Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Роль лимфоидных и эритроидныхлеток в регуляции противоопухолевой активности костномозговых цитостатических клеток-эффекторов

Р Г Б ОН

На правах рукописи

ТАРАБАН Вадим Яковлевич

РОЛЬ ЛИМФОИДНЫХ И ЭРИТРОИДНЫХ КЛЕТОК В РЕГУЛЯЦИИ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ КОСТНОМОЗГОВЫХ ЦИТОСТАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК-ЭФФЕКТОРОВ

14.00.36 - Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Новосибирск - 1997

Работа выполнена в Институте клинической иммунологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук.

Научный руководитель: член-корреспондент РАМН, профессор, д.м.н.

В.А. Козлов

Официальные оппоненты: д.м.н., профессор Д.Н. Маянский

к.м.н. С.В. Киселев

Ведущее учреждение: НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН

Защита состоится "_"___1997г. в _ часов на заседании

диссертационного совета Д.001.01.01 Института клинической иммунологии СО РАМН по адресу: 630091, г. Новосибирск - 91, ул. Ядринцевская 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института клинической иммунологии СО РАМН.

Автореферат разослан "_"_1997г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат

щокного совета . ¿?

биологических наук о т Кудаева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1 ктуальнасть темы. В настоящее время детально охарактеризованы функциональные свойства различных популяций эффекторных клеток, в том числе, ¡стественных киллерных клеток, лимфокин-активированных киллеров, (итотоксических Т-лимфоцитов, макрофагов и полиморфонуклеарных лейкоцитов, ютенциально способных индуцировать некроз и/или апоптоз опухолевых клеток Takasugi М. et al., 1973; Herberman R.B., Ortaldo J.R., 1981; l'ódack E.R., 1985; Hykowsky M.J., Stutinan О., 1986; Young J.D.-E., Liu (l-C.. НШ; Rappolee D.A., WerbZ., 1989; Jane way C.A.. 1989; Ломакин M.C., 1990; Суслов А.П. 1990; Man! ovaт A. et al.. 1992). Значительно меньше информации имеется о клетках, способных тодавлять опухолевый рост посредством механизмов, не ассоциированных с гибелью клеток опухоли. Вместе с тем, есть основания предполагать, что эти механизмы могут играть значительную роль в предотвращении развития эпухолевого процесса (Mitani М. et al., 1985).

Многочисленные экспериментальные данные, полученные к настоящему времени, свидетельствуют о существовании в пределах костного мозга пула неспецифических регуляторных клеток, обладающих выраженным антипролиферативным потенциалом. Часть из них, обозначенная в современной литературе термином "естественные супрессорные клети" (ECK), способна подавлять пролиферацию активированных лимфоцитов и, тем самым, супрессировать развитие иммунных реакций как in vitro, так и in vivo (Strober S., 1984; Maier Т. el al, 1986,; Maier Т., Holcia J.H. 1987; Maier T. et al. 1989; Moore S.C., Theus S.A. eral., 1992; Moore SC., Shaw M.A. etat., 1992; Brooks-Kaiser J.C. et al, 1992, 1993; Brooks J.C., Hoskin D.W. 1994; Кусмарцев C.A. it др., 1994; Angulo 1. et al., 1995). Кроме того, в самое последнее время, внимание исследователей привлекла другая сторона антипролиферативной активности клеток костного мозга, а именно, способность неспецифически ингибировать рост опухолей, прежде всего, опухолей костномозгового происхождения (Sugiura К. et al., 1990; Кусмарцев С.А., 1990; Seledtsov V.l. et al, 1995; Вельский Ю.П., 1996). Костномозговые эффекторные клетки, ответственные за супрессию опухолевого роста не несут на своей поверхности маркеров зрелых иммунекомпетентных клеток, их цитостатическая активность не рестриктирована по антигенам главного комплекса гистосовместимости (ГКГ), не связана с разрушением опухолевых клеток и опосредуется, по крайней мере частично, продукцией растворимых супрессорных факторов {Sugiura К. et al, 1990; Seledtsov V.l. et al, 1995; Вельский Ю.П.. 1996). Эти признаки, а также ряд других морфофункциональных особенностей, являются общими для костномозговых цитостатических клеток-эффекторов (КЦЭ) и естественных супрессорных клеток (ECK) и, по-видимому, свидетельствуют о сходстве этих клеточных популяций. Однако, конкретные механизмы супрессии опухолевого роста оставались, к началу нашего исследования, не вполне ясными. Поэтому, одной из основных задач, стоявших перед нами, было проведение сравнительного анализа механизмов естественной иммуносупрессорной и противоопухолевой цитостатической активности клеток костного мозга.

Важной функциональной особенностью ECK является их высокая чувствительность к регуляторному действию ряда цитокинов. В частности, шшуиосупрессорная активность костномозговых ECK значительно возрастает под влиянием ИНФ-у и ИЛ-2. С другой стороны, было показано, что противоопухолевая

цитостатическая активность клеток костного мозга также способна возрастать в присутствии рекомбинантного ИЛ-2 или культуральных супернатангов, полученных от аллоантиген-активированных Т-лиыфоцитов (Seledtsov V.l. et al„ 1995). Дальнейшее изучение регуляторных влияний, способных изменять функциональное состояние костномозговых цитостатических эффекторов представляется задачей, имеющей не только теоретическое, но и потенциальное практическое значение.

Важно отметить, что ранее полученные данные свидетельствуют о способности незрелых эритроидных клеток (ЭК) осуществлять экспрессию гена ИНФ-у, а также ряда других цитокинов, потенциально способных оказьшагь влияния на процессы дифференцировки клеток костного мозга (Sennikov S.V. et al., 1996). Выяснение степени возможного участия ЭК в регуляции функционального состояния костномозговых цитостатических эффекторов также являлась одной из задач, которые мы считали важными не только в теоретическом, но и практическом отношении.

Цепь и задачи исследования. Цель работы - провести сравнительное исследование механизмов естественной супрессорной и противоопухолевой цитостатической активности клеток костного мозга (ККМ) и охарактеризовать роль лимфоцитов и незрелых эритроидных клеток (ЭК) в регуляции функциональной активности КЦЭ.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Сравнить фенотипические характеристики КЦЭ и костномозговых естественных супрессорных клеток (ECK).

2. Провести сравнительный анализ механизмов антипролиферативного действия КЦЭ и костномозговых ECK.

3. Исследовать регуляторные влияния Т- и В-лимфоцитов. а также незрелых эритроидных клеток на противоопухолевую цитостатическую активность ККМ.

Новизна работы. Впервые показано, что популяции KI Р и костномозговых ECK не идентичны как по клеточному составу, так и по механизмам антипролиферативного действия. Показана способность лимфоидных и эритроидных клеток усиливать противоопухолевую активность КЦЭ. Охарактеризована роль ИНФ-у в этом процессе.

Научная и практическая значимость работы. Представленные результаты вносят вклад в понимание значимости цитостатических межклеточных взаимодействий, направленных на подавление опухолевого роста, а также очерчивают роль нормального костного мозга как важного компонента целостной системы иммунобиологического надзора и неспецифической противоопухолевой резистентности организма. Полученные данные могут способствовать разработке принципиально новых подходов к иммунопрофилактике и лечению гемобластозов, связанных с попытками избирательной активации костномозговых цитостатических клеток-эффекторов, в том числе, основанных на использовании терапевтических воздействий, направленных на стимуляцию эритропоэза.

кновпые положения, выносимые на защиту:

1. Популяции костномозговых ECK и КЦЭ не идентичны по своему клеточному оставу.

2. Естественная иммуносупрессорная активность свежеизолированных клеток остного мозга опосредуется продукцией окислов азота.

3. Противоопухолевая цитостатическая активность свежеизолированных клеток :остного мозга не связана с синтезом N0 и не опосредуется продукцией ТРФ-ß или гростаглаидинов; важным условием эффективного торможения опухолевого роста, >существляемого ККМ, являются непосредственные контактные взаимодействия с шетками-мишенями,

4. Противоопухолевая цитостатическая активность клеток костного мозга ¡начительно возрастает под влиянием растворимых регуляторных факторов, продуцируемых лимфоцитами и незрелыми эритроидными клетками, одним из которых является ИНФ-у; усиление противоопухолевой активности ККМ не гопровождается генерацией цитолитически активных клеток-эффекторов.

5. Незрелые эритроидные клетки способны модулировать функциональное состояние макрофагов, в частности, индуцировать или подавлять, посредством продукции ИНФ-у и ТРФ-ß, процессы синтеза окислов азота.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 108 страницах машинописного текста, содержит 13 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Список литературы включает 261 цитируемую работу, в том числе, 26 работ, опубликованных в отечественных, и 235 -в зарубежных научных изданиях.

Апробация материалов диссертации и публикации. Материалы диссертации доложены и обсуждены на конференции молодых ученых ИКИ СО РАМН (Новосибирск, 1996), семинарах отдела экспериментальной иммунологии ИКИ СО РАМН (Новосибирск, 1996, 1997), 3-й отчетной конференции ИКИ СО РАМН (Новосибирск, 1997), семинаре группы молекулярной иммуногематологии лаборатории регуляции иммунопоэза ИКИ СО РАМН (Новосибирск, 1997), общеинститутском семинаре ИКИ СО РАМН (Новосибирск, 1997). По материалам диссертации опубликовано 4 печатных работы и 4 находятся в печати.

Работа выполнена в лаборатории регуляции иммунопоэза ИКИ СО РАМН. Большинство экспериментов, а также математическая обработка и анализ полученных данных выполнены лично автором. Автор искренне признателен за поддержку и квалифицированную помощь участникам ряда совместных исследований, к.м.н. Г.В. Селедцовой и В.В. Сенюкову, а также всем коллегам, проявлявшим искреннее дружеское участие и создававшим неповторимую атмосферу морального комфорта и творческого энтузиазма, в том числе, к.м.н. В.И. Селедцову, к.м.н. Д.М. Самарину, О.В. Повещенко и Э.А. Кащенко. Особую благодарность автор выражает к.м.н. Л.П. Коненковой, чья требовательность и терпение помогли ему сделать первые, самые важные, шаги в иммунологии и чью дружескую поддержку он всегда опгущал в повседневной жизни.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Использованные в работе мыши (CBAxC57BL/6)Fl (CBF1, Н-2к /Н-2Ь), (DBAxC57BL/6)F 1 (BDF1, H-2b/H-2d) 6-9 месячного возраста были получены из питомника лабораторных животных СО РАМН. Мыши DBA (H-2d), а также бестимусные мыши Balb/c nu7niT (H-2d), 3-6 месячного возраста, были, любезно предоставлены руководителем лаборатории экспериментальных животных Томского научного центра к.м.н. С.А. Кусмарцевым.

Среда RPMI 1640, бикарбонат натрия (NaHC03), HEPES, L-глютамип, гентамицин, липополисахарид (ЛПС, Е. C.oli, серотипы 0111 :В4 и В5:055), сульфаниламид, нитрит натрия (NaN02), индометацин, фенилгидразин (ФГ), а также агглютинин зародышей пшеницы (АЗП), N-ацетил-О-глюкозамин и №-монометил-D-аргинина ацетат (DMMA) были получены от Sigma Chemical Со (США). Эмбриональная телячья сыворотка (ЭТС) забуференный физиологический раствор Дульбекко (Д-ЗФР), не содержавший Ca'" и Mg++ (pH 7,2), - от НПО "Вектор" (Кольцово, Россия). ЭТС освобождали от присутствия комплемента инкубацией при 58 "С в течение 50 минут. Раствор перколла, 2-меркаптоэтанол, L-лейцил-метиловый эфир (ЛМЭ), №-монометил-Ь-аргинина ацетат (LMM А), N-1-нафтилэтилендиамина дигидрохлорид и фосфорная кислота были произведены Fluka Chemika (Швейцария). Конканавалин А (КонА) был получен от фирмы Pharmacia Biotechnology Inc. (Швеция); [3Н]-тимидин - от компании "Изотоп" (Санкт-Петербург, Россия). Тиогликолятный бульон был изготовлен в институте микробиологии и эпидемиологии им. Гамалеи (Москва). Кроличьи антитела (AT) к IgM/IgG иммуноглобулинам мыши были аффинно очищены в нашей лаборатории. AnTH-Thy-1,2 моноклональные антитела (мАТ) (клон 5а-8, IgG2b, кат. N CL8600A, рабочее разведение супернатанта 1:500), конъюгированные с флуоресцеина изотиоцианатом (ФИТЦ) кроличьи AT к иммуноглобулинам мыши (кат. N CL6002F), а также кроличий комплемент были получены от Cedarlane Laboratories Ltd. (Канада). Мышиные анти-ТРФД мАТ, которые в рабочей концентрации 20-30 мкг/мл были способны нейтрализовать приблизительно 0.10-0.50 нг/мл общего ТРФ-ß, и анти-ИНФ-у мАТ (приблизительно 7 нг которых были способны ингибировать 50% макрофаг-активирующей активности, проявляемой одной международной единицей мышиного ИНФ-у), были получены от фирмы Genzyme Со. (США). Все перечисленные выше AT хранились в жидком азоте при температуре -196°С до момента использования.

Клетки мастоцитомы Р815 (H-2d) и лимфомы LI 210 (H-2d) были получены из Онкологического научного центра РАМН (г.Москва). Опухолевые клетки сохраняли пассированием in vitro в среде RPMI 1640, содержавшей 10% ЭТС, 2 г/л NaHC03, 2 мМ L-глютамина и антибиотики.

Клетки костного мозга получали при помощи перфузии бедренных и больших берцовых костей лабораторных животных, по методике, подробно описанной ранее (Seledtsov V.l. et al, 1995). В части экспериментов, ККМ (107/мл), инкубировали при комнатной температуре в бессывороточной среде RPMI 1640 с 15 мМ ЛМЭ, в соответствие с ранее описанным протоколом (Thiele D.L., Lypsky P.E., 1985). Через 30 мин после начала инкубации, клетки дважды отмывали охлажденным Д-ЗФР,

содержащим 10% ЭТС, и, после оценки жизнеспособности методом исключения трипанового синего, использовали в экспериментах.

Для фракционирования, ККМ (4 х 10б/мл) инкубировали с 50 мкг/мл АЗП при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем, клеточную суспензию осторожно наслаивали на поверхность 50% раствора ЭТС в Д-ЗФР (3 мл в 12-мл пробирке для центрифугирования). Через 30 минут дальнейшей инкубации при комнатной температуре, собирали верхнюю, взвешенную, фракцию АЗП-рецептор(Р)"-ККМ и нижнюю, осадочную, фракцию, содержащую агглютинировавшие АЗП-Р+-ККМ. Агглютинировавшие клетки диссоциировали посредством обработки 0.2 М раствором N-ацетил-О-глюкозамина, как это было описано ранее (Brooks-Kaiser J.С. et al., 1992). Эта процедура позволяла получать приблизительно 40% от исходной популяции ККМ с высокой степенью жизнеспособности, более 95%. Приблизительно 70% и 30% этих клеток были АЗП-Р* и АЗП-Р", соответсвенно. После интенсивной отмывки Д-ЗФР, содержащим 1% ЭТС, полученные фракции ККМ использовались в дальнейших экспериментах.

Клетки культивировали, если не указано иначе, в среде RPMI 1640 с добавлением 10 мМ HEPES, 2 г/л NaMCOi, 2 мМ L-глютамина, 5 х 10'5 М меркаптоэтанола, 30 мкг/мл гентамицина и 7,5% ЭТС, при 37°С, во влажной атмосфере с 5% СОг- Каждый экспериментальный вариант был представлен 3 параллельными культурами.

Для определения цитостатической противоопухолевой активности ККМ, клетки Р815 или L1210 (104/лунку) культивировались в течение 24 или 48 часов совместно с ККМ (3 х 105/лунку, если не указывалось иначе) в круглодонных, либо, в ряде экспериментов, в плоскодонных или V-образкых, 96-луночных культуральных планшетах (BDSL, Великобритания, Nunc, Дания, и Linbro, США, соответственно). И ряде опытов, одновременно с ККМ, в культуры вносили указанные ниже растворимые добавки и реагенты. В части экспериментов, ККМ предварительно инкубировали в течение 20 часов в присутствие, или без, культуральных супернатаитов, кондиционированных активированными лимфоцитами или незрелыми эритроидными клетками. В контроле, опухолевые клетки культивировались либо самостоятельно, либо в присутствии нормальных тимоцитов (3 х 105/лунку), которые, как ранее было показано {Seledtsov V.l. et al., 1995), были не способны оказывать какого-либо супрессорного эффекта на рост лейкозных клеток in vitro. За 5 часов до окончания культивирования в культуры вносили [3Н]-тимидин (0.75 MKCi/лунку). Уровень синтеза ДНК оценивали с использованием стандартной процедуры, включавшей перенос клеток на стекловолокнистый фильтр и учет радиоактивности с помощью жидкостного сцинтилляционного ß-счетчика. Процент супрессии опухолевого роста определяли, сравнивая радиоактивность опытных и контрольных проб:

имп/мин в опыте

% супрессии = ( 1-------------------------) х 100

имп/мин в контроле

Для определения цитолитической противоопухолевой активности ККМ, опухолевые клетки-мишени (2-Зх106 /10 мл) культивировали в полной культуральной среде, содержащей [3Н]-тимидин (1 мкСл/мл. активность 5 Ci/мМ), в пластиковых флаконах (25 см\ Linbro). Через 20 часов меченные клетки тщательно отмывали и

продолжали культивировать в течение 24 часов в круглодонных 96-луночных планшетах (BDSL, 104/0.15 мл/лунку), совместно с ККМ (3 х 105/лунку) (опыт) или без них (контроль). По окончании культивирования, при помощи вакуум-аспирации, удаляли культуральную среду, содержавшую меченные [3Н]-тимидином фрагменты ДНК, высвободившиеся из погибших клеток. Оставшиеся клетки переносили на стекловолокнистый фильтр, оценивая радиоактивность образцов при помощи стандартного метода, отмеченного выше. Уровень цитолиза определяли по формуле:

имп/мин в опыте

% цитолиза = ( 1-------------------------) х 100

имп/мин в контроле

Естественную иммуносупрессорную активность ККМ оценивали, культивируя их совместно с клетками нормальной селезенки (3 х 105/лунку) в присутствии ЛПС (12 мкг/мл) или Кон А (5мкг/мл), в круглодонных 96-луночных планшетах, в течение 48 часов, в том числе, последние 6 часов с [3Н]-тимидином (0.75 мкСл/лунку). Для того, чтобы оценить возможные неспецифические антипролиферативные эффекты, связанные с избыточной плотностью клеточного монослоя/осадка, в исследование были включены культуры, в которых вместо ККМ было добавлено такое же количество облученных селезеночных клеток (20 Гр). Как было обнаружено, эти клетки не оказывали никакого сулрессорного эффекта на пролиферацию лимфоцитов. Включение {3Н]-гимидина определяли методом, указанным выше, оценивая процент супрессии митоген-стимулированной пролиферации лимфоцитов по формуле, аналогичной той, что была использована для определения уровня супрессии опухолевого роста.

Для оценки влияния индометацина на противоопухолевую и естественную иммуносупрессорную активность ККМ использовали раствор индометацина в этиловом спирте; его рабочее разведение готовили в среде RPM1 1640, так, чтобы конечная концентрация индометацина, внесенного в клеточные культуры, составляла 10'6 М.

Уровень продукции NO в культурах оценивали по аккумуляции нитритов в культуральных супернатантах, в соответствие с методом, подробно описанным ранее (Migliorini Р. et al, 1991). Для этого, 50 мкл каждого супернатанта переносили в 96-луночный планшеты для микроанализа (Greiner) и инкубировали с равным количеством реагента Гриесса (0,05% нафтилэтилендиамина дигидрохлорида, 0,5% сульфаниламида и 2,5% И3РО4) в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем оценивали поглощение образцов при 570 нм, с помощью мккро-ИФА-спектрофотометра (Behring), и вычисляли концентрацию нитритов, используя в качестве стандартной калибровочной кривой последовательные разведения 1мМ раствора NaNÜ2.

Источником незрелых эритроидпых клеток служили селезенки мышей, у которых внутрибрюшинным введением ФГ индуцировали развитие гемолитической анемии и последующее усиление эритропоэза. ФГ инъецировали в первоначальной дозе 1,2 мг/мл/мышь. Через 12 и 20 часов проводили повторные инъекции ФГ по 0,6 мг/мл/мышь. Еще через 48 часов селезёнки изолировали и подвергали гомогенизации, получая клеточную суспензию в соответствие с протоколом описанным ранее (Seledtsov V.l. et al., 1995). Ранее опубликованные данные (Цырлова И.Г. и др., 1986)

свидетельствовали, что более 60% полученных таким образом спленоцитов составляют ЭК. Последующие этапы выделения ЭК были нацелены на выделение неадгезивных клеток, обладавших низкой плавучей плотностью, и включали центрифугирование клеточной суспензии в градиенте плотности раствора перколла (1,076 г/л, 400g, в течение 30 мин) и инкубацию клеток, составлявших интерфазное кольцо, в присутствии анти-ТЬуi,2 мАТ (б концентрации 10-15х10в/мл, в бессывороточной среде RPM1 1640, содержавшей 10 мМ HEPF.S, при 4°С, в течение 50 минут). Зрелые Мф, Т- и B-лимфоциты удалялись в результате последующей процедуры "пэннинга", в ходе которой, клетки, после тщательной отмывки от избытка антител, наносили на пластиковые чашки Петри ("Меднолимер", Санкт-Петербург) диаметром 90 мм, с предварительно адсорбированными аффинно-выделенными кроличьими антителами к иммуноглобулинам мыши. Внесённые клетки (не более 4хЮ6 /чашку) инкубировали в среде RPMI 1640, с 20 мМ LIEPES и 5% ЭТС, в течение 2 часов при 4°С. В середине инкубационного периода клеточную суспензию мягко перемешивали в течение 20-30 сек. В результате вышеописанной процедуры, Мф, за счет неспецифической адгезии, B-лимфоциты, несущие на своей поверхности иммуноглобулиновые рецепторы, и Т-лимфоциты, покрытые анти-Thyl,2 мАТ, оказывались прикреплёнными к пластиковой поверхности. Степень очистки популяции клеток, оставшихся неприкрепленными, оценивали при помощи иммунофлуоресцентного анализа с использованием анти-ТЬу1,2 мАТ и конъюгированных с ФИТЦ анти-мышииых lg AT, в соответствии с описанным ранее методом (Jadus M.R., Parkman R., ¡986). Выделенные клетки (1x107/мл) инкубировали еще в течение 30 минут при 22ПС в бессывороточной среде RPM1 1640 с 15 мм ЛМЭ. После окончания инкубации клетки трижды отмывали Д-ЗФР/)0% ЭТС и использовали в последующих экспериментах, после предварительной оценки их жизнеспособности методом исключения трипанового синего. Анализ клеточных мазков, окрашенных но методу Нохта-Максимова свидетельствовал, что выделенная клеточная популяция состояла, как правило, не менее чем на 97% из базофнлыгых ЭК.

Для получения преактивированных Т-лимфоцитов, клетки нормальной селезёнки (5х10'/10 мл) культивировали в присутствии Кон А (5 мкг/мл) в пластиковом флаконе (25 см3, Linbro). Через 24 часа клеточную суспензию тщательно отмывали от митогена и освобождали от прилипающих клеток и B-лимфоцитов, инкубируя в пластиковых чашках Петри, предварительно покрытых анти-Ig AT, как это было описано выше. Не прикрепившиеся к пластиковой поверхности клетки обрабатывали анш-Thy 1,2 мАТ, в соответствие с ранее отмеченным протоколом, и повторно проводили процедуру "пэннинга". После окончания инкубации, неприлигапие клетки удаляли, а оставшиеся, после тщательной отмывки чашек, собирали при помощи специального скребка (Becton Dickinson Со, США) и использовали в дальнейших экспериментах. Как было определено при помощи непрямого иммунофлуоресцентного анализа, с использованием анти-Thy !,2 мАТ и, ФИТЦ-конъюгированных анти-Ig, практически 100% полученных таким образом клеток были Thy 1.2-позитивными.

Для получения преактивированных В-лимфоцнтов, селезёночные клетей (5хЮ6/мл) культивировали в присутствии ЛПС (E.Coli В5:055, 20 мкг/мл) в пластиковом флаконе (25cmj, Linbro) в объёме 10мл. Через 24 ч, клетки, тщательно отмытые от митогена, инкубировали в течение 2 часов при 4°С в чашках Петри, с

целью удаления клеток, способных неспецифически прикрепляться к пластиковой поверхности (преимущественно, Мф). После завершения инкубации, неприкрепившиеся клетки переносили в чашки с предварительно адсорбированными анти-Ig AT, продолжая их инкубировать в тех же условиях еще в течение 80-90мин. Затем неприкрепившиеся клетки удаляли, промывая чашки Д-ЗФР/1% ЭТС, а оставшиеся клетки собирали, как описано выше, и использовали в дальнейших тестах. Как было установлено при проведении прямого иммунофлюоресцентного анализа с использованием меченных ФИТЦ анти-lg AT, практически 100% полученных клеток являлись В-лимфоцитами.

Для получения сред, кондиционированных прсактивированными лимфоцитами или ЭК, соответствующие клетки (5х106/мл), культивировали в течение 24 часов в бессывороточной среде RPMI 1640, содержащей 4 мМ L-глюгамина, 2 г/л NaHCCb и 20 мМ HEPES, в лунках 24-луночного планшета (Linbro). Культуральный супернатант отделяли от клеток при помощи центрифугирования, стерилизовали, используя фильтр с диаметром пор 0,22 мкм (Cole-Parmer Instrument Co., США), и хранили при температуре -20°С до момента использования. Как было установлено дальнейшими функциональными тестами, среда, кондиционированная В-клетками (ВКС), в 25% концентрации эффективно поддерживла ЛПС-стимулированпую пролиферацию спленоцитов, культивированных в условиях субоптимальной клеточной плотности (4х104/лунку) в лунках 96-луночного плоскодонного планшета, в то время как 25% супернатант, кондиционированный Т-лимфоцитами (ТКС), был способен, в присутствии ЛПС {Е. Coli, серотип 0111 :В4, 20 нг/мл), индуцировать выраженную активацию перитонеалышх Мф и продукцию ими NO.

Для получения Мф, на 3-4 день после внугрибрюшинного введения тиогликолятного бульона (3%, 2 мл/мышь), проводили промывание перитонеальной полости животных охлажденным Д-ЗФР. Полученные клетки отмывали, переносили (2х103/лунка) в 96-луночные плоскодонные планшеты (Nunc) и инкубировали при 37°С во влажной атмосфере с 5% СО? в течение 2 часов. Затем неприлипшие клетки удаляли, промывая лунки предварительно нагретой до 37°С средой RPMI 1640, а прилипшие клетки продолжали культивировать либо в кулътуральной среде (контроль), либо с дополнительными растворимыми или клеточными добавками, указанными ниже. Через 18 часов лунки вновь тщательно промывали, продолжая культивировть Мф еще в течение 36-40 часов. После завершения инкубации продукцию NO активированными Мф оценивали методом, указанным выше и подробно описанным ранее (Migliorini P. ei al„ 1991).

Статистическую обработку полученных экспериментальных результатов проводили с помощью парного теста Стьюдента для связанных выборок. Представленные ниже данные (средние значения, дополненные соответствующими среднеарифметическими отклонениями) достоверно отражают результаты 3-х однотипных экспериментов (/><0.05).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнительная характеристика естественной иммуносупрессарной и противоопухолевой цитостатической активности свежеизолированных клеток костного мозга. Ранее было показано, что чувствительность к лизосомотропному литическому агенту, лейцил-метиловому эфиру (ЛМЭ), является одной из универсальных характеристик ECK, и, в частности, обработка клеток костного лиша ЛМЭ полностью отменяет их иммуносупрессорную активность (Moore S.C. el al, 1992; Angulo l. eí al., 1995). С другой стороны, известно, что агглютинация клеток костного мозга при помощи лектина, выделенного из зародышей пшеницы (АЗП) является эффективным средством позитивной селекции ECK (Sugiura К. et al, 1988,1990; Angulo I. et al, 1995).

Результаты наших собственных экспериментов, представленные на рисунке 1, свидетельствуют, что в отличие от интактных свежеизолированных клеток костного мозга, которые одновременно обладали как противоопухолевой, гак и естественной супрессорной активностью, клетки костного мозга, обработанные ЛМЭ, оказались не способны ни подавлять рост опухолевых линий Р815 или 1Л210, ни супрессировать митоген-стимулированную пролиферацию сингенных селезеночных клеток. В то же время, удаление клеток, экспрессирующих поверхностные рецепторные структуры к агглютинину зародышей пшеницы (АЗП-Р ' - клеток) резко снижало способность ККМ ингибировать пролиферацию митоген-стимулированных клеток селезенки, но не влияло на их цитостатическую противоопухолевую активность. Более того, в трех из пяти аналогичных экспериментов, АЗП-Р" клетки оказывали даже более выраженные

антипролиферативные эффекты на рост опухолевых линий. Таким образом, наши результаты свидетельствуют, что несмотря на некоторое фенотипическое сходство и ряд общих функциональных характеристик (в частности, чувствительность к ЛМЭ), популяции костномозговых FCK и ККМ, обладающих цитостатической противоопухолевой активностью, не идентичны по сьоему клеточному составу.

Выраженная зависимость иммуносупрессорной активности ККМ от ирису-тс гния ИНФ-у была показана многими авторами (Halda J.H. et al., 1986, 1988; Angulo I. et al., 1995). Как свидетельствуют экспериментальные данные, полученные ранее, ИНФ-у является основным индуктором процессов синтеза моноксида азота, N0 -плейотропного медиатора, способного подавлять пролиферацию клеток-мишеней (Angulo I. et al, I995;YoungM.Rl. et ai, 1996). В то же время, как показывают наши результаты, представленные на рисунке 2, цитостатические противоопухолевые эффекты свежеизолированных ККМ не зависели от активности ИНФ-у и не были опосредованы продукцией окислов азота. В частности, моноклональные антитела, нейтрализующие активность ИНФ-у, добавленные в начале культивирования, не отменяли противоопухолевого действия ККМ. На их противоопухолевые эффекты также не оказывал никакого влияния L-монометил-аргинин (LMMA), конкурентный ингибитор процессов синтеза окислов азота. В полном соответствии с этими результатами, мы не обнаружили какой-либо заметной продукции окислов азота в ходе совместного культивирования клеток костного мозга и опухолевых клеток-мишеней.

В. иптактные ККМ

□. ккм+лмэ

0АЗП-Р*ККМ П А311-Р ККМ

Рисунок 1. Антипролифератнвная активность свежеизолированных клеток костного мозга мышей ВИП: интактных, обработанных ЛМЭ и фракционированных агглютинацией с АЗП. Контрольное включение [3Н]-тимидина в клетках Р815, Ы2(0, КонА- и ЛПС-индуцированных лимфобластах варьировало в пределах 210000+15000, 320000+24000, 132000±16000 и !05000±14000 имп/мин соответственно.

100

8 80 в

о £ 60

£ «

и ^ 20

0

Р815 1Л210 КонА ЛПС

Ш Среда В аити-ИНФ-гамма □ ЬММА ЕШММА

Рисунок 2. Антнпролиферативная активность клеток костного мозга мышей ВОР1 в присутствии анти-ИНФ-у мАТ, ЬММА и 1)\1МА. Контрольная пролиферация клеток Р815, Ь1210, КонА- и ЛПС-индуцированных лимфобластов определялась на уровне 184000+19000, 191000+8000, 98000±9000 и 60000+14000 имп/мин соответственно. Спонтанная пролиферация ККМ не превышала 15000 имп/мин. Каждая из указанных выше растворимых добавок, сама по себе, не оказывала никакого заметного эффекта на пролиферацию клеток в контрольных культурах.

С другой стороны, в соответствии с литературными данными, моноклональные антитела, нейтрализующие ИНФ-у, также как ЬММА, были способны значительно снижать естественную иммуносупрессорную активность клеток костного мозга, направленную против КонА-стимулированной пролиферации клеток селезенки

(рисунок 2) и аккумуляцию нитритов в супернатантах при совместном культивировании ККМ и митоген-стимулированных спленоцитов (рисунок 3).

Кон А ЛПС

["■Среда Шантн-ИНФ-гамма □ LMMA BDMMA

Рисунок 3. Продукция окислов азота при совместном культивировании ККМ и митоген-стимулированных клеток селезенки. Спонтанная продукция N0 клетками костного мозга и митоген-стимулированными клетками селезенки, культивированными раздельно, не превышала 3 мкМ и 8 мкМ соответственно.

Таким образом, в отличие от естественной иммуносупрессорной активности, связанной, главным образом, с продукцией окислов азота, цитостатические противоопухолевые эффекты ККМ, по-видимому, опосредуются иными, NO-независимыми механизмами.

Роль ТРФ-ß в иммуносупрессорной активности клеток костного мозга была ранее охарактеризована в целом ряде исследований (Moore S.C. et al.,1992; Hoskin D.W. et al„ 1992; Young MRA. et ai, 1995). Литературные данные также указывают на возможность вовлечения простагландинов, в частности ПГЕ2, в реализацию супрессорного потенциала ECK (Choi K.L. et al., ¡988; Howell C.D. et al, 1992). Однако, проведенные нами исследования показали, что нейтрализация активности ТРФ-ß моноклональными антителами, не оказывала никакого заметного эффекта ни на противоопухолевую цитостатическую, ни на естественную супрессорную активность ККМ. Согласно нашим данным, ПГЕ2 также, по-видимому, не играет заметной роли в этих процессах, поскольку блокада синтеза простагландинов индометацином не оказывала никакого заметного влияния как на выраженность противоопухолевого цитостатического, так и естественного иммуносупрессорного действия клеток костного мозга.

Р815

L1210

frñ ÉT

1 1, -"ir

1 2 3

Форма лунок:

HV-образная РЦ-оброзная □ Плоское дно

Рисунок 4. Зависимость противоопухолевых цитостатических эффектов клеток костного мозга от плотности клеточных культур. 1, 2, 3 - соотношение ККМ/клетки-мишсни: 40/1, 20/1 и 10/1 соответственно.

Ранее рядом авторов (Sugiura К. et al., ¡990; Seledtsov V.I. et al., 1995; Вельский Ю.П., 1996) было показано, что цитостатическая противоопухолевая активность клеток костного мозга опосредуется продукцией растворимого супрессорного фактора(ов). Вместе с тем, полученные ранее экспериментальные данные (Seledtsov V.I. et ai, 1995) позволили предположить, что среди возможных механизмов противоопухолевого действия КЦЭ, наряду с продукцией растворимых медиаторов, важное место занимают непосредственные, контактные взаимодействия с клетками-мишенями. Более того, по нашему мнению, подобные взаимодействия in vivo могут

являться ключевыми механизмами контроля пролиферации и злокачественной трансформации клеток костного мозга. Это предположение основано на ранее сделанных наблюдениях, показывающих 1) возможность заметного подавления пролиферации опухолевых клеток уже в первые часы их совместного культивирования со свежевыделенными клетками костного мозга, когда концентрация предполагаемых костномозговых цитостатических медиаторов в культуральной среде может быть крайне незначительной; и 2) более выраженные антипролиферативные эффекты ККМ в сравнении с полученной от них культуральной средой, проявляемые в равных экспериментальных условиях (Seledtsov V.l. et ai„ 1995).

Результаты, представленные на рисунке 4, свидетельствуют, что при культивировании костномозговых клеток в течение 24 часов совместно с клетками Р815 или L1210, наиболее выраженная супрессия опухолевого роста отмечалась в культурах, помещенных в культуральные планшеты с лунками, имеющими конусовидное дно, которые, в следствие этого, отличались наибольшим уровнем клеточной плотности. Наименьший уровень супрессии отмечался в культурах, помещенных в плоскодонные культуральные планшеты, а промежуточный - при культивировании клеток в лунках с круглым дном. Важно отметить, что при максимальном соотношении ККМ/клетки-мишени (40/1) регистрируемая супрессия опухолевого роста была примерно одинаковой во всех культурах, независимо от конфигурации лунок, однако, по мере уменьшения концентрации клеток костного мозга, различия в выраженности противоопухолевых цитостатических эффектов становились более отчетливыми.

Таким образом, полученные нами экспериментальные данные подтверждают ранее сделанные предположения о значимости межклеточных контактных взаимодействий в процессе осуществляемого клетками костного мозга подавления пролиферации опухолевых клеток.

Влияние цитокинов, продуцируемых активироваиными лимфоцитами, на противоопухолевую активность клеток костного мозга. Полученные к настоящему времени экспериментальные данные свидетельствуют о способности активированных лимфоцитов, в частности, посредством продукции ИЛ-2, усиливать противоопухолевую цитостатическую активность КЦЭ (Seledtsov V.l. et al., 1995).

Результаты, представленные на рисунке 5, указывают на то, что противоопухолевая активность ККМ in vitro, заметно усиливалась после их предварительного 20-часового культивирования в присутствии среды, кондиционированной высокоочищенными активированными Т-клетками (ТКС). Подобный эффект наблюдался также в результате предварительного культивирования ККМ в присутствии культурального супернатанта, полученного от активированных B-клеток (ВКС). Важно отметить, что увеличение противоопухолевой цитостатической активности клеток костного мозга в значительной мере отменялось моноклональными антителами, нейтрализующими ИНФ-у, добавляемыми одновременно с ТКС, но не с ВКС. Таким образом, наши результаты, свидетельствующие о возможной значимой роли ИНФ-у в регуляции противоопухолевой активности КЦЭ, не исключают возможного участия в этом процессе других цитокинов, в том числе продуцируемых В-лимфоцитами.

Р815 Ы210

■ Среда ВТКС DTKC+анги-ИНФ-гамма QBKC □ ВКС+ анти-ИНФ-гамма

Рисунок 5., Влияние культуральных супернатантов, кондиционированных активированными лимфоцитами на противоопухолевую цнтостатическую активность клеток костного мозга. ТКС и ВКС - культуральная среда, кондиционированная активированными Т- или B-лимфоцитами. Контрольная пролиферация клеток Р815 и L1210 отмечалась на уровне 172000+13000 и 182000±9000 имп/мин соответственно.

Необходимо отметить, что усиление противоопухолевой цитостатической активности клеток костного мозга под действием культуральных супернатантов, полученных от активированных лимфоцитов, не сопровождалось генерацией вдтолитически активных клеток. Как показали проведенные нами исследования, последующее 24-часовое культивирование ККМ совместно с предварительно меченными [3Н]-тимидином клетками Р815 и L1210 не приводило к заметному разрушению опухолевых мишеней.

Взятые вместе, наши результаты позволяют подтвердить ранее сделанное предположение о том, что функциональная активность КЦЭ, также как и костномозговых ECK, может заметно изменяться под влиянием регуляторньгх цитокшюв продуцируемых иммунокомпетентными клетками. Полученные нами результаты позволяют рассматривать ИНФ-у в качестве одного из важных модуляторов функционального состояния КЦЭ.

f. Необходимо подчеркнуть, что наблюдаемые неспецифические противоопухолевые эффекты свежеизолированных клеток костного мозга не являются результатом иммунных реакций, опосредуемых Т-клетками и латентно протекающих in vivo, под влиянием окружающей микрофлоры. Как свидетельствуют результаты нашего исследования, ККМ, полученные от бестимусных мышей : BALB/c, также обладали выраженной противоопухолевой цитостатической активностью, ничем в этом отношении не отличаясь от костномозговых клеток нормальных мышей той же линии. Более того, предварительное культивирование таких клеток, также как и ККМ нормальных мышей, совместно с ТКС значительно усиливало их супрессорные эффекты, оказываемые на пролиферацию опухолевых линий L1210 и Р815. Таким образом, наши результаты свидетельствуют, что противоопухолевая цитостатическая активность клеток костного мозга, по крайней мере, в значительной части, опосредуется КЦЭ, отличными от Т-лимфоцитов.

Влияние незрелых эритроидных клеток на противоопухолевую цитостатическую активность клеток костного мозга и

функциональное состояние перитопеальпых макрофагов. Одной из важных задач настоящего исследования являлось выяснение возможных функциональных взаимосвязей костномозговых цитостатических противоопухолевых эффекторов и незрелых клеток эритроидного происхождения, которые, как было показано в самое последнее время, по-видимому, обладают не только выраженной иммуносупрессорной активностью, но также значительным регуляторным потенциалом (Хептко\> S. V. е( а1., 1996).

60

50 ■

§40 о

й 30 с

U 20

30 -

20 - ШМ

о--Швв.

■

Р815

L1210

| В Среда ПЭКС |

Рнсунок 6. Влияние культуряльной среды, кондиционированной незрелыми эритроидными клетками, на противоопухолевую цитостатическую активность клеток костного мозга. Контрольная пролиферация клеток Р815 и Ь1210 отмечалась на уровне 172000113000 и 182000±9000 имп/мин соответственно.

Ранее полученные экспериментальные данные позволили исключить ЭК из числа возможных претендентов на роль КЦЭ (Самарии Д.М., 1996). Вместе с тем, показанная ранее способность ЭК экспрессировать гены целого ряда регуляторных цитокинов, в том числе ИНФ-у, ТРФ-ß, -а, ИЛ-1, ИЛ-4, ИЛ-6, ГМ-КСФ (Sennikov S.V. et ai, 1996; Walz T.M. ei al., 1996), выдвигает эти клетки на одно из ключевых мест в системе регуляции функционального состояния ККМ, в том числе, костномозговых цитостатических клеток-эффекторов.

Как свидетельствуют результаты наших исследований (рисунок 6), предварительная 20-часовая инкубация клеток свежеизолированного костного мозга в присутствии культурального супернатанта, кондиционированного

высокоочищенными незрелыми эритроидными клетками (ЭКС), вызывала значительное усиление их противоопухолевой цитостатической активности.

Одной из возможных популяций клеток костного мозга, чувствительных к регуляторным влияниям ЭК, предположительно, могут быть костномозговые макрофаги. Их функциональное состояние, как известно, в значительной степени определяется балансом позитивных и негативных регуляторов, прежде всего, ИНФ-у и ТРФ-ß {Ding А.Н. et al., 1988, 1990). С другой стороны, макрофагальные клетки в костном мозге тесно связаны, структурно и функционально, с ЭК, формируя в очагах

кроветворения отчетливо различимые морфологические единицы, т.н. эритроидные островки (Bernard ,/., 1991; Bretongorius J. et al. ¡991; Mohandas N., 1991; Hanspal M., Hanspal J.S., 1994).

В наших исследованиях, мышиные перитонеальные макрофаги были использованы в качестве экспериментальной модели для оценки потенциальной способности незрелых эритроидных клеток модулировать функциональное состояние макрофагов и, в частности, индуцировать, посредством продукции ИНФ-у, процессы синтеза окислов азота. Выбор экспериментальной системы был продиктован многочисленными литературными данными, опубликованным в последние годы, свидетельствовавшими, что процессы активации макрофагов и приобретение ими противоопухолевых, микробицидных и иммуносупрессорных свойств in vivo ассоциируются с продукцией окислов азота (Hibbs J.В., Jr. et al., ¡987; Ding A.H. et al., 1988; James S.L., Glaven J. 1989; Mills C.D., 1991) а оценка уровня их продукции in vitro является высокочувствительным методом определения активности ИНФ-у в биологических жидкостях (Migliormi P. étal., 1991).

Как свидетельствовали результаты предварительно проведенных нами контрольных экспериментов с использованием ТКС, в качестве источника регуляторных цитокинов (позитивный контроль), выбранная экспериментальная система действительно оказалась быстрым, надежным и высокочувствительным способом оценки уровня продукции ИНФ-у эффекторными клетками, что подтверждало ранее сделанные методические рекомендации ряда авторов (Migliorini P., Corradin G., Corradin S.B., 1991).

501 45-

ЛПС -+-++++ анти-ТРФ-|3 - -.-. + + анти-ИНФ-у ----.+ - +

Рисунок 7. Продукция окислов азота перитонеальными макрофагами мышей СВП, индуцированная совместным культивированием с эритроидными клетками. Знаками "+" и "_" отмечалось внесение растворимых добавок, указанных в пояснении к рисунку.

Результаты, представленные на рисунке 7, свидетельствуют о способности незрелых эритроидных клеток индуцировать макрофагальную продукцию окислов азота. Подобное действие эритроидных клеток проявилось отчетливее в присутствии ЛПС и оказалось еще более выраженным при добавлении ЛПС одновременно с моноклональными антителами, нейтрализующими активность ТРФ-р. Важно подчеркнуть, что при одновременном внесении в культуры анти-ИНФ-у моноклональных антител, стимулирующий эффект эритроидных клеток практически полностью отменялся, что проявлялось в резком снижении количества продуцируемых макрофагами окислов азота, и убедительно свидетельствовало о ключевой роли ИНФ-у в качестве медиатора, опосредующего активирующие влияния эритроидных клеток на макрофаги.

Сходные эффекты наблюдались также при инкубации макрофагов в присутствии кульгурального супернатанта, кондиционированного высокоочищенной популяцией незрелых эритроидных клеток.

Таким образом, результаты, полученные в нашей экспериментальной системе, свидетельствуют, что незрелые эритроидные клетки, посредством продукции ИНФ-у, способны индуцировать процессы активации макрофагов. С другой стороны, ТРФ-(5, секретируемый эритроидными клетками, по-видимому, может играть значимую роль в процессах негативной регуляции их функциональной активности. Необходимо подчеркнуть, что наши результаты находятся в полном соответствии с существующими представлениями о роли ИНФ-у и ТРФ-р в процессах регуляции функционального состояния макрофагов. Тем самым, они дают основания для достаточно правдоподобных предположений о существовании тесных функциональных взаимосвязей незрелых эритроидных клеток и костномозговых макрофагов и указывают на возможность участия эритроидных клеток в процессах регуляции противоопухолевой цитостатической активности клеток костного мозга.

Как свидетельствуют полученные нами результаты, популяции костномозговых цитостатических эффекторов и естественных супрессорнных клеток не идентичны по своему клеточному составу. Наши экспериментальные данные также свидетельствуют, что в основе естественной иммуносупрессорной и противоопухолевой цитостатической активности клеток костного мозга лежат различные антипролиферативные механизмы. В полном соответствии с литературными данными, нам удалось показать, что иммуносупрессорное действие свежеизолирванных костномозговых клеток опосредуется, главным образом, продукцией окислов азота. В то же время, как свидетельствуют наши результаты, противоопухолевые цитостатические эффекты клеток костного мозга не связаны с действием N0, продукцией ТРФ-Р или активностью простаглапдина Е2. По нашему мнению, ключевую роль в реализации противоопухолевого цитостатического действия клеток костного мозга играют непосредственные контактные взаимодействия с клетками-мишенями.

Вместе с тем, результаты настоящего исследования, в совокупности с ранее опубликованными данными, указывают, по-видимому, на достаточно ограниченные пространственно-временные рамки функционирования КЦЭ. Представляется, что в динамике опухолевого процесса, активность КЦЭ может иметь наибольшее значение в самые ранние сроки от момента злокачественной трансформации. В частности, многочисленные эксперименты свидетельствуют, что максимально полное

подавление опухолевого роста клетками KM in vitro достигалось лишь при достаточно высоком (в сотни раз) количественном преобладании эффекторных клеток (Seledtsov V.l. et al„ 1995). В то же время, наши экспериментальные данные свидетельствуют о возможности усиления антипролиферативного действия КЦЭ под влиянием растворимых регуляторных факторов, продуцируемых активированными лимфоцитами и незрелыми эритроидными клетками. Наряду с ИЛ-2 (Seledtsov V.l. el ai, 1 1995), важным медиатором, способным регулировать функциональную активность КЦЭ, по-видимому, является ИНФ-у, основным источником которого в пределах костного мозга могут быть незрелые эритроидные клетки. Наши результаты, в совокупности с экспериментальными данными, опубликованными ранее, позволяют также предполагать, что эритроидные клетки, посредством продукции ИНФ-у н ТРФ-ß, а также благодаря возможной продукции других факторов, в том числе ГМ-КСФ (Sennikov S.V. et al., 1996), могут играть значимую роль в регуляции функционального состояния клеток костного мозга, в частности, костномозговых макрофагов и, таким образом, являются реальными претендентами на роль ключевых регуляторов активности КЦЭ.

Возможность усиления противоопухолевой цитостатической активности клеток костного мозга под влиянием цитокинов, прежде всего, продуцируемых Т-лимфоцитами и незрелыми эритроидными клетками, нацеливает нас на поиск новых подходов к профилактике и лечению гемобластозов, основанных на попытках избирательной активации костномозговых цитостатических эффекторов. Одним из таких подходов может быть использование терапевтических воздействий, связанных со стимуляцией эритропоэза. В настоящее время в ИКИ СО РАМН уже накоплен подобный опыт, в частности, при лечении ревматоидного артрита, и перенесете его в гематологическую практику, возможно, является делом недалекого будущего.

ВЫВОДЫ

1. Популяции костномозговых ECK и КЦЭ не идентичны по своему клеточному составу. Несмотря на то, что воздействие лейцил-метилового эфира одновременно отменяло не только естественную супрессорную, но и противоопухолевую цитостатическую активность свежеизолированных клеток костного мозга, первой из этих активностей обладали исключительно АЗП-Р- клетки, а противоопухолевое цитостатическое действие было наиболее выражено у АЗП-Р" фракции ККМ.

2. Естественная иммуиосупрессорная активность свежеизолированных клеток костного мозга опосредуется продукцией окислов азота, т.к. подавление процессов синтеза N0 при помощи L-монометил-аргинина сопровождалось практически полной отменой супрессорного эффекта ККМ в отношении митоген-индуцированной пролиферации селезеночных клеток.

3. Противоопухолевая цитостатическая активности свежеизолированных клеток костного мозга не связана с синтезом N0, не опосредуется продукцией ТРФ-ß и не зависит от активности простагландинов, т.к. подавление пролиферации опухолевых клеток Р815 и L1210 при совместном культивировании с ККМ не сопровождалось аккумуляцией нитритов в культуральных супернатантах и не отменялось ни моноклональными антителами, нейтрализующими ИНФ-у, ни L-монометнл-аргинином. Противоопухолевая цитостатическая активность

свежеизолированных ККМ также не отменялась при добавлении к культурам моноклональных антител, нейтрализующих ТРФ-ß, или индометацина.

4. Непосредственные контактные взаимодействия с клетками-мишенями являются важным условием эффективного торможения опухолевого роста, осуществляемого свежеизолированными клетками костного мозга, т.к. выраженность супрсссорного действия ККМ в отношении пролиферации опухолевых клеток Р815 и LI210 уменьшалась по мере уменьшения плотности распределения клеток в анализируемых совместных культурах.

5. Антипролиферативное действие КЦЭ значительно возрастает под влиянием растворимых регуляторных факторов, продуцируемых лимфоцитами и незрелыми эритроидными клетками. Одним из значимых медиаторов, регулирующих функциональную активность КЦЭ in vitro является ИНФ-у. Противоопухолевая цитостатическая активность ККМ возрастала после 20-часового предварительного культивирования в присутствии культуральных супернатантов, кондиционированных активированными Т-, B-лимфоцитами или ядросодержащими эритроидными клетками. Добавление моноклональных антител, нейтрализующих ИНФ-у, одновременно с культуральными супернатантами, полученными от Т-лимфоцитов, в значительной степени отменяло эффект усиления противоопухолевой цигостатической активности ККМ.

6. Основным источником ИНФ-у в пределах костного .шага могут быть незрелые эритроидные метки, которые, благодаря продукции ИНФ-у и ряда других цитокшюв. в том числе, ТРФ-ß, потенциально способны модулировать функциональное состояние костномозговых эффекторпых клеток, в частности, клеток макрофагального происхождения. Это подтверждается результатами, свидетельствующими о способности незрелых эритроидных клеток, а также полученных от них культуральных супернатантов, индуцировать продукцию окислов азота перитонеальными макрофагами. Продукция окислов азота еще более возрастала при добавлении к макрофатальным культурам бактериального липополисахарнда, а также антител, нейтрализующих активность ТРФ-ß. Вместе с тем, одновременное добавление антител, блокирующих ИНФ-у, приводило к практически полной отмене синтеза N0.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Самарин Д.М., Селедцова Г.В., Селедцов В.И., Тарабан В.Я., Сенников С В., Кащенко Э.А., Козлов В.А. Роль трансформирующего ростового фактора-бета в осуществляемой эритроидными клетками супрессии В-клеточпого б.тастогенеза. // Научный отчет ИКИ СО РАМН, Новосибирск. - 1996. - С. 25.

2. Тарабан В.Я., Селедцова Г.В., Селедцов В.И., Самарин Д.М., Кащенко Э.А., Козлов В.А. Роль интерферона-гамма и трансформирующего ростового фактора-бета в осуществляемой эритроидными клетками регуляции функционального состояния макрофагов.// Научный отчет ИКИ СО РАМН, Новосибирск. - 1996. - С. 25-26.

3. Sennikov S.V., Guskova L.V., Samarin D.M., Seledtsov V.l. Seledtsova G.V., Taraban V.Y., Konevets D.A., Vlasov V.V., Kozlov V.A. The role of transforming

growth factor-beta in erythroid cell-mediated immunosuppression.// Eur. Cytokine Netw. - 1996. - Vol.7, Iss,3. - P. 589.

4.Самарин Д.М., Селедцова Г.В., Селедцов В.И., Тарабан В.Я., Козлов В.А. Супрессорный эффект незрелых эритроидных клеток на В-клеточнуго пролиферацию.//Бюл. экспер. биол. мед. - 1997. - N1. - С. 66-70.

5. Селедцова Г.В., Селедцов В.И., Самарин Д.М., Тарабан В.Я., Сенюков В.В., Кащенко Э.А., Козлов В.А.Роль трансформирующего ростового фактора-бета в опосредуемой эритроидными клетками супрессии В-клеточного бластогенеза.// Бюл. экспер. биол. мед. (в печати).

6. Селедцов В.И., Тарабан В.Я., Селедцова Г.В., Сенюков В.В., Самарин Д.М., Кащенко Э.А., Козлов В.А. Продукция активированными лимфоцитами медиаторов, усиливающих противоопухолевую цитостатическую активность костномозговых клеток.// Бюл. экспер. биол. мед. (в печати).

7. Селедцов В.И., Селедцова Г.В., Тарабан В.Я., Сенюков В.В., Самарин Д.М., Повещенко О.В., Кащенко Э.А., Козлов В.А. Сравнительное исследование противоопухолевой цитостатической и естественной супрессорной активности костномозговых клеток.// Бюл. экспер. биол. мед. (в печати).

8. Seledtsova G.V., Seledtsov V.I., Taraban V.Y., Samarin D.M., Kozlov V.A. A role for interferon-gamma and transforming growth factor-beta in erythroid cellmediated regulation of nitric oxide production.// Immunology (в печати).