Автореферат и диссертация по медицине (14.00.05) на тему:Оптимизация диагностики, оценки эффективности лечения и прогноза при иммуновоспалительных заболеваниях (ревматоидном артрите, системной красной волчанке, хроническом гломерулонефрите)

На правах рукописи \/Э Ои,

Барышсва Ольга Юрьевна

003464778

Оптимизация диагностики, оценки эффективности лечения и прогноза при иммуновоспалительных заболеваниях (ревматоидном артрите, системной красной волчанке, хроническом гломерулонефрите)

14.00.05 - внутренние болезни

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Петрозаводск - 2009

003464778

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Петрозаводский государственный университет» (ПетрГУ)

Научный консультант Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, доцент Всзнкова Наталья Николаевна

доктор медицинских наук, профессор Шишкин Александр Николаевич

доктор медицинских наук, профессор Коршунов Николай Иванович

доктор медицинских наук, доцент Дуданова Ольга Петровна

Ведущая организация

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Защита состоится « "/^"»"апреля 2009 г. в часов на заседании Диссертационного совета Д 212.190.05 при ГОУ ВПО «Петрозаводский государственный университет» по адресу 185910, г. Петрозаводск, пр. Ленина, д. 33.

С диссертацией можно ознакомиться в медицинской библиотеке ГОУ ВПО «Петрозаводский государственный университет» по адресу 185910, г. Петрозаводск, пр. Ленина, д. 33.

Автореферат разослан » --1Л-

2009 г.

Учений секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, доцент Карапетян Т. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность проблемы

Иммуновоспалительные заболевания представляют собой группу заболеваний, характеризующихся глубокими нарушениями иммунного гомео-стаза, выражающимися в развитии иммунорегуляторного дисбаланса, угнетении супрессорной и увеличении хелперной активности Т-лимфо-цитов (Лф), активации В-Лф, гиперпродукции антител самой различной специфичности и образовании иммунных комплексов. Все заболевания, входящие в эту группу, имеют ряд общих черт, таких как неизвестность этиологии, общность патогенеза, сходство морфологических проявлений, многосистемный характер поражения, хроническое течение с периодами обострения и ремиссии, обострение под влиянием неспецифических воздействий (инфекция, инсоляция, вакцинация и др.), лечебный эффект иммуносупрессивных средств (глюкокортикостероиды, цитоста-тические иммунодепрессанты). Прогноз при заболеваниях данной группы всегда серьезный, а известные варианты терапии не всегда эффективны. В связи с этим продолжаются поиски наиболее оптимальных схем диагностики и лечения заболеваний, а также уточняются факторы риска неблагоприятного течения заболеваний и возможности их коррекции [С. Н. Быковская, 2005; А. В. Караулов, 1999; И. Ю. Короткова, 2007; В. И. Мазуров, 2001, 2005; И. Е. Тареева, 2000].

С этой точки зрения большой интерес представляет изучение активности апоптоза (А) иммунокомпетентных клеток - механизма, который организм использует для освобождения от чужеродных клеток, клеток с дефектным генетическим аппаратом, аутоагрессивных Лф, "отработавших" клеток иммунной системы - и возможности использования для оптимизации диагностики, лечения и оценки прогноза при иммуновос-палительных заболеваниях [Н. Н. Белушкина, 1998; Н. В. Бережков, 1990; М.Ю.Григорьев, 2003; В. Н. Залесский и др., 2001; А.М.Коршунов и др., 1998; В. Е. Кухта и др., 2004].

Внимание к А как возможному механизму развития и поддержания патологического процесса при ревматоидном артрите (РА) обусловлено современными представлениями о патофизиологии и патоморфологии заболевания. При данном заболевании выявлена более низкая апопто-тическая активность синовиальных фибробластов и макрофагов, с чем связана характерная пролиферация синовиальной ткани и развитие паннуса [А. Н. Богданов и др., 2005, 2006; Т. Duffy et al., 2001; P. Emery et al., 1997; K. Itoh et al., 2004; G. S. Panayi et al., 2001; F. Ponchel et al., 2002; O. Slot et al., 2002].

Гораздо меньшее количество работ посвящено изучению активности А иммунокомпетентных клеток, в том числе, Лф, как синовиальных, так и циркулирующих, и факторов, модулирующих их апоптотиче-скую активность [К. М. Багринцева и др., 1998; М. С. Веникова, 1984; Т. О. Волкова и др., 2004]. Имеющиеся данные отражают главным образом иммунологические характеристики программированной клеточной гибели in vitro без учета активности, течения заболевания и проводимой терапии.

В настоящее время фактор некроза оиухоли-а (ФНО-а), являющийся одним из основных участников патогенеза иммуновоспалительных заболеваний, в частности, РА, рассматривается и как регулятор А с разнонаправленными эффектами от апоптотической гибели до стимуляции клеточной пролиферации и дифференцировки. Для интерлей-кина 2 (ИЛ-2) в случае А Лф также документирован как защитный эффект, так способность вызывать А. Результат воздействия данных цито-кинов на клетку зависит от типа рецептора и внутриклеточных механизмов реализации сигнала. Для интерлейкина 6 (ИЛ-6) выявлено отрицательное влияние на активность А синовиальных фибробластов. [А. А. Ярилин, 1996: Т. Duñy et al., 2001; К. Eguchi, 2001; F. Mor, R.Cohen, 1996; H. Perlman, L. J. Pagliari et al„ 2001; G. S. Panayi et al., 2001].

Данные об активности А Лф при системной красной волчанке (СКВ) противоречивы. С одной стороны, СКВ отнесена к заболеваниям с угнетенным А Лф, так как при данном заболевании выявлена усиленая выработка растворимого Fas-рецептора, а также для включения актива-ционного А необходимо на 2 порядка больше клеток-индукторов. Однако, прямые нарушения экспрессии Fas-рецептора и Вс1-2 не обнаруживаются, и in vitro регистрируется усиление А Лф [М. Ю. Григорьев, 2003; Н. Г. Гусева, 2004; W. В. Graninger et al., 2000; A. Rosen et al., 1999; M. Salmon et al., 1999].

Большой интерес представляют данные о роли А в развитии различного рода нефропатий, прогрессирование которых характеризуется клеточной пролиферацией с накоплением внеклеточного матрикса и последующим сморщиванием ткани [Н. Н. Белушкина и др., 1998; Н. В. Бережков, 1990; М. Ю. Григорьев и др., 2003; А. М. Коршунов и др., 1998; В. Е. Кухта и др., 2004; Ю. Б. Перевезеицева, 2001; Ф. Д. Цаликова, 1999; А. А. Ярилин, 1996, 1998; С. В. Thompson, 1995]. Известно также, что циклоспорин и глюкокортикостероиды вызывают А так называемых митоген-активируемых мононуклеаров, причем, эта способность коррелирует с их иммунодепрессивной активностью [10. Б. Перевезищева, 2001; Ф. Д. Цаликова, 1999].

Изучение механизмов регуляции различных этапов А позволяет определенным образом воздействовать на его отдельные этапы с целью их регуляции или коррекции. Через индукцию А осуществляется действие большинства цитотоксических химиопрепаратов, антиметаболитов нуклеиновых кислот, ингибиторов топоизомераз, и результатом воздействия этих препаратов является включение в клетках опухоли программы А. Дальнейшее повышение эффективности терапии заболеваний, в частности иммуносупрессивной терапии, связано с более детальным изучением ее биолошческих основ [Т. А. Астрелина и др., 2002; Е. Б. Владимирская, 2001,2002; Т. О. Волкова и др., 2004,2006].

В связи с выше сказанным представляет большой интерес изучение влияния иммуносупрессивной терапии на активность А Лф и зависимость эффективности иммуносупрессивной терапии от исходной активности АЛф. Не исключается возможность прогнозирования эффективности цитостатических средств на основании полученных результатов. Более детальное исследование влияния иммуносупрессивных препаратов на А может помочь объяснить различную чувствительность пациентов к данным лекарственным средствам [Д. Е. Каратеев, 2003; И. Е. Тареева, 2000; М. В. Робинсон и др., 1991].

Цель исследования

Изучить возможности использования активности апоптоза периферических лимфоцитов для оптимизации диагностики, оценки эффективности лечения и прогноза при заболеваниях иммуновоспалительного генеза - ревматоидном артрите, системной красной волчанке, хроническом гломерулонефрите.

Задачи исследования

1. Изучить активность апоптоза периферических лимфоцитов при различных иммуновоспалительных заболеваниях - ревматоидном артрите, системной красной волчанке, хроническом гломерулонефрите и провести сравнительный анализ.

2. Выявить корреляционные связи между активностью апоптоза лимфоцитов и активностью основных цитокинов (фактора некроза опухоли а, интерлейкина 2, интерлейкина 6) при иммуновоспалительных заболеваниях.

3. Изучить in vitro влияние иммуносупрессивных препаратов (метил-преднизолона, метотрексата, циклофосфамида) на активность апоптоза периферических лимфоцитов при ревматоидном артрите, системной красной волчанке, хроническом гломерулонефрите.

4. Изучить динамику активности апонтоза периферических лимфоцитов на фоне иммуносупрессивной терапии ревматоидного артрита, системной красной волчанки, хронического гломерулонефрита.

5. Определить прогностическую значимость исходной активности апоп-тоза периферических лимфоцитов при ревматоидном артрите, системной красной волчанке, хроническом гломерулонефрите.

6. Определить факторы риска неэффективности иммуносупрессивной терапии при ревматоидном артрите, системной красной волчанке, хроническом гломерулонефрите, а также факторы риска развития люнус-нефрита у больных системной красной волчанкой.

7. Разработать принципы выбора варианта иммуносупрессивной терапии в зависимости от исходной активности апонтоза периферических лимфоцитов.

Научная новизна исследования

В ходе исследования изучена активность А Лф при РА, СКВ и хроническом гломерулонефрите (ХГН). Проведен сравнительный анализ активности АЛф при данных заболеваниях, различающихся патогенетическими механизмами, распространенностью и преимущественной локализацией патологического процесса, выявлены различия в интенсивности А при этих заболеваниях.

Впервые методом флуоресценции определена активность каспаз (К) и степень реализации программированной клеточной гибели в виде разрывов ДНК при иммуновоспалительных заболеваниях со сравнительной оценкой показателей при различных стадиях, длительности течения и активности заболевания, наличия функциональной недостаточности. Обнаружена связь нарушений А периферических Лф с активностью и длительностью течения заболеваний.

Изучена связь между активностью А Лф и активностью ФНО-а, ИЛ-2, ИЛ-6, которые имеют важное значение как в развитии и течении заболеваний, так и в осуществлении процессов программированной клеточной гибели.

Выявлена связь между активностью медь/цинк-зависимой суперок-сидидсмутазы, отражающей активность хронических воспалительных заболеваний и являющейся средством ранней диагностики нефропатии, и активностью А периферических Лф.

Изучено влияние наиболее широко используемых иммуносупрсссив-ных препаратов - метилпреднизолона (Мпн), метотрексата (Mtx) и цик-лофосфана (Цф) - на активность А Лф in vitro, выявлено стимулирующее влияние этих иммуносупрессивных препаратов на процессы А Лф.

В работе впервые исследована динамика интенсивности программированной гибели периферических Лф на фоне проводимого лечения им-муносупрессивными препаратами в течение 2-5 лет. При РА также проанализирована динамика активности А периферических Лф на фоне терапии современным биологическим агентом - инфликсимабом. Выявлено коррелирующее влияние эффективной базисной терапии в отношении ассоциированного с воспалительной активностью изменения активности А.

Впервые оценена возможность использования показателей активности А периферических Лф в качестве прогностических факторов течения иммуновоспалительных заболеваний и эффективности лечения иммуно-супрессивными препаратами.

Теоретическая н научно-практическая значимость работы

Полученные результаты позволяют оценить характер изменений активности А при заболеваниях иммуновоспалительного генеза - РА, СКВ, ХГН. В ходе исследования выявлено, что количество разрывов ДНК и активность каспаз 8, 6, 4, определяемые в динамике методом флуоресценции как показатели интенсивности А, могут быть использованы в комплексе с традиционными клинико-лабораторными данными для оценки активности заболеваний и прогноза.

В работе показана способность иммуносупрессивных препаратов индуцировать программированную гибель периферических Лф. Знание исходной активности А Лф позволяет решить вопрос о варианте иммуно-супрессивной терапии, ее интенсивности, а исследование активности А периферических Лф в динамике может указать на необходимость коррекции проводимой терапии.

Внедрение результатов исследования

Результаты исследования внедрены в практическую деятельность ГУЗ «Республиканская больница им. В. А. Баранова» (Республика Карелия, г. Петрозаводск). Материалы диссертации используются в учебном процессе для студентов и клинических ординаторов на кафедре госпитальной терапии медицинского факультета Петрозаводского государственного университета, а также при повышении квалификации врачей терапевтов, нефрологов и ревматологов Республики Карелия на факультете повышения квалификации медицинских работников Петрозаводского государственного университета.

Апробация результатов исследования

Основные положения диссертации были доложены и обсуждены на Конгрессе ревматологов России (Саратов, 2003), IV съезде ревматологов России (Казань 2005), второй, третьей, четвертой, пятой, шестой, седьмой Северо-западных конференциях по ревматологии (Петрозаводск, 2002; Псков, 2003; Великий Новгород, 2004; Санкт-Петербург, 2005; Петрозаводск, 2006; Вологда, 2007), Республиканских научно-практических конференциях терапевтов (Петрозаводск 2002, 2004, 2006, 2007).

Положения, выносимые на защиту

1. Активность апоитоза периферических лимфоцитов повышена при заболеваниях иммуновоспалительного генеза - ревматоидном артрите, системной красной волчанке, хроническом гломерулонефрите.

2. Интенсивность апоптоза периферических лимфоцитов зависит от активности, давности, системности иммуновоспалительных заболеваний.

3. Интенсивность апоптоза периферических лимфоцитов коррелирует с активностью фактора некроза опухоли-a, интерлейкина 2, интср-лейкина 6, медь/цинк-зависимой супероксиддисмутазы и отражает активность иммуновоспалительных заболеваний.

4. Метилпреднизолон, метотрексат и циклофосфан in vitro оказывают стимулирующее влияние на активность апоптоза периферических лимфоцитов.

5. Эффективная иммуносупрессивная терапия достоверно усиливает апоптоз периферических лимфоцитов при иммуновоспалительных заболеваниях.

6. Активность апоптоза лимфоцитов может быть использована при выборе варианта имуиосупрессивной терапии.

7. Активность апоптоза периферических лимфоцитов наряду с признаками высокой активности заболеваний являются факторами риска неблагоприятного прогноза при иммуновоспалительных заболеваниях.

Публикации и поддержка исследовании

По теме диссертации опубликована 41 печатная работа (из них 8 -в ведущих рецензируемых журналах и изданиях, определенных ВАК).

Диссертационная работа была выполнена в рамках ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2002-2006 годы по мероприятию 1.9 «Проведение молодыми учеными научных исследований по приоритетным направлениям науки, высоких технологий и образования» («Развитие инфраструктуры» IV очередь - Молодые ученые), гос. контракт № 02.442.11.7392,

шифр 2006-РИ-19.0/001/585 «Изучение активности апоптоза лимфоцитов при иммуновоспалительных заболеваниях на модели ревматоидного артрита, системной красной волчанки и хронического гломерулонефри-та», поддержана грантом Президента Российской Федерации для молодых российских ученых и ведущих научных школ Российской Федерации на выполнение научных исследований № МК-1814.2004.7 «Изучение активности программированной клеточной гибели лимфоцитов в дебюте ревматоидного артрита, системной красной волчанки и хронического гломерулонефрита», Программой Росбразования «Университеты России» УР.11.01.009 «Роль программированной клеточной гибели лимфоцитов в патогенезе и лечении ревматоидного артрита».

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 343 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, шести глав собственных наблюдений, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 374 источника, из них 158 отечественных и 216 иностранных работ. Диссертация иллюстрирована 184 рисунками и 75 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В исследование включено 357 человек, из них 172 больных РА, 85 больных СКВ и 75 больных ХГН, 25 здоровых доноров. Все больные на момент включения в исследование обследовались и лечились в ревматологическом или нефрологическом отделении Республиканской больницы (Карелия, г. Петрозаводск), в контрольные сроки - в Республиканской поликлинике, ревматологическом или нефрологическом отделении.

Всем больным РА и СКВ диагноз устанавливался на основании диагностических критериев РА и СКВ Американской коллегии ревматологов. Диагноз ХГН у 40 больных (53,3 %) устанавливался морфологически, у остальных больных на основании характерных для заболевания клинических синдромов.

В ходе исследования у больных РА оценивались параметры суставного синдрома, стадия патологического процесса, степень общей активности, у больных СКВ - вариант течения заболевания, степень активности, наличие поражения почек, почечной недостаточности, у больных

9

ХГН - клинический и морфологический вариант заболевания, степень активности, наличие почечной недостаточности.

Клинические методы исследования

Оценка общего суставного синдрома у больных РА клинически проводилась но следующим параметрам: суставной индекс Ричи (СИР), общий счет болезненных суставов (СБС), общий счет припухших суставов (СПС), утренняя скованность (УС), оценка выраженности боли пациентом с использованием визуальной аналоговой шкалы (ВАШ) в покое и при физической нагрузке, для оценки общей активности заболевания использовался комбинированный индекс Disease Activity Score (DAS4). Для оценки эффективности терапии использовалось динамика индекса DAS 4 согласно рекомендациям EULAR.

При СКВ и ХГН больные исследованы клинически по стандартам осмотра больных терапевтического профиля без использования специальных методов исследования.

У больных СКВ для оценки активности заболевания рассчитывался индекс SLEDAI (Systemic lupus erythematosus disease activity index) по сумме баллов в зависимости от наличия поражения органов и систем. В динамике при уменьшении индекса SLEDAI на 6 баллов констатировалось улучшение, при увеличении на 8 баллов - ухудшение течения заболевания.

Лабораторные методы исследования

Всем больным выполнялся клинический анализ крови, общий анализ мочи, определялся уровень общего белка с помощью прецизионного рефрактометра, белковых фракций с использованием диагностического набора для электрофоретического разделения белков сыворотки крови на агарозе "Cormay gel protein", С-реактивного белка (СРБ) методом иммуноферментного анализа (ИФА), креатинина реакцией Иоффе, мочевины УФ-кинетическим уреазным методом, циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) методом фотометрии. У больных РА и ряда больных СКВ исследовался уровень ревматоидного фактора (РФ) методом ИФА. У больных СКВ дополнительно исследовались антитела к ДНК непрямым твердофазным иммуноферментным методом (ELISA) с использованием тест-систем фирмы "Orgentec" и оценкой на многофункциональном анализаторе Victor II (Pribori Oy, Финляндия), у ряда больных определялся титр антинуклеарного фактора (АНФ) иммуноф-луоресцентным методом. У больных СКВ с наличием нефрита и больных ХГН сульфосалициловым методом исследовалась суточная протеину-

10

рия, рассчитывалась скорость клубочковой фильтрации по формуле Cockoft-Golt.

Определение уровня ИЛ-2, ИЛ-6, ФНО-а, растворимого Fas-лиганда (sFas-L), медь/цинк-зависимой супероксиддисмутазы (Си/7пСОД) проводилось на сенсорном иммуноферментном анализаторе Sunrise (TECAN Austria GmbH) с использованием тест-систем фирмы "Biosourse Europe S.A.", Бельгия при определении ИЛ-2, ИЛ-6, ФНО-а, Cu/ZnC-ОД и тест-системы фирмы "Bender Medsystems", Австрия при определении sFas-L. Минимально определяемыми концентрациями согласно методикам измерений были для ИЛ-2 5,1 пг/мл, для ИЛ-6 2 пг/мл, для ФНО-а 1,7 пг/мл, для sFas-L 0,1 нг/мл, для Си/7пСОД 0,07 нг/мл. Показатели ниже уровня детекции принимались равными 0.

Исследование активности апоитоза периферических лимфоцитов

Выделение периферических Лф производилось из гепаринизирован-ной крови в двойном градиенте плотности фиколл-верографина 1,077 и 1,092 г/мл с первоначальным центрифугированием в течение 40 мин. при скорости 1500 об./мин. с последующим центрифугированием в течение 5 мин. при 400 об./мин. в градиенте перколла 1,060 г/мл.

Определение характера повреждений ДНК (1-й 2-нитевые разрывы,) проводили флуоресцентным методом по изменению параметров флуоресценции двух ДНК-тропных красителей: бромистого этидия ("Sigma", США) и 4', 6-диамидино-2-фенилиндола ("Serva", США) (Иванов, 1992; Анисимов, Болотников, 1999). Измерения проводили на приборе ФМ-Ц-2 (ЛФ ВНИИМП, Россия). Определение активности К проводили флуоресцентным методом с использованием специфических субстратов, меченных флуоресцентной меткой (7-амино-4-трифлуорометилкумарин - AFC) ("BioRad", США). Определение количества отщепленного AFC проводили на СФ=46 (ЛОМО, Россия) при X = 395 нм через 30, 60, 90, 120, 150, 180 мин. после начала реакции.

Инструментальные методы исследования

Всем больным РА проводилась рентгенография суставов кистей и/или стоп для определения стадии заболевания согласно классификации Steinbroker. Всем больным СКВ и ХГН проводилось ультразвуковое исследование почек. Дополнительно к вышеперечисленным методам исследования всем больным выполнялась ЭКГ, по показаниям - рентгенологическое исследование органов грудной полости.

Морфологические методы исследования.

Больным СКВ с поражением почек и больным ХГН выполнялась диагностическая нефробиопсия под контролем УЗИ. У всех больных было получено информированное согласие на проведение данного метода обследования. Полученные кусочки (размером 3—4*3-4 мм) фиксировались в течение суток в 1 % растворе нейтрального формалина с последующей проводкой и заливкой в парафин общепринятым способом, затем срезы окрашивались гематоксилин-эозином, толлуидиновым синим, на фибрин по Вейгерту и проводилась ШИК-реакция с последующей микроскопией полученных препаратов в гистологической лаборатории ГУЗ "Республиканская больница им. В. А. Баранова".

Исследование активности апоптоза периферических лимфоцитов крови in vitro под влиянием метилпреднизолона, метотрексата циклофосфлмида.

У 25 больных РА, 20 больных СКВ и 20 больных ХГН in vitro исследовали влияние иммуносупрессивных препаратов на активность А Лф. Первоначально определяли исходную активность. А Лф. Затем обрабатывали Лф больных, каждая проба в количестве 2x106 Лф, в течение 14 часов в зависимости от заболевания иммуносупрессивными препаратами: при РА - в первой пробе - Мпн (концентрация 100 мкМ), во второй пробе - Mtx (концентрация 10 мкг/мл), в третьей пробе первоначально Мпн, в последущсм Mtx в указанных концентрациях; при СКВ и ХГН - в первой пробе - Мпн (концентрация 100 мкМ), во второй пробе - Цф (концентрация 10 мкг/мл), в третьей пробе первоначально Мпн, в последущем Цф в указанных концентрациях. После окончания времени инкубации во всех пробах повторно определяли активность К и количество разрывов ДНК.

Для подтверждения внекаспазного пути активации А Лф 25 больных РА и 15 больных СКВ в количестве 2x106 инкубировали в присутствии ингибитора К ZVAD. в концентрации 50 мкМ в течение 1 ч при 37 "С с последующей обработкой при PA Mtx в концентрации 10 мкг/мл, при ХГН Цф в концентрации 10 мкг/мл и определением активности К и количества разрывов ДНК.

Статистическая обработка результатов.

Результаты исследования были занесены в таблицу формата Microsoft Excel 2003, затем проводилась статистическая обработка данных при помощи пакета программ Statistica 6.0. Перед началом статистиче-

ской обработки распределения значений количественных признаков были проверены на нормальность. Проведенный анализ показал, что все количественные признаки имеют нормальное распределение. Определялись средние величины [М+т], достоверность различия средних значений в группах по критерию Стыодента (0, по критериям знаков и Манна-Уитни для малых выборок. Наличие достоверных различий между группами обозначено в таблицах знаком * (р<0,05 - *, р<0,01 - **, р<0,001 - ***). Изучена теснота связи (корреляция) между клиническими, лабораторными, инструментальными показателями при помощи коэффициента корреляции Пирсона (коэффициент парной корреляции). Влияние отдельных факторов риска (количественных и качественных) на результаты лечения определяли в регрессионном анализе по величине риска отсутствия улучшения, выражавшемся в отношении шансов. Данный показатель отражает во сколько раз риск невозможности достичь улучшения от проводимой базисной терапии выше у пациента с определенным фактором риска по сравнению с тем, у кого этот фактор не определяется.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Изучение активности апоптоза периферических лимфоцитов при заболеваниях иммуновосналительпого генеза -ревматоидном артрите, системной красной волчанке, хроническом гломерулонефрите

Для решения поставленных целей и задач исследовано 172 больных достоверным РА, 129 женщин (75 %), 43 мужчины (25 %), средний возраст составил 47,4±12,2 лет (19 лет - 71 год), давность заболевания 43,1±19,7 мес (максимально 8 лет), из них давность заболевания до 6 мес включительно имела место у 45 (26,2 %) пациентов, от 6 мес до 1 года - у 62 (36,1 %) от 1 года до 2 лет - у 22 (12,8 %), от 2 до 5 лет -у 18 (10,5%) и более 5 лет - у 25 (14,4%). У 75 больных (43,6 %) на момент включения в исследование заболевание диагностировано впервые. У 150 пациентов (87,2 %) имел место полиартрит, у 22 (12,8 %) -олигоартрит. Серопозитивный вариант РА имел место в 114 случаях (66,3 %), серонегативный - в 58 (33,7 %). I рентгенологическая стадия была диагностирована у 38 пациентов (22,1 %), II - у 48 (27,9 %), III -у 38 (22,1 %), IV - у 14 (8,1%), у 34 (19,8%) не было выявлено патологических изменений на выполненных рентгенограммах. Активность забо-

левания определялась согласно критериям, рекомендованным Ассоциацией ревматологов России (АРР), а также по уровню индекса DAS4 согласно критериям EULAR. Наибольшее количество больных составили пациенты с умеренной (76 пациентов (44,2%) rio критериям АРР и 77 (44,8%) по критериям EULAR) и высокой (59 пациентов (34,3%) но критериям АРР и 58 (33,7%) по критериям EULAR) степенью активности заболевания. У 37 пациентов (21,5%) и по критериям АРР, и по критериям EULAR была констатирована минимальная степень активности патологического процесса. У всех больных имела место функциональная недостаточность различной выраженности - у 51 пациента (29,7 %) I степени, у 62 (36,1 %) - И, у 45 (26,2 %) - III, у 14 (8,0 %) - IV. Системные проявления заболевания отмечены у 105 больных (61,1 %).

В исследование включено 85 больных достоверной СКВ, 76 женщин (89,4%), 9 мужчин (10,6%), средний возраст составил 39,1±14,2 лет (16 лет - 73 года), давность 7,4±6,7 года (максимально 27 лет). У 16 пациентов (18,8 %) СКВ диагностирована впервые. У 4 пациентов (4,7 %) имело место острое течение заболевания, у 65 (76,5 %) - подострое, у 16 (18,8 %) - хроническое. У 20 (23,5 %) больных имела место минимальная активность заболевания, у 34 (40%) - умеренная, у 31 (36,5 %) -высокая. Люпус-нефрит имел место в 38 случаях (44,7 %), в 10 из них (26,3 %) верифицированный морфологически, у 5 больных имела место хроническая почечная недостаточность, у 1 больной - в терминальной стадии, в последующем больная получала терапию хроническим гемодиализом. В меньшем проценте случаев встречался полисерозит (у 22 больных), нейролюпус (у 19 пациентов), антифосфолипидный синдром (у 18 больных). Особое внимание в работе уделено группе больных СКВ с наличием люпус-нефрита.

В исследование включено 75 больных ХГН, 50 мужчин (66,7 %), 25 женщин (33,3 %), средний возраст составил 34,3±14,5 лет (17 лет -63 года), давность 4,6±7,1 года (максимально у 1 больного 36 лет). У 48 больных (64 %) на момент включения в исследование заболевание диагностировано впервые. В исследование были включены больные только с активными вариантами ХГН. У 46 пациентов (61,3 %) имел место нефротический вариант заболевания, у 20 (26,7 %) - смешанный вариант (нефротический синдром, артериальная гипертензия), у 9 (12 %) — нефритический синдром. У 40 больных (53,3 %) выполнялась нефробиоп-сия, по результатам которой у 26 больных (34,7 %) имел место мезангио-пролиферативный вариант заболевания, у 14 (18,6%) - мембранозная нефропатия, у 6 (8 %) - экстраканиллярый гломерулонефрит с иолулу-ниями. У 46 больных (61,3 %) функция почек была сохранена, у 29 (38,7 %)

имела место почечная недостаточность различной степени выраженности -у 14 (18,7%)- I, у 9 (12%) - II, у 6 (8%) - III по классификации С. И. Рябова.

Изучена активность К 8, К 6, К 4 и количество 1- и 2-нитсвых разрывов ДНК в целом в группах больных РА, СКВ и ХГН на момент включения в исследование в сравнении с контрольной группой здоровых доноров. Результаты представлены в таблице 1 и на рисунке 1.

Реализация программированной клеточной гибели Лф в виде 1- и 2-нитевых разрывов ДНК оказалась достоверно выше при всех изучаемых иммуновоспалительпых заболеваниях по сравнению со здоровыми донорами, что представлено на рисунке 1.

2-нитевые разрывы ДНК 1-нитвые разрывы ДНК

ВРА И СКВ В ХГН □ Контрольная группа

* - различия достоверны при сравнении с группой контроля (* - р < 0,05, ** — р < 0,01, ***-р< 0,001)

различия достоверны при сравнении между группами больных с различными заболеваниями (°— р < 0,05)

Рисунок 1 — Количество 1- и 2-нитевых разрывов ДНК при РА, СКВ и ХГН

Процесс А осуществляется посредством последовательной активации каскада К. Активность исследуемых К при изучаемых заболеваниях представлена в таблице 1. К 8 - активатор эффекторных К и эффектор-ная К 6 достоверно более активны при всех изучаемых заболеваниях по

сравнению с контрольной группой. К 4 также имеет достоверно более высокую активность, что наиболее вероятно связано не только с ее участием в процессе А, но и с ее ролью активатора цитокинов.

При сравнении активности А Лф при изучаемых заболеваниях выявлено, что активность К 8 несколько ниже при РА по сравнению с СКВ и ХГН при сравнимых активности К 6, К 4 и количестве разрывов ДНК. Отсутствие значимых различий в активности А Лф при различных им-муновоспалительных заболеваниях позволяет предположить более важную роль активности патологического процесса, а не его распространенности.

Таблица 1.

Активность К 8, К 6, К 4 при РА, СКВ и ХГН

Показатель РА СКВ ХГН Контрольная группа

Активность К 8, мин от начала реакции 30 ' 0,0027+0,0011"°° 0,0032±0,0012*" 0,0034±0,0010" 0,0019±0,0007

60 ' 0,0044±0,0012°° 0,0050±0,0015 0,0052±0,0014 0,0042±0,0011

90 ' 0,0060±0,001Г 0,0067±0,0028 0,0064+0,0015 0,0059±0,0008

120 ' 0,0075±0,0014**° 0,0085±0,0028" 0,0082±0,0022* 0,0069±0,0008

150 ' 0,0093+0,0017"° 0,0110±0,0038" 0,010910,0040* 0,0088±0,0006

180 ' 0,0128±0,0033"*° 0,014410,0054"* 0,0145+0,0064" 0,0098+0,0007

Активность К 6, мин от начала реакции 30 ' 0,0027±0,0012 0,0031±0,0010 0,0028±0,0012 0,0021 ±0,0008

60 ' 0,0045±0,0015 0,0047+0,0014 0,0046±0,0011 0,0047±0,0014

90 ' 0,0061±0,0017" 0,0066±0,0028" 0,0060+0,0014" 0,0058±0,0008

120 ' 0,0074±0,0016" 0,0081±0,0029*"°° 0,0074±0,0019" 0,0068±0,0008

150 ' 0,0094+0,0021" 0,0101 ±0,0032** 0,0098±0,0026* 0,0084±0,0005

180 ' 0,0122±0,0031*" 0,0127±0,0041*" 0,0131+0,0047" 0,0102±0,0008

Активность К 4, мин от начала реакции 30 ' 0,0048±0,0025"* 0,0056±0,0030***°° 0,0048±0,0025"* 0,0024±0,0005

60 ' 0,0131±0,0066*""° 0,0170+0,0083*** 0,0191±0,0057*** 0,0052±0,0009

90 ' 0,0297±0,0383*" 0,0296+0,0172"" 0,0311±0,0126"*° 0,0064±0,0008

120 ' 0,0420±0,0167"* 0,0445±0,0210*"* 0,0474±0,0199*** 0,0074±0,0008

150 ' 0,0594±0,0172*" 0,0621 ±0,0211 *** 0,0616±0,0233*** 0,0088±0,0007

180 ' 0,0813±0,0207*" 0,0725±0,0313"* 0,0805±0,0196*** 0,0096±0,0005

* - различия достоверны при сравнении с группой контроля (* - р < 0,05, ** -р < 0,01, ***-р< 0,001)

различия достоверны ири сравнении между группами больных с различными заболеваниями (° - р < 0,05, 00 - р < 0,01)

В связи с важной ролью Рав-Ь в протекании процессов А проведено сравнение активности изучаемых К и количества разрывов ДНК раздельно у БРаБ-Ь-позитивных и у зРав-Ь-нетапшних больных РА, СКВ,

16

ХГН. Выявлено, что как среди серопозитивных, так и среди серонега-тивных по зРаз-Ь больных, достоверно более высокая активность К 8 и К 6 наблюдается при ХГН, минимальная - при СКВ. Активность К 4 среди серопозитивных по БРаз-Ь больных достоверно более высока у больных СКВ и сравнима при РА и ХГН. Активность К 4 среди серо-негативных по зРаз-!^ больных наименьшая у больных ХГН и сравнима при РА и СКВ. Количество разрывов ДНК у серопозитивных по зИаз-Ь больных при РА, СКВ и ХГН не имеет достоверных различий, тогда как у серонегативных по БРаз-Ь больных отмечается достоверно большее количество 1-нитевых разрывов ДНК при ХГН при их меньшем и сравнимом количестве при РА и СКВ. Полученные данные позволяют предполагать различную долю участия зРаэ-Ь в реализации процессов А при различных иммуновоспалительных заболеваниях.

Проведен анализ зависимости активности А Лф от особенностей заболевания: при РА - ог варианта, активности, длительности, стадии, наличия внесуставных проявлений, наличия и выраженности функциональной недостаточности, при СКВ - от варианта течения, давности, активное™, наличия нефрита.

Выявлена более высокая активность К и количества разрывов ДНК у больных серопозитивным вариантом РА, с высокой активностью заболевания, при наличии внесуставных проявлений заболевания. Убедительных различий в активности изучаемых К и количестве разрывов ДНК при различных рентгенологических стадиях заболевания не отмечено.

Выявлено, что у больных "ранним РА" (давность заболевания не более 6 мес) имеет место более низкая активность К 8 и 6 и меньшее количество разрывов ДНК как по сравнению с больными "неранним РА", так и с группой контроля (результаты представлены на рисунке 2), что может свидетельствовать о депрессии процессов программированной клеточной гибели в дебюте заболевания, что, возможно, и является предрасполагающим фактором для развития РА.

При СКВ выявлена более высокая активность К и количества разрывов ДНК при подостром течении заболевания по сравнению с хроническим течением заболевания. Отмечена более высокая активность К и большее количество разрывов ДНК при высокой активности заболевания по сравнению как с контрольной группой, так и с группами больных с минимальной и умеренной активностью заболевания. При впервые диагностированной СКВ в сравнении с ранее диагностированным заболеванием констатирована достоверно более высокая активность К 8 и К 6 и большее количество 1-нитевых разрывов ДНК при сравнимой активности К 4 и количестве 2-нитевых разрывов ДНК. Активность всех

исследуемых К и количество разрывов ДНК были достоверно выше в обеих исследуемых группах по сравнению с группой контроля.

ы

X

ч

ш о о 3 о.

а 15

35

30

25 20

о

о ¿

о

10

2-нитевые разрывы ДНК 1-нитевые разрывы ДНК

□ "ранний РА" И "неранний РА" ^контрольная группа

*- различия достоверны при сравнении между группами (р<0,05)

Рисунок 2 — Количество разрывов ДНК при РА в зависимости от давности заболевания

Обнаружена более высокая активность А Лф у больных СКВ с поражением почек по сравнению с больными без люпус-нефрита (результаты представлены на рисунке 3).

При РА и СКВ выявлена достоверная прямая зависимость между активностью К 8 и 6 (при РА г=от 0,259 до 0,748, р< от 0,05 до 0,001, при СКВ г=от 0,320 до 0,937, р< от 0,05 до 0,001 ), а также между активностью К 8 и 6 и количеством разрывов ДНК (при РА г=от 0,268 до 0,397, р< от 0,05 до 0,001, при СКВ г=от 0,345 до 0,463, р< от 0,05 до 0,01), что подтверждает последовательную активацию этих К, реализующуюся в конечном итоге в виде разрывов ДНК. Выявлено, что К 4 имеет достоверную отрицательную корреляционную связь с К 8, К 6 (при РА г=от -0,257 до -0,440, р< от 0,05 до 0,01, при СКВ г=от -0,225 до -0,324, р< от 0,05 до 0,01) и количеством разрывов ДНК (при РА г=от -0,226 до -0,395, р< от 0,05 до 0,001, при СКВ г=от -0,310 до -0,679, р< от 0,05 до 0,001), что может свидетельствовать об участии К 4 в ингибировании А.

30

25

Ч 20

15

10

32,88+3

—

6,39+0,51 5^5+0 43

35_ 30,49+2,58

2-нитевые разрывы ДНК 1-нитевые разрывы ДНК

О нефрит + В нефрит

*- различия достоверны при сравнении между группами (р<0,05)

Рисунок 3 - Количество разрывов ДНК при СКВ в зависимости от наличия люпус-нефрита

При РА выявлена достоверная положительная корреляционная связь между активностью К 8 и СПС (г=0,162-0,273, р<0,05), выраженностью боли по ВАШ (г=0,180, р<0,05), длительностью УС (г=0,227-0,231, р<0,05), уровнем СРБ (г=0,163-0,233, р<0,05), у-глобулинов (г=0,237-0,249, р<0,05), РФ (г=0,267, р<0,05), ЦИК (г=0,191-0,278, р<0,05), достоверная положительная корреляционная связь между активностью К 6 и СИР (г=0,227, р<0,05), уровнем СРБ (г=0,168-0,268, р<0,05), у-глобулинов (г=0,262-0,347, р<0,05-0,01), фибриногена (г=0,291-0,309, р<0,05-0,01), РФ (г=0,170-0,303, р<0,05-0,01), ЦИК (г=0,161-0,308, р<0,05-0,01), достоверная положительная корреляционная связь между активностью К 4 и СПС (г=0,167-0,273, р<0,05), СИР (г=0,160-0,243, р<0,05), выраженностью боли по ВАШ (г=0,167, р<0,05), уровнем СРБ (г=0,164-0,290, р<0,05), у-глобулинов (г=0,254-0,305, р<0,05-0,01), фибриногена (г=0,248-0,311, р<0,05-0,01), РФ (г=0,270-0,287, р<0,05), ЦИК (г=0,256-0,306, р<0,05-0,01), достоверная положительная корреляционная связь между количеством разрывов ДНК и всеми изучаемыми показателями клинической активности РА (СБС, г=0,259-0,296, р<0,05, СПС, г=0,244-0,247, р<0,05, СИР, г=0,271-0,162, р<0,05, выраженностью боли по ВАШ, г=0,248-0,268-0,278-0,162,

19

р<0,05, длительностью УС, г=0,256-0,262, р<0,05), а также уровнем СРБ (г=0,255-0,278, р<0,05), у-глобулинов (г=0,236, р<0,05), РФ (г=0,268-0,271 р<0,05), ЦИК (г=0,254-0,308, р<0,01).

При СКВ выявлена достоверная положительная корреляционная связь между активностью К 8 и уровнем антител к ДНК (г=0,236, р<0,05), уровнем ЦИК (г=-0,322, р<0,05), достоверная положительная корреляционная связь между активностью К 6 и уровнем у-глобулинов (г=0,247, р<0,05), ЦИК (г=0,228, р<0,05), достоверная положительная корреляционная связь между активностью К 4 и уровнем СОЭ (г=0,215-0,219, р<0,05), антител к ДНК (г=0,250-0,269, р<0,05), у-глобулинов (г=0,216-0,228, р<0,05), ЦИК (г-0,292-0,371, р<0,05), достоверная положительная корреляционная связь между количеством разрывов ДНК и уровнем СОЭ (г=0,189, р<0,05), антител к ДНК (г=0,251-0,391, р<0,05, 0,001), у-глобулинов (г=0,247, р<0,05), ЦИК (1-0,220, р<0,05), достоверная отрицательная корреляционная связь между активностью всех исследуемых К и количества разрывов ДНК с выраженностью анемии (г= от -0,225 до -0,366, р<0,05, 0,01). Выявлена достоверная корреляционная связь между активностью К 4 и наличием люпус-нефрита (на 30' - г=0,403, р<0,01, на 60' - г=0,391, р<0,05, на 180' - г=0,395, р<0,01).

Полученные корреляционные зависимости подтверждают существование взаимосвязи между активностью патологического процесса и активностью программированной клеточной смерти Лф.

2. Изучение взаимосвязи между активностью апоптоза периферических лимфоцитов и активностью ФНО-а, ИЛ-2, ИЛ-6 при заболеваниях иммуновоспалительпого генеза

Активность ФНО-а определяли у 80 больных РА, 27 больных СКВ и 17 больных ХГН, активность ИЛ-2 - у 44 больных РА, 24 больных СКВ и 15 больных ХГН и активность ИЛ-6 - у 25 больных РА, 20 больных СКВ и 15 больных ХГН на момент включения больных в исследование. Результаты представлены на рисунке 4. При всех заболеваниях выявлено достоверное (р<0,001) повышение активности всех изучаемых цитокинов, при этом достоверно наиболее высокая активность ФНО-а и ИЛ-2 и, в особенности, ИЛ-6 отмечается при РА в сравнении с СКВ и ХГН. Наиболее вероятно, что именно различная активность ФНО-а, ИЛ-2 и ИЛ-6 и определяет особенности протекания процессов А Лф при различных иммуновоспалительных заболеваниях.

При проведении корреляционного анализа при РА выявлена достоверная положительная корреляционная связь между уровнем ИЛ-2 и индексом активности РА БА84 (г=0,400, р<0,05), СПС (г=0,371, р<0,05),

выраженностью боли но ВАШ (г=0,385, р<0,05), длительностью УС (1=0,501, р<0,01), уровнем СОЭ (1=0,384, р<0,05), между уровнем ИЛ-6 и индексом активности РА ОАБ4 (г=0,405, р<0,05), СПС (г=0,411, р<0,01), длительностью УС (1=0,403, р<0,05), уровнем у-глобулинов (1=0,355, р<0,05), между уровнем ФНО-а и индексом активности РА БА84 (г=0,433, р<0,01), СИР (1=0,413, р<0,05), выраженностью боли по ВАШ (1=0,421, р<0,01), уровнем СОЭ (г=0,411, р<0,05), что подтверждает связь между активностью заболевания и активностью изучаемых цитокинов.

□ РА НСКВ ОХГН В Минимально определяемая концентрация ;

*- различия достоверны при сравнении между группами больных с различными заболеваниями (* - р<0,05, *** - р<0,001)

Рисунок 4 - Активность ФНО-а, ИЛ-2 и ИЛ-6 при РА, СКВ и ХГ'Н

При РА также выявлена достоверная положительная корреляционная связь между активностью К 8, К 6, К 4, количеством разрывов ДНК и активностью ИЛ-2 (г=ог 0,294 до 0,389, р<от 0,05 до 0,001), ИЛ-6 (г=от 0,223 до 0,396, р<от 0,05 до 0,001), ФНО-а (г=от 0,300 до 0,399, р<от 0,05 до 0,001), что также подтверждает наличие тесной связи между активностью заболевания и активностью процессов программированной смерти клеток, в том числе периферических Лф.

При обследовании больных РА в динамике выявлена достоверная положительная корреляционная связь между исходной активностью К 8 на 180' и активностью ФНО-а через 6 мес (г=0,416, р<0,01), активностью ИЛ-6 через 6 мес (г=0,369, р<0,05), исходным количеством 1-нитевых

разрывов ДНК и активностью ФНО-а через 6 мес (г=0,316, р<0,05), исходным количеством 2-нитсвых разрывов ДНК и активностью ФНОа через 6 мес (г=0,401, р<0,05), активностью ИЛ-6 через 6 мес (г=0,368, р<0,05). При длительности наблюдения за больными 1 год и более выявлена отрицательная корреляционная связь между исходным количеством 1-нитевых разрывов ДНК и активностью ФНО-а в динамике (г=-0,400, р<0,05), активностью ИЛ-6 в динамике (г=-0,319, р<0,05), исходным количеством 2-нитевых разрывов ДНК и активностью ФНО-а в динамике (г=-0,481, р<0,01).

При динамическом обследовании больных с люпус-нефритом выявлена достоверная отрицательная корреляционная связь между исходной активностью К 8 на 60, 90, 120, 180' и активностью ФНО-а через 2 года (г=-0,580, р<0,05, г=-0,593, р<0,05, г=-0,704, р<0,01, г=-0,528, .р<0,05, г=-0,542, р<0,05 соответственно), между исходной активностью К 6 на 90, 120, 150, 180' и активностью ФНО-а через 2 года (г=-0,682, р<0,01, г=-0,742, р<0,01, г=-0,633, р<0,01, г=-0,658, р<0,01 соответственно), между исходным количеством 1-нитевых разрывов ДНК и активностью ФНО-а через 2 года (г=-0,544, р<0,05) и достоверная положительная корреляционная связь между исходной активностью К 4 на 90, 120, 150, 180' и активностью ФНО-а через 2 года (г=0,634, р<0,01, г=0,599, р<0,01, г=0,547, р<0,05, г=0,513, р<0,05 соответственно). Кроме того, выявлена достоверная отрицательная корреляционная связь между исходной активностью К 8 на 180' и активностью ИЛ-6 через 1 год (г=0,456, р<0,05), исходным количеством 2-нитевых разрывов ДНК и активностью ИЛ-6 через 1 год (г=0,486, р<0,05).

При ХГН выявлена достоверная отрицательная корреляционная связь между исходной активностью К 8 на 30, 60, 90, 120, 180' и активностью ФНО-а через 2 года (г=-0,571, р<0,05, г=-0,581, р<0,05, г=-0,595, р<0,05, г=-0,706, р<0,01, г=-0,529, р<0,05, г=-0,544, р<0,05 соответственно), между исходной активностью К 6 на 90, 120, 150, 180' и активностью ФНО-а через 2 года (г=-0,684, г=-0,741, г=-0,635, г=-0,659, р<0,01 соответственно), между исходным количеством 1-нитевых разрывов ДНК и активностью ФНО-а через 2 года (г=-0,546, р<0,05) и достоверная положительная корреляционная связь между исходной активностью К 4 на 90, 120, 150, 180' и активностью ФНО-а через 2 года (г=0,635, р<0,01, г=0,599, г=0,549, г=0,513, р<0,05 соответственно). Кроме tozo, выявлена достоверная отрицательная корреляционная связь между исходной активностью К 8 на 180' и активностью ИЛ-6 через 2 года (г=0,456, р<0,05), исходным количеством 1-нитевых разрывов ДНК и активностью ИЛ-6 через 2 года (г=0,477, р<0,05).

3. Влияние иммуносупрессивпых препаратов па активность апоптоза периферических лимфоцитов in vitro при илшуповоспалительпых заболеваниях

При проведении клинико-экспериментальной части исследования in vitro выявлено, что при РА в периферических Лф под влиянием только Мпн происходит активация К 8 и К 6, увеличивается количество разрывов ДНК, при этом активность К 4 уменьшается. Под влиянием только Mtx происходит еще более выраженная активация К 8 и К 6, в большей степени увеличивается количество разрывов ДНК и снижается активность К 4 по сравнению с влиянием только Мпн. Наиболее выраженная активация К 8, К 6, увеличение количества разрывов ДНК и снижение активности К 4 наблюдается при сочетанием воздействии Мпн и Mtx на периферические Лф, что может быть связано или с суммацией эффекта, или с различными механизмами активации А клеток под влиянием этих иммуносуирессивных препаратов.

При СКВ и ХГН выявлено, что после обработки Лф только Мпн происходит достоверное повышение активности К 8 и, в несколько меньшей степени, К 6. Воздействие Цф также активирует К, однако, в меньшей степени по сравнению с Мпн. При комбинированном воздействии Мпн и в последующем Цф наблюдается наиболее выраженное и достоверное как по отношению к исходным показателям, так и по отношению к действию только Мпн или только Цф, повышение активности как К 8, так и К 6. Активация К реализуется в увеличении количества разрывов ДНК, как 1-нитевых, так и 2-нитевых, что также наиболее выражено при комбинированном воздействии Мпн и Цф и менее выражено при воздействии этими препаратами по отдельности. Снижение активности К 4 отражает общее противовоспалительное действие, оказываемое Мпн и Цф, и еще раз подтверждает связь между активностью воспалительного процесса и активностью А Лф.

В серии опытов с использованием ингибитора К показано, что активность К 8 и К 6 в присутствии ингибитора К достоверно ниже, чем их исходная активность и активность после воздействия Mtx. При РА активность К 4 в присутствии ингибитора К достоверно ниже исходного уровня и несколько выше активности К 4 после влияния Mtx (р<0,05). При СКВ активность К 4 в присутствии ингибитора К достоверно не отличается ни от исходного уровня, ни от активности К 4 под влиянием Цф. Однако, количество разрывов ДНК, прежде всего 1-нитевых, под влиянием Mtx при РА и Цф при СКВ в присутствии ингибитора К достоверно выше, чем исходный уровень количества разрывов ДНК, а при СКВ выше и чем количество разрывов ДНК после обработки Цф

(р<0,01), что может быть обусловлено существованием альтернативных каспазному путей активации А клеток.

4. Влияние штупосупрессивпых препаратов па активность апоптоза периферических лимфоцитов in vivo при илшуповоспалительпых заболеваниях

Больные после включения в исследование получали разнообразную иммуносупрессивную терапию. Изучена активность А Лф в зависимости от варианта иммуносупрессивной терапии, ее длительности (при РА в течение 6 мес, 1 года, 2 лет, 3 лет, 4 лет, 5 лет и более, при СКВ и ХГН - в течение 1 и 2 лет).

При РА через 6 мес обследовано 172 пациента (100 %), через 1 год -160 (93 %), через 2 года - 150 (87,2%), в интервале через 2-5 лет от начала исследования - 143 (83,1 %) и при длительности наблюдения более 5 лет - 127 (73,8 %). На начало исследования и в течение первых 6 мес 155 пациентов (90,1 % от включенных в исследование больных РА) получали "базисную" терапию, через 1 год - 143 пациента (89,4 %), через 2 года - 133 (88,7 %), в интервале 2-5 лет от начала исследования -126 (88,1 %) и при длительности исследования более 5 лет - 110 больных (86,6 %). Более половины пациентов больных получали "базисную" терапию Mtx (в разные сроки от 56,4% до 60,8%), остальные пациенты получали терапию сульфасалазином (СС) (в разные сроки от 25,5 % до 27,3 %), лефлуномидом (ЛФ) (6 пациентов в течение 2 лет, 1 пациентка в течение 1 года), инфликсимабом (7 пациентов). После включения в исследование 17 больных по различным причинам (отдаленность проживания, наличие противопоказаний, нежелание пациента) не получали адекватной базисной терапии.

Выявлено, что "базисные" препараты оказывают различное влияние на активность А Лф при РА, кроме того направленность влияния зависит от длительности терапии. Так, при длительности терапии в течение 6 мес и СС, и ЛФ, и Mtx оказывают подавляющее действие на активность К 8 и 6. В последующем у СС и ЛФ сохраняется супрессивная активность относительно А Лф, тогда как Mtx оказывает стимулирующее действие на К, что реализуется в увеличении количества 1-нитевых разрывов ДНК. Видимо, различия во влиянии на активность А Лф связаны с различными механизмами действия препаратов и с различной степенью их влияния на активность самого РА, т. к. показано, что у больных, не получавших базисной терапии и у больных, получавших терапию СС и ЛФ отмечается повышение активности К 4, коррелирующей

с активностью патологического процесса в отличие от больных, получавших терапию Mix и имеющих в динамике снижение активности К 4. Разнонаправленные изменения активности показателей А Лф на фоне терапии инфликсимабом могут свидетельствовать об участии не только ФНО-а в регуляции активности процессов А, но и других биологически активных веществ, на которые влияние инфликсимаба не распространяется или распространяется в меньшей степени. Также выявлено, что выраженность и направленность влияния терапии на активность А Лф зависит не только от варианта терапии, но и от наличия ответа на проводимую терапию.

У пациентов, отвечающих на базисную терапию вне зависимости от ее варианта, через 6 мес отмечена достоверно более высокая активность К 8 и К 6 и достоверное большее количество разрывов ДНК (представлено на рисунке 5) при меньшей активности К 4, что, вероятно, обусловлено снижением активности самого заболевания в результате эффективной терапии. Подобная закономерность сохраняется через 1 и 2 года от начала базисной терапии. При более длительном сроке от момента начала базисной терапии достоверной разницы в активности А Лф между пациентами, отвечающими и не отвечающими на терапию, не выявлено.

-32,87+2,56'

30,44+2,67

¿£1

—6г13+0,41

5,75+0,37

•W

0

2-нитевые разрывы ДНК 1-нитевые разрывы ДНК

¡□"неответчики" □ "ответчики

*- различия достоверны при сравнении между группами (*- р<0,05, **-р<0,01)

Рисунок 5 - Количество разрывов ДНК при РА через 6 мес в зависимости от ответа на терапию

Все больные СКВ после включения в исследование получали имму-носупрессивную терапию. Больные с органными поражениями получали преимущественно комбинированную иммуносупрессивную терапию (45 пациентов, 52,9 %) - глюкокортикостероидами (ГКС) (преднизоло-ном (Пн) или Мпн) и цитостатическими иммунодепрессантами Цф или азатиоприном (Аза)), при наличии люпус-нефрита предпочтение отдавалось Цф. Ряд пациентов с хроническим или подострым течением и минимальной активностью заболевания получали монотерапию (16 пациентов, 18,8%) ГКС (9, 10,6%) или аминохинолиновыми производными (Ах) (делагилом - 2,2,3 % или плаквенилом - 5, 5,9%).

Все больные (100%) были обследованы через 1 и 2 года ог момента включения в исследование. Отсутствие эффекта от терапии по динамике индекса БЬЕОАГ было констатировано через 1 год от начала терапии у 8 пациентов (9,4 %), через 2 года - у 9 (10,6 %).

Выявлено, что ГКС как в варианте монотерапии, так и в комбинации с Цф и еще в большей степени с Аза способны активировать процессы АЛф, при этом наибольшую подавляющую активность на К 4 оказывает терапия Цф в комбинации с ГКС. Терапия Ах не оказывает существенного влияния на активность А Лф. Выраженность влияния иммуносупрессивной терапии на активность А Лф зависит не только от ее варианта, но и от наличия эффекта от проводимой терапии.

48 пациентов (64 %) с впервые диагностированным ХГН до включения в исследование терапии, в том числе, иммуносупрессивной терапии, не получали. 27 больных (36 %) ранее получали терапию ингибиторами ангиотензинпревращающего фермента, иммуносупрессивную терапию, из них 10 больных (13,3 %) только Цф, 8 (10,7 %) - только ГКС (Пн или Мпн в средней дозе 0,75 мг/кг веса в сутки), 9(12%)- комбинированную терапию Цф и ГКС, суммарная доза Цф в среднем 8 г. Длительность монотерапии Цф в среднем 1,2±0,4 года при средней достигнутой суммарной дозе 9, 3±3,4 г. ГКС назначались в средней дозе 4560 мг/сут в течение 4-6 недель с последующим постепенным снижением дозы до полной отмены при отсутствии признаков активности заболевания, длительность терапии ГКС составила в среднем 5,2±2,8 мес. При комбинированной иммуносупрессивной терапии Цф назначался или одномоментно с ГКС, или присоединялся позднее при недостаточной эффективности начатой терапии ГКС. Иммуносупрессивная терапия не проводилась пациентам при наличии почечной недостаточности, тяжелой артериальной гипертензии, плохой переносимости Цф, наличии побочных эффектов иммунносупрессивной терапии.

Эффективность терапии оценивалась по купированию нефротиче-ского синдрома, гематурии, нормализации функции почек. Проводимая терапия оказалась неэффективна у 7 пациентов (9,3 %), из них 5 получали комбинированную терапию Пн и Цф, 2 - монотерапию Цф.

Выявлено, что проводимая при ХГН иммуносупрессивная терапия как в варианте монотерапии Цф и, в меньшей степени, Пн, так и в большей степени в варианте комбинации Пн и Цф способна активизировать процессы А Лф. При этом выраженность активирующего влияния зависит как от варианта иммносупрессивной терапии, так и от наличия ответа на проводимую терапию.

5. Прогностическая значимость исследования апоптоза периферических лимфоцитов при иммуповоспалительных заболеваниях

Для уточнения влияния активности А Лф на течение иммуповоспалительных заболеваний, его прогностической значимости проведен корреляционный анализ между показателями активности А Лф и показателями активности изучаемых заболеваний в динамике в контрольные сроки исследования.

При РА через 6 мес от начала исследования выявлена достоверная положительная корреляционная связь между исходными показателями активности А Лф и показателями активности РА в динамике (К 8 на 90' и длительность УС г=0,244, р<0,05, К 6 на 30' и индексом DAS4 г=0,300, р<0,05).

В последующем в более отдаленные сроки от начала исследования (через 1 год и в последующем) выявлена достоверная отрицательная корреляционная связь между показателями исходной активности А Лф и показателями активности РА в динамике. Так, корреляция между количеством 2-нигевых и 1-нитевых разрывов ДНК и индексом DAS4 через 1 год от начала исследования составила г=-0,445, р<0,05 и г=-0,338, р<0,05 соответственно, между СПС и К 8 на 30' - г=-0,278, р<0,05, между СБС и К 8 на 150' - г=-0,229, р<0,05, между СБС и К 6' на 120' - г=-0,243, р<0,05. Отмечены множественные отрицательные корреляционные связи между исходной активностью К 8 и 6, количеством разрывов ДНК и уровнем СРБ в динамике (г= от -0,331 до -0,525 для разных показателей активности А Лф, р<0,05).

При сроке наблюдения за больными в течение 2 лет также сохраняется огрицательная корреляция между исходной активностью К 8 и 6 и активностью РА. Так, корреляция между К 8 на 30' и индексом DAS 4 составила г=-0,354, р<0,05, между К 8 на 60' и индексом DAS 4 - г=-

0,369, р<0,01, между К 8 на 120' и длительностью УС - г=-0,228, р<0,05, между К 6 на 90' и длительностью УС - г=-0,232, р<0,05, между К 6 на 60' и СБС - г=-0,236, р<0,05.

Через 2-5 лет от начала исследования корреляция между исходным количеством 2-нитевых и 1-нитевых разрывов ДНК и индексом DAS4 в динамике составила г=-0,341, р<0,05 и г=-0,346, р<0,05 соответствсн-но. Отмечены отрицательные корреляционные связи между активностью К 8 и К 6 и индексом DAS 4 (г= от -0,300 до -0,425 для разных показателей активности А Лф, р<0,05), активностью К 6 на 180' и длительностью УС (г= -0,398, р<0,05), активностью К 8 на 180' и СБС (г= -0,286, р<0,05), активностью К 6 на 30' и 60' и выраженностью боли по ВАШ (г= -0,419 и р= -0,334 соответственно, р<0,05), количеством 2-и 1-ншевых разрывов ДНК и уровнем СРБ (г= -0,396 и г= -0,391 соответственно, р<0,05).

Таким образом, при сроке наблюдения за больными до 6 мес выявлена прямая зависимость между исходной активностью А Лф и динамикой активности РА. В последующем при более длительном наблюдении за больными в течение 1 года и более отмечается обратная зависимость между исходной активностью А Лф и динамикой активности РА. Следовательно, более высокая исходно активность А Лф может определить менее активное течение заболевания в отдаленные сроки, а исходна супрессия А Лф может являться прогностически неблагоприятным признаком.

Также выявлены достоверные отрицательные корреляционные связи между исходной активностью А Лф и уровнем Нв и эритроцитов в динамике. [г= от -0,240 до -0,383, р< 0,05 или 0,01]. Вероятно, более высокая активность К и более высокая активность РА определяют наличие и выраженность анемии при сроке наблюдения за больными до 6 мес. В последующем по мере подавления активности заболевания и нормализации процессов А Лф анемия ликвидируется.

При проведении корреляционного анализа между исходной активностью А Лф и активностью А Лф в динамике в контрольные сроки при РА выявлены отрицательные корреляционные связи между исходной активностью К 8 и активностью К 8 в динамике (г=от -0,287 до -0,626, р<0,05 или р<0,01), а также К 6 (г=от -0,265 до -0,471, р<0,05 или р<0,01), К 4 (г=от -0,265 до -0,658, р<0,05 или р<0,01) и количеством разрывов ДНК (г=от -0,323 до -0,568, р<0,05 или р<0,01) в динамике. Аналогичная зависимость выявлена между исходной активностью К 6 и активностью К 6 в динамике (г=от -0,269 до -0,595, р<0,05), а также количеством разрывов ДНК в динамике (г=от -0,365 до -0,417, р<0,05).

Выявлена достоверная положительная корреляционная связь между исходной активностью К 4 и активностью К 4 в динамике (г=от 0,247 до 0,652, р<0,05 или р<0,01), при этом отмечена достоверная отрицательная корреляционная связь между исходной активностью К 4 и количеством разрывов ДНК в динамике (г=от -0,277 до -0,568, р<0,05 или р<0,01). Выявлена достоверная отрицательная корреляционная связь между исходным количеством разрывов ДНК и количеством разрывов ДНК в динамике (г=от -0,311 до -0,581, р<0,05 или р<0,01), а также между количеством разрывов ДНК исходно и активностью Кб в динамике через 2 года (г=от -0,303 до -0,471, р<0,05) и активностью К 4 в динамике через 6 мес и 1 год (г=от -0,369 до -0,587, р<0,05 или р<0,01).

Для уточнения выраженности влияния исходной активности А Лф и исходной активности РА на эффективность терапии проведен регрессионный анализ с оценкой риска отсутствия улучшения по критериям ЕиЬАЛ. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Факторы риска отсутствия эффекта на терапию при РА

Фактор риска ОШ Р

DAS4 более 2,4 5,44 0,0079

С-реактивный белок более 96 мг/л 3,23 0,0077

Ревматоидный фактор более 256 МЕ/мл 2,93 0,0099

Фактор некроза опухоли-а более 17 лг/мл 1,82 0,0167

Интерлейкин-6 более 20 лг/мл 1,34 0,0067

СОД более 70 нг/мл 1,27 0,0974

Наличие системных проявлений РА 1,20 0,0346

Наличие совместно сниженной активности К 8 на 180', К 6 на 180', количества 2- и 1-нитевых разрывов ДНК менее М±а в контрольной группе 1,20 0,0467

СОЭ > 45 мм/ч 1,19 0,0332

Повышенная активность К 4 на 180' (менее М±а в контрольной группе) 1,18 0,0445

Сниженное количество 1-нитевых разрывов ДНК (менее М±о в контрольной группе) 1,13 0,0099

Сниженная активность К 8 на 180' (менее М±сг в контрольной группе) 1,07 0,0167

Сниженная активность К 6 на 180' (менее М±а в контрольной группе) 1,06 0,0344

Сниженное количество 2-нитевых разрывов ДНК (менее М±о в контрольной группе) 1,03 0,0267

При СКВ выявлена достоверная отрицательная корреляционная связь между исходной активностью К 8 и К 6 и показателями активности СКВ в динамике. Так, коэффициент корреляции между исходной активностью

29

К 8 на 120 и 180' и уровнем СОЭ через 1 год от начала исследования составил -0,353 и -0,363 соответственно (р<0,05), между исходной активностью К 6 на 30' и уровнем ЦИК через 1 год - г=-0,360, р<0,05, исходной активностью К 6 на 60' и уровнем антител к ДНК через 1 год -г=-0,340, р<0,05. Выявлена достоверная положительная корреляционная связь между исходной активностью К 8 и К 6 и количеством эритроцитов и лейкоцитов в динамике (г= от 0,308 до 0,375, р<0,05). Выявлена достоверная положительная корреляционная связь между исходной активностью К 4 и уровнем АНФ и антител к ДНК через 1 год (г=0,393 и 0,392 соответственно, р<0,05), достоверная отрицательная корреляционная связь между исходной активностью К 4 на 120 и 180' и количеством лейкоцитов через 1 год (г=-0,362 и -0,353 соответственно, р<0,05). Выявлена достоверная отрицательная корреляционная связь между исходным количеством 1-нитевых разрывов ДНК и индексом SLEDAY и уровнем антител к ДНК через 1 год (г=-0,379 и -0,358 соответственно, р<0,05), достоверная положительная корреляционная связь между исходным количеством 2-нитевых разрывов ДНК и уровнем лейкоцитов через I год (г=0,367, р<0,05). Выявлена достоверная положительная корреляционная связь между таким показателем активности волчаноч-ного нефрита как суточная протеинурия через 1 год и исходным уровнем К 4 на 120 и 180' (г=0,330, р<0,05 и г=0,460, р<0,01 соответственно) и достоверная отрицательная корреляционная связь между выраженностью суточной протеинурии через 1 год и исходным количеством 2-нитевых разрывов ДНК (г=-0,350, р<0,05), уровнем СКФ через 1 год и количеством 2-нитевых разрывов ДНК (г=-0,360, р<0,05), уровнем СКФ через 1 год и исходной активностью К 4 (г=-0,370, р<0,05).

Отмечена достоверная корреляционная связь между исходной активностью К 8 и уровнем антител к ДНК, выраженностью суточной протеинурии, СКФ через 2 года (г=-0,453, -0,390, -0,407 соответственно, р<0,05), исходной активностью К 6 и уровнем АНФ, антител к ДНК и СКФ через 2 года (г=-0,396, -0,418, -0,399 соответственно, р<0,05), исходной активностью К 4 и индексом SLEDAY, уровнем Нв, лейкоцитов, СОЭ, антител к ДНК, суточной протеинурии (г=0,353, -0,390, -0,391, -0,389, 0,573, 0,411 соответственно, р<0,05 или р<0,01) через 2 года, исходным количеством 2-нитевых разрывов ДНК и уровнем антител к ДНК и СКФ через 2 года (г=-0,462 и -0,456 соответственно, р<0,05), исходным количеством 1-нитевых разрывов ДНК и уровнем СОЭ через 2 года (г=-0,393, р<0,05).

При СКВ выявлены множественные значимые достоверные связи между исходной активностью К 8 и активностью К 8 в динамике, ис-

ходной активностью К 8 и активностью К 6 в динамике, исходной активностью К 6 и активностью К 6 в динамике, исходной активностью К 6 и активностью К 8 в динамике, исходной активностью К 4 и активностью К 4 в динамике (г= от 0,302 до 0,961, р от <0,01 до <0,001), между исходной активностью К 8 и К 6 и количеством 1-й 2-нитевых разрывов ДНК в динамике (г= от 0,317 до 0,510, р<0,05 или <0,01), между исходным количеством 1- и 2-нитевых разрывов ДНК и активностью К 8, 6 в динамике (г= от 0,316 до 0,463, р<0,05), исходным количеством разрывов ДНК и активностью К 4 в динамике (г= от -0,310 до -0,397, р<0,05), исходным количеством разрывов ДНК и количеством разрывов ДНК в динамике (г= от 0,375 до 0,697, р от <0,01 до 0,001).

В течение всего времени наблюдения за больными у 8 пациентов, не имевших люпус-нефрита в дебюте заболевания, диагностировано его развитие. При анализе частоты развития люпус-нефрита в группах больных с разной активностью А Лф на момент включения больных в исследование выявлено, что у 7 пациентов из этой группы исходно отмечалась сниженная относительно контрольной группы активность А Лф и лишь у 1 пациента исходно активность А Лф была повышена (различие достоверно, р=0,00362). Полученные результаты еще раз подтверждают негативную роль депрессии А Лф в дебюте заболевания.

Извес тно, что высокая концентрация Си/7.пСОД в биологических жидкостях организма имеет диагностическую ценность для измерения активности различных болезней, в том числе нефропатии, является средством ранней диагностики нефропатии, а также контроля лечения хронического воспаления. В группах больных с развившимся люпус-нефритом и при его отсутствии как в дебюте СКВ, так и в дальнейшем (количество больных 15 человек), проанализирована исходная активность Си/2пСОД. Выявлено, что уровень СаО^пСОД на момент включения больных в исследование был достоверно выше у больных, у которых при динамическом наблюдении был диагностирован люпус-нефрит по сравнению с больными без поражения почек (102,1±9,15 уб 54,0±12,7 иг/мл, р<0,01).

Для уточнения выраженности влияния исходной активности А Лф и исходной активности СКВ на эффективность терапии проведен регрессионный анализ с оценкой риска отсутствия улучшения по динамике индекса БЬЕЭАУ. Полученные результаты представлены в таблице 3.

Также проведен регрессионный анализ с оценкой риска развития вол-чаночного нефрита, результаты представлены в таблице 4. Повышенный риск развития волчаночного нефрита имеют больные с высокой активностью СКВ в дебюте заболевания и сниженной активностью А Лф.

Таблица 3.

Факторы риска отсутствия эффекта на терапию при СКВ

Фактор риска ОШ Р

SLEDAY более 12 баллов 3,41 0,0090

Антитела к ДНК более 80 МЕ/мл 2,13 0,0082

Фактор некроза опухоли-ct более 8,5 пг/мл 1,78 0,0377

Наличие волчаночного нефрита в дебюте 1,33 0,0461

Выполнение нефробиопсии через 6 мес и более от дебюта нефритического мочевого осадка 1,31 0,0099

Наличие совместно сниженной активности К 8 на 180', Кб на 180', количества 2- и 1-нитевых разрывов ДНК менее М±а в контрольной группе 1,28 0,0267

СОЭ > 40 мм/ч 1,27 0,0333

Наличие гематурии в дебюте 1,26 0,0167

Повышенная активность К 4 на 180' (менее М±а в контрольной группе) 1,25 0,0433

Сниженное количество 2-нитевых разрывов ДНК (менее М±а в контрольной группе) 1,23 0,0330

Сниженная активность К 8 на 180' (менее М±о в контрольной группе) 1,17 0,0167

Сниженная активность К 6 на 180' (менее М±а в контрольной группе) 1,16 0,0440

Сниженное количество 1-нитевых разрывов ДНК (менее М±а в контрольной группе) 1,09 0,0167

При ХГН выявлена достоверная корреляционная связь между активностью К 8 и К 6 и критериями активности ХГН в динамике. Так, коэффициент корреляции между исходной активностью К 8 на 180' и уровнем СОЭ через 1 год от начала исследования составил -0,495, р<0,05, между исходной активностью К 6 на 90' и уровнем у-глобулинов через 1 год - г—0,498, р<0,05. Выявлена достоверная положительная корреляционная связь между исходной активностью К 6 на 150' и 180' и количеством эритроцитов в динамике через 1 год (г= от 0,503 до 0,544, р<0,05). Выявлена достоверная положительная корреляционная связь между исходной активностью К 4 на 180' и уровнем СОЭ через 1 год (г-0,593, р<0,05), достоверная отрицательная корреляционная связь между исходной активностью К 4 на 120' и 180' и количеством эритроцитов через 1 год (г=-0,492 и -0,473 соответственно, р<0,05). Выявлена досто-

верная отрицательная корреляционная связь между исходным количеством 1-нитевых разрывов ДНК и уровнем СОЭ через 1 год (г=-0,497, р<0,05), достоверная положительная корреляционная связь между исходным количеством 2-нитевых разрывов ДНК и уровнем эритроцитов через 1 год (г=0,486, р<0,05). Выявлена достоверная положительная корреляционная связь между выраженностью суточной протеинурии через 1 год и исходным уровнем К 4 на 150' и 180' (г=0,530, р<0,05 и г=0,560, р<0,01 соответственно) и достоверная отрицательная корреляционная связь между выраженностью суточной протеинурии через 1 год и исходным количеством 2-нитевых разрывов ДНК (г=-0,532, р<0,05), уровнем СКФ через 1 год и количеством 2-нитевых разрывов ДНК (г=-0,536, р<0,05), уровнем СКФ через 1 год и исходной активностью К 4 (г=-0,472, р<0,05).

Таблица 4.

Факторы риска развитии волчаночного нефрита при СКВ

Фактор риска ОШ Р

SLEDAY более 12 баллов 4,56 0,0013

Антитела к ДНК более 80 МЕ/мл 4,03 0,0367

СОД более 70 нг/мл 3,25 0,0555

Фактор некроза опухоли-a более 8,5 пг/мл 2,63 0,0171

Наличие совместно сниженной активности К 8 на 180', К 6 на 180', количества 2- и 1-нитевых разрывов ДНК менее М±а в контрольной группе 2,20 0,0067

Повышенная активность К 4 на 180' (менее М±ст в контрольной группе) 1,18 0,0289

Сниженное количество 2-нитевых разрывов ДНК (менее М±а в контрольной группе) 1,13 0,0267

Сниженное количество 1-нитевых разрывов ДНК (менее М±а в контрольной группе) 1,09 0,0344

Сниженная активность К 8 на 180' (менее М±а в контрольной группе) 1,07 0,0467

Сниженная активность К 6 на 180' (менее М±а в контрольной группе) 1,06 0,0444

Отмечена достоверная отрицательная корреляционная связь между исходной активностью К 8 на 30' и 180' и уровнем СОЭ через 2 года (г=-0,518 и -0,517 соответственно, р<0,05), исходной активностью К 6 на 30' и уровнем у-глобулинов через 2 года (г=-0,506, р<0,05), исходной активностью К 4 на 180' и количеством эритроцитов и уровнем НЬ (г=-0,634, р<0,01 и -0,606, р<0,05 соответственно), исходной активно-

33

стыо К 4 на 180' и уровнем СКФ через 2 года (г=-0,647, р<0,01), исходным количеством 1-нитевых разрывов ДНК и выраженностью суточной протеинурии, уровнем СКФ через 2 года (г=-0,533 и -0,539 соответственно, р<0,05). Выявлена достоверная положительная корреляционная связь между исходной активностью К 4 на 120' и уровнем у-глобулииов через 2 года (г=0,497, р<0,05), исходной активностью К 4 на 180' и выраженностью суточной протеинурии через 2 года (г=0,519, р<0,05).

Выявлены множественные значимые достоверные связи между исходной активностью К 8 и активностью К 8 в динамике, исходной активностью К 8 и активностью К 6 в динамике, исходной активностью К 6 и активностью К 6 в динамике, исходной активностью К 6 и активностью К 8 в динамике, исходной активностью К 4 и активностью К 4 в динамике (г= от 0,475 до 0,760, р от <0,05 до <0,001), между исходной активностью К 8 и К 6 и количеством 1- и 2-нитевых разрывов ДНК в динамике (г= от 0,491 до 0,656, р<0,05 или <0,01), между исходным количеством 1- и 2-нитевых разрывов ДНК и активностью К 8, 6 в динамике (г= от 0,499 до 0,591, р<0,05), исходным количеством разрывов ДНК и активностью К 4 в динамике (г= от -0,485 до -0,560, р<0,05), исходным количеством разрывов ДНК и количеством разрывов ДНК в динамике через 2 года (г= 0,507 - 0,580, р <0,05).

Для уточнения выраженности влияния исходной активности А Лф и исходной активности ХГН на эффективность терапии проведен регрессионный анализ с оценкой риска отсутствия улучшения по динамике суточной протеинурии и уровня скорости клубочковой фильтрации. Полученные результаты представлены в таблице 5.

Согласно полученным результатам, на эффективность терапии имму-новоспалительных заболеваний (РА, СКВ, ХГН) в большей степени оказывает влияние активность самого заболевания, однако снижение исходной активности А Лф также вносит свой негативный вклад в достижение эффекта от терапии, а, следовательно, и в прогноз для больных.

Современный уровень развития медицины требует индивидуального подхода к диагностике, лечению заболеваний и оценке прогноза. При иммуновоспалительных заболеваниях, таких, как РА, СКВ, ХГН, часто встречающихся в клинике внутренних болезней, эта проблема еще не решена в той мере, которая удовлетворяла бы врачей. Очевидно, что необходимо продолжить поиски новых способов решения этой задачи, что позволило бы повысить эффективность лечения и улучшить прогноз при этих серьезных заболеваниях.

Таблица 5.

Факторы риска отсутствия эффекта на терапию при ХГН

Фактор риска ОШ Р

СКФ < 70 мл/мин в дебюте заболевания 2,45 0,0098

Наличие гематурии в дебюте заболевания 2,33 0,0199

СОЭ > 40 мм/ч 2,01 0,0123

Наличие совместно сниженной активности К 8 на 180', К 6 на 180', количества 2-и 1-нитевых разрывов ДНК менее М±о в контрольной группе 1,33 0,0198

Повышенная активность К 4 на 180' (менее М±а в контрольной группе) 1,24 0,0345

Фактор некроза опухоли-а более 8,5 лг/мл 1,22 0,0435

Сниженное количество 2-нитевых разрывов ДНК (менее М±о в контрольной группе) 1,19 0,0237

Сниженная активность К 8 на 180' (менее М+ст в контрольной группе) 1,16 0,0267

Сниженная активность К 6 на 180' (менее М±а в контрольной группе) 1,15 0,0244

Сниженное количество 1-нитевых разрывов ДНК (менее М±а в контрольной группе) 1,11 0,0099

ВЫВОДЫ

1. Определение активности апоптоза периферических лимфоцитов у больных иммуновоспалительными заболеваниями - ревматоидным артритом, системной красной волчанкой, хроническим гломерулонеф-ритом - имеет важное значение для диагностики, оценки эффективности терапии и прогноза.

2. При ревматоидном артрите, системной красной волчанке, хроническом гломерулонефрите имеет место более интенсивный апоптоз лимфоцитов периферической крови по сравнению со здоровыми донорами, при этом степень активизации коррелирует с показателями активности заболеваний.

3. Повышенная продукция фактора некроза опухоли-а, интерлейки-на 2, интерлейкина 6, растворимого Рав-лиганда, медь-цинк-зависимой сунероксиддисмутазы оказывает стимулирующее влияние на активность апоптоза периферических лимфоцитов.

4. Активность аиогггоза периферических лимфоцитов снижена у больных "ранним" ревматоидным артритом и не зависит от давности систем-

ной красной волчанки и хронического гломерулонефрита и повышена у больных системной красной волчанкой с наличием люпус-нефрита в сравнении с больными без поражения почек.

5. Метотрексат, циклофосфамид и метилпреднизолон in vitro активируют апоптоз периферических лимфоцитов.

6. Эффективная иммуносупрессивная терапия способна корригировать имеющиеся изменения активности апоптоза периферических лимфоцитов.

7. Исследование активности апоптоза периферических лимфоцитов позволяет прогнозировать эффект назначаемой базисной терапии у больных иммуновоспалительными заболеваниями.

8. Снижение исходной активности апоптоза периферических лимфоцитов является фактором риска недостаточного ответа на терапию при иммуновоспалительных заболеваниях (ревматоидном нефрите, системной красной волчанке, хроническом гломерулонефрите), а также фактором риска развития волчаночного нефрита.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Определение реализации апоптоза периферических лимфоцитов в виде количества разрывов ДНК в сочетании с исследованием активности каспаз 8, 6, 4 методом флуоресценции может быть использовано для оценки активности иммуновоспалительных заболеваний (ревматоидного артрита, системной красной волчанки, хронического гломерулонефрита), а также прогноза и эффективности терапии в дополнение к традиционным клинико-лабораторным данным.

2. Наличие исходно сниженной активности апоптоза периферических лимфоцитов при ревматоидном артрите также, как и высокая степень активности заболевания, повышение уровня фактора некроза опухоли-а, интерлейкина-6, медь/цинк-зависимой супероксиддисмутазы являются показаниями для активизации терапии.

3. При исходно сниженной активности апоптоза периферических лимфоцитов при ревматоидном артрите препаратом выбора является метотрексат, но не сульфасалазин и лефлюномид.

4. Наличие исходно сниженной активности апоптоза периферических лимфоцитов при системной красной волчанке, также, как и высокая степень активности заболевания, повышение уровня фактора некроза опухоли-а, наличие волчаночного нефрита в дебюте, гематурии, является показанием для более активной иммуносупрессивной терапии, пред-

почтительна комбинация глюкокортикостероидов и цитостатических иммунодепрессантов.

5. Определение уровня медь/цинк-зависиой сунероксиддисмутазы, фактор некроза опухоли-а показано больным системной красной волчанкой для уточнения риска развития волчаночного нефрита.

6. Наличие исходно сниженной активности апогггоза периферических лимфоцитов при хроническом гломерулонефрите также, как и гематурии в дебюте, ускорения СОЭ, повышения уровня фактора некроза опухоли-а, является показанием для более активной иммуносупрессивной терапии, предпочтительна комбинация глюкокортикостероидов и цитостатических иммунодспрессантов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Варга О. Ю. Игнатьев В. К., Везикова Н. Н., Марусепко И. М. Роль апоптоза лимфоцитов в патогенезе ревматоидного артрита // Материалы II Северо-Западной научно-практической конференции по ревматологии, Петрозаводск, 2002. - С. 16-18.

2. ХейфецЛ.М., Варга 0.10. Нарушения липидного обмена при хроническом гломерулонефрите // Сборник трудов X ежегодного Санкт-Петербургского нефрологического семинара, Санкт-Петербург, 2002. -С. 216-219.

3. Варга О. Ю. Игнатьев В. К., Везикова Н. Н., Марусенко И. М. Апоптоз лимфоцитов при ревматоидном артрите // Научно-практическая ревматология. - 2002. - №4. - С. 80.

4. Варга О. Ю. Игнатьев В. К., Везикова Н. Н., Марусенко И. М. Активность программированной клеточной гибели лимфоцитов при раннем ревматоидном артрите // Актуальные проблемы современной ревматологии. Сборник научных работ, Волгоград, 2002. - С. 25-26.

5. Везикова Н. Н., Игнатьев В. К., Марусенко И. М., Варга О. Ю. Распространенность ревматоидного артрита и остеоартроза в Республике Карелия // Научно-практическая ревматология. - 2003. - № 2. - С. 85-86.

6. Варга О. Ю., Игнатьев В. К., Везикова Н. Н., Марусенко И. М., Волкова Т. О. Программированная клеточная гибель лимфоцитов при раннем ревматоидном аргрите // Научно-практическая ревматология. Приложение к № 2 2003 г. Тезисы Конгресса ревматологов России, Саратов, 2003.- С. 21. ,

7. Хейфец JI. М., Варга О. Ю., Стратегопуло В. А., Лютая Е. А., Рач-кова Л. М. Выраженность системного остеопороза у больных хроническим гломерулонефритом в додиализном периоде хронической почечной недостаточности // Актуальные вопросы нейропедиатрии. Тезисы докладов научно-практической конференции, Петрозаводск, 2003. - С. 79-80.

8. Варга О. Ю., Игнатьев В. К., Везикова Н. Н., Марусенко И. М. Активность каспаз 4, 6, 8 лимфоцитов при ревматоидном артрите // Материалы Третьей Северо-Западной конференции по ревматологии, Псков, 2003.-С. 11-12.

9. Варга О. Ю., Игнатьев В. К., Герасимов А. А., Везикова Н. Н., Марусенко И. М. Остеогенон в лечении системного остеопороза при ревматоидном артрите и хронической почечной недостаточности // Тезисы Российского конгресса по остеопорозу, Москва, 2003. - С. 144.

10. Хейфец Л. М., Варга О. Ю., Игнатьев В. К. Остеопороз у больных хроническим гломерулонефритом в додиализном периоде хронической почечной недостаточности // Тезисы Российского конгресса по остеопорозу, Москва, 2003. - С. 116.

11. Герасимов А. А., Игнатьев В. К., Варга О. Ю. Минеральная плотность костной ткани при ревматоидном артрите // Тезисы III конференции молодых ученых России с международным участием, Москва, 2004.-С. 282-283.

12. Герасимов А. А., Игнатьев В. К., Варга О. Ю. Минеральная плотность костной ткани при ревматоидном артрите и остеоартрозе // Научно-практическая ревматология. - 2004. - №2. - С. 126.

13. Хейфец Л. М., Варга О. Ю., Стратегопуло В. А., Лютая Е. А., Рач-кова Л. М. Распространенность и выраженность нарушений фосфорно-кальциевого обмена у больных хроническим гломерулонефритом (ХГН) в додиализном периоде хронической почечной недостаточности // Сборник трудов XII ежегодного Санкт-Петербургского нефрологиче-ского семинара, Санкт-Петербург, 2004. - С. 79.

14. Герасимов А. А., Игнатьев В. К., Варга О. Ю., Балашов А. Т., Кон-дричина С.Н. Распространенность и факторы риска системного остеопороза при ревматоидном артрите и остеоартрозе // Материалы III научно-практической конференции с международным участием "Болезнь Ходжкина", Петрозаводск, 2004. - С. 86-87.

15. Хейфец Л. М., Варга О. Ю., Стратегопуло В. А., Лютая Е. А., Рач-кова Л. М., Мадани С., Балашов А. Т., Кондричина С. Н. Рентгеновская костная денситометрия в диагностике вторичного остеопороза у больных в додиализной стадии хронической почечной недостаточности //

Материалы III научно-практической конференции с международным участием "Болезнь Ходжкина", Петрозаводск, 2004. - С. 128-130.

16. Варга О. Ю., Игнатьев В. К., Хейфец JI. М., Волкова Т. О. Программированная клеточная гибель лимфоцитов как критерий активности и эффективности терапии при системной красной волчанке и хроническом гломерулонефрите // Материалы III научно-практической конференции с международным участием "Болезнь Ходжкина", Петрозаводск, 2004.-С. 132-134.

17. Варга О. Ю., Игнатьев В. К., Хейфец JL М., Везикова Н. Н., Мару-сенко И. М., Волкова Т. О. Программированная клеточная гибель лимфоцитов при ревматоидном артрите, системной красной волчанке и хроническом гломерулонефрите // Материалы IV конференции по ревматологии Северо-Западного федерального округа, Великий Новгород,

2004. - С. 36-38.

18. Хейфец Л. М., Варга О. Ю., Стратегопуло В. А., Лютая Е. А., Рач-кова Л. М., Мадани С. Распространенность и выраженность снижения минеральной плотности костной ткани у больных в додиализной стадии хронической почечной недостаточности И Материалы IV конференции по ревматологии Северо-Западного федерального округа, Великий Новгород, 2004. - С. 159-161.

19. Варга О. Ю., Игнатьев В. К., Хейфец Л. М., Волкова Т. О. Программированная клеточная гибель лимфоцитов при системной красной волчанке // Научно-практическая ревматология. - 2004. - №4. - С. 7.

20. Игнатьев В. К., Марусенко И. М., Везикова Н. Н., Варга 0.10. Ревматология в Карелии // Научно-практическая ревматология. - 2004. -№3. - С. 99-101.

21. Варга О. Ю. Значение апоптоза в патогенезе и лечении заболеваний // Материалы научно-практической конференции "Петрозаводские педиатрические чтения-И: диагностика в педиатрии", Петрозаводск,

2005.-С. 15-16.

22. Варга О. Ю., Игнатьев В. К., Марусенко И. М., Везикова Н. Н. Влияние метилпреднизолона и циклофосфана на активность программированной клеточной гибели лимфоцитов in vitro при системной красной волчанке // Научно-практическая ревматология. - 2005. - №3. - С. 25.

23. Герасимов А. А., Игнатьев В. К., Варга О. Ю. Остеоиороз при ревматоидном артрите и остеоартрозе // Научно-практическая ревматология. - 2005.-№3. - С. 29.

24. Герасимов А. А., Игнатьев В. К. Варга О. Ю. Остеопороз в Республике Карелия. Минеральная плотность костной ткани при ревматоидном

артрите и оетеоартрозе // Медицинский академический журнал. - 2005. -№2. - Приложение 6. - С. 187-190.

25. Игнатьев В. К., Хейфец JI. М., Везикова Н. Н., Марусенко И. М., Кузнецова Т. Ю., Варга О. Ю. Ревматология в Карелии: достижения и перспективы // Медицинский академический журнал. - 2005. - №2. -Приложение 6. - С. 195-198.

26. Варга О. Ю., Рябков В. А., Хейфец JI. М. Влияние метотрексата на активность апоптоза лимфоцитов при ревматоидном артрите // Материалы V Северо-западной конференции по ревматологии, Санкт-Петербург. - 2005. - С.ЗО-31.

27. Варга О. Ю., Игнатьев В. К. Апоптоз лимфоцитов при ревматоидном артрите // Медицинский академический журнал. - 2005. - №3. -Приложение 7. - С. 11-16.

28. Варга О. Ю., Рябков В. А., Хейфец JI. М. Прогностическая значимость активности апоптоза лимфоцитов при ревматоидном артрите // Медицинский академический журнал. - 2005. - №3. - Приложение 7. -С. 16-18.

29. Хейфец Л. М., Варга О. Ю. Выраженность й темпы прогрессиро-вания снижения минеральной плотности костной ткани у больных хронической почечной недостаточностью в преддиализной стадии // Тезисы II Российского конгресса по остеопорозу, Ярославль, 2005. - С. 170.

30. Варга О. Ю., Везикова Н. Н., Марусенко И. М. Остеогенон в лечении переломов лучевой кости при вторичном остеопорозе // Тезисы II Российского конгресса по остеопорозу, Ярославль, 2005. - С.116.

31. Варга О. Ю., Хейфец Л. М., Волкова Т. О., Кручек М. М. Активность апоптоза лимфоцитов при хроническом гломерулонефрите // Нефрология и диализ. - 2006. - №2. - С. 151-157.

32. Варга О. Ю., Рябков В. А. Что такое апоптоз и что дает знание о нем // Экология человека. - 2006. - №7. - С. 28-32.

33. Варга О. Ю., Хейфец Л. М., Стратегопуло В. А., Лютая Е. А., Рач-кова Л. М. Уровень sFas-лиганда, интерлейкинов 2, 6 и фактора некроза опухолей а при хроническом гломерулонефрите // Материалы III научной конференции с междануродным участием "Интервенционная радиология", Петрозаводск, 2006. - С. 102-103.

34. Рябков В.А., Варга О.Ю. Влияние активности ревматоидного артрита на качество жизни больных и показатели липидного спектра // Материалы III научной конференции с международным участием "Интервенционная радиология", Петрозаводск, 2006. - С. 113-115.

35. Варга О. Ю., Хейфец Л. М., Волкова Т. О. Прогностическая значимость активности апоптоза лимфоцитов при системной красной вол-

чайке // Материалы VI Северо-западной конференции но ревматологии, Петрозаводск, 2006. - С. 43^5.

36. Рябков В. А., Варга О. Ю. Взаимосвязь между активностью заболевания, активностью апоптоза периферических лимфоцитов и нарушениями липидного обмена при ревматоидном артрите // Материалы VI Северо-западной конференции по ревматологии, Петрозаводск, 2006. -С. 164-165.

37. Варга О. Ю., Рябков В. А. Влияние основных цитокинов на активность апоптоза циркулирующих лимфоцитов при ревматоидном артрите // Материалы VI Северо-западной конференции по ревматологии, Петрозаводск, 2006. - С. 166—167.

38. Варга О. Ю., Игнатьев В. К., Рябков В. А., Волкова Т. О., Кру-чек М. М. Активность программированной клеточной гибели лимфоцитов при ревматоидном артрите // Терапевтический архив. - 2006. -№6.-С. 14-19.

39. Варга О. Ю. Уровень sFas-лиганда (sFas-L), фактора некроза опухолей а (ФИО а ), интерлейкинов 2 (ИЛ-2) и 6 (ИЛ-6) при системной красной волчанке (СКВ) // Научно-практическая ревматология. - 2007. -№2. - С. 102

40. Всзикова Н. Н., Рябков В. А., Марусенко И. М., Варга О. Ю. Качество жизни пациентов как показатель эффективности терапии // Научно-практическая ревматология. - 2007. - №2. - С. 102

41. Варга О. Ю. Влияние метилпреднизолона и циклофосфана in vitro на активность апоптоза лимфоцитов периферической крови при системной красной волчанке // Российский биомедицинский журнал Med-line.ru. - 2007. - Т 8. - С. 518-525.

Подписано в печать 27.02.09. Формат 60x84 '/,6. Бумага офсетная. Уч.-изд. л. 1. Тираж 100 экз. Изд. № 63.

Государственное образовательное учреждение Высшего профессионального образования ПЕТРОЗАВОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Типография Издательства ПетрГУ 185910, г. Петрозаводск, пр. Ленина, 33

Актуальность проблемы

Иммуновоспалительные заболевания представляют собой группу заболеваний, характеризующихся глубокими нарушениями иммунного гомеостаза, выражающимися в развитии иммунорегуляторного дисбаланса, угнетении су-прессорной и увеличении хелперной активности Т-лимфоцитов, активации В-лимфоцитов, гиперпродукции антител самой различной специфичности и образовании иммунных комплексов. Все заболевания, входящие в эту группу, имеют ряд общих черт, таких как неизвестность этиологии, общность патогенеза, сходство морфологических проявлений, многосистемный характер поражения, хроническое течение с периодами обострения и ремиссии, обострение под влиянием неспецифических воздействий (инфекция, инсоляция, вакцинация и др.), лечебный эффект иммуносупрессивных средств (глюкокортикостероиды, цитостатические иммунодепрессанты). Прогноз при заболеваниях данной группы всегда серьезный, а известные варианты терапии не всегда эффективны. В связи с этим продолжаются поиски наиболее оптимальных схем диагностики и лечения заболеваний, а также уточнение факторов риска неблагоприятного течения заболеваний и возможности их коррекции [21,41, 55, 59, 64, 65, 95].

С этой точки зрения большой интерес представляет изучение активности апоптоза иммунокомпетентных клеток - механизма, который организм использует для освобождения от чужеродных клеток, клеток с дефектным генетическим аппаратом, аутоагрессивных лимфоцитов и «отработавших» клеток иммунной системы, которые успели выполнить свою функцию, и возможности использования для оптимизации диагностики, лечения и оценки прогноза при иммуновоспалительных заболеваниях [12, 15, 35, 43, 60, 61].

Хотя зрелые лимфоциты и другие клетки иммунной системы устойчивы к индукции апоптоза, они становятся чувствительными к ней после активации: дисбаланс стимулирующих сигналов, включая дефицит ростовых факторов, повторная стимуляция и просто старение активированных клеток приводят к развитию апоптоза [1, 15, 26, 35, 60, 61, 70, 71, 112, 113, 116, 154, 155]. Эти особенности апоптоза, а также большое количество эндогенных и экзогенных факторов, которые способны модифицировать осуществление апоптоза вплоть до полной блокады или тотального проявления, делают процесс программированной клеточной смерти одним из ключевых в патологии человека и животных [104, 108, 143, 154, 155, 193].

Апоптоз поддерживает баланс между клеточной пролиферацией и клеточной смертью, а его нарушения ведут к развитию патологических состояний. Неоправданно низкий уровень апоптоза способен обеспечить выживание и накопление аномальных клеток, а повышение активности программированной клеточной гибели ведет к развитию дегенеративных состояний. По-видимому, в той или иной степени нарушения апоптоза играют роль в развитии всех заболеваний [17, 112, 113, 154,315,325].

Однако известны заболевания, для которых патология апоптоза служит основой. К ним относятся и иммуновоспалительные заболевания, в частности, ревматоидный артрит, системная красная волчанка, хронический гломеруло-нефрит, в основе патогенеза которых лежат процессы аутоиммунного системного или преимущественно локального воспаления, и одними из ключевых участников являются лимфоциты [17, 18, 21, 26, 35, 47].

Внимание к апоптозу как возможному механизму развития и поддержания патологического процесса при ревматоидном артрите обусловлено современными представлениями о патофизиологии и патоморфологии заболевания. Одно из направлений исследований активности апоптоза при ревматоидном артрите посвящено изучению активности апоптоза клеток синовиальной ткани -синовиальных фибробластов, макрофагов. Выявлена низкая апоптотическая активность данных клеток при ревматоидном артрите, с чем связана характерная для ревматоидного артрита пролиферация синовиальной ткани и развитие паннуса [18, 214, 227, 258, 309, 315].

Гораздо меньшее количество работ посвящено изучению проблемы апоп-тоза иммунокомпетентных клеток, в том числе лимфоцитов, как синовиальных, так и циркулирующих, и факторов, модулирующих их апоптотическую активность [4, 23, 27]. Продолжает выясняться роль в нарушениях процесса апоптоза его отдельных участников, в том числе наиболее изученного индуктора программированной клеточной гибели Fas-лиганда, экспрессируемого на активированных Т-лимфоцитах. Растворимая форма Fas-лиганда, образующаяся путем отщепления внеклеточного региона Fas-лиганда, способна связывать рецептор Fas, нарушая апоптоз [180, 189, 353].

В настоящее время фактор некроза опухоли-a, являющийся одним из основных участников патогенеза иммуновоспалительных заболеваний, в частности, ревматоидного артрита, рассматривается как регулятор апоптоза с разнонаправленными эффектами от апоптотической гибели до стимуляции клеточной пролиферации и дифференцировки. Также продемонстрировано влияние интерлейкинов как провоспалительных цитокинов на активность программированной гибели лимфоцитов синовиальной ткани и периферической крови при ревматоидном артрите. Результат воздействия фактора некроза опухоли-a и ин-терлейкина 2 на клетку зависит от типа рецептора и внутриклеточных механизмов реализации сигнала. Для интерлейкина 6 показано отрицательное влияние на на активность апоптоза синовиальных фибробластов [154, 214, 309].

Активация апоптоза считается одним из механизмов патогенетического действия, рекомендованных для лечения ревматоидного артрита базисных противовоспалительных препаратов. Отдельные исследования посвящены проблеме влияния общепринятых (метотрексат) и новых (2 acetylthiomethyl-4-(4-methylphenyl)-4-oxobuta-noic acid, КЕ-298) вариантов терапии ревматоидного артрита на активность апоптоза лимфоцитов, не исключается возможность прогнозирования эффективности цитостатических средств на основании результатов изучения программированной клеточной гибели [74, 204, 353].

Несмотря на признанное участие периферических лимфоцитов в патогенезе ревматоидного артрита, опубликованные сведения, посвященные нарушениям апоптоза как причине накопления клона аутореактивных Т-клеток, весьма малочисленны, а имеющиеся данные отражают главным образом иммунологические характеристики программированной клеточной гибели in vitro без учета активности, течения заболевания и проводимой терапии.

Данные об активности апоптоза при системной красной волчанке противоречивы [35, 38, 243, 323, 324]. Согласно мнению одних авторов [154,155,157, 342], при системной красной волчанке наблюдается усиленная выработка активированными Т-лимфоцитами растворимой формы Fas-рецептора, накопление которого в микроокружении мононуклеаров препятствует реализации Fas-зависимого апоптоза (конкурентным образом подавляет взаимодействие Fas-рецептора с его лигандом FasL). У больных системной красной волчанкой обнаружены также мутации гена Fas (CD95), вызывающие резистентность В-клеток зародышевых центров к Fas-индуцированному апоптозу и массивную клональную экспансию пула плазмобластов [273]. Высказывается гипотеза, что подавление апоптоза способствует персистенции клона аутореактивных лимфоцитов и прогрессированию аутоиммунного процесса.

В то же время, другими исследователями [218, 358] показано, что лимфоциты крови больных системной красной волчанкой обладают повышенной склонностью к апоптозу in vitro. Выявлена прямая линейная зависимость между концентрацией растворимой формы Fas-рецептора в сыворотке и количеством апоптотических периферических Т-клеток, что доказывает проапоптоген-ный эффект растворимой формы Fas-рецептора [331]. Возможно, программа апоптоза подразумевает высвобождение растворимой формы Fas-рецептора с целью распространения сигнала смерти. Предполагается, что программированная гибель мононуклеаров является одним из механизмов, приводящих к появлению ядерных антигенов во внеклеточной среде. Ускорение апоптоза лимфоцитов может сопровождаться возрастанием экскреции из клеток деградированной ДНК и гистонов [358]. Таким образом, апоптотические клетки "поставляют" ранее скрытые аутоантигены, способствуя порочному кругу ау-тоагрессии.

Основой лечения данного заболевания, как и ревматоидного артрита, являются иммуносупрессивные препараты. Однако, влияние средств патогенетической терапии системной красной волчанки на активность апоптоза лимфоцитов остается не до конца выясненным. Имеются сообщения о том, что глю-кокортикостероиды [329], цитостатические иммунодепрессанты [154], амино-хинолиновые соединения [288]) обладают свойством индуцировать апоптоз. Остается невыясненным всегда ли необходима активация апоптоза лимфоцитов при данном заболевнаии. Кроме того, принимая во внимание необходимость практически пожизненного применения большинством больных имму-носупрессивных препаратов, принципиально важным является исследование активности апоптоза лимфоцитов как у пациентов с впервые в жизни установленным диагнозом до начала патогенетической терапии, так и в динамике на фоне продолжающейся терапии. Изучение влияния иммуносупрессивных препаратов на активность апоптоза лимфоцитов поможет раскрыть некоторые особенности течения этой патологии и найти ключ к оптимизации терапии.

Большой интерес представляют данные о роли апоптоза в развитии различного рода нефропатий, прогрессирование которых характеризуется клеточной пролиферацией с накоплением внеклеточного матрикса и последующим сморщиванием ткани [12, 15, 26, 35, 60, 61, 104, 143, 154, 155, 348]. При этом компоненты матрикса влияют на чувствительность мезангия к различным индукторам апоптоза, что приводит к значительным потерям гломерулярных клеток и развитию гломерулосклероза. Однако недостаточность почечных функций определяется не только гломерулосклерозом, но и наличием тубулоинтер-стициальных нарушений, при этом разрушение клеток канальцевого эпителия, наряду с некрозом, может происходить и путем апоптоза. Установлено, что при ингибиции апоптоза развиваются первичный гломерулонефрит, люпус-нефрит,

А-нефропатия, интенсивность апоптоза клеток клубочка достоверно коррелирует с их общим числом, а также — при мезангиопролиферативном варианте хронического гломерулонефрита - с интенсивностью протеинурии [143]. Активация апоптоза играет роль в развитии гломерулосклероза, кортикального некроза, обструктивных нефропатий, рефлюкс-нефропатии, поликистоза, гидронефроза, интерстициального нефрита, в том числе циклоспориновой нефропа-тии, посттрансплантационной острой почечной недостаточности [104, 143].

Большое значение имеют процессы запрограммированной смерти Т-лимфоцитов: гибель этих клеток с использованием механизма апоптоза играет большую роль в развитии лимфопении при хронической почечной недостаточности. Известно также, что циклоспорин и глюкокортикостероиды вызывают апоптоз так называемых митоген-активируемых мононуклеаров, причем эта способность коррелирует с их иммунодепрессивной активностью. Выявлено положительное влияние апоптоза на выживаемость почечного трансплантата у крыс: животные, получавшие иммуносупрессивную терапию эверолимусом, не имели признаков хронической нефропатии аллографта благодаря антипролифе-ративному и проапоптозному действию препарата [104, 143].

Изучение механизмов реализации различных этапов апоптоза позволяет определенным образом воздействовать на его отдельные этапы с целью их регуляции или коррекции. В настоящее время установлен тот факт, что если клетка погибает от апоптоза, подразумевается возможность терапевтического вмешательства, если вследствие некроза — нет. Известно, что через индукцию апоптоза осуществляется действие большинства цитотоксических химиопрепаратов, антиметаболитов нуклеиновых кислот, ингибиторов топоизомераз, и результатом воздействия этих препаратов является включение в клетках опухоли программы апоптоза. Дальнейшее повышение эффективности терапии заболеваний, в частности иммуносупрессивной терапии, связано с более детальным изучением ее биологических основ [3, 25, 26, 27, 28].

В связи с этим представляет интерес вопрос влияния иммуносупрессивной терапии на активность апоптоза лимфоцитов и зависимость эффективности иммуносупрессивной терапии от исходной активности апоптоза лимфоцитов. Не исключается возможность прогнозирования эффективности цитостатических средств на основании результатов изучения программированной клеточной гибели. Более активное исследование влияния иммуносупрессивных препаратов на апоптоз поможет объяснить различную чувствительность пациентов к имеющимся лекарственным средствам [50, 95, 112].

Цель работы

Изучить возможности использования активности апоптоза периферических лимфоцитов для оптимизации диагностики, оценки эффективности лечения и прогноза при заболеваниях иммуновоспалительного генеза - ревматоидном артрите, системной красной волчанке, хроническом гломерулонефрите.

Задачи

1. Изучить активность апоптоза периферических лимфоцитов при различных иммуновоспалительных заболеваниях — ревматоидном артрите, системной красной волчанке, хроническом гломерулонефрите и провести сравнительный анализ.

2. Выявить корреляционные связи между активностью апоптоза лимфоцитов и активностью основных цитокинов (фактора некроза опухоли-а, интерлей-кина 2, интерлейкина 6) при иммуновоспалительных заболеваниях.

3. Изучить in vitro влияние иммуносупрессивных препаратов (метилпред-низолона, метотрексата, циклофосфамида) на активность апоптоза периферических лимфоцитов при ревматоидном артрите, системной красной волчанке, хроническом гломерулонефрите.

4. Изучить динамику активности апоптоза периферических лимфоцитов на фоне иммуносупрессивной терапии ревматоидного артрита, системной красной волчанки, хронического гломерулонефрита.

5. Определить прогностическую значимость исходной активности апоптоза периферических лимфоцитов при ревматоидном артрите, системной красной волчанке, хроническом гломерулонефрите.

6. Определить факторы риска неэффективности иммуносупрессивной терапии при ревматоидном артрите, системной красной волчанке, хроническом гломерулонефрите, а также факторы риска развития люпус-нефрита у больных системной красной волчанкой.

7. Разработать принципы выбора варианта иммуносупрессивной терапии в зависимости от исходной активности апоптоза периферических лимфоцитов.

Научная новизна

В ходе исследования изучена активность апоптоза лимфоцитов при ревматоидном артрите, системной красной волчанке и хроническом гломерулонефрите. Проведен сравнительный анализ активности апоптоза лимфоцитов при данных заболеваниях, различающихся патогенетическими механизмами, распространенностью и преимущественной локализацией патологического процесса, выявлены различия в интенсивности апоптоза при этих заболеваниях.

Впервые методом флуоресценции определена активность каспаз и степень реализации программированной клеточной гибели в виде разрывов ДНК при иммуновоспалительных заболеваниях со сравнительной оценкой показателей при различных стадиях, длительности течения и активности заболевания, наличии функциональной недостаточности. Обнаружена связь нарушений апоптоза периферических лимфоцитов с активностью и длительностью течения заболеваний.

Изучена связь между активностью апоптоза лимфоцитов и активностью фактора некроза опухоли-а, интерлейкина 2, интерлейкина 6, которые имеют важное значение как в развитии и течении заболеваний, так и в осуществлении процессов программированной клеточной гибели.

Выявлена связь между активностью медь/цинк-зависимой супероксиддис-мутазы, отражающей активность хронических воспалительных заболеваний и являющейся средством ранней диагностики нефропатии, и активностью апоп-тоза периферических лимфоцитов.

Изучено влияние наиболее широко используемых иммуносупрессивных препаратов - метилпреднизолона, метотрексата и циклофосфамида - на активность апоптоза лимфоцитов in vitro, выявлено стимулирующее влияние этих иммуносупрессивных препаратов на процессы апоптоза лимфоцитов.

В работе впервые исследована динамика интенсивности программированной гибели периферических лимфоцитов на фоне проводимого лечения имму-носупрессивными препаратами в течение 2-5 лет, а при ревматоидном артрите - и на фоне терапии современным биологическим агентом - инфликсимабом. Выявлено корригирующее влияние эффективной базисной терапии в отношении ассоциированного с воспалительной активностью изменения активности апоптоза лимфоцитов. Доказано, что активность апоптоза периферическимх лимфоцитов является более чувствительным показателем эффективности терапии, чем клинические и лабораторные критерии эффективности терапии.

Впервые оценена возможность использования показателей активности апоптоза периферических лимфоцитов в качестве прогностических факторов течения иммуновоспалительных заболеваний и эффективности лечения имму-носупрессивными препаратами.

Практическая значимость

Полученные результаты позволяют оценить характер изменений активности апоптоза при заболеваниях иммуновоспалительного генеза - ревматоидном артрите, системной красной волчанке, хроническом гломерулонефрите. В ходе исследования выявлено, что количество разрывов ДНК и активность каспаз 8, 6,

4, определяемые в динамике методом флуоресценции как показатели интенсивности апоптоза, могут быть использованы в комплексе с традиционными клини-ко-лабораторными данными для оценки активности заболеваний и прогноза.

В работе показана способность базисных иммуносупрессивных препаратов индуцировать программированную гибель периферических лимфоцитов. Знание исходной активности апоптоза лимфоцитов позволяет решить вопрос о варианте иммуносупрессивной терапии, ее интенсивности, а исследование активности апоптоза периферических лимфоцитов в динамике может указать на необходимость коррекции проводимой терапии.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Активность апоптоза периферических лимфоцитов повышена при заболеваниях иммуновоспалительного генеза - ревматоидном артрите, системной красной волчанке, хроническом гломерулонефрите.

2. Интенсивность апоптоза периферических лимфоцитов зависит от активности, давности, системности иммуновоспалительных заболеваний.

3. Интенсивность апоптоза периферических лимфоцитов коррелирует с активностью фактора некроза опухоли-а, интерлейкина 2, интерлейкина 6, медь/цинк-зависимой супероксиддисмутазы и отражает активность иммуновоспалительных заболеваний.

4. Метилпреднизолон, метотрексат и циклофосфамид in vitro оказывают стимулирующее влияние на активность апоптоза периферических лимфоцитов.

5. Эффективная иммуносупрессивная терапия достоверно усиливает апоп-тоз периферических лимфоцитов при иммуновоспалительных заболеваниях.

6. Активность апоптоза лимфоцитов может быть использована при выборе варианта терапии.

7. Активность апоптоза лимфоцитов наряду с признаками высокой активности заболеваний являются факторами риска неблагоприятного прогноза при иммуновоспалительных заболеваниях.'

Апробация работы

Основные положения диссертации были доложены и обсуждены на конгрессе ревматологов России (Саратов, 2003), на IV съезде ревматологов России (Казань 2005), второй, третьей, четвертой, пятой, шестой, седьмой Северозападных конференциях по ревматологии (Петрозаводск, 2002; Псков, 2003; Великий Новгород, 2004; Санкт-Петербург, 2005; Петрозаводск, 2006; Вологда, 2007); на Республиканских научно-практических конференциях терапевтов (Петрозаводск 2002, 2004, 2006, 2007).

По теме диссертации опубликована 41 печатная работа, из них в рекомендованных ВАК изданиях статей - 8.

Реализация результатов работы

Основные положения диссертации внедрены в практику работы ревматологического отделения Республиканской больницы им. Н. В. Баранова. Материалы работы используются при обучении студентов 5 и 6-го курсов медицинского факультета специальностей «лечебное дело» и «педиатрия», на циклах усовершенствования по теме «Ревматология» и «Избранные вопросы терапии» на кафедре госпитальной терапии медицинского факультета Петрозаводского государственного университета.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 343 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, шести глав собственных наблюдений, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 374 источника, из них 158 отечественных и 216 иностранных работ.

ВЫВОДЫ

1. Определение активности апоптоза периферических лимфоцитов у больных иммуновоспалительными заболеваниями — ревматоидным артритом, системной красной волчанкой, хроническим гломерулонефритом - имеет важное значение для диагностики, оценки эффективности терапии и прогноза.

2. При ревматоидном артрите, системной красной волчанке, хроническом гломерулонефрите имеет место более интенсивный апоптоз лимфоцитов периферической крови по сравнению со здоровыми донорами, при этом степень активизации коррелирует с показателями активности заболеваний.

3. Повышенная продукция фактора некроза опухоли-а, интерлейкина 2, интерлейкина 6, растворимого Fas-лиганда, медь/цинк-зависимой супероксид-дисмутазы оказывает стимулирующее влияние на активность апоптоза периферических лимфоцитов.

4. Активность апоптоза периферических лимфоцитов снижена у больных "ранним" ревматоидным артритом и не зависит от давности системной красной волчанки и хронического гломерулонефрита и повышена у больных системной красной волчанкой с наличием люпус-нефрита в сравнении с больными без поражения почек.

5. Метотрексат, циклофосфамид и метилпреднизолон in vitro активируют апоптоз периферических лимфоцитов.

6. Эффективная иммуносупрессивная терапия способна корригировать имеющиеся изменения активности апоптоза периферических лимфоцитов.

7. Исследование активности апоптоза периферических лимфоцитов позволяет прогнозировать эффект назначаемой базисной терапии у больных иммуно-воспалительными заболеваниями.

8. Снижение исходной активности апоптоза периферических лимфоцитов является фактором риска недостаточного ответа на терапию при иммуновоспалительных заболеваниях (ревматоидном артрите, системной красной волчанке, хроническом гломерулонефрите), а также фактором риска развития волчаноч-ного нефрита.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Определение реализации апоптоза периферических лимфоцитов в виде количества разрывов ДНК в сочетании с исследованием активности каспаз 8, 6, 4 методом флуоресценции может быть использовано для оценки активности иммуновоспалительных заболеваний (ревматоидного артрита, системной красной волчанки, хронического гломерулонефрита), а также прогноза и эффективности базисной терапии в дополнение к традиционным клинико-лабораторным данным.

2. Наличие исходно сниженной активности апоптоза периферических лимфоцитов при ревматоидном артрите, так же, как и высокая степень активности заболевания, повышение уровня фактора некроза опухоли-а, интерелйкина 6, медь/цинк-зависимой супреоксиддисмутазы, являются показаниями для активизации терапии.

3. При исходно сниженной активности апоптоза периферических лимфоцитов при ревматоидном артрите препаратом выбора является метотрексат, но не сульфасалазин и лефлюномид.

4. Наличие исходно сниженной активности апоптоза периферических лимфоцитов при системной красной волчанке так же, как и высокая степень активности заболевания, повышение уровня фактора некроза опухоли-а, наличие волчаночного нефрита в дебюте, гематурии, является показанием для более активной иммуносупрессивной терапии, предпочтительна комбинация глюкокор-тикостероидов и цитостатических иммунодепрессантов.

5. Определение уровня медь/цинк-зависимой супероксиддисмутазы, фактора некроза опухоли-а показано больным системной красной волчанкой для уточнения риска развития волчаночного нефрита.

6. Наличие исходно сниженной активности апоптоза периферических лимфоцитов при хроническом гломерулонефрите так же, как и гематурии в дебюте, ускорения СОЭ, повышения уровня фактора некроза опухоли-а, является показанием для более активной иммуносупрессивной терапии, предпочтительна комбинация глюкокортикостероидов и цитостатических иммунодепрессантов.