до 64,0±11,0%), а в концентрации 20 мкг/мл ФКС практически полностью блокировали пролиферацию этих клеток (до 14,0±7,1% от контрольных значений). Для L-929 клеток также наблюдалось дозозависимое ингибирование пролиферации, но меньшая степень выраженности эффекта (рис.1).

■ RAW-264.7 □ L-929

120

£д во

=г с ш о

§-§•60 §§

1 * 40 о о.

С 20 0

0,1 1 5 10 20

Концентрация ФКС, мкг/мл Рисунок 1. Влияние ФКС на пролиферацию клеток мышиных опухолевых линий RAW-264.7 и Ь-929.

Следующим этапом исследования стала оценка влияния ФКС на пролиферацию клеток человеческих опухолевых линий: эпителиального (НТ-29, А-431), глиального (ОЬ-б, и-373) и лейкозного (11-937) типов. Как и в случае с мышиными клеточными линиями, мы наблюдали дозозависи-

-4

1 ■ -i тГЬ

мое подавление пролиферации при внесении ФКС в культуру клеток опухолей человека. Наименее чувствительной к ФКС оказались опухолевые клетки эпидермоидной карциномы А-431. Даже в дозе 20 мкг/мл ФКС достоверно ингибировали пролиферацию всего лишь на 16,2±2,7% (р<0,05). Клетки колоректапьной аденокарциномы НТ-29 оказались более чувствительными к ФКС (рис. 2).

ра431

□ НТ-29

120

2

& 100

Ё О

* 80

к 60

I 40 <и ■6-| 20

0,1

20

1 5 10

Концентрация ФКС. мкг/мл Рисунок 2. Влияние ФКС на пролиферацию клеток человеческих эпителиальных опухолевых линий А-431и НТ-29.

Чувствительность исследуемых глиальных клеточных линий к ФКС была различной: подавление пролиферации клеток ОЬ-6 наблюдалось в меньшей степени, чем клеток линии и-373 (рис. 3).

а и-373 □ а.-б

ф

-е-§

о.

с

120 100 80 60 40 20

т 1 ------------------- гЬ

"Г

н-

5 10

Концентрация ФКС мкг/мл

20

Рисунок 3. Влияние ФКС на пролиферацию клеток человеческих глиальных опухолевых линий ОЬ-6 и и-373.

В качестве препарата сравнения нами был выбран флавоноид дигид-рокверцетин, обладающий множеством фармакологических эффектов, в том числе и противоопухолевым [Lee K.W. 2008; Teillet F. 2007]. Его исследование проводили на одной из наиболее чувствительных к ФКС линии -U-937. При этом наблюдалось дозозависимое подавление пролиферации лейкоз-ных клеток, однако эффект дигидрокверцетина, был сравнительно менее выражен, чем эффект препарата ФКС. Так, ФКС в концентрации 20 мкг/мл подавляли пролиферацию почти на 80% (до 22,1±3,9%; р<0,05), а дигидрок-верцетин (20 мкг/мл) только на 50% (до 46,5±2,9%; р<0,05) (рис. 4).

а ФКС иДигидрокверцетин 120-------

2 -г

8. 1оо нн j

к 60

20--^Н----- - Ж:

Я ■ Ш Г1

о —------1-

1 5 ю 20

Концентрация, мкг/мл

Рисунок 4. Влияние ФКС и дигидрокверцетина на пролиферацию клеток лейкоза и-937.

Обобщая полученные данные можно заключить, что ФКС обладают выраженным дозозависимым антипролиферативным эффектом в отношении опухолевых клеток, который не имеет значимой видовой (человек/мышь) или гистологической специфичности (лейкозы/раки/саркомы).

Антипролиферативный эффект ФКС мог быть реализован, по крайней мере, двумя способами: снижением количества опухолевых клеток в результате индукции их гибели (апоптоз, некроз) или остановкой культуры в фазах клеточного цикла (О^Б, С2/М). Поэтому следующим этапом исследований явилось изучение цитотоксичности и индукции апоптоза опухолевых клеток в присутствии ФКС, как механизмов, которые могут лежать в основе их антипролиферативного действия.

а ФКС иДигидрокверцетин

Üül

1 5 ю 20

Концентрация, мкг/мл

2. Изучение влияния ФКС на жизнеспобоность опухолевых клеток in vitro

Прямую цитотоксичность препарата ФКС изучали, по отношению к клеткам человеческих опухолевых линий (U-373, GL-6, А-431) находящихся в стационарной фазе роста. При 24-часовой экспозиции ФКС с исследуемыми клеточными опухолевыми линиями отмечалась лишь недостоверная тенденция к понижению доли жизнеспособных клеток на 10-15%. Напротив, к 48 ч инкубации наблюдалось статистически значимое по сравнению с контролем снижение метаболически активных клеток в изучаемых опухолевых культурах в зависимости от концентрации ФКС (рис. 5).

А.

120 100 80 60 40 20 0

1 5 10 20

15 10 20

Рисунок 5. Влияние ФКС (48 ч инкубации) на жизнеспособность клеток линии: A. GL-6; Б. U-373; В. А-431. По оси ординат: OD - оптическая плотность при длине волны 492 нм, % к контролю. По оси абсцисс: концентрация ФКС, мкг/мл.

Следует заметить, что при 24 ч экспозиции с препаратом выраженность данного эффекта была меньше, по сравнению со способностью флавоноидов солодки ингибировать пролиферацию: антипролиферативный эффект ФКС не коррелировал с прямой цитотоксичностью данного агента. По-видимому, ингибирование пролиферации клеток изучаемых опухолевых линий не связано с прямой цитотоксичностью препарата.

В связи с этим на следующем этапе изучалась способность ФКС индуцировать апоптоз, как возможный механизм антипролиферативного действия тестируемого агента.

3. Изучение влияния ФКС на апоптоз опухолевых клеток in vitro

Способность ФКС индуцировать апоптоз изучалась в культуре клеток различного гистологического происхождения (U-937, А-431, GL-6). При ин-

кубации клеток и-937 с ФКС (20 мкг/мл) в течение 24 ч, наблюдалась статистически недостоверная тенденция к повышению уровня апоптоза (рис. 6, пик О; рис. 7) на 10-15%. Однако при этом происходило достоверное понижение доли диплоидных (находящихся в во/О, фазах клеточного цикла - пик С) и увеличение доли тетраплоидных (находящихся в 02/М фазах клеточного цикла - пик И) клеток. Это может свидетельствовать о нарушении вхождения клеток в фазу митоза - остановке клеточного цикла в 02/М-фазе.

10° ю1 ю2

Контроль 24/48 ч

Экспозиция с ФКС 48 ч Рисунок 6. Типичные гистограммы распределение флуоресцирующих клеток при оценке апоптоза клеток опухолевой линии и-937.

К 48 ч инкубации клеток с ФКС наблюдались статистически значимое увеличение уровней апоптозирующих и тетраплоидных клеток, снижение уровня диплоидных клеток (рис. 6, 7). Достоверный проапоптоген-ный эффект ФКС (48-часовая экспозиция) и характерный рост С2/М-пика наблюдался и на остальных тестируемых линиях.

■ субдиплоидные клетки Пдиплоидные клетки

О промежуточна Я ПЛОИПНОГТ». Пте-п^п п^и >А......., —

Контроль 24 /48 ч ФКС 24 ч ФКС 48 ч

Рисунок 7. Влияние ФКС (инкубация 24 или 48 ч) на долевое распределение опухолевых клеток линии U-937 по плоидности после окраски фиксированных и пермеабилизированных клеток пропидий иодидом.

Таким образом, опираясь на исследования уровня пролиферации, прямой цитотоксичности и уровня апоптоза при инкубации с ФКС изучаемых опухолевых линий можно заключить следующее: по-видимому, инги-бирование пролиферации является следствием остановки опухолевых клеток в 02/М-фазе клеточного цикла, что и вызывает их последующую апоп-тотическую гибель.

4. Изучение влияния ФКС и доксорубицина на пролиферацию и апоптоз опухолевой линии K-562/DOX in vitro

На предыдущих этапах работы мы выяснили, что ФКС дозозависимо

подавляют пролиферацию различных по гистологии опухолевых культур.

Следующим этапом стало изучение эффектов комбинации ФКС с противо-

опухолевым антибиотиком доксорубицином на пролиферацию резистентной к данному цитостатику опухолевой линии K-562/DOX. Флавоноиды солодки достоверно подавляли (до 30-35%) уровень пролиферации лейкоз-ных клеток только в высоких концентрациях (10-20 мкг/мл), а доксоруби-цин ингибировал пролиферацию (до 30-40%) клеток линии K-562/DOX только в концентрациях, превышающих терапевтические (10"М0"5 М) и не оказывал эффекта в концентрациях 10'8-10"7 М. При совместном введении

ФКС (20 мкг/мл) и доксорубицина в опухолевую культуру пролиферация клеток линии К-562/ООХ ингибировалась в большей степени: эффект комбинации был равен сумме эффектов отдельных препаратов (рис. 8).

ПДоксорубицин

ОФКС+Доксорубицин

120

5.100 2 80

г?

60

о:

5

га 40

а.

®

"І" 20

10(-В)

Ю(-5)

10(-7) Ю(-Є)

Концентрация доксорубицина, М Рисунок 8. Влияние ФКС (20 мкг/мл) и доксорубицина (10'8, 10"7, 10"6,10'5 М) на пролиферацию клеток лейкоза К-562ЯЮХ, резистентного к доксо-рубицину.

В связи с тем, что основной механизм антипролиферативного эффекта ФКС связан с индукцией апоптоза, на следующем этапе изучалось влияние ФКС и доксорубицина на апоптоз клеток К-562ЯЮХ. Апоптогенный эффект комбинации ФКС (20 мкг/мл) с доксорубицином (10"6 М) практически соответсвовал сумме апоптогенных эффектов доксорубицина и препарата флавоноидов по отдельности (рис. 9).

Рисунок 9. Влияние ФКС и доксорубицина (24 ч инкубации) на уровень апоптоза опухолевой культуры К-562/БОХ. По оси ординат - количество анализируемых клеток. По оси абсцисс -интенсивность флуоресценции клеток.

Ри 1од

Поскольку при комбинации ФКС с доксорубицином на резистентной линии мы не наблюдали потенцирование, а только суммирование эффектов препарата флавоноидов корня солодки и цитостатика, можно предположить, что ФКС имеет отличный от цитостатика, дополнительный механизм противоопухолевой активности.

5. Изучение противоопухолевой эффективности флавоноидов корня солодки в модели in vivo

Противоопухолевая эффективность ФКС была изучена в модели лейкоза мышей Р388. ФКС (10 мг/кг) вводили внутрибрюшинно через 24 ч после перевивки гемобластоза в режиме через день (каждый четный день) до начала гибели животных в группе. Статистическая обработка результатов показала, что СПЖ мышей в группе, получавшей только ФКС, составила 9,5±0,4 дней, что статистически недостоверно отличалось от контрольных значений (9,9±0,3 дней). В группе мышей, получавших ФКС, процентное распределение погибших мышей, по дням за время наблюдения, также не имело достоверной разницы с контролем (рис. 10).

100

^ 80

і

§ 60 ф

«в а

* 40

2 a¡

20

-Контроль

■ФКС

«L

0 2 4 6 8 10 12 14 Продолжительность жизни, дни

Рисунок 10. Влияние ФКС на динамику гибели мышей с перевитым лим-фолейкозом Р388.

На следующем этапе было решено использовать комбинированную терапию флавоноидов с цитостатиком ЦФ. Препарат использовался в различных дозах (100 и 150 мг/кг), в которых он замедлял прогрессирование лейкоза Р388, увеличивая СПЖ мышей. Использование ЦФ совместно с ФКС приводило к достоверному увеличению продолжительности жизни животных по сравнению с мышами, пролеченными только ЦФ (табл. 1).

Таблица 1. Влияние ФКС на противоопухолевый эффект ЦФ у мышей с лимфолейкозом Р388.

Группы Доза СПЖ**, дни УПЖ, % ТВ, %

ЦФ, мг/кг ФКС, мг/кг

Контроль - - 9,9±0,3 - -

ЦФ 100,0 - 18,9±0,8 90,9 -

150,0 - 26,8±0,6 170,7 -

ЦФ+ФКС 100,0 10,0 23,4±0,9* 136.4 23,8

150,0 10,0 36,0±2,6* 263,6 343

♦Достоверность по отношению к группе, получавшей только ЦФ; ♦♦Средняя продолжительность жизни мышей с признаками опухолевой прогрессии.

На рис. 11 приведено сравнение динамики гибели животных при введении ЦФ и комбинации ЦФ+ФКС. ФКС в исследуемых дозировках достоверно сдвигает кривые в сторону увеличения продолжительности жизни (р<0,05, logrank тест). Необходимо заметить, что в группе, которой вводили ФКС с ЦФ в дозе 150 мг/кг, до 10% мышей выжили (СПЖ > 90 дней), что является критерием излечения для моделей гемобластозов. Следует подчеркнуть, что при комбинированном лечении ФКС с ЦФ в высокой дозе (150 мг/кг) около трети животных в группе погибали на 8-13 день развития лейкоза без признаков прогрессирования гемобластоза. Учитывая, что длительное введение ФКС в таком же режиме не вызывало смерти или каких-нибудь других признаков токсичности у интактных мышей без опухолевого процесса, можно свидетельствовать о потенцировании токсичности больших доз циклофосфамида на фоне использования ФКС.

—ЦФ 100 ЦФ+ФКС

-•-ЦФ150

-»-ЦФ+ФКС

^ 80-

t

§ 60'

г

X

§

л ю

20-

в

i 40-

0'

ol i i i I I ......

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 SO 55 60 Продолжительность ЖИЗНИ, дни

О 5 10 15 20 25 30 Продолжительность жизни, дни

Рисунок 11. Влияние ФКС и ЦФ (100 мг/кг и 150 мг/кг) на динамику гибели мышей с лимфолейкозом Р388.

Таким образом, проведенные исследования показали: 1) ФКС не обладает значимым, противоопухолевым эффектом в модели лимфолейкоза мышей Р388; 2) ФКС потенцирует противоопухолевый эффект циклофос-фамида в экспериментальной терапии лимфолейкоза Р388.

В результате проведенных исследований, были получены эффекты, демонстрирующие противоопухолевую активность ФКС in vitro. В опытах in vivo был получен эффект потенцирования в комбинации с цитостатиком. В целом, полученные результаты свидетельствуют о перспективности дальнейшего углубленного исследования отдельных флавоноидов корня солодки, преследуя цель создания лекарственных препаратов, повышающих эффективность противоопухолевой терапии.

1. Флавоноиды корня солодки дозозависимо угнетают пролиферацию опухолевых клеток in vitro. Антипролиферативный противоопухолевый эффект не имеет значимой видовой (человек/мышь) или гистологической специфичности (лейкозы/раки/саркомы).

2. Флавоноиды корня солодки не обладая прямой цитотоксичностью, вызывают апоптоз опухолевых клеток in vitro. Индукция апоптоза может быть связана с остановкой опухолевых клеток в С2/М-фазе клеточного цикла.

ВЫВОДЫ

3. Флавоноиды корня солодки дозозависимо умеренно подавляют пролиферацию резистентной к доксорубицину клеточной линии K-562/DOX.

4. Комбинация флавоноидов корня солодки с доксорубицином приводит к усилению противоопухолевого эффекта in vitro. Противоопухолевый антипролиферативный и проапоптогеный эффекты комбинации ФКС с доксорубицином равны сумме эффектов доксорубицина и ФКС по отдельности (эффект суммации).

5. ФКС не увеличивают среднюю продолжительность жизни экспериментальных животных на модели перевиваемого лимфолейкоза Р388, но потенцируют противоопухолевый эффект алкилирующего цитостатика циклофосфамида.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ Д ИССЕРТАЦИИ

1. Цицуашвили, М.Д. Возможность оптимизации фармакокинетики и повышение эффективности препаратов флавоноидов [Текст] / М.Д. Цицуашвили, С.И. Павлова, Г.О. Степанов, Д.З. Албегова, М.В. Демина, И.Г. Козлов // Российский аллергологический журнал. - 2010. -№ l.-вып. 1.-С. 199-200.

2. Цицуашвили, М.Д. Сравнение антипролиферативного эффекта различных экспериментальных лекарственных форм флавоноидов корня солодки. [Текст] / М.Д. Цицуашвили, С.И. Павлова, Д.З. Албегова, Е.В. Маркина, И.Б. Жукова // Вестник уральской медицинской академической науки. - 2010. -№ 2/1(29). - С. 276-277.

3. Албегова, Д.З. Флавоноиды - ингибиторы сигнальных путей. [Текст] / Д.З. Албегова, С.И. Павлова, П.Ю. Малышев, М.Д. Цицуашвили, Г.О. Дибирова, М.В. Демина, И.Г. Козлов // Российский аллергологический журнал. - 2010. - № 1. - вып. 1. - С. 7-8.

4. Цицуашвили, М.Д. Перспектива создания наносомальных форм препаратов флавоноидов [Текст] / М.Д. Цицуашвили, С.И. Павлова, Д.З. Албегова, И.Г. Козлов // Международный журнал по иммунореабили-тации. - 2010. - Т. 12, № 2. - С. 105.

5. Tsitsuashvili, M.D. The prospect of a nanosomal forms of flavonoids

drugs. [Текст] / M.D. Tsitsuashvili, S.I. Pavlova, G.O. Stepanov, D.Z. Albegova, I.G. Kozlov // Proceedings of the III World Asthma & COPD Forum and World Forum of Pediatrics. - 2010. - P. 153-156. . 6. Павлова, С.И. Механизмы антипролиферативной активности ФКС по отношению к клеткам гистиоцитарной лимфомы U-937 [Текст] I С.И. Павлова, М.Д. Цицуашвили, М.А. Тимаков, С.Е. Милешина, И.Г. Козлов // Вестник Уральской медицинской академической науки. -2011.-№2/2.-С. 48-49.

7. Павлова, С.И. Изучение противоопухолевых эффектов флавоноидов корня солодки в экспериментальных моделях in vitro и in vivo [Текст] /

C.И. Павлова, М.Д. Цицуашвили, Г.О. Дибирова, Г.В. Кукушкин, И.Г. Козлов // Вестник Волгоградского государственного медицинского университета - 2011. - № 3. - С. 64-66.

8. Цицуашвили, М.Д. Флавоноиды корня солодки подавляют пролиферацию опухолевых клеток [Текст] / М.Д. Цицуашвили, С.И. Павлова, МЛ. Тимаков, Д.З. Албегова, Г.О. Дибирова, И.Г. Козлов // Аллергология и иммунология. 2011. - Т. 12, № 2. - С. 210.

9. Tsitsuashvili, M.D. Interaction of fluorochrome-labeled nanosomes with U-937 tumor cell line in vitro. [Текст] / MJ). Tsitsuashvili, S.I. Pavlova,

D.Z. Albegova, I.G. Kozlov // International Journal on Immunoreahabilitation. - 2011. - Vol. 13. - № 1. - P. 102-103.

10. Tsitsuashvili, M.D. Evaluation of licorice root flavonoid antiproliferative effect in different tumor cell lines [Текст] / M.D. Tsitsuashvili, S.I. Pavlova, I.G. Kozlov // International Journal on Immunoreahabilitation. - 2011. -Vol. 13.-№2.-P. 165-166.

СПИСОК СОРАЩЕНИЙ

ДМСО - диметилсульфоксид

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

СПЖ - средняя продолжительность жизни

ТВ - терапевтический выигрыш

УПЖ - увеличение продолжительности жизни

ФКС - флавоноиды корня солодки

ЦФ - циклофосфамид

Подписано в печать 01.03.2012. Формат 60x90 1/16. Усл.-печ. л. 1,16. Тираж 100 экз. Заказ 27. Бесплатно. Отпечатано на полиграфическом участке ИБХ РАН 117437 Москва, улица Миклухо-Маклая, 16/10