Автореферат и диссертация по медицине (14.00.09) на тему:Влияние перинатальной гипоксии на структурно-функциональную организацию мембраниммунокомпетентных клеток (лимфоцитов) у детей впериоде новорожденности

На правах рукописи

СУПРУНЕЦ Светлана Николаевна

Влияние перинатальной гипоксии на структурно-функциональную организацию мембран иммунокомпетентных клеток (лимфоцитов) у детей з периоде новорожденное™

14.00.09 - Педиатрия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Тюмень - 1997

Работа выполнена в Тюменской государственной медицинской академии

Научный руководитель:

Консультант по клинической иммунологии:

доктор медицинских наук, профессор ПЕТРУШИНА А.Д.

кандидат медицинских наук Чебышева Е.В.

Официальные оппоненты : доктор медицинских наук,

Коршунов С.Ф. кандидат медицинских наук, доцент Моисеенко С.П.

Ведущая организация : Российский медицинский Университет

Защита диссертации состоится

"29" декабря 1997 года в 10 часов на заседании диссертационного совета К 084.48.02 в Тюменской государственной медицинской академии

(652023, г. Тюмень, ул. Одесская, 52)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке академии. Автореферат разослан "29" ноября 1997 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук,

профессор Дурыгин А.Н.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В структуре перинатальной заболеваемости одно из важнейших мест по частоте и значимости занимают перинатальные поражения ЦНС, которые составляют 60-80% всех заболеваний нервной системы в детском возрасте (Бадалян Л.О. 1989; Яцык Г.В., 1989; Студеникин М.Я., 1993; Барашнев Ю.И., 1993; Савельева Г.М., Сичинава Л.Г., 1995). В последние годы на фоне существенного снижения перинатальной заболеваемости и смертности не наблюдается параллельного снижения частоты неврологических расстройств у детей.

Существует множество пре- и перинатальных факторов, ответственных за патологию центральной нервной системы у детей. Наряду с различными причинами церебральных расстройств (внутриутробная инфекция, наследственная и врожденная патология и др.) особую значимость имеет хроническая и/или острая гипоксия плода, связанная, как правило, с осложненным течением беременности и родов (Савельева Г.М., Сичинава Л.Г., 1995). Вопрос о роли анте- и интранатальных факторов в патогенезе гипоксических нарушений нервной системы плода и новорожденного далек от окончательного решения.

Известно, что новорожденные, подвергшиеся воздействию гипоксии, составляют группу "повышенного риска" по развитию болезни. Это связано с воздействием гипоксии на обменные процессы в организме, со значительными изменениями структурно-функциональных свойств клеточной мембраны и сниженными адаптационными возможностями, при которых могут возникнуть отклонения, ведущие к срыву адаптации и развитию заболеваний у новорожденных. В то же время, многие стороны механизмов адаптации клетки при гипоксии новорожденных, отражающие состояние компенсаторно-приспособительных реакций, нераскрыты (Яцык Г.В с соавт., 1992).

Гипоксия плода и новорожденного занимает особое место среди повреждающих факторов, изменяющих течение биохимических процессов и снижающих возможности адаптации жизненно важных органов и систем. Существует прямая зависимость между изменениями липидного обмена, степенью тяжести заболевания, выраженностью клинической симптоматики. При тяжелых формах заболевания процессы биохимической адаптации не заканчиваются к концу первого месяца жизни. Определение отдельных показателей липидного обмена может служить дополнительным диагностическим критерием в оценке состояния детей с гипоксически-травматическими поражениями центральной нервной системы (Голенецкая Е.С., Кантур Н.А., 1995).

Повреждения, вызванные перинатальной гипоксией и обусловленные нарушением свободно-радикальных процессов, являются одним из патогенных факторов модификации клеточных мембран и, как следствие, возникновения ряда патологических состояний. Изменение активности свободно-радикального окисления у клинически здоровых детей, как один из первых сигналов о наличии срыва адаптации, указывает на необходимость проведения

профилактических мероприятий с целью снижения интенсивности переокисления липидов (Афонин A.A., Длужевская Т.С., Лагодина H.H., 1995).

Согласно данным литературы, фактор гипоксии играет главную роль в развитии патологических процессов на уровне структурно-функциональной организации клеточных мембран. Исследования, проведенные на модели лимфоцита, могут дать новые данные о формировании клинико-патогенетических проявлений перинатального поражения ЦНС.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ: на основании изучения особенностей структурно-функциональной организации клеточных мембран лимфоцитов установить их роль в клинико-патогенетических проявлениях перинатального поражения ЦНС и формирования иммунологического статуса у новорожденных.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

¡.Исследовать активность ферментов трансмембранного транспорта лимфоцитов и уровень интрацеллюлярного кальция у новорожденных с перинатальным поражением ЦНС в зависимости от характера перенесенной гипоксии в динамике неонатального периода.

2.Изучить состояние активности процессов ПОЛ и антиоксидантной системы лимфоцитов у новорожденных с перинатальным поражением ЦНС в зависимости от характера перенесенной гипоксии в динамике неонатального периода.

3.Исследовать содержание и соотношение основных классов липидов в мембранах лимфоцитов у новорожденных с перинатальным поражением ЦНС в зависимости от характера перенесенной гипоксии в динамике неонатального периода.

4.Изучить особенности субпопуляционного состава лимфоцитов у новорожденных с перинатальным поражением ЦНС в зависимости от характера перенесенной гипоксии.

5.Определить эффективность включения в комплексную терапию пирацетама у детей с перинатальным поражением ЦНС.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ: Проведенные комплексные исследования липидной структуры мембран лимфоцитов, состояния активности процессов ПОЛ и антиоксидантной защиты позволило впервые с позиций клинической мембранологии проанализировать клинико-патогенетические изменения у новорожденных в зависимости от характера перенесенной гипоксии (острой, хронической, сочетанной).

Впервые у здоровых новорожденных и больных с различным характером перенесенной гипоксии проанализированы особенности иммунологического статуса с определением фенотипических субпопуляций лимфоцитов, уровня гуморальных факторов иммунитета в конце неонатального периода.

Установлена впервые взаимосвязь между изменением липидной структуры лимфоцитов и их иммунологическими характеристиками в зависимости от характера перенесенной гипоксии.

Новыми являются результаты влияния на липидную структуру лимфоцитов и их иммунологические характеристики пирацетама, назначенного больным с гипоксически-ишемическим поражением мозга в течение неонатального периода.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ: Показатели общих фосфолипидов мембран лимфоцитов могут быть использованы, как критерии степени дестабилизации и глубины поражения структур мозга у новорожденных с различным характером гипоксии.

Полученные показатели иммунологического статуса у новорожденных не из пуповинвой крови, а из периферической в конце неонатального периода <в возрасте 25-28 дней) здоровых и больных с острой, хронической и сочетанной гипоксией, могут быть использованы как критерии в оценке глубины поражений при гипоксии на организменном уровне.

Результаты исследования, проведенные в данной работе расширяют диагностические возможности у новорожденных в зависимости от характера перенесенной гипоксии.

Показатели клинической и биохимической эффективности применения пирацетама в комплексной терапии у новорожденных с хронической и сочетанной гипоксией позволяют рекомендовать включение данного препарата в лечение аналогичных больных.

Установленные взаимосвязи измененной структуры лимфоцитов и их иммунологических функций необходимо включить в учебные программы подготовки специалистов на базовом и последипломном уровне.

ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ. Результаты проведенных исследований внедрены в работу отделения патологии новорожденных ГКБ N2 г. Тюмени, включены в учебные программы подготовки субординаторов, интернов.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы исследования доложены на международной выставке "Медицина и охрана здоровья" (Тюмень, 1996), городской научно-практической конференции "Актуальные проблемы медицины" (Тюмень, 1996).

Апробация диссертации проведена на заседании проблемной комиссии "Охрана материнства и детства" Тюменской медицинской академии.

По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ. ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1.У новорожденных, перенесших острую, хроническую и сочетанную гипоксию, отмечаются выраженные мембранодестабилизирующие процессы иммунокомпетентных клеток (лимфоцитов), которые опосредованы характером гипоксии, и проявляются нарушением активности ферментов

трансмембранного транспорта, уровня интрацеллюлярного кальция, процессов ПОЛ и антиоксидантной системы.

2.Установлено, что дестабилизация липидной фазы мембран лимфоцитов у новорожденных предопределяет формирование иммунологического статуса у новорожденных в зависимости от характера гипоксии.

3.Применение в комплексной терапии у новорожденных с хронической и сочетанной гипоксией пирацетама повышает эффективность реабилитационной терапии в неонатальном периоде.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация содержит 166 страниц машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 7 глав собственных наблюдений, заключения, выводов, практических рекомендаций. Иллюстрирована 41 таблицами, 5 рисунками. Список литературы включает 293 источника, из которых 238 отечественных, 55 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.В работе представлен анализ результатов клинического наблюдения и специальных биохимических и иммунологического исследований 140 новорожденных детей, перенесших перинатальную гипоксию различного характера (острую, хроническую, сочетанную) в динамике неонатального периода. Их них 84 (0.60) мальчика, 56 (0.40) девочек. Выделены клинические группы новорожденных с ОГ - 45 (0.32), с ХГ -35 (0.25) и СГ - 60 (0.43). Контрольную группу составили 25 здоровых новорожденных.

Клиническое обследование новорожденных проводилось по методике, разработанной Е.С.Бондаренко и В.В.Гаврюшовым (1986). У всех детей оценивалась совокупность сомато-неврологического обследования в динамике позднего неонатального периода с учётом документальных и анамнестических данных о течении беременности и родов, данных гистологического исследования плаценты, морфологического исследования периферической крови, данных функциональных методов исследования (нейросонография, реоэнцефалография, электрокардиография, ультразвуковое исследование сердца). По показаниям проводился анализ спинномозговой жидкости, осмотр глазного дна, бактериологическое обследование, консультация невропатолога.

Специальные биохимические исследования выполнены в проблемной лаборатории клинической биохимии ЦНИЛа Тюменской медицинской академии (зав. лабораторией - с.н.с., к.б.н. Т.Д.Журавлева, научный руководитель - д.м.н., профессор А.Д.Петрушина). Иммунологические исследования проводились в лаборатории городского иммунологического центра (главный врач - к.м.н. Е.В. Чебышева, научный руководитель - д.м.н., профессор Э.А.Кашуба).

Биохимические методы включали:

1 .Анализ состояния антиоксидантной системы проводился по:

а) активности супероксиддисмутазы в лимфоцитах по методу В.И. Чумаковой и Л.Ф.Осинской (1979);

б) активности каталазы в лимфоцитах по методу М. Karen (1986);

2. Анализ состояния перекисного окисления липидов в мембранах лимфоцитов по:

а) уровню диеновой конъюгации полиненасыщенных липидов по методу И.Д. Стальной (1977);

б) содержанию шиффовых оснований по методу Ф.З. Меерсона (1979).

3. Исследование липидного бислоя мембран лимфоцитов методом тонкослойной хроматографии на "Silufol"-254 (Э. Шталь, 1965; В.И. Крылов, 1975) с определением фракций фосфолипидов (лизофосфатидилхолина, фосфатидилсерина, сфингомиелина, фосфатидилхолина, фосфатидилэта-ноламина) и уровня холестерина.

Лейкоцитарную взвесь выделяли в градиенте плотности фиколл-верографин (Балуза В.П. с соав., 1980).

Предварительным этапом хроматографического анализа фракций фосфолипидов, шиффовых оснований, диеновой коньюгации полиненасыщенных липидов являлось приготовление липидных экстрактов с использованием спиртово-эфирной смеси (4:1).

4. Исследование состояния трансмембранного транспорта электролитов в лимфоцитах осуществлялось по активности Mg2+-, Na+-K+-, Са2+-АТФаз (A.M. Казеннов с соавт., 1984; М. Reinila et.al.,1982), по содержанию общего интрацеллюлярного кальция, основанного на цветовой реакции (Mayer et al., 1966; Као et al., 1971).

5. Анализ энергетического обмена лимфоцитов по определению активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Kornberg A. et.al., 1955).

6. Определение фосфолипазной активности (КФ 3.1.1.4) лимфоцитов методом токсического гемолиза (X. Брокерхоф с соавт., 1978).

Исследования фенотипа лимфоцитов крови проводили с использованием широкой панели моноклональных антител, производимых НПО "Диагнотех" Онкологического научного центра РАМН, направленных к следующим диффе-ренцировочным антигенам лимфоцитов: СДЗ, СД4, СД8, СД11 в, СД16, СД18, СД22, СД25, СДЗ8, СД45 RA, HLA-DR, CD45. Измерение проводили с помощью реакции непрямой иммунофлюоресценции с подсчётом окрашенных клеток на цитофлюориметре "Faescan" (Becton Dickincon).

Уровень сывороточных иммуноглобулинов определяли по методу Манчини (1975).

Статистическая обработка результатов исследования проводилась на IBM PC/AT 486 методом вариационной статистики и математического парного корреляционного анализа с использованием пакета прикладных программ "Paradox" и "Microsoft Excel".

в

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

На основе анализа клинико-функциональных проявлений у новорожденных с перинатальным поражением ЦНС в зависимости от характера перенесенной гипоксии установлено, что низкие оценки по шкале Апгар характерны для новорожденных, перенесших ОГ и СГ. При оценке неврологического статуса наблюдаемых новорожденных отмечено преобладание синдрома угнетения ЦНС у детей, перенесших СГ, синдромов внутричерепной гипертензии и повышенной нервно-рефлекторной возбудимости у новорожденных, перенесших острое гипоксическое воздействие, в то время как у детей с ХГ с равной частотой диагностировались все вышеуказанные синдромы. Обращает на себя внимание тот факт, что проявления гипертензионного синдрома у детей, перенесших ОГ, к концу неонатального периода купировались в 89% случаев.

Учитывая влияние гипоксии на структурно-функциональную организацию клеточных мембран и иммуногенез, нами проведен комплекс специальных биохимических исследований, направленный на изучение особенностей структурной и функциональной организации мембран лимфоцитов в зависимости от характера гипоксии.

Анализируя полученные данные (табл.1), необходимо отметить, что у детей, перенесших ОГ, в возрасте 5-7 дней отмечается достоверное снижение активности Са2+-АТФазы (в 1.8 раза), что сопровождается накоплением интрацеллюлярного кальция. При этом отмечается тенденция к снижению активности 1У^2+-АТФазы и повышение №+-К+-АТФазы. К концу же неонатального периода отмечается достоверное увеличение активности Са2+-АТФазы, приближающейся к нормативным показателям, при достоверном повышении активности М£2+-АТФазы (в 1.9 раза превышающей показатели группы контроля), что сопровождается нормализацией содержания интрацеллюлярного кальция. При этом активность Ыа+-К+-АТФазы также имеет тенденцию к нарастанию.

Анализируя полученные данные, можно предположить, что у новорожденных, перенесших ОГ, не выявлено тотального угнетения активности ферментов трансмембранного транспорта и соответственно высокий уровень интрацеллюлярного Са2+ сохранялся только в первые 10 дней неонатального периода.

К концу неонатального периода (табл.2) в связи с компенсаторным повышением активности М£2+-АТФазы отмечается тенденция к нормализации деятельности №+-К+-АТФазы и Са2+-АТФазы, что приводит к нормализации уровня внутриклеточного кальция.

У детей, перенесших ХГ, в остром периоде патологии отмечается достоверное повышение уровня интрацеллюлярного кальция (в 5 раз), на фоне достоверно низкой активности Са2+-АТФазы.

К концу неонатального периода, в отличие от больных с ОГ, уровень интрацеллюлярного Са2+ у новорожденных с ХГ остается достаточно высоким,

несмотря на повышение активности Са2+-АТФазы. По всей видимости, это эбусловлено снижением и/или истощением компенсаторных возможностей эрганизма новорожденных с хронической гипоксией, ибо в этот период падает активность М§2+-АТФазы и №+-К+-АТФазы. Хотя эти показатели и достигают практически нормативных величин.

Активность ферментов трансмембранного транспорта у новорожденных, перенесших СГ, разнонаправлена в динамике неонатального периода и отличается от показателей детей с ХГ.

Следовательно, можно сделать заключение, что выраженность адаптационно-приспособительных механизмов у новорожденных зависит от характера перенесенной гипоксии.

Как свидетельствуют данные литературы, Са2+ , особенно его повышенные концентрации, активирует многие ферментативные системы протеазы, фосфолипазы, а особенно фосфолипазу А2 , которая высвобождает арахидоновую кислоту из фосфолипидов клеточных мембран. Именно она запускает процессы перекисного окисления липидов.

Несмотря на достаточно недлительное повышение уровня интрацеллюлярного Са 2+ у новорожденных с ОГ, активность фосфолипазы у этой группы детей значительна и не нормализуется к концу неонатального периода.

Основываясь на данных литературы и предшествующих научных исследованиях педиатров Тюменской медицинской Академии (В.И.Крылов, 1990; А.ДЛетрушина, 1993; В.А.Жмуров, 1994), можно предположить, что длительная патологическая активность фосфолипаз, накопление арахидоновой кислоты создают оптимальные условия для повышения активности процессов свободно-радикального окисления белков, а, в первую очередь, липидов и накоплению агрессивных свободных радикалов (Н*, ОН" ,СООН" и др.).

Если ОГ у новорожденных ведет к повышению активности фосфолипаз, и, в частности, фосфолипазы Аг , то в группе новорожденных, перенесших ХГ, активность фосфолипазы имеет слабую тенденцию к нарастанию.

А к 23-25 дню жизни больных ее активность падает почти в 3 раза. Т.е. можно предположить, что при развитии ХГ у плода и новорожденного мембранодестабилизирующие процессы имеют свою специфику, а, следовательно, те терапевтические рекомендации по мембранотропным препаратам могут оказаться не действенными у данной группы больных.

Как видно из представленных результатов, фосфолипазная активность у больных с СГ не только не нарастает, а значительно снижается до статистически значимых цифр (Р<0.001) в остром периоде заболевания и незначительно повышается, но даже не приближаясь к нормативным показателям в позднем неонатальном периоде. Вероятно, в данном случае, формирование патофизиологического процесса у наблюдаемых больных идет не по пути активации процессов ПОЛ в мембранах лимфоцитов.

Таблица 1.

Показатели структурно-функциональной организации мембран лимфоцитов у новорожденных с перинатальной гипоксией в возрасте 5-7 дней._

Анализируемые показатели Здоровые дети Новорожденные с перинатальной гипоксией Р

острой хронической сочетанной

Ыа*-Ю-АТФаза (мкмоль/час/106) 0.06610.005 0.07710.004 0.07410.008 0.063 10.008

Мя2*-АТФаза (мкмоль/час/10б) 0.05710.001 0.05210.003 0.11910.009 0.09710.013 р1 <0.001 рЗ<0.05

Са >-АТФаза (мкмоль/час/106) 0.26110.03 0.14010.009 0.17010.010 0.235 1 0.040 р1<0.01 р2<0.05

Кальций вн/кл. (мкмоль/106) 0.00410.0004 0.00610.0004 0.021+0.002 0.00510.001 р1<0.05 р2<0.05

Фосфолипазная активность (мкм оль/106) 1.1610.08 1.7710.15 1.2310.12 0.3910.06 р1<0.01 рЗ<001

да (нмоль/мг лип.) 65.1216.62 74.0314.15 66.0415.18 92.95 1 4.31 р1<0.01 рЗ<0.01

ШО (усл.ед.флуор/мг лип) 162.49+13.89 111.88111.10 88.1317.02 110.2917.78 р1<0.05 р2 <0.001 рЗ <0.001

СОД (усл.ед.торм./106) 1.48 ±0.22 1.9510.15 1.5510.10 1.1710.09

Каталаза (мкмоль/мин/104) 1.1810.15 1.281 1.15 1.9510.17 1.7110.16 р2<0.01 рЗ<0.05

Общий холестерщ (мг/мл) 0.10310.004 0.092 1 0.004 0.110 ±0.004 0.09010.007 р1 <0.05 рЗ<0.05

Сумма фосфолипидов (мг/мл) 0.12510.004 0.10510.008 0.11410.004 0.091 10.004 р1<0.05 р2<0.05 рЗ<0.001

ЛФХ (%) 11.0910.88 12.83 ±0.53 12.12 ±0.89 13.0510.64

ФС (%) 15.4011.02 15.0410.68 16.70 ± 1.34 17.11 11.08

СФМ (%) 23.431 1.20 21.7910.85 20.01 1 1.30 22.43 1 1.59

ФХ (%) 28.621 1.75 28.33 1 0.96 28.041 1.95 26.591 1.24

ФЭА (%) 21.371 1.64 22.461 1.83 21.8511.91 20.361 1.39

Гл-6-ФДГ ти/10'кл 0.341 10.029 0.277 1 0.034 0.52710.028 2.07410.201 р2<0.001 рЗ<0.001

Примечание: Р- величина статистической достоверности различий показателей: р1- у детей с ОГ и здоровых, р2-у детей с ХГ и здоровых, рЗ- у детей с СГ и здоровых.

Таблица 2.

Показатели структурно-функциональной организации мембран лимфоцитов у новорожденных с перинатальной гипоксией в возрасте 23-25 дней._

Анализируемые Здоровые Новорожденные с перинатальной гипоксией Р

показатели дети острой хронической сочетанной

№*-К+"АТФаза 0.066±0.005 0.082 ±0.010 0.063 ± 0.008 0.057 ± 0.009 р] <0.001

(мкмоль/час/106)

Г^'-АТФаза 0.05710.001 0.108 ±0.011 0.096 ±0.007 0.077 ±0.011 р2 <0.001

(мкмоль/час/106)

Са 2*-АТФаза 0.261 ±0.03 0.182 ±0.010 0.307 ± 0.033 0.433 ± 0.07 р1 <0.05

(мкмоль/час/106) рЗ<0.05

Кальций вн/кл. 0.004±0.0004 0.004 ± 0.0003 0.014 ±0.001 0.008 ± 0.001 р2< 0.001

(мкмоль/106) рЗ<0.05

Фосфолипазная активность (мкмоль/106) 1.16±0.08 1.55 ±0.07 0.44 ±0.05 0.48 ± 0.04 р1 <0.01 р2<0.001 рЗ<0.001

ДК 65.12±6.62 97.54 ± 6.53 61.31 ±4.64 57.42 ± 4.30 р1<0.01

(нмоль/мг лип.)

ШО 162.49+13.89 173.26 ± 12.82 91.10 + 9.86 94.11 ± 10.02 р2<0.001

(усл.ед.флуор/мг Л1Ш) рЗ<0.001

СОД 1.48+0.22 1.70 ±0.12 1.82 ± 0.17 1.61 ±0.18

(усл.ед.торм./106)

Катал аза 1.18±0.15 1.50 ±0.12 0.75 ± 0.053 1.8610.25 р2<0.05

(мкмоль/мин/106) рЗ<0.05

Общий холестерин 0.103 ±0.004 0.104 ±0.009 0.110 ±0.008 0.130 ±0.005 рЗ<0.001

(мг/мл)

Сумма фосфолипидов (мг/мл) 0.125 ±0.004 0.108 ±0.006 0.104 + 0.007 0.118 ±0.008 р1 <0.05 р2<0.05

ЛФХ (%) 11.09 ±0.88 14.19 ±0.44 10.08 ±0.60 11.16 ±0.73 р1<0.01

ФС (%) 15.40 ± 1.02 17.51 ±1.13 15.38 ±0.79 16.7411.40

СФМ (%) 23.43 ± 1.20 20.04 ± 0.90 24.39 ± 1.02 23.051 1.90 р1 <0.05 р2<0.05

ФХ (%) 28.62 ± 1.75 27.27 ±1.33 28.35 ± 1.60 31.07 ± 1.98

ФЭА (%) 21.37 ±1.64 20.96+ 1.04 21.66 ± 1.35 17.78 ±1.79

Гл-6-ФДГ 0.341±0.029 0.362 ± 0.036 0.271 ± 0.021 1.036 ±0.080 рЗ<0.001

ти/106 кл

Активность процессов ПОЛ в лимфоцитах у новорожденных с ОГ выражена значительно. Уже в раннем неонатальном периоде отмечается статистически достоверный ( р1<0.01) рост ДК, который не только не снижается к концу неонатального периода, а еще значительнее нарастает. Это, по всей вероятности, свидетельствует о лавинообразном характере процессов переокисления липидов.

Процессы нейтрализации активных радикалов, определяемых по уровню ШО, также указывают на высокую активность свободно-радикального окисления мембранных липидов. Так, содержание ШО в раннем неонатальном периоде (5-7 дней) статистически достоверно снижается (р<0.05), а к 23-25 дню периода новорожденное™ резко нарастает. Это указывает, с одной стороны, на достаточные компенсаторные возможности детей по нейтрализации продуктов переокисления мембранных липидов.

С другой стороны, этот показатель можно рассматривать, как прогностически неблагоприятный в плане возможного формирования хронического течения патологического процесса.

Уровень ДК полиненасышенных жирных кислот у детей, перенесших ХГ, практически не изменяется в динамике неонатального периода и даже имеет некоторую, правда, статистически недостоверную динамику к снижению в 23-25 дней жизни больных. А уровень ШО не только не увеличивается, а даже имеет четкую, статистически достоверную динамику к снижению, особенно в раннем неонатальном периоде.

Следовательно, полученные результаты подтверждают высказывание о том, что в условиях ХГ у новорожденных активность процессов ПОЛ в лимфоцитах достаточно низкая. Однако даже в этих условиях у детей с ХГ страдают процессы нейтрализации свободных радикалов.

Активность процессов ПОЛ в лимфоцитах новорожденных с сочетанной гипоксией достаточно и статистически достоверно высока (р<0.001) в остром периоде. На фоне лечебных мероприятий уровень ДК снижается к концу неонатального периода даже ниже нормативного параметра. Эта динамика отличается от изменений данных процессов при ОГ и ХГ.

Неблагоприятно то, что на фоне вроде бы положительной динамики образования начальных продуктов перекисного окисления, отмечается прогностически неадекватные процессы нейтрализации свободных радикалов. На это указывает неуклонно снижающийся уровень ШО липидов (р<0.001; 0.001). Следовательно, в крови у новорожденных с СГ постоянно высокая концентрация агрессивных продуктов перекисного окисления.

В лимфоцитах у новорождённых, перенесших ОГ, определяется тенденция к повышению активности СОД в раннем неонатальном периоде и к уменьшению в возрасте 23-25 дней, но нормативных показателей не достигает. Уровень каталазы имеет тенденцию к нарастанию на 5-7 день жизни и продолжает повышаться к 23-25 дню. Подобная динамика указывает на

адекватную реакцию ферментов антиоксидантной и антиперекисной систем защиты.

Несколько иная картина наблюдается при анализе активности процессов ПОЛ у новорождённых, перенесших ХГ. Считается, что клетки плода выдерживают более глубокую гипоксию, чем зрелые клетки. Кроме того, хорионический гонадотропин (специфический гормон беременности) оказывает мощное антиоксидантное действие. Вероятно, поэтому сохранена активность СОД в 5-7-дневном возрасте, и которая нарастает к концу неонатального периода. Более чем в 1.5 раза повышена активность каталазы, показатели которой значительно снижаются к 23-25 дню жизни, и достоверно отличимы от нормативных значений, что свидетельствует о высокой антиперекисной активности внутриклеточных механизмов зашиты.

Активность СОД в остром периоде у детей с СГ снижается, а к концу неонатального периода нарастает и эта разница достоверна (р<0.05).

Антиперекисный фермент каталаза значительно повышает свою активность как в остром периоде в сроке 5-7 дней жизни новорожденных с СГ, а особенно к концу неонатального периода (р<0.05).

Конечным субстратом в реализации биохимических процессов при развитии патологии являются клеточные структуры. И формирование любого патологического процесса и воздействия неблагоприятных факторов определяется степенью и глубиной нарушений структуры цитомембран (Крепе, Ю.Е. Вельтищев, Капустян, 1983).

Обращает внимание разнонаправленное изменение показателей липидного обмена в мембранах лимфоцитов у новорождённых, перенесших ОГ.

Анализируя содержание различных фракций фосфолипидов и холестерина в динамике неонатального периода у новорожденных, перенесших ОГ, следует отметить значительные изменения в структуре липидов лимфоцитов. Так, первым показателем выраженной дестабилизации у наблюдаемых больных является уровень ЛФХ, который нарастает с 5-7 дня жизни детей и к 23-25 дню достигает значительного статистически достоверного различия с уровнем у здоровых детей.

На существенное изменение структуры мембраны лимфоцитов указывает низкий уровень трудноокисляемых фосфолипидов СФМ и ФХ - основных "цементирующих" мембранных липидов. Аналогичная динамика отмечена и по содержанию холестерина.

У детей с ХГ в остром периоде нарастает уровень ЛФХ, хотя это увеличение не достигает статистически достоверных величин. Аналогичная динамика отмечается со стороны фракции ФС. В отличие от легкоокисляемых фракций фосфолипидов уровень СФМ статистически достоверно снижен. А фракции ФХ и ФЭА по содержанию у наблюдаемых детей не отличаются от нормативных показателей. Компенсаторно имеется тенденция к увеличению уровня холестерина.

К концу неонатального периода на фоне проводимой терапии снижается уровень ЛФХ до показателя у здоровых детей и нарастает содержание СФМ. Все эти изменения вроде бы свидетельствуют о положительной динамике в структуре липидов мембран лимфоцитов. Однако общее суммарное содержание фосфолипидов цитомембран лимфоцитов снижается, что является прогностически неблагоприятным признаком, так как для полноценной функции лимфоцитов и адекватного иммунного ответа необходимо увеличение суммарной фракции фосфолипидов в основном за счет легкоокисляемых фракций (Эшмен, Ляшенко, 1987) в ответ на воздействие неблагоприятных факторов.

У детей, перенесших СГ, более значительно нарастает содержание ЛФХ в остром периоде, снижаются не только легкоокисляемые фракции фосфолипидов - ФЭА, но и трудноокисляемые - СФМ и ФХ. А также падает концентрация холестерина -основного структурного, цементирующего липида цитомембран. И как результат, снижается общее содержание фосфолипидов статистически высоко достоверно (р<0.001).

К концу неонатального периода выявлены положительные тенденции в содержании фракций фосфолипидов : практически нормализуется уровень ЛФХ, СФМ; значительно увеличивается содержание ФХ.

Однако содержание главного фосфолипида в формировании иммунного ответа ФЭА - резко падает.

Таким образом, учитывая выявленные изменения у детей, перенесших СГ, можно сделать вывод, что процессы дестабилизации у данной группы больных наиболее значительны и требуют коррекции практически с момента рождения ребенка.

Активность гл-б-ФДГ у детей с ОГ снижается в раннем неонатальном периоде, что указывает на низкие или отсутствие компенсаторных механизмов, т.к. данный фермент контролирует уровень редуцированного глютатиона, который, в свою очередь, определяет резистентность клеточных структур к внешним воздействиям. Однако к 23-25 дню жизни активность данного фермента достигает нормативных показателей и даже имеет тенденцию к незначительному росту.

У детей с ХГ динамика активности данного фермента диаметрально противоположна. У детей с ОГ компенсаторные возможности к концу неонатального периода увеличиваются, а у новорожденных с ХГ нарастает декомпенсация.

Активность гл-6-ФДГ у детей, перенесших СГ, значительно и статистически достоверно нарастает в остром периоде (р<0.001) и сохраняется высокой к концу неонатального периода. Это свидетельствует о том, что у них происходит резкая активация пентозо-фосфатного цикла. Это можно расценить как адаптационно-компенсаторную реакцию организма на фоне несостоятельности процессов в системе гликолиза.

Таким образом, исходя из полученных данных можно сделать заключение, что гипоксия плода и новорожденного ведет к выраженным дестабилизирующим процессам в липидном бислое белых клеток крови -лимфоцитах. Процессы дестабилизации цитомембран лимфоцитов у новорожденных с перинатальной гипоксией, носят неспецифический характер, но зависят от характера гипоксии (острой, хронической, сочетанной).

Естественно предположение, что в связи с изменением структуры клеточных мембран лимфоцитов должна страдать их функция, как иммунокомпетентных клеток.

С этой целью в настоящей работе и проведено изучение субпопуляционного состава лимфоцитов и содержание общих иммуноглобулинов классов А, М, б У новорожденных с перинатальным поражением ЦНС в зависимости от характера гипоксии.

Динамика иммунологических показателей у новорожденных, перенесших ОГ, отражает угнетение клеточного (увеличение доли функционально неполноценных Т-клеток всех субпопуляций и нарушение межклеточных взаимодействий) при одновременном напряжении гуморального иммунитета.

Действие ОГ можно оценить как стрессовую ситуацию, подавляющую отдельные звенья системы и нарушающую внутрисистемную регуляцию иммунокомпетентных клеток: подавление Т-клеточного звена с одновременным нарушением супрессорной функции в отношении к В-клеточному звену, следствием чего является неадекватная стимуляция выработки основных классов иммуноглобулинов.

Анализ изучаемых показателей в группе детей, перенесших ХГ, выявил изменения аналогичные показателям, полученным у новорожденных , перенесших ОГ, но в иной степени.

У новорожденных с хронической гипоксией отмечается большее угнетение клеточного звена иммунитета вследствие хронической гипоксии с увеличением доли незрелых Т-лимфоцитов среди клеток, несущих супрессорную функцию, большую активацию гуморального иммунитета (выраженная в повышении ^в) на общем фоне большего напряжения иммунокомпетентных клеток. По всей вероятности, это обусловлено продолжительным влиянием ряда патологических факторов на систему иммунитета, приводящее к более грубым нарушениям межклеточного взаимодействия в системе.

При СГ возникает качественно иная ситуация. Действие ХГ может рассматриваться не только как повреждающий фактор, но и как стимул, поддерживающий систему иммунитета в постоянном напряжении. В последствие, при действии иного достаточно сильного стрессового фактора (ОГ), система реагирует выбросом функционально неполноценных клеток. Опасность данной ситуации состоит в том, что за количественными показателями, сходными с показателями здоровых детей, кроется функциональная неполноценность иммунокомпетентных клеток с

последующим тяжелым истощением системы, ведущем к развитию состояния иммунодефицита.

Таблица 3.

Субпопуляции лимфоцитов крови и содержание общих иммуноглобулинов классов А, М, в у новорожденных в возрасте 25-28 дней в зависимости от

МКА Здоровые дети Острая гипоксия Хроническая гипоксия Сочстаниая гипоксия

Лейкоциты п 9585± 1008 7 8208 ± 602 12 9092 ±794 12 8688 ±658 17

Лимфоциты п 6643 ±812 7 5388 ±465 12 5470 ±368 11 6405 ± 409 17

CD3* п 4666 ±605 6 2709 ± 234 12 р<0.05 2605 ± 271 11 р<0.01 2997 ±351 12 р<0.05

CD4* п 2540 ± 556 7 1646 ±187 11 1759 ±143 9 2511 ±217 13

CD8+ □ 1349 ±248 7 831±115 8 696±146 9 р<0.05 706 ± 59 11 р<0.05

CD22* п 645 ± 95 6 652 ± 96 9 1177 ±189 8 р<0.05 579 ± 60 13

CD 16* п 1048±101 7 682± 113 9 р<0.05 623 ± 89 10 р<0.01 965 ±103 15

CD38* п 3761 ± 778 7 1595 ±335 6 р<0.05 2633 ±615 9 2947 ± 275 10

CD45 RA" п 3112 ±759 7 1606 ±204 12 1681 ±166 8 1592± 171 13

HLA DR" D 1977 ± 181 6 710 ±103 10 р<0.001 443 ±76 8 р<0.001 507 ± 64 12 pcO.OOl

CD45* D 5107 ±828 6 2514 ±420 6 р<0.05 4441±1442 6 5448 ±423 11

CD 11 b* n 1177 ±278 6 733 ± 95 10 577 ±108 7 1126 ± 126 13

CD 18* n 4898 ± 918 6 1888 ±494 7 р<0.05 2651 ±279 10 3315 ±438 14

CD25* и 912±199 6 366 ±86 8 р<0.05 449+122 6 р<0.05 1082±102 12

IgA (мг%) n 26.21 ±4.42 7 24.44 ± 5.33 14 23.92 ±4.27 13 21.25 ±0.84 17

IgM (мг%) D 36.25 ± 8.35 7 54.52 ±16.15 8 72.71 ± 6.87 10 р<0.01 64.39 ±6.71 17 р<0.05

IgG (мг%) n 448.8 ± 125.4 7 742.75 ±43.85 13 755.0 ±68.02 12 р<0.05 716.42 ±55.81 17

В последнее время большое внимание исследователей уделяется проблеме межклеточных взаимодействий и созданию в иммунологии регуляторных системных концепций, которые на одно из первых мест выдвигают мембранные липидные структуры. Поэтому в настоящей работе сделана попытка установить взаимосвязь между липидной структурой лимфоцитов и их иммунологическими характеристиками.

Таблица 4.

Характеристика иммунобиохимических корреляционных парных взаимосвязей у новорожденных с перинатальным поражением ЦНС.

Здоровые дети. N-8 ЛФХ ФС СФМ ФХ ФЭА холестерин

CD3* -0.62198 +0.541654 -0.53442

CD4* -0.58208

CD8* -0.62198 -0.69912

CD 16* -0.90019 -0.66232

CD 18* +0.811898 +0.583577

CD22* -0.67882

CD25* -0.70758

CD38* -0.75283 -0.58234

CD45 RA* -0.68448

HLA DR* -0.94634

ОГ (25дн) ЛФХ ФС СФМ ФХ ФЭА холестерин

CD 18* -0,56431 +0,576607

CD22* -0,50172

CD38* -0.53822

HLA DR* +0.649071

CD45* +0.485084

ХГ (25дн) ЛФХ ФС СФМ ФХ ФЭА холестерин

CD4* -0,60578 -0.54954

CD8* -0.56154 -0.77235

CDllb* -0.64532

CD22* +0.57698

CD25* +0.695279 +0.60075 +0.881445

CD38* +0,526249 +0,731428

CD45 RA* -0.60256

HLA DR* -0,60969 -0.50843

CD45* +0.732949

СГ (25дн) ЛФХ ФС СФМ ФХ ФЭА холестерин

CD3* +0587224 +0.629182

CD8* +0.603661 +0,550254

CD 18* +0.576607

CD25* +0,506501 -0.74003

CD38* -0,53822

CD45* -0,6336

С этой целью проведен корреляционный анализ показателей фосфолипидов, холестерина и изучаемыми фенотипическими показателями данных иммунокомпетентных клеток у здоровых новорожденных и перенесших гипоксию различного характера.

Данные представлены в табл. 4. Из данных таблицы четко видно, что статистически достоверные корреляции отмечаются между МКА и основными классами метаболически активных фосфолипидов.

Такой подход позволяет рассматривать мембраны иммунокомпетентных клеток как часть единой мембранной системы организма с общими закономерностями ее функционирования и участия в метаболизме липидов, создает возможности поиска звеньев патогенеза для различных видов патологии. На этой основе возможно развитие общебиологических принципов клинической иммунологии с разработкой нового направления мембранокорригирующей иммунотерапии.

В настоящей работе проведено изучение клинико-биохимической и иммунологической эффективности одного из препаратов ноотропного действия - пирацетама.

Пирацетам (ноотропил), циклическое производное ГАМК (2-окси-1-пирролидинацетамид), отличающееся от нее быстрым всасыванием из желудочно-кишечного тракта и легким проникновением через гемотоэнцефалитический барьер (Лукьянова Л.Д., 1989; Ковалев Г,В., 1990).

Клинико-биохимический анализ эффективности применения в комплексном лечении пйрацетамом проведен у 25 новорожденных, перенесших хроническую и сочетанную гипоксию ( 7 - ХГ и 18 - СГ ). контрольную группу составили 25 новорожденных с перинатальным поражением ЦНС, подобранных методом паракопий.

Новорожденным основной группы в комплексное лечение дополнительно включался препарат пирацетам, вводимый внутривенно струйно. Разовая доза препарата составляла 50 мг/кг 1 раз в день и вводилась в течение 10-12 дней с 5-7 дневного возраста. Все дети хорошо переносили препарат, побочных реакций и осложнений не отмечено.

В результате применения пирацетама в составе комплексной терапии отмечалось уменьшение сроков восстановления нарушенных функций в сравнении с новорожденными, получавшими традиционную терапию в более короткие сроки купировались нарушения физиологических рефлексов и мышечного тонуса, отмечена более ранняя стабилизация периферической гемодинамики, в большем проценте случаев исчезают явления ишемии вещества головного мозга по данным нейросонографии, уменьшаются явления гипоксической кардиопатии.

В основе клинической эффективности, безусловно, лежат мембранорепарационные процессы. Это полностью подтверждается изучением показателей структурно-функциональной организации клеточных мембран лимфоцитов.

Анализ иммунологических показателей у новорожденных с ХГ и СГ, получавших пирацетам в комплексной терапии, позволяет отметить рост доли функционально полноценных иммунокомпетентных клеток. Механизм данного действия, с нашей точки зрения, может быть как опосредованным, через влияние пирацетама на другие системы организма, так и непосредственным, через воздействие пирацетама на окислительно-восстановительные процессы и синтез нуклеиновых кислот в иммунокомпетентных клетках.

ВЫВОДЫ:

1. У новорожденных, перенесших острую, хроническую и сочетанную гипоксию, отмечаются выраженные мембранодестабилизирующие процессы иммунокомпетентных клеток (лимфоцитов), которые опосредованы характером гипоксии, и проявляются нарушением активности ферментов трансмембранного транспорта, уровня интрацеллюлярного кальция, процессов ПОЛ и антиоксидантной системы, а также развитием патологических изменений иммунологического статуса.

2. Гипоксия плода и новорожденного приводит к нарушению активности ферментов трансмембранного транспорта и уровня интрацеллюлярного кальция, который наиболее высок у больных с хронической гипоксией. Это обусловлено, прежде всего, низкой активностью Са24-АТФазы. Компенсаторно в динамике неонатального периода отмечается повышение активности №+-К+-АТФазы, а особенно М^ 2+-АТФазы. Уровень активности ферментов взаимосвязан с характером гипоксии.

3. Активность процессов ПОЛ лимфоцитов, тестируемых по уровню ДК полиненасыщенных жирных кислот и флюоресцирующих ШО, у новорожденных с перинатальной гипоксией разнонаправлена, особенно в раннем неонатальном периоде: при повышении уровня ДК низкое содержание ШО. Это указывает на несостоятельность процессов нейтрализации.

4. У новорожденных с хронической и сочетанной гипоксией отмечаются изменения активности антиоксидантного фермента - СОД и антиперекисного -каталазы в лимфоцитах, что, вероятно, обусловлено адаптационно-компенсаторным влиянием материнского организма, направленным на сохранение липидной структуры иммунокомпетентных клеток.

5. Гипоксия у новорожденных ведет к выраженной дестабилизации липидной фазы цитомембран лимфоцитов, о чем свидетельствует значительное снижение суммарных фосфолипидов, особенно выраженное у новорожденных с сочетанной гипоксией.

6. Дестабилизация липидной структуры мембран лимфоцитов предопределяет нарушение формирования иммунологического статуса у новорожденных, перенесших гипоксию. Причем, наиболее значительные нарушения в виде депрессии иммунного ответа установлено у больных с сочетанной гипоксией.

7. Применение в комплексной терапии пирацетама повышает адаптационно-компенсаторные возможности организма новорожденных, перенесших хроническую и сочетанную гипоксию, что проявляется быстрым купированием патологических симптомов: более быстрая нормализация физиологических рефлексов, мышечного тонуса, стабилизация периферической гемодинамики, уменьшение симптомов гипоксической энцефалопатии, в основе которых лежат мембраностабилизирующие процессы: нормализация активности антиокси-дантной системы, процессов ПОЛ, активация системы глютатиона.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

1. Для повышения эффективности терапии у новорожденных с хронической и сочетанной гипоксией рекомендуется включение пирацетама из расчета 50 мг/кг в сутки в течение 10-12 дней, который оказывает выраженный церебропротекторный эффект и позволяет более быстро купировать патологические симптомы гипоксически-ишемического поражения ЦНС.

2. Дети, перенесшие острую, хроническую и сочетанную гипоксию, составляют группу "высокого риска" по развитию иммунодефицитных состояний и требуют проведения профилактики вирусно-бактериальных заболеваний.

3. Содержание и соотношение липидных фракций цитомембран лимфоцитов можно использовать для оценки уровня и глубины гипоксически-ишемических поражений мозга у новорожденных с различным характером гипоксии.

4. Результаты, полученные в настоящей работе, целесообразно включить в учебные программы студентов, субординаторов, интернов и врачей ФУВа.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Реагирование иммунокомпетентных клеток на стресс у новорожденных с перинатальной гипоксией // материалы 1 съезда РАСПМ. -Суздаль. - 1995. - С.240 (в соавт. с АД. Петрушиной, М.И. Сосланд, Т.Ф. Белогуровой).

2. Структурно-функциональная организация иммунокомпетентных клеток у новорожденных с перинатальной гипоксией // Материалы научно-практической конференции врачей, посвященной 50-летию областной клинической больницы: Тез. докл. - Тюмень. - 1994.- С. 36-37 (в соавт. с АД. Петрушиной, Т.Ф. Белогуровой, М.И. Сосланд).

3. Состояние резистентности цитомембран у новорожденных при различных видах гипоксии // Медицина и охрана здоровья / Тез. докл. международного симпозиума. - Тюмень.- 1996.- С. 59 (в соавт. с А.Д. Петрушиной, Е.М. Ершовой, М.И. Сосланд).

4. Состояние структурно-функциональной организации иммунокомпетентных клеток у новорожденных, перенесших острую гипоксию // Актуальные проблемы медицины / Тез. докл. научно-практической конференции, посвященной 20-летию 2 ГКБ. - Тюмень.- 1996.- С. 70.

5. Влияние гипоксии на структурно-функциональною организацию мембран иммунокомпетентных клеток (лимфоцитов) у детей в периоде новорожденное™ // Актуальные вопросы физиологии и патологии детского возраста / Тез. докл. - Белокуриха. - 1997.- С.129-130 (в соавт. с АД. Петрушиной).

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. Са2+-АТФаза - кальциевая аденозинтрифосфатаза

2. Ка+-К+-АТФаза - натрий-калиевая аденозинтрифосфатаза

3. М§2+-АТФаза - магниевая аденозинтрифосфатаза

4. Гл-б-ФДГ - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа

5. АТФ - аденозинтрифосфорная кислота

6. ДК - диеновые конъюгаты

7. ЛФХ - лизофосфатидилхолин

8. ОГ - острая гипоксия

9. ПОЛ - перекисное окисление липидов

10. РЭГ - реоэнцефалография

11. СГ - сочетанная гипоксия

12. СОД - супероксиддисмутаза

13. СФМ - сфингомиелин

14.УЗС - ультразвуковое сканирование г

15.ФС - фосфатидилсерин

16. ФХ - фосфатидилхолин

17. ФЭА - фосфатидилэтаноламин

18. ХГ - хроническая гипоксия

19. ШО - шиффовые основания

20. ЦНС - центральная нервная система