Автореферат и диссертация по медицине (14.00.39) на тему:Влияние циклофосфамида и бемитила на антиоксидантный статус и целостность ДНК у больных системной красной волчанкой и ревматоидным артритом

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

^ ^ ИНСТИТУТ РЕВМАТОЛОГИИ ^--

г^ На правах рукописи

♦V

ЛИСИЦЫНА Татьяна Андреевна

ВЛИЯНИЕ ЦИКЛОФОСФАМИДА И БЕМИТИЛА НА АНТИОКСИ-

ДАНТНЫЙ СТАТУС И ЦЕЛОСТНОСТЬ ДНК У БОЛЬНЫХ СИСТЕМНОЙ КРАСНОЙ ВОЛЧАНКОЙ И РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМ

14.00.39- ревматология 14.00.25 -фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва -1997

Работа выполнена в Институте ревматологии РАМН (директор - академик РАМН, профессор В.А. Насонова)

Научные руководители: доктор медицинских наук

профессор М.М. Иванова,

доктор медицинских наук, профессор А.Д. Дурнев.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор Е.Л. Насонов,

доктор медицинских наук Г.Г. Незнамов.

Ведущая организация: Российский государственный медицинский университет.

Зашита состоится " 27" июня_1997 г. в ''13 часов на заседании

Диссертационного совета Д.001.18.01 при Институте ревматологии РАМН (115522, г. Москва, Каширское шоссе, д.34 а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института ревматологии РАМН.

Автореферат разослан 1997 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д.001.18.01 при Институте ревматологии РАМН

кандидат медицинских наук Яковлева Г.И.

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность;

Нарушения в системе антноксндангном защиты и/или чрезмерное усиление эбоднорадикального окисления под влиянием экзогенных н эндогенных факсов приводят к возникновению "окислительного стресса", который рассмпт-вается как важнейшее звено патогенеза различных заболеваний [Ю.А. Влади-ров,1973, 1991 :В. Hallivvell et al., 1992,1995; Byimg Pal Y.U 1994].

Сегодня установлено, что у больных ревматоидным артритом (РА) уснле-интенсивность свободнорадикальных процессов, в частности, увеличено об-зование активных форм кислорода (АФК). и снижена активность систем ан-оксидантнои зашиты, при этом выраженность этих эффектов зависит от ак-вности заболевания [К.Н. Агишева, 1991; Р.И. Микунис и соавт.,1989: О. herak, 1991: P. Eegleton, 1995].

Предложена свободнораднкальная гипотеза системной красной волчанки KB) [ J.Feher et al., 1987]. В ее основу положены представления о генетической герминированностн нарушений лро-/антиоксидантного баланса у больных и тигеннон модификации компонентов ядра за счет свободнораднкальнои ата-

Сегодня в пользу этой гипотезы свидетельствуют новые данные, указы-ющие на повышение образования АФК у больных СКВ и возможность античной модификации ДНК под влиянием АФК с последующей активацией син-за антител к ДНК. возникновение которых рассматривается в качестве ключе-го звена патогенеза заболевания [В.А.Насонова. 1989: A.Casellas et al..1991: J. a et al.. 1992; S. Blount et al.. 1989 ].

У части пациентов с РА и большинства больных СКВ наблюдается иовы-гнныи уровень спонтанного мутирования [I.Emerit et al.. 1 OSO), увеличенная вствнтельность к действию мутагенов in vitro (О.Я. Скшкпни, 1990). Кроме ю. у них наблюдаются также нарушения репарации ДНК ( Г.Д. Часухина. 1984: А. Илюшина и соавт.,1993; P.G. Winyard et al., 1990; B.S. Rosenstein et al.,1992).

С другой стороны, установлено, что АФК являются причиной нарушения параипи и аномально высокого мутирования при состояниях, сопровож-

дующихся развитием "окислительного стресса" [С.Б.Середенин, А.Д.Дурнев, 1992: В. Ames. 1983,1991].

Таким образом, аномально высокое образование АФК может быть обшей причиной, определяющей как нарушение репарации, так и формирование триады. типичном для аутоиммунных заболеваний с нарушениями репарации ДНК: хромосомные повреждения, патологический иммунный ответ и повышенная частота опухолей [J. Feher et al.,1987, Т. Pettersson et al.,1992], что имеет место , в частности, при СКВ.

Последнее позволяет предполагать, что применение фармакологических антиоксидантов может оказывать положительный терапевтический эффект при лечении СКВ и РА, а также препятствовать побочным эффектам иммуносупрес-сора циклофосфамида (ЦФ), опосредованным его прооксидантными свойствами [С.Б.Середенин, А.Д.Дурнев, 1992]. ЦФ применяется в терапии СКВ более 20 лет и имеет существенное значение для лечения нефрита и поражений центральной нервной системы (ЦНС)[М.М. Иванова, >995}.

Существует некоторый позитивный опыт применения витаминов-антиоксидантов при лечении аутоиммунных болезней [В.Н. Бобырев и/со-адт.,1989: Г.С. Козлов и соавт.,1991; О. Scherak, 1991]. Однако, до сих пор не! достаточной ясности в вопросах о клинической эффективности применения ан тиоксидантов, не ясно также могут ли фармакологические средства подобной типа действия предотвращать явление окислительного стресса и генотоксиче ские эффекты у больных СКВ и РА.

Цель работы: Исследовать антиоксидантный статус, целостность и peni рацию ДНК в клетках цельной крови больных системной красной волчанкой ревматоидным артритом и оценить влияние циклофосфамида и бемитила - акт' протектора с антноксидантными свойствами, на указанные показатели и клин ко-лабораторные параметры.

Задачи:

I. Методом люмпнолзависимой хемилюминесценции цельной крови оценить антиоксидантный статус у больных СКВ в группах пациентов, получающих: а) глюкокортикостероиды (ГКС); б) ГКС и ЦФ; в) ГКС и бемитил; г) ГКС, ЦФ и бемитил.

2. Методом люминолзависимой хемклюминесиенцни цельной крови оце-|ть антиоксидантный статус у больных РА в группах пациентов, получающих: "базисным" препарат; б) ЦФ в качестве '"базисного" препарата; в) "базисный"

>епарат и бемитнл; г) ЦФ п бемнтил.

3. У тех же больных оценить уровень ДНК-повреждений и их репарации ггояами ДНК-комет и хроматографии клеточных лизатов на колонках с гнд-жсиапатитом.

4. Сопоставить клинико-лабораторные проявления СКВ и РА с антиокси-1нтным статусом и степенью поврежденности ДНК.

5. Оценить клиническую эффективность терапии СКВ и РА. усовершен-вованную введением в комплекс лечения актопротектора бемнтнла.

Научная новизна работы:

1. Выявлены значительные нарушения антиоксндантного статуса н це-)стности ДНК, а также установлена прямая зависимость между активностью |болевания и интенсивностью процессов АФК-образования, степенью повреж-;нностн ДНК и способностью к репарации ДНК у больных СКВ и РА. что дает :нованпя для исследования механизма развития этих заболеваний с новых по-щип.

2. Впервые исследовано влияние ииклофосфамида н бемитила на ан-юксидантный статус, целостность ДНК, а также ДНК-репарирующую способ-эсть у больных СКВ и РА. Выявлено негативное влияние ииклофосфамида на ¡учаемые показатели и установлено, что бемнтил способен предупреждать и :лаблять побочные эффекты применения этого иммуносупрессора у больных КВ п РА.

3. Показано положительное влияние бемитила на клинико-лабораторные роявления и антиоксидантный статус больных СКВ н РА, что позволяег ис-эльзовать его в качестве дополнительного средства, позволяющего достигнуть элге быстрого снижения активности заболевания и продлить ремиссию.

4. Обоснована целесообразность применения бемитила в комплексе лече-ия больных СКВ н РА и показана его фармакологическая совместимость с сновными группами средств, применяемых для лечения этих больных.

Практическая ценность работы:

1. Обоснована целесообразность применения бемитила в комплексе терапии больных СКВ и РА как средства, влияющего на одно из ключевых звеньев патогенеза этих заболеваний .

2. Выявлена возможность снижения части побочных эффектов циклофос-фамида у больных СКВ и РА с помощью бемитила, а также показано, что с его помощью может быть стабилизирована и, в ряде случаев, снижена поддерживающая доза предннзолона.

3. Определены клинические показания к назначению бемитила больным СКВ и РА:

- высокая активность заболевания и степень вовлеченности систем и органов:

- назначение цпклофосфамида больным;

- частые интеркуррентные инфекции, в том числе - вирусные;

- наличие синдрома хронической усталости или признаков астении.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. У больных СКВ и РА, по сравнению со здоровыми донорами имеет место изменение антиоксидантного статуса с преобладанием прооксидантных проявлений.

2. Цнклофосфамид усугубляет существующие у больных СКВ и РА изменения антиоксидантного статуса.

3. У больных СКВ и РА значительно повышена поврежденность ДНК лимфоцитов периферической крови и снижена способность к ДНК- репарации.

4. На фоне применения бемитила показатели, характеризующие антиокси-дантный статус, ДНК-повреждения и ДНК-репарацию у больных СКВ и РА, приближаются к значениям, установленным у здоровых доноров.

5. Бемнтил может быть использован в качестве эффективного дополнительного средства лечения больных СКВ и РА., а также в качестве фармакологического корректора части побочных эффектов ЦФ.

Публикации и доклады по теме диссертации:

По теме диссертации опубликовано и принято в печать 7 печатных работ (3 статьи и 4 тезисов, в том числе - 1 тезисы за рубежом).

Материалы диссертации представлены в устном докладе на III Российском циональном конгрессе "Человек и лекарство"(Москва, 1996). в виде стенда на Европейской конференции по СКВ (Пиза, Италия. 1996).

Объем и структура диссертации: Диссертация изложена на страницах

(шинописного текста н состоит из введения. 3 глав, обсуждения, выводов. 1актических рекомендаций, приложения, списка литературы, включающего ' ечественных и зарубежных источников. Диссертация иллюстирована 50 блицами. рисунками, 5 клиническими примерами. 3 фотографиями.

Работа выполнена на базе Института ревматологии РАМН (директор ин-итута - академик РАМН, профессор В.А. Насонова).

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ:

Основу данной работы составили результаты обследозання 61 больною <В и 42 больных РА. находившихся на лечении в клинике Института ревмато-гии РАМН с 1993 по 1997 годы.

Все пациенты с СКВ и РА соответствовали диагностическим критериям иериканской Коллегии Ревмагологов.

Больные включались в исследование рандомишровано.

Первую группу составили больные СКВ: вторую - больные РА. В качестве нгрольной группы выступили 26 здоровых доноров. Первая и вторая группы 1ли разделены на 4 подгруппы, в зависимости от варианта проводимой гера-1И. Соответственно: "традиционная" тераппя без ЦФ (I подгруппа), раднционная" терапия с ЦФ ( 2 подгруппа), "традиционная" терапия oei ЦФ. | с бемитилом (3 подгруппа), "традиционная" тераппя с ЦФ н бемнтилом (4 дгруппа).

Вариант течения и степень активности СКВ определялись согласно клас-фикации В.А.Насоновой(1972).

Всего было обследовано 57 женщин II 4 мужчин, больных СКВ.

Возраст обследованных больных колебался от 15 до 55 лет н в среднем ставил 32.3 ± 9.8 года. Средняя длительность заболевания составила 9.2 ± 8.0 да (от 2 мес. до 38 лет).

Распределение больных СКВ в. подгруппах в зависимости ог степени ак-вности и характера течения заболевания представлено в таблице 1.

Во всех подгруппах преобладали больные с умеренной и высокой степенью активности процесса. К моменту начала обследования И степень активности преобладала у больных 1 и 3, а III степень активности СКВ - у пациентов 2 и 4 подгрупп.Высокую активность СКВ у больных к началу наблюдения подтверждает то, что индекс активности шкалы SLEDAI-I во всех подгруппах был выше 15 баллов, а шкалы ECLAM выше 3 баллов.

Таблица I

Характер течения и активность СКВ.

Характер течения 1подгруппа (п=15) абс. % 2 подгруппа (п-15) абс. % 3 подгруппа (п=15) абс. % 4 подгруппа (п=16) абс. % Р

острое 1 7 5 33 6 40 4 25

подострое 5 33 7 47 6 40 5 31

хроническое 9 60 3 20 3 20 7 44

Степень активности

1 минимальная 3 20 0 0 4 27 0 0

II умеренная 8 53 5 33 8 53 6 37,5

III высокая 4 27 10 67 3 20 10 62.5 р2.!=0,03 Ры=0,04

ЗСЕОАИ (М±БО) баллы 23,9+10,6 27,0 ±9,9 23,5 ± 13,9 25,2 + 7,3

Еалм (М±30) баллы 7,0 ±2,4 7,3 ±2,6 7,0 ±2,3 7,2 ±2,6

В I подгруппе преобладали больные с хроническим течением (60"»). во 2. 3 и 4 подгруппах - с подострым и острым течением СКВ.

Клиническая картина болезни на момент начала наблюдения характеризовалась полисиндромностью.

В 1.3 и 4 подгруппах доминировало поражение 1ДНС (мигрень, нарушение структуры сна, ухудшение памяти), а во 2 подгруппе - поражение кожи ( эрите-ма-"бабочка") и почек. Таким образом, 2 и 4 подгруппы оказались наиболее активными по характеру и степени поражения систем и органов, что и послужило основанием к назначению больным этих подгрупп ЦФ.

Большинство больных во всех подгруппах получали кортикостероиды (преднизолон - внутрь в дозе 20 - 30 мг/сут), плаквеннл. Пульс-терапия солю-медролом проводилась во 2 и 4 подгруппах чаще (80"« п. соответственно - 56"").

м в 1(27'!") и 3(20'Х>) подгруппах. Экстракорпоральные методы лечения лазмаферез) использовались для лечения больных 2 подгруппы (в 27% случаев) I подгруппы (в 7% случаев).

Среди больных РА преобладали женщины (90,5% от общего количества >льных). Средний возраст больных РА составил 39,7± 10,3 года и колебался от ! до 55 лет. Давность заболевания в среднем составила Ю,9± 6,1 лет (от 4 мес. ) 31 года).

Степень активности болезни во всех подгруппах была II и III. Причем со -й степенью активности преобладали пациенты в 1 (81,8%) и 3 (54,5%) подгруп-с Ш-й - во 2 (90%) и 4 (80%) подгруппах.

Рентгенологическая стадия заболевания, согласно модифицированной шссифнкаШш О. 51етЬгоскег (1949) была преимущественно 3 и 4 во всех под->уппах.

Большинство больных были серопозитивными по ревматоидному факто-

По количеству воспаленных суставов и длительности утренней скован-эсти лидировали больные 2 и 4 подгруппы.

Системные проявления болезни наблюдались у 100"" больных 4 подгруп-ы. у 80% больных 2 подгруппы, у 72.7% - 1-й и у 63.6";, - 3-й подгруппы.

Почти все больные РА получали малые дозы преднизолона (5-10 мг/сут). ульс-терапия солю-медролом проводилась в основном больным 2-й и 4-й под->упп (40% и 50% соответственно). Больным всех подгрупп в период исследова-ия внутрнсуставно вводились ГКС (кеналог. дипроспан).

Большинство больных (около 50" о) 1. 2 и 3 подгрупп в качестве 5азисного" препарата принимаю плаквенил (0,4-0.6 г/сут). больным 4-й под->уппы плаквенил не назначался (случайная выборка). Другим часто встре-дашимся "базисным" препаратом был тауредон - его принимали 36"с, больных подгруппы н 18"<>- 3 полгруппы.

18"'о больных 1-й и 3-й подгрупп в качестве "базисного" препарата при-имали цнтостатлки (метотрексат 7.5 мг/нед или азатиоприн 50-100 мг/сут).

Наконец. 27"/,> больных 3-й подгруппы проводилась терапия сульфасалази-ном (1-Г.5 г/сут). Из НПВП наиболее часто использовались вольтарен в 1,2 и 3 подгруппах и индометацнн в 4-й подгруппе.

В целом, в начале наблюдения были сопоставимы между собой по полу, возрасту, клинико-лабораторным проявлениям, степени активности, характеру 1ечения и проводимой терапии больные 1-3 и 2-4 подгрупп, как для СКВ, так и для РА.

Все больные трижды подвергались комплексному клинико-лабораторному обследованию. Первый раз - при поступлении на стационарное лечение в Институт ревматологии РАМН, второй раз - через 3 недели, третий раз - через 8 недель с момента первого обследования.

Исследование антиоксидантного статуса выполнялось методом люминол-завнспмой хемилюминесценции цельной крови на хемилюминометре - 1251 фирмы LKB Wallac (Швеция), на базе Российского Государственного Медицинского Университета, в "Лабораторий патогенеза и экспериментальной терапии пневмокониозов" (зав. лабораторией, академик Б.Т.Величковский).

Целостность ДНК определялась методом ДНК-комет (щелочного электрофореза одиночных клеток) на базе Института химической физики РАН, в лаборатории под руководством д.б.н, профессора И.И. Пелевиной.

ДНК-репарируюшую способность клеток периферической крови определяли методом хроматографии клеточных лизатов на колонках с гидроксиапати-том в Институте общей генетики РАН, в лаборатории под руководством д.б.н, профессора Г.Д.Засухнной.

В лаборатории фармакологической генетики НИИ фармакологии РАМН (зав. лабораторией академик РАМН С.Б.Середенин) на различных биологических моделях, включая био.модели аутоиммунных заболеваний, были всесторонне исследованы антиоксидантные и антимутагенные свойства актопротектора бемитила и обоснована возможность его применения в качестве средства терапии аутоиммунных заболеваний. В настоящей работе бемитил назначался пациентам СКВ и РА в 3 и 4 подгруппах по 0,5-0,75 г/сут - 5 дней в неделю в течение 2 месяцев.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Оценка антиоксидантного статуса больных СКВ и РА.

У больных СКВ в начале наблюдения хемилюминесцентный ответ (ХЛ-гвет) цельной крови значительно отличался от такового у здоровых доноров ипичные кривые ХЛ-ответов представлены на рис. I). Несмотря на выра-енные индивидуальные различия, средние значения спонтанного и стимулиро-1нного опсонизированным зимозаном (ОЗ) и форболмиристатацетатом (ФМА) Л-ответа практически во всех подгруппах были статистически значимо выше, ем у здоровых доноров. Время достижения максимума после добавления сти-улов у больных СКВ было значительно выше, чем у здоровых. Кроме того, гимулированный ХЛ-ответ цельной крови на ОЗ был ниже, чем на ФМА, по равнению со здоровыми донорами, что, учитывая разный механизм действия тих стимулов, может быть обусловлено патологией рецепторов, располо-сенных на мембране клеток крови больных СКВ, или тем, что эти рецепторы аблокированы иммунными комплексами.

Интенсивность стимулированного ХЛ-ответа цельной крови больных ЖВ положительно коррелировала с активностью заболевания, острым и юдострым вариантом течения СКВ.

При. оценке антиоксидантного статуса больных РА в начале наблюдения становлено, что как спонтанный, так и активированный ХЛ-ответ больных начительно превышал таковой у здоровых доноров. Время достижения макси-!ума после добавления стимулов у больных РА было больше, чем у здоровых юноров. Интенсивность ответа клеток крови на ОЗ, • в отличии от больных ЖВ, была сравнима с интенсивностью ответ'а на ФМА (рис.2). Необходимо отбить, что повышенная интенсивность ХЛ-ответа в начале наблюдения положительно коррелировала с активностью РА к наличием системных проявлений.

Таким образом, данные, полученные в этой части работы, подтвердили (аличие дисбаланса антиоксидантного статуса с преобладанием прооксидант-шх воздействий у больных СКВ и РА.

3.1.1. Влияние терапии на антиоксидантный статус больных СКВ и РА.

При оценке влияния различных вариантов терапии на антиоксидантный

:татус больных СКВ выявлено, что у пациентов 3 и 4 подгрупп, т.е тех, в ком-члекс лечения которых был введен бемитил, к концу наблюдения антиокси-

дантный статус стал сравним с таковым у здоровых доноров, в отлнчмн от пациентов I и 2 подгрупп. Отдельно необходимо отметить, что на фоне терапии ЦФ (во 2 подгруппе) к концу наблюдения интенсивность активированного ХЛ-отвега значительно увеличивалась (рис.1).

При оценке влияния различных вариантов терапии на антиоксидантныи статус больных РА отмечалась аналогичная ситуация (рис.2).

Таким образом, введение бемптила в комплекс лечения больных СКВ и РА приводит к нормализации ХЛ-ответп цельной крови, а терапия ЦФ усугубляет имеющиеся прооксидантные отклонения.

3.2. Влияние терапии на клинико-лабораторные проявления активности

СКВ и РА.

Оценена динамика ряда клинико-лабораторных проявлений активности СКВ и РА.

Для больных СКВ принималась во внимание динамика 18 клинических, 12 лабораторных показателей п количественные изменения ХЛ-ответа.Чем большее количество показателей к концу наблюдения статистически значимо улучшалось. тем эффективнее считалась проводимая терапия.

Наиболее эффективной терапия была в 4 и 3 подгруппах (табл. 2). В этих подгруппах достоверное улучшение отмечалось по всем 3 группам показателей. Исходя из динамики клинических проявлений СКВ, наиболее эффективной была терапия больных, получавших ЦФ в сочетании (4 подгруппа) и без бемптила (2 подгруппа). Нужно отметить, что во 2 подгруппе значимая положительная динамика была связана с уменьшением проявлений кожного и суставного синдромов. а также экссудатпвного серознта; в 4 подгруппе - с улучшением со стороны ЦНС и почек, отмеченным уже к концу 3 недели наблюдения.

Следует также отметить, 'что наличие бемптила в комплексной терапии больных СКВ 3 и 4 подгрупп приводило к статистически значимому снижению уровня антител к нативноп ДНК. В начале наблюдения уровень антител к ДНК был повышен практически \ всех пациентов. В свою очередь, терапия ЦФ не только не способствовала снижению, но в ряде случаев приводила к увеличению уровня антител к ДНК в первые 6-8 недель терапии, что, скорее всего связано с прооксидантными н ДНК-повреждаюшимп воздействиями ЦФ.

ДИНАМИКА ХЛ-ОТВЕТА ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ БОЛЬНЫХ СКВ НА ЗИМОЗАН

70000

60000 -

Время (минуты)

ДИНАМИКА ХЛ-ОТВЕТА ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ БОЛЬНЫХ СКВ НА ФОРБОЛМИРИСТАТАЦЕТАТ

70000

Ш 5

60000 -

X

ш т ш со о л

I-

о о

X

ш з;

0

1 ш ь

X

50000 -40000 -30000 20000 10000

Время (минуты)

Контроль до лечения 1п/гр ч/з 8 нед -•— 2 п/гр ч/з 8 нед —а— 3 п/гр ч/з 8 нед -х- 4 п/гр ч/з 8 нед

ДИНАМИКА ХЛ-ОТВЕТА ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ БОЛЬНЫХ РА НАЗИМОЗАН

со 5,

К

X Ш

т ш ю о л н о о

X

ш о

X ш IX 5

Время (минуты)

ДИНАМИКА ХЛ-ОТВЕТА ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ БОЛЬНЫХ РА НА ФОРБОЛМИРИСТАТАЦЕТАТ

80000

-Контроль -до лечения - 1п/гр ч/з 8 нед.

т-СОЮГ-ГОЧ-СОШГ^ОЭ-г-СОШ ■ 2 п/гр ч/з 8 нед.

Время (минуты) Рис.2

—а— 3 п/гр ч/з 8 нед -ж-4 п/гр ч/з 8 нед.

Таб. ища 2

Сривиителышя динамика основных /сшнико-жСюрапюрпых показателей активности заболевания в подгруппах вольных СКВ мм) в.шяпием терапии.

1одгруппы больных Эффект терапии Клинические проявления (п= 18) абс. % Лабораторные проявления (п=12) абс. % Показатели ХП-ответа цельной крови (п=10) абс. % Все показатели активности (п=40) абс. %

1 подгруппа ГКС) )=15 улучшение ухудшение без динамики 4 22 0 0 14 78 0 0 0 0 12 100 4 40 1 10 5 50 8 20 1 2.5 31 77.5

1 подгруппа ГКС+ЦФ) 1=15 улучшение ухудшение без динамики 9 50 0 0 9 50 0 0 0 0 12 100 0 0 5 50 5 50 9 22.5 5 12,5 26 65

' подгруппа ГКС+бемитил) 1=15 улучшение ухудшение без динамики 6 33 0 0 12 67 3 25 0 0 9 75 6 60 0 0 4 40 15 37.5 0 0 25 62.5

1 подгруппа ;ГКС+ЦФ+бемитил) 1=16 улучшение ухудшение без динамики 13 72 0 0 5 28 6 50 0 0 6 50 3 30 0 0 7 70 22 55 0 0 18 45

Р улучшение р3_4=0,04 Ри=0,07 р,.14=0,01 Рм=0,005 рм=0,002 р„=0,006

ухудшение Рм.«=0,04

Об эффективности терапии, проводимой в разных подгруппах СКВ. судили также по динамике средних значений индексов активности 5ЬЕПА1-1 и ЕСЬАМ и средней суточной дозы преднизолона (рис.З). Наиболее эффективной оказалась терапия больных, в комплекс лечения которых был введен бемшнл (в 3 и 4 подгруппах): индексы активности у них снижались более значимо, а суточная доза преднизолона оставалась прежней, а в некоторых случаях даже была снижена к концу наблюдения, в то время как в I и 2 подгруппах доза преднизолона неизбежно повышалась для достижения лечебного эффема.

При оценке эффективности терапии в подгруппах больных СКВ было отмечено. что у пациентов 3 и 4 подгрупп к концу наблюдения значительно реже встречались симптомы астении, жалобы на повышенную утомляемость, усталость. Для объективизации влияния различных вариантов терапии на данную симптоматику была прослежена динамика синдрома хронической усталости, оцененного по шкале тяжести усталости (Н58).

В начале наблюдения выраженная усталость была выявлена у 52"" больных СКВ. К концу наблюдения достоверное уменьшение выраженности ус 1 ало

ДИНАМИКА СРЕДНИХ ЗНАЧЕНИЙ ИНДЕКСОВ АКТИВНОСТИ и СРЕДНЕЙ СУТОЧНОЙ ДОЗЫ ПЗ В ПОДГРУППАХ СКВ

1 подгруппа

В начале Через 3 нед. Через 8 нед.

наблюдения

2 подгруппа

В начале Через 3 нед. Через 8 нед.

наблюдения

В начале Через 3 нед. Через 8 нед.

наблюдения

4 подгруппа

5

наблюдения

ШаЫЕЪМА ВЕСЫ\М —»—ДОЗА ПЗ

сти отмечено у больных, в комплекс лечения которых был введен бемитил, в отличии от пациентов 1 и 2 подгрупп.

Оценка терапии, проводимой в подгруппах больных РА, осуществлялась по динамике 4 групп показателей активности: 3 клинических, 11 системных проявлений, 11 лабораторных и показателей ХЛ-ответа (табл. 3).

Таблица 3

Сравнительная динамика основных клипико-лабораторпых показателей активности заболевания в подгруппах больных РА под влиянием терапии.

Подгруппы больных Эффект терапии Клинические показатели (п=3) абс. % Системные проявления (п=11) абс. % Лаборатор -ные проявления (п=11) абс. % Показатели ХЛ-ответа цельной крови (п=10) абс. % Все показатели активности (п=35) абс. %

1 подгруппа "Базисная"терап ия (п=11) улучшение ухудшение без динамики 3 100 0 0 0 0 0 0 0 0 11 100 1 9 0 0 10 91 1 10 1 10 8 80 5 14 1 3 29 83

2 подгруппа ЦФ (п=10) улучшение ухудшение без динамики 3 100 0 0 0 0 0 0 0 0 11 100 0 0 0 0 11 100 2 20 5 50 3 30 5 14 5 14 25 72

3 подгруппа "Базисная'терап ия+ бемитил (п=11) улучшение ухудшение без динамики 3 100 0 0 0 0 0 0 0 0 11 100 5 45 0 0 6 55 5 50 0 0 5 50 13 37 0 0 22 63

4подгруппа ЦФ+ бемитил (п=10) улучшение ухудшение ■без динамики 3 '100 0 0 0 0 1 9 0 0 10 91 3 27 0 0 8 73 4 40 0 0 6 60 11 31 0 0 24 69

Р улучшение Р2-5=0,01

ухудшение Р2.з.«=0,03

Также, как в подгруппах СКВ, наиболее эффективной терапия оказалась в 3 и 4 подгруппах больных РА, где улучшение было отмечено по основным группам показателей. У больных РА, получавших ЦФ (во 2 подгруппе), клинические показатели улучшились, однако было отмечено достоверное увеличение ХЛ-ответа.

Высокая эффективность комплексной терапии, включающей бемитил. подтверждается меньшим количеством побочных эффектов, развившихся в подгруппах больных СКВ и РА. получавших ЦФ или ЦФ в сочетании с бемитилом. Так, побочные эффекты были отмечены у 25% больных СКВ, получавших ЦФ. и

только V 12.5 I» пациентов, леченных ЦФ и бемитилом. В подгруппе больных РА, леченных ЦФ, побочные эффекты развились у 30% больных, и только у 10% - в подгруппе больных, леченных ЦФ и бемитилом.

3.3. Исследование целостности ДНК лимфоцитов периферической крови

больных СКВ и влияния на этот показатель терапии бемитилом.

Определение целостности ДНК лимфоцитов периферической крови было

выполнено в клетках крови 19 больных СКВ из основной группы.

Было продемонстрировано, что ДНК лимфоцитов крови больных СКВ повреждена в большей степени, чем у здоровых доноров. Этот эффект выражался в увеличении собственно фоновой поврежденности ДНК и в достоверном увеличении доли клеток, содержащих поврежденную ДНК. Другим изменением, характеризующим поврежденность ДНК лимфоцитов больных СКВ, является возрастание количества гиподиплондных клеток, появление которых принято интерпретировать как свидетельство программированной гибели клеток - апоп-тоза [В.А. Тронов, И.И.Пелевина, 1996].

Пять человек иэ 19 обследованных пациентов СКВ получали бемитил. Существенных различий в ДНК-поврежденности клеток до и после лечения выявлено не было. Однако, значительно снижалась доля гиподиплондных клеток и их вклад в интегральную поврежденность ДНК. Последнее указывает на перспективу изучения бемитила в качестве средства регуляции апоптоза.

3.4. Исследование ДНК-репарирующвй способности лимфоцитов больных

СКВ и РА и влияния на этот показатель проводимой терапии.

Исследование лимфоцитов периферической крови, проведенное в начале наблюдения у 26 больных СКВ и 12 пациентов с РА, не выявило существенных различий в чувствительности клеток больных СКВ и РА к действию ДНК-повреждаюшего агента. Использованный УФ-миметик - 4-нитрохинолиноксид (4-НХО) вызывал значимое увеличение ДНК-поврежденности у 47% больных СКВ и 42% пациентов с РА. В то же время эти больные существенно различались по способности к репарации ДНК-повреждений. Снижение репарации было выявлено у 74'!» больных СКВ и только у 33% пациентов с РА.

ДИНАМИКА РАЗРЫВОВ ДНК и ИХ РЕПАРАЦИИ В ЛИМФОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ БОЛЬНЫХ СКВ, ПОЛУЧАВШИХ БЕМИТИЛ

ПОРЯДКОВЫЕ НОМЕРА БОЛЬНЫХ

В ДНК-разрывы до лечения 0 ДНК-разрывы после лечения □ ДНК-репарация до лечения В ДНК-репарация после лечения

ДИНАМИКА РАЗРЫВОВ ДНК и ИХ РЕПАРАЦИИ В ЛИМФОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ БОЛЬНЫХ СКВ, ПОЛУЧАВШИХ ЦФ и БЕМИТИЛ

100 „ 90 | 80 е- 70 о 60 5 50 £ 40 * 30 9 20 "" 10 о

0 ДНК-разрывы до лечения 0 ДНК-разрывы после лечения '□ДНК-репарация до лечения □ДНК-ре>1арация после лечения

1 2 3 4 5 6 Л?

ПОРЯДКОВЫЕ НОМЕРА БОЛЬНЫХ

2(1

При этом отмечено, что репарационная активность клеток значительно ниже у больных с хроническим течением СКВ и с максимальной степенью активности заболевания.

На рис 4. представлены данные, полученные при изучении ДНК-: повреждений и репарации у больных СКВ с различными схемами лечения. Установлено. что терапия бемнтилом восстанавливает изначально нарушенную репарацию ДНК и не влияет на количество спонтанных разрывов ДНК в клетках периферической крови больных СКВ. Терапия ЦФ приводит к значительному увеличению количества ДНК-разрывов и не влияет на уровень репарации (она остается сниженной). В результате лечения комбинацией ЦФ и бемитила у больных СКВ происходит активация репарации (меньшая, чем при применении только бемитила) и уменьшается количество разрывов ДНК.

Суммируя материалы выше приведенных разделов, отметим, что результаты комплекса проведенных исследований позволили выявить взаимосвязь между выраженностью основных клинико-лабораторных проявлений СКВ и РА и ан-гиоксндантным статусом больных, увеличение ДНК-поврежденности й снижение репарационной способности. Выявлено положительное влияние бемитила, вводимого в комплекс терапии, на все вышеперечисленные параметры.

Особенно следует отметить, что данные амбулаторного наблюдения больных. леченных бемитнлом в комплексе с поддерживающей терапией, свидетельствуют. что у данной категории пациентов в 2-3 раза удлиняются сроки ремиссии и существенно реже возникают обострения болезни.

В целом, результаты проведенного комплексного клннико-лабораторного и специальных методов исследовании позволяют сделать следующие выводы.

ВЫВОДЫ

1. Методом люминолзависимой хемплюмннесценшш интактных и стнму-ированных клеток цельном крови установлено увеличение образования ак-ивных форм кислорода у больных СКВ и РА (в 2-4 раза) по сравнению со особыми донорами, положительно коррелирующее с характером течения и с.тепе-ью активности СКВ. системными проявлениями и степенью активности РА.

2. Посредством метода ДНК-комет выявлено, что степень поврежденности [НК лимфоцитов периферической крови больных СКВ в 6 раз превышает ана-огичный показатель у здоровых доноров.

3. Снижение ДНК-репарации выявлено у 74 обследованных больных КВ и 33 пациентов с РА. Снижение репарпрующей способности положи-ельно коррелирует с острым течением и высокой степенью активности СКВ и ысокои степенью активности РА.

4. Введение в комплекс терапии больных СКВ и РА бемнтила приближает оказатеди. характеризующие антиоксидантный статус к значениям, выявлен-ым у здоровых доноров, уменьшает ДНК-поврежденность и активирует ДНК-епарацию в клетках обследованных больных.

5. Исследования, проведенные после 3 н 8 недель применения циклофос-1амида показали, что у больных СКВ увеличивается образование активных юрм кислорода и поврежденность ДНК клеток периферической крови. не-ативные явления, а также такие побочные зффекты. как гоиинна. шпопенпи и рнсоединенне интеркуррентной инфекции существенно ниже у пациентов, поучавших циклофосфамид в сочетании с бемитнлом.

6. Эффективность терапии, определяемая по значениям к.тинпко-[абораторных показателей активности (классификация В.А. 'Насоновой. 1LEDA1-1. ECLAM) у больных СКВ. показателям акшвностп у больных РА индекс Рнчи. число воспаленных суставов и пр.). оказалась значимо выше у патентов. в комплекс лечения которых был добавлен бемшп.т.

7. Введение бемнтила в комплекс leparnin больных СКВ пожоляе! тбс-кать повышения, а в некоторых случаях снизить необходимые для получения :лннического эффекта средние суточные дозы предшиолона. а также иро.хтить юстигнутую ремиссию.

8. Показана фармакологическая совместимость бемитила с основными группами средств, применяемых для лечения СКВ и РА, что позволяет использовать его в качестве дополнительного средства в комплексной терапии этих заболеваний.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

1. Бемитил может быть рекомендован для комплексной терапии больных СКВ и РА, как средство, позволяющее достигнуть более быстрого и значимого клинического эффекта и продлить ремиссию.

2. Назначение бемитила особенно показано пациентам:

- с высокой активностью заболевания:

- получающим циклофосфамид;

- с частыми интеркуррентными инфекциями;

- при наличии у них синдрома хронической усталости и признаков

астении:

- с высокой поддерживающей дозой кортикостероидов, прини

маемых внутрь.

3. Метод люминолзависимой хемилюминесценции цельной крови может быть рекомендован в качестве дополнительного лабораторного теста при определении активности СКВ п РА.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Активные формы кислорода н патогенез ревматоидного артрита и системной красной волчанки. II Вестннк Российской Академии Медицинских Наук, 1996, № 12. с. 15-19. - Лисицына Т.А.. Иванова М.М., Дурнев А.Д.

2. Использование антирадикального препарата бемитил в комплексе лечения больных системной красной волчанкой и ревматоидным артритом и оценка его эффективности. //Тез. докладов 111 Российского национального конгресса "Человек и лекарство", Москва, 16-20 апреля 1996 г. с. 154. - Лисицына Т.А.. Ибрагимова Г.А., Иванова М.М., Дурнев А.Д.

. Роль антиоксиданта бемитила в комплексном лечении больных системной расной волчанкой и ревматоидным артритом. // Сборник "Актуальные вопро-ы диагностики и лечения системных заболеваний соединительной ткани", 4осква, 1996, с. 132-133.-Лисицына Т.А., Иванова М.М., Дурнев А.Д. . Evaluation of Bemethyl efïicacy as antiradical drug in treatment of SLE and RA atients. // III Européen Conférence of SLE, 1996, Pisa, Abstracts, p. 60. .Сравнительное исследование ДНК-репарирующей способности лимфоцитов ольных системной красной волчанкой и ревматоидным артритом. // Генетика принята в печать), 1997 - Васильева И.М., Лисицына Т.А., Дурнев А.Д., Ивано-а M.M.-, Засухина Г.Д.

. Исследование поврежденности ДНК мононуклеарных клеток крови больных истемной красной волчанкой методом ДНК-комет. // Бюллетень эксперимен-альной биологии и медицины {принята в печать), 1997 - Лисицына Т. А., Тронов 1.А., Коноплянников М.А., Дурнев А.Д., Иванова М.М.

7. Генерация свободных радикалов кислорода и кластогенез в клетках костного юзга мышей линии MRL/1. // Бюллетень экспер.биол.и мед.-1997, т. 123. -тр.22-25 - Гусева Н.В., Дурнев А.Д., Плесковская Г.Н., Лисицына Т.А., Середе-[ин С.Б., Насонова В.А.