Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Влияние нейротрофического фактора головного мозга BDNF на состояние сетчатки в эксперименте

На правах рукописи

084599845

БАКАЕВА ЛАРИСА МЕВЛЕДИНОВНА

ВЛИЯНИЕ НЕЙРОТРОФИЧЕСКОГО ФАКТОРА ГОЛОВНОГО МОЗГА (ВБОТ) НА СОСТОЯНИЕ СЕТЧАТКИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

14.03.03 - патологическая физиология 14.01.07 - глазные болезни

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2010

1 АПР 2010

004599845

Работа выполнена на кафедре глазных болезней ГОУ ВПО Московского государственного Медико-стоматологического Университета на базе ФГУ «МНТК «Микрохирургии глаза» им. академика С.Н. Федорова Росмедтехнологии»

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Гаврилова Наталья Александровна доктор медицинских наук, профессор Чикина Наталья Андреевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Онищенко Нина Андреевна доктор медицинских наук, Иойлева Елена Эдуардовна

Ведущая организация: Российский Университет дружбы народов

Защита диссертации состоится «_» _2010 года в«_»часов

на заседании Диссертационного совета Д 001.003.01. при У РАМН НИИ общей патологии и патофизиологии Российской АМН по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, д.8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института Автореферат разослан «_»_2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Лариса Николаевна Скуратовская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время одной из важнейших медико-социальных проблем в отечественной и зарубежной офтальмологии является патология сетчатки и зрительного нерва, приводящая к значительному снижению зрения, слепоте и инвалидности. Функциональная реабилитация сетчатки и зрительного нерва при патологии различного генеза в настоящее время остается актуальной задачей офтальмологии.

Одной из основных причин слепоты и слабовидения в настоящее время в развитых странах является центральная инволюционная дистрофия (Beatty S. et al., 2001; Perry W.Y., 2002; Thornton J. et al., 2005; Clemons Т.Е. et al, 2005). В возрасте старше 40 лет заболевание развивается в 25-40% случаев, старше 60 лет - в 58-100% случаев (Klein R., Klein В., 2002). Первичная инвалидность при центральной инволюционной дистрофии регистрируется у лиц в работоспособном возрасте в 11 % случаев, в возрасте старше 60 лет - в 28% случаев (Либман Е. С. И др., 2006). Многочисленные исследования, проведенные в последние годы, указывают на прогрессирующее увеличение числа пациентов с центральной инволюционной дистрофией сетчатки (Либман Е.С. и др., 2000; La-Heij Е.С., 2001; Korner-Stiefbold U., 2001; Мошетова Л. К. и др., 2006).

Патология глазного дна воспалительной этиологии также является одной из основных причин инвалидности по зрению, что обусловливает социальную значимость этой группы заболеваний (Либман Е.С.и др., 2000; Южаков A.M. и др., 2000; Архипова Л.Т., 2006). В восстановительном лечении нуждаются от 50 до 90 % инвалидов по зрению при крайне незначительной реализации этой потребности в большинстве регионов - не более 13 % (Либман Е.С. и др., 2000; 2005).

За последнее десятилетие отмечено повышение в 2 раза уровня инвалидности с частичной атрофией зрительного нерва. Возросла доля трудноустранимой приобретенно-наследственной офтальмопатологии. У детей основными причинами слепоты и слабовидения остаются частичная атрофия зрительного нерва, дистрофия сетчатки и амблиопия, которые в детской глазной патологии составляют от 19,4 до 32,4% (Либман Е. С., 2000).

Несмотря на успехи, достигнутые в современной офтальмологии, слабовидение, слепота и инвалидность по зрению продолжают неуклонно возрастать. За последние 20 лет численность слепых и слабовидящих во всем мире увеличилась на 12 миллионов человек (Либман Е. С. и др., 2006).

Поиск и разработка новых методов лечения является актуальной проблемой офтальмологии.

Большие возможности для восстановления структуры и функции поврежденных тканей открывает регенеративная медицина с использованием нейротрофических факторов.

BDNF - белок с молекулярной массой 13 кило Дальтон, который принадлежит к классу цитокинов, семейству факторов роста и подсемейству

нейротрофинов; экспрессируется в глиальных и, преимущественно, в нейрональных клетках. ЕЮ№ играет важную роль в развитии и функционировании ЦНС, существенное значение имеет в развитии ее различных патологических состояний. В работах, посвященных исследованиям нейродегенеративных заболеваний, ишемических повреждений и травм ЦНС установлено, что ВО№ обладает выраженными нейропротективными свойствами, угнетает клеточный апоптоз, препятствует гибели нейронов и стимулирует рост холинэргических нервных волокон.

Результаты проведения первых зарубежных экспериментальных исследований свидетельствуют о том, что ВО№ в условиях патологии и повреждения выполняет функции нейропротектора и сохраняет жизнеспособность фоторецепторов и ганглиозных клеток сетчатки. Однако, незначительное число исследований, их единообразие (используемые экспериментальные модели, в основном - глаукомная и повреждение зрительного нерва, способ введения фактора - интравитреальный) и некоторая, при этом, противоречивость полученных результатов (уменьшение количества ТгкВ рецепторов ганглиозных клеток сетчатки при интравитреальном введении 1Ю№ животным без офтальмопатологии; увеличение жизнеспособности клеток при повторных инъекциях по результатам одних авторов и некоторый дозозависимый эффект по результатам других авторов) позволяют только сделать предположение о том, что ВОМ7 является реальным претендентом на роль нейропротектора в лечении патологии заднего отрезка глаза. Для подтверждения этого предположения и получения в дальнейшем рекомендаций по внедрению ВОМ7 в клиническую практику необходимо проведение детальных, всесторонних исследований его влияния на ткани глаза в условиях без повреждения, повреждения и патологии различного генеза, при различных дозах и способах его введения. Необходимо выявить наиболее оптимальные и полезные свойства ВБОТ в различных условиях й исключить его возможные отрицательные эффекты.

В настоящее время в различных областях биологии и медицины широко проводятся исследования, направленные на изучение возможностей применения генетически модифицированных клеток с трансфицированными генами нейротрофических факторов (ВООТ, ЭТ-З, 00№ и т.д.).

Решающим условием успешной генотерапии является обеспечение эффективной доставки, то есть трансфекции чужеродного гена в клетки-мишени, обеспечение длительного функционирования его в этих клетках и создание условий для полноценной работы гена.

Предполагается, что применение методов генно-клеточной терапии в офтальмологии может быть одним из самых приоритетных направлений, так как в этой области риск нежелательной трансфекции (переноса генетической информации) из-за относительной изолированности структур глазного яблока и риск онкогенеза, так как большинство клеток в тканях глаза не претерпевают деления, являются минимальными.

Результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о том, что генно-клеточные конструкции с геном ЕЮЫР, также как и рекомбинантный ВБОТ, в условиях патологии и повреждения выполняют нейропротективные функции и сохраняют жизнеспособность фоторецепторов и ганглиозных клеток сетчатки. Однако единичное число исследований позволяет сделать тоже только предположение о возможности применения генно-клеточных конструкций в лечении патологии заднего отрезка глаза. Кроме того, в работах используются только аденовирусные и аденовирусоассоциированные векторы, перед мировой же практикой в настоящее время стоит серьезная проблема замены вирусных векторов на более безопасные носители. В связи с этим необходимо проведение дальнейших, более детальных и всесторонних исследований, направленных на оптимизацию генно-клеточных конструкций, изучение возможности их применения в условиях повреждения и патологии различного генеза, различной степени выраженности, при различных дозах и способах введения.

Цель исследования изучить влияние рекомбинантного ВБ№ и клеточных систем его экспрессии на состояние сетчатки в эксперименте.

Задачи исследования

1. Изучить влияние рекомбинантного на состояние органотипических культур сетчатки.

2. Оценить характер изменений биоэлектрической активности интактной сетчатки экспериментальных животных и состояние ее структурной организации при интравитреальном и супрахориоидальном способах введения рекомбинантного ВОИБ и клеточных систем его экспрессии.

3. Определить сроки жизнеспособности (переживания) клеточных систем экспрессии ВОЫБ в тканях глаза и особенности их функционирования при различных способах введения в нормальных условиях и в условиях лазерного повреждения сетчатки.

4. Изучить динамику биоэлектрической активности сетчатки при различных способах введения рекомбинантного ВООТ и клеточных систем его экспрессии на модели лазерного повреждения сетчатки.

5. Оценить морфофункциональное состояние сетчатки после ее лазерного повреждения в зависимости от применения рекомбинантного ВО№, клеточных систем его экспрессии и различных способов их введения.

Научная новизна. На основании проведения исследования влияния рекомбинантного ВЭОТ на состояние органотипических культур сетчатки животных и человека и применения различных способов культивирования установлено, что при его концентрации 100 нг/мл увеличивается клеточная жизнеспособность в культурах, развиваются процессы активной клеточной миграции и роста [З-Ш-тубулин иммунопозитивных аксоноподобных отростков нейрональной природы.

Установлено, что рекомбинантный ВО№% особенно при супрахориоидальном способе введения, способствует активному восстановлению ретинального электрогенеза при его угнетении в результате инструментальной травмы предварительно интактной сетчатки; клеточные системы экспрессии 1Ю№ при супрахориоидальном введении вызывают повышение ее функциональной активности до суперномальных значений с последующей нормализацией показателей.

В условиях ретинального повреждения выявлено, что В1ЖР обладает нейропротекторными свойствами, степень выраженности которых, зависит от способа доставки фактора, концентрации и длительности его пребывания в тканях глаза.

Установлено, что генно-инженерные конструкции типа 07-1М и НЕК 293 обладают высокой жизнеспособностью при интравитреальном способе их введения и способностью к активной миграции к зоне повреждения.

Выявлено, что при супрахориоидальном способе введения рекомбинантного ВБ№ угнетение функциональной активности сетчатки при ее лазерном повреждении является менее выраженным и развивается в более отдаленные сроки.

Показано, что при супрахориоидальном использовании клеточных систем экспрессии ВОМ7 - 07-1М и НЕК 293, в течение первых двух недель сохраняется более высокая функциональная активность сетчатки, чем при использовании рекомбинантного фактора; при применении клеточной системы экспрессии НЕК 293 высокий функциональный результат сохраняется и в более отдаленные сроки наблюдения.

На основании данных гистоморфометрического анализа установлено, что наиболее активно репаративные процессы при лазерном повреждении сетчатки происходят при супрахориоидальном введении клеточных систем экспрессии ВВОТ, особенно НЕК 293.

Теоретическая и практическая значимость.

Впервые в экспериментальной офтальмологии в качестве клеточных систем экспрессии ВВОТ для изучения влияния фактора на состояние сетчатки использованы генно-инженерные конструкции типа 07-1М и НЕК 293.

Установлено, что рекомбинантный ВБ№ в дозе 100 нг/мл и клеточные системы его экспрессии 07-1М и НЕК 293 в дозе 500 000 при интравитреальном и супрахориоидальном способах их введения являются безопасными - не оказывают токсического действия на ткани глаза, не вызывают аллергических реакций и реакций иммунного отторжения при интравитреальном и супрахориоидальном способах их введения; что в условиях ретинального повреждения ВОКП7 обладает нейропротекторными свойствами, степень выраженности которых зависит от способа доставки фактора, концентрации и длительности его пребывания в тканях глаза и

наиболее высокий морфофункциональный результат наблюдается при использовании клеточных систем экспрессии ЕЮ№.

Полученные результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о целесообразности проведения дальнейших исследований, связанных с использованием ЕШ№ в клинической практике, и могут служить основой для разработки практических подходов его использования в офтальмологии.

Положения, выносимые на защиту.

1. В органотипических культурах сетчатки животных и человека при их культивировании с рекомбинантным ВО№ в концентрации 100 нг/мл повышается уровень клеточной жизнеспособности, увеличивается зона роста, активируются процессы клеточной миграции и формирования 0-111-тубулин иммунопозитивных аксоноподобных отростков.

2. Генно-инженерные конструкции 07-1М и НЕК 293, используемые в качестве клеточных систем экспрессии ВО№, обладают высокой жизнеспособностью и способностью к активной миграции в условиях лазерного повреждения сетчатки.

3. При интравитреальном и супрахориоидальном способах введения рекомбинантный ВО№ в дозе 100 нг и клеточные системы его экспрессии С7-1М и НЕК 293 в дозе 500 ООО являются безопасными, так как не вызывают аллергических реакций, реакций иммунного отторжения и не токсичны для тканей глаза; наличие у В ВОТ в условиях ретинального повреждения нейропротекторных свойств, степень выраженности которых, зависит от способа доставки фактора, концентрации и длительности его пребывания в тканях глаза.

4. Процесс активного восстановления электрогенеза при его угнетении в результате инструментальной травмы, предварительно интактной сетчатки, при интравитреальном и супрахориоидальном способах введения ВБ^; повышение функциональной активности сетчатки до суперномальных значений с последующей нормализацией показателей при супрахориоидальном введении клеточных систем экспрессии ВБ№.

5. Наличие при применении рекомбинантного ВБ№, особенно супрахориоидальном способе его введения, менее выраженного и более отсроченного эффекта угнетения функциональной активности сетчатки при ее лазерном повреждении; при супрахориоидальном применении клеточных систем экспрессии - на ранних сроках более высокой функциональной активности сетчатки, чем при использовании рекомбинантного фактора; при применении клеточной системы экспрессии НЕК 293 - более высокого функционального результата на протяжении длительного периода времени.

6. Наличие при лазерном повреждении сетчатки активно протекающих репаративных процессов при супрахориоидальном введении клеточных систем экспрессии ВО№, особенно НЕК 293.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на совместных научно-практических конференциях ФГУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова Росмедтехнологии» и кафедры глазных болезней ГОУ ВПО Московского государственного медико-стоматологического Университета, на юбилейной научно-практической конференции "Федоровские чтения - 2007" (Москва, 2007), на 7-ой Всероссийской научно-практической конференции "Федоровские чтения - 2008" (Москва, 2008).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 5 работ, из них 1 в журнале, рекомендованном ВАК РФ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста и состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и библиографического указателя. Работа иллюстрирована 3 таблицами и 32 рисунками. Библиографический указатель включает 251 литературных источников, из которых - 51 русскоязычный и 200 -иностранных.

Работа выполнена на кафедре глазных болезней ГОУ ВПО Московского государственного Медико-стоматологического Университета на базе ФГУ МНТК «Микрохирургии глаза» им. академика С.Н. Федорова Росмедтехнологии (генеральный директор и зав. кафедрой, д.м.н., проф. Х.П. Тахчиди); в группе нейрогенетики и генетики развития (рук. - д.б.н. Г.В. Павлова) при дирекции Института биологии гена (директор д.б.н., профессор, академик РАН Ю.В. Ильин); в лаборатории клеточной биологии и патологии развития (рук. - к.б.н. И.Н. Сабурина) Учреждения Российской АМН НИИ общей патологии и патофизиологии (директор - д.м.н., проф., академик РАМН A.A. Кубатиев).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В основе настоящего исследования лежат лабораторные исследования на органотипических культурах сетчатки и экспериментальные исследования на животных - 55 кроликах породы Шиншилла весом от 2,0 до 3,5 кг в возрасте 4-6 месяцев, 72 эксплантата сетчатки человека (постмортальный период) и 46 эксплантатов сетчатки 2-х месячных крыс. На них проведены две серии экспериментов.

Экспериментальные исследования на органотипических культурах

сетчатки.

Изоляция тканей и способы культивирования сетчатки. В работе использовались 2-х месячные крысы породы albino Wistar. Сразу после декапитации животных производили энуклеацию, изолированные глаза

промывали в 70% этиловом спирте в течение 5-10 минут и промывали в растворе Хэнкса. Вскрытие глазного яблока производили в охлажденной среде DMEM. Глазным скальпелем сначала делали прокол в области роговицы, затем ножницами для микрохирургии с загнутыми концами выполняли разрез в области лимба и удаляли ее; с помощью глазного пинцета и инъекционной иглы удаляли хрусталик и стекловидное тело; путем несильного воздействия на внешнюю поверхность глазного яблока пинцетом с гладкими кончиками отслаивали сетчатку от подлежащего пигментного эпителия, глазное яблоко при этом фиксировали пинцетом с зубцами за зрительный нерв. Выделенную сетчатку измельчали на фрагменты, размером 1-2 мм2, эксплантаты промывали раствором антибиотиков и помещали в культуральную чашку с полной питательной средой (DMEM/F12 с добавлением цитокинов, антибиотиков и 5% сыворотки). Транспортировка -MEM (medium minimum essential medium) с добавлением HEPES 3,57mg/ml, NaOH 0,3 mg/ml (pH 7.2) при 0 градусов в лабораторию.

Эксплантаты культивировали двумя способами - в прикрепленном виде в чашке Петри диаметром 30 мм и в роллере - флаконе, вращающемся со скоростью 60 об./мин. При роллерном культивировании фрагменты сетчатки сворачиваются и формируются сферические трехмерные структуры -ретинальные тельца.

Микроскопический морфологический анализ включал в себя определение способности клеток выселяться, мигрировать, давать отростки и дифференцироваться. Проводили количественную оценку роста культивируемых эксплантатов с использованием индекса площади (ИП) -отношение площади эксплантата, вместе с зоной выселяющихся клеток к исходной площади эксплантата на 14, 21 и 30 сутки. Значения ИП выражали в процентах, контрольное значение ИП принимали за 100 %.

Анализ на жизнеспособность клеток эксплантата сетчатки проводился на 14, 21 и 30 сутки с помощью окраски йодидом пропидия (PI) для выявления погибших клеток, а также использовали акридиновый оранжевый, который окрашивает живые клетки. Посредством флуоресцентного микроскопа производили прямой подсчет жизнеспособных клеток и погибших клеток на равновеликих участках.

Иммуногистохимический анализ. По окончании эксперимента эксплантаты промывали фосфатным буфером и фиксировали 4% раствором параформальдегида в физиологическом растворе с добавлением 0,01 молярного фосфатного буфера при pH 7,4 в течение 20 минут при 4°С. После промывания фиксированных прикрепленных эксплантатов в фосфатном буфере дно культуральной чашки подсушивали и эксплантаты с выселившимися клетками окружали гидрофобной полоской, после чего проводили их иммуногистохимическую окраску. Для этого использовали метод непрямого иммуногистохимического окрашивания с использованием коктейля моноклональных мышиных антител к маркеру коммитированных нейробластов - ß-III тубулину в разведении 1:100 (Chemicon, MAB 1637) и

поликлональных кроличьих антител к маркеру глиальных клеток - кислому глиальному фибриллярному белку - GFAP в разведении 1:80 (Sigma, G9269). Реакцию с первичными антителами проводили в течение 12 часов при 4°С. После промывки в фосфатном буфере эксплантаты покрывали смесью вторичных антител к иммуноглобулину кролика, меченых Техасским красным (красное свечение при зеленом освещении) и антител к иммуноглобулину мыши меченых Су 2 (зеленое свечение при синем освещении) оба в разведении 1:100.

Достоверность различий в контрольных и опытных образцах оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.

Экспериментальные исследования на животных.

Характеристика экспериментального материала.

Работа проводилась на 55 кроликах (110 глаз) породы Шиншилла серый (половозрелые животные, весом 2,5-3,0 кг). Проведено два экспериментальных исследования, каждое из которых включало несколько серий экспериментов.

Первый экспериментальный фрагмент работы - исследование результатов применения рекомбинантного BDNF и клеточных систем его экспрессии при интравитреальном и супрахориоидальном способах введения.

Выполнено две серии экспериментальных исследований. В первой серии эксперимента было произведено однократное введение рекомбинантного BDNF в дозе 100 нг в 0,1 мл сбалансированного физиологического р-ра (СФР) интравитреально (4 глаза) и супрахориоидально (4 глаза) в такой же дозе в 0,02 мл СФР. Во второй серии эксперимента интравитреально и супрахориоидально вводили виде суспензии клеточные системы экспрессии нейротрофического BDNF - G7-1M в дозе 500 тыс. в 0,1 и 0,02 мл СФР, соответственно (3 и 4 глаза) и НЕК 293 в количестве 500 тыс. в 0,1 и в 0,02 мл СФР, соответственно (3 и 4 глаза). В контрольный глаз вводили 0,02мл. СФР (4 глаза).

Второй экспериментальный фрагмент работы - исследование влияния рекомбинантного BDNF и клеточных систем его экспрессии на состояние сетчатки животных с лазерным повреждением (очаговыми дистрофическими изменениями) сетчатки при интравитреальном и супрахориоидальном способах введения.

Выполнено две серии экспериментальных исследований. В первой серии эксперимента на следующий день после лазерного повреждения BDNF вводили интравитреально (7 кроликов - 7 глаз) в дозе 100 нг в 0,1 мл сбалансированного физиологического р-ра (СФР) и в такой же дозе в 0,02 мл СФР супрахориоидально (7 кроликов - 7 глаз). Во второй серии эксперимента интравитреально и супрахориоидально вводили клеточные системы экспрессии нейротрофического BDNF - G7-1M в дозе 500 тыс. в 0,1 и 0,02

мл СФР, соответственно (3 глаза и 7 глаз) и НЕК 293 в виде суспензии в количестве 500 тыс. в 0,1 и 0,02мл СФР, соответственно (3 глаза и 6 глаз).

В контрольный глаз на всех этапах и во всех сериях работы вводили объем сбалансированного физиологического раствора, эквивалентный используемому опытному объему в каждом конкретном случае.

Модель лазерного повреждения - модель очаговых дистрофических изменений сетчатки.

С помощью аргоновой лазерной установки производили лазерное повреждение обоих глаз. Коагуляты наносились в нижней половине глазного дна, по 200 коагулятов на каждом экспериментальном глазу. Средняя мощность излучения составляла 300 мВт, длительность экспозиции 0,1 сек, диаметр пятна 200 мкм. По классификации L' Esperance световой ожог в таких условиях соответствует 3-ей степени (L' Esperance F., 1983).

Повреждение сетчатки при сверхпороговом лазерном воздействии характеризуется, как правило, нарушением ультраструктуры клеток вплоть до изменения архитетектоники хориоретинальной области. Повреждение сетчатки как результат прямого термического воздействия развивается в пигментном эпителии, сопровождается некрозом ядер в наружном зернистом слое, некрозом внутренних и наружных сегментов фоторецепторов (Seiler М. et al., 1991).

Способы введения BDNF и клеточных систем его экспрессии

Наркоз - подкожно 5% раствор кетамина гидрохлорид - 40 мг/кг, 0,5% раствор реланиума - 2 мг/кг, 1% раствор димедрола 1 мг/кг. После инстилляции в конъюнктивальную полость раствора 0,5% раствора дикаина и гентамицина, веки фиксировали блефаростатом, под контролем операционного микроскопа фирмы «Opton (CFC-6) в верхненаружном квадранте делали разрез конъюнктивы. BDNF и клеточные системы его экспрессии вводили интравитреально в проекции плоской части цилиарного тела или супрахориоидально с использованием шприца Hamilton (серия 750LT) и субретинальной канюли 41Ga (Dork 1270-01). Операцию завершали иньекцией Sol.Dexasoni 0,5 мл под коньюктиву.

В послеоперационном периоде животные получали антисептики в инсталляциях в течение двух недель.

Клеточные системы экспрессии BDNF

Клеточные системы экспрессии BDNF разработаны в группе нейрогенетики и генетики развития Института биологии гена РАН (д.б.н. Павлова Г.В., к.б.н. Рыбалкина Е.Ю., к.б.н. Ревищин А.В.)

Клеточная система экспрессии В О МГ - (?7-7М

На основе вектора рСаБрег создается генно-инженерная конструкция (рис.1), которая содержит ген человеческого мозгового нейротрофического фактора, поставленный под промотор гена белка теплового шока, благодаря которому он активируются при температуре 37°С. Методом блот-гибридизации по Саузерну подтверждается, что конструкция с геном ВБОТ встраивается в геном линии 07-1М, методом блот-гибридизации по Нозерну

- наличие экспрессии встроенного гена и установлено, что экспрессия мРНК, индуцированная повышением температуры до температуры теплового шока

- 37°С происходит на всех стадиях эмбрионального развития. Для ксенотрансплантации используются диссоциированные клетки нервной системы.

Преимущества клеточной системы экспрессии В0№ - 07-1М -промотор имеет невирусное происхождение и является регулируемой структурой - активируется при температуре 37°С, обеспечивая высокий уровень синтеза продукта, кратковременность действия системы - срок жизни трансгенных эмбриональных нервных клеток менее месяца, отсутствие склонности клеток - носителей к делению, оказывает антиглиозное действие (Павлова Г.В., 2009).

Xbai SmRl

Рис. 1. Схема конструкции на базе вектора pCaSper, содержащей ген BDNF человека под промотором белка теплового шока HSP70. hsp 70 prom.- промотор белка теплового шока HSP 70 .

Клеточная система экспрессии НЕК 293

Генно-инженерная конструкция для введения человеческого гена BDNF синтезирована на основе вектора EGFP-N1, содержащего CMV промотор и

маркерный ген флуоресцентного белка GFP (зеленый). В этот вектор был встроен нейральный человеческий ген BDNF. В результате была получена конструкция, несущая гены BDNF и GFP под общим CMV промотором. Клетки линии НЕК293 были трансфицированы плазмидой, содержащей химерный ген BDNF/GFP и ген устойчивости к неомицину (NEO). Трансфекцию проводили с помощью реагента «ExGen 500 in vitro Transfection Reagent» (Fermentas) в соответствии с протоколом фирмы. Для получения стабильно трансфицированных клеток проводили селекцию на среде содержащей неомицин (500 мкг/мл). Все отобранные клетки при анализе на флуоресцентном микроскопе имели зеленое свечение при рассматривании с системой фильтров для FITC. Анализ полученных культур проводили методом Саузерн-блот анализа. Для проверки нормальной транскрипции РНК был проведен Нозерн-блот анализ. Данный анализ показал, что ген BDNF нормально работает во всех вариантах.

Данная конструкция обеспечивает более длительную продукцию нейротрофического фактора и также, как G7-1M оказывает антиглиозное действие (Павлова Г.В., 2009).

Для визуализации клеточный материал перед трансплантацией окрашивали ядерным люминесцентным красителем бизбензимидом («Hoechst 33342», «Serva»).

В ходе эксперимента животных обследовали с использованием традиционных методик биомикроскопии и офтальмоскопии, производились фоторегистрация глазного дна и электроретинографические исследования для объективной оценки степени и характера изменений функционального состояния сетчатки.

Биомикроскопия проводилась на щелевой лампе «SL-30» фирмы «Opton» (Германия). Клиническая оценка состояния переднего отрезка глаза проводилась по признакам наличия или отсутствия воспалительной и аллергической реакций. Офтальмоскопия выполнялась с помощью непрямого бинокулярного офтальмоскопа Скепенс с использованием асферической линзы 20 и 28 Д фирмы «Nikon» (Япония). Клиническая оценка состояния глазного дна проводилась по признакам купирования отека в области поврежденного участка, степени пигментации коагулятов, которые оценивали по бальной системе, разработанной Н.В.Пак (2004 г.)

Электрофизиологические исследования. ЭРГ регистрировали с помощью контактной линзы-электрода. В глаза предварительно закапывали 0,5% раствор дикаина и 1% раствор мидриацила (цель - исключить влияние диаметра зрачка на результаты опыта). Референтный и заземляющие электроды помещали подкожно в скальпе животного. ЭРГ регистрировали с помощью электрофизиологической системы фирмы «Amplaid» МК-15 (Италия). Электрофизиологические исследования в первом экспериментальном фрагменте проводили до введения, на 1-е, 7-е, 14-е и 21 сутки после введения BDNF, во втором - до коагуляции, на 7-е, 14-е и 30 сутки после введения BDNF.

Морфологические исследования. Выведены животные из эксперимента в первом фрагменте были на 21 сутки, во втором - на 14-е и 30-е сутки. На энуклеированных глазах проводилось патогистологическое исследование. Глаза подопытных кроликов фиксировали с помощью перфузии 4% раствором параформальдегида на физиологическом растворе и фосфатном буфере (pH 7,4). Для этого кровяное русло промывали физиологическим раствором через канюлю вставленную в сердце. Затем тем же путем пропускали фиксирующий раствор (4% формальдегид в фосфатном буфере на физиологическом растворе). Глаза извлекали из орбит и делали надрез горизонтальный роговицы, через который извлекали хрусталик. Глаза фиксировали в том же фиксаторе в холодильнике (+4°С) в течение 12-15 часов. После этого глаза заключали в парафин через спирты обычным способом. Изготавливали вертикальные срезы всего глаза толщиной 10 мкм. Каждый 50-й срез наклеивали на предметное стекло, депарафинировали и окрашивали красителем Гимза (Giemsa) и через спирты заключали в среду DPX. Каждый 100-й срез подвергали морфометрическому микроскопическому анализу. Изготавливали цифровые микрофоторгафии дегенеративных участков сетчатки. С помощью программы "Image Tool" проводили измерения линейных размеров участков сетчатки, на которых полностью отсутствовали фоторецепторы. Далее вычисляли средние транссекционные размеры поражений. Морфометрические измерения были проведены на 20-30 срезах, содержащих лазерное повреждение.

Иммуногистохимические исследования. Для визуализации клеточного материала при его супрахориоидальном введении производили окрашивание ядерным люминесцентным красителем бизбензимидом («Hoechst 33342», «Serva»),

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные исследовании на органотипических культурах

сетчатки.

Анализ индекса площади эксплантатов сетчатки выявил достоверное увеличение индекса площади в эксплантатах, культивируемых с BDNF по сравнению с контролем как на 14, 21 так и на 30 сутки. Таким образом, выявлено, что на 30 сутки культивирования зона роста эксплантатов, культивируемых с BDNF увеличивается в 3 раза, по сравнению с контролем (диаграмма №1).

По результатам анализа клеток сетчатки на жизнеспособность на 14, 21 и 30 сутки в эксплантатах контроля было выявлено наличие обширных очагов клеточной гибели, как внутри, так и на поверхности эксплантатов. В эксплантатах, культивируемых с BDNF, очаги клеточной гибели были значительно меньше (диаграмма №2).

Диаграмма №1. Индекс площади (зона роста) эксплантатов, культивируемых с ВГЖ'Р- фактором и без него.

Контроль ■ С BDNF-фактором

Диаграмма №2. Жизнеспособность клеток сетчатки в эксплантатах, культивируемых с ВО№- фактором и без него.

100 75 /

50 -—

У

25 у -

А ян шгазг ш ФЖ1ВИ ■ к

14 сутки 21 сутки 30 сутки

Контроль ■ С BDNF-фактором

После иммуногистохимической окраски на 30 сутки культивирования в зоне расселения клеток из эксплантатов, культивируемых с BDNF, образовывались пучки сильно разветвленных отростков, длина которых была значительно больше, чем на 21 сутки. На препаратах,

иммуногистохимически окрашенных на GFAP и Tubulin, определялось наличие утолщений на тубулин позитивных отростках. В эксплантатах, культивируемых в присутствии BDNF, было найдено большое количество GFAP иммунонегативных - pill-тубулин иммунопозитивных клеток с аксоноподобными тубулин-позитивными отростками, распространяющимися

за пределы тела эксплантата. За пределами эксплантата волокна распространялись по поверхности выселившихся клеток, но за зону их распространения не выходили. Образование обширных сетей отростков вне эксплантата наблюдалось в местах наибольшей плотности выселившихся клеток. Наличие экспрессии рШ-тубулина свидетельствует о принадлежности данных клеток к нейрональному ряду. В контроле клетки, экспрессирующие Р-Ш-тубулин, были выявлены только в глубине эксплантатов и в очень незначительном количестве. Аксоноподобные Р-Ш-тубулин позитивные отростки были очень тонкие, определялись только в теле эксплантата и никогда не выходили за его пределы, в отличие от опыта.

В эксплантатах сетчатки крыс, культивируемых с ВБОТ и без него, получены результаты сходные с результатами, полученными на сетчатке человека.

Экспериментальные исследования на животных

В результате проведения гистологических исследований при интравитреальном и супрахориоидальном способах введения ВООТ никаких изменений структуры сетчатки выявлено не было, нетипично расположенных клеток в супрахориоидальном пространстве и стекловидном теле не обнаружено, нарушений структуры сетчатки и пигментного эпителия в месте введения не выявлено. При интравитреальном введении клеток 07-1М и НЕК 293 с трансгеном ВБОТ в стекловидном теле было выявлено наличие единичных, рассеянно расположенных клеток; основная масса клеточного материала была расположена в непосредственной близости от внутренней поверхности сетчатки или на ней. Клетки распределялись единично и группами, плотность их распределения резко уменьшалась по мере удаления от места введения. В ткани сетчатки эктопически расположенных нетипичных клеток обнаружено не было. При супрахориоидальном введении клеточных систем 07-1М и НЕК 293 с трансгеном ВБ№, окрашенных бизбензимидом, на 21 день после трансплантации определялось наличие единичных клеток с люминесцентным свечением, расположенных в хориоидее, в наружных и внутренних слоях сетчатки, но в основном определялось лишь остаточное диффузное свечение в ткани сетчатки, что свидетельствует о разрушении трансплантируемого клеточного материала.

Через сутки после лазерной коагуляции отмечалось наличие поверхностной и глубокой сосудистой инъекции, которая сохранялась в течение 4-5 дней, других изменений со стороны переднего отрезка глаза выявлено не было на протяжении всего срока наблюдения. Достоверных различий по состоянию глазного дна и каких-либо временных различий между опытными и контрольными глазами выявлено не было.

При проведении микроскопического анализа срезов сетчатки экспериментальных животных в опытных и контрольных глазах в зонах

лазерного воздействия было выявлено наличие дегенеративных изменений. По размерам и степени выраженности поражения участки существенно различались. Наблюдалось наличие небольших (50-300 микрометров) участков, соответствующих единичному локальному лазерному поражению и, в ряде случаев участков, расположенных по периферии, с глубокой дегенерацией и значительной площадью поражения.

Дегенеративные очаги представляли собой хорошо ограниченное нарушение архитектоники с вовлечением в процесс всех слоев сетчатки, сопровождающееся разрушением и дезорганизацией фоторецепторного слоя, большинства нейронов в наружном и внутреннем ядерных слоях.

В первой серии эксперимента в результате морфометрического анализа было выявлено, что на 14 сутки эксперимента средний размер первичных очагов дегенерации в опытных глазах был меньше, чем в контрольных, при интравитреальном способе введения рекомбинантного ЕШЫР - в 5 случаях из 7, при супрахориоидальном - во всех. Статистически достоверные различия между опытом и контролем наблюдались в 28% и 57% случаев, соответственно. На 30 сутки эксперимента по результатам морфометрического анализа достоверных различий по размерам зон первичной лазерной дегенерации выявлено не было. Нетипично расположенных клеток в супрахориоидальном пространстве и стекловидном теле не было обнаружено, нарушений структуры сетчатки и пигментного эпителия в месте введения В БОТ выявлено не было.

Во второй серии эксперимента при супрахориоидальном введении клеточных систем экспрессии ВБОТ, независимо от типа конструкции, средний размер первичных очагов дегенерации на 14 сутки в опытных глазах был меньше, чем в контрольных у всех животных. Статистически достоверные различия между опытом и контролем были выявлены в 57% и 67% случаев, соответственно. На 30 сутки эксперимента средний размер первичных очагов дегенерации в опытных глазах животных с клеточными системами экспрессии 07-1М и НЕК -293 был меньше, чем в контрольных, соответственно, в 1,3 и 1,5 раза и опытных глазах с рекомбинантным ВБИР в 1,5 раза

При интравитреальном введении клеток С7-1М и НЕК 293 с трансгеном В БОТ в стекловидном теле было выявлено наличие единичных, рассеянно расположенных клеток; основная масса клеточного материала была расположена в непосредственной близости от внутренней поверхности сетчатки или на ней. Клетки распределялись единично и группами, плотность их распределения увеличивалась по направлению к заднему полюсу глаза, до зоны лазерного повреждения. В ткани сетчатки были обнаружены эктопически расположенные нетипичные клетки. При супрахориоидальном введении клеточных систем 07-1М и НЕК 293, окрашенных бизбензимидом, на 14 сутки после трансплантации было выявлено наличие немногочисленных клеток с люминесцентным свечением,

расположенных в хориоидее, в наружных и внутренних слоях сетчатки, на 30 сутки в основном определялось остаточное диффузное свечение ткани сетчатки, что свидетельствует о разрушении трансплантируемого клеточного материала к этому сроку.

Таким образом^ на основании данных иммуногистохимических исследований установлено, что при интравитреальном и супрахориоидальном способах введения ВБОТ никаких изменений структуры сетчатки не наблюдается, жизнеспособность клеточных систем экспрессии ВОМ5 - 07-1М и НЕК 293, как и в нормальных условиях более продолжительная при интравитреальном способе введения (до 30 суток), располагаются они в непосредственной близости от внутренней поверхности сетчатки или на ней, способны к миграции, тропны к очагу поражения.

На основании данных ЭРГ установлено, что при использовании рекомбинантного ВО№, особенно супрахориоидальном способе его введения угнетение функциональной активности сетчатки при ее лазерном повреждении является менее выраженным и развивается в более отдаленные сроки; на 7 сутки эксперимента при супрахориоидальном способе введения ВБ№ амплитуда а- и в-волн ЭРГ в опытных глазах выше, чем в контрольных на 23 и 21%, соответственно; на 14 сутки - на 14% и 28%; менее существенные различия наблюдаются на 30 сутки. При супрахориоидальном использовании клеточных систем экспрессии ВОМ7 -07-1М и НЕК 293, в течение первых двух недель после лазерного повреждения сохраняется более высокая функциональная активность сетчатки, чем при использовании рекомбинантного фактора, независимо от типа клеточной системы; при использовании НЕК 293 высокий функциональный результат сохраняется и в более отдаленные сроки наблюдения - амплитуда а- и -в-волны выше, чем у животных с клеточной конструкцией 07- 1М в 1,5 и 1,6 раза, соответственно, и выше, чем при супрахориоидальном способе введения рекомбинантного ВОЫЕ в 1,3 раза.

На основании данных гистоморфометрического анализа установлено, что на 14 сутки эксперимента при интравитреальном и супрахориоидальном способах введения ВОЫР средний размер первичных очагов дегенерации в опытных глазах в 28% и 57% случаев, соответственно, достоверно меньше, чем в контрольных; при супрахориоидальном введении клеточных систем экспрессии ВВ№ - 07-1М и НЕК 293 в 57% и 67% случаев, соответственно; на 30 сутки эксперимента средний размер первичных очагов дегенерации в опытных глазах животных с клеточными системами экспрессии 07- 1М и НЕК -293 меньше, чем в контрольных, соответственно, в 1,3 и 1,5 раза и опытных глазах с рекомбинантным БОМБ в 1,5 раза.

Полученные результаты измерений свидетельствуют о том, что наиболее активно репаративные процессы при лазерном повреждении сетчатки происходят при супрахориоидальном введении клеточных систем экспрессии особенно НЕК 293

ВЫВОДЫ

1. В органотипических культурах сетчатки при культивировании с ВО№ в концентрации 100 нг/мл увеличивается клеточная жизнеспособность, развиваются процессы активной клеточной миграции и роста Р-Ш-тубулин иммунопозитивных аксоноподобных отростков нейрональной природы; зона роста эксплантатов на 21 и 30 сутки больше, чем в контроле, соответственно, в 2 и 3 раза.

2. Рекомбинантный ВО№, особенно при супрахориоидальном способе введения, способствует активному восстановлению электрогенеза сетчатки при его угнетении в ответ на инструментальную травму предварительно интактной сетчтаки; клеточные системы экспрессии ВБ№ при супрахориоидальном введении вызывают повышение ее функциональной активности - амплитуда в-волны ЭРГ увеличивается до суперномальных значений с нормализацией показателей к 21 суткам.

Изменений структуры сетчатки, нетипично расположенных клеток при интравитреальном и супрахориоидальном способах введения рембинантного ВОда и клеточных систем его экспрессии не выявлено.

3. Клеточные системы экспрессии ВО№ - С7-1М и НЕК 293 обладают высокой жизнеспособностью, особенно при интравитреальном способе введения (до 30 суток) и способностью к активной миграции в зону повреждения сетчатки.

4. При супрахориоидальном способе введения рекомбинантного В БОТ угнетение функциональной активности сетчатки при ее лазерном повреждении является менее выраженным и развивается в более отдаленные сроки - на 7 сутки эксперимента амплитуда а- и в-волн ЭРГ в опытных глазах выше, чем в контрольных на 23 и 21%, соответственно; на 14 сутки -на 14% и 28%; на 30 сутки наблюдаются менее существенные различия.

5. При супрахориоидальном способе введения клеточных систем экспрессии ВО№ - 07-1М и НЕК 293 в течение первых двух недель после лазерного повреждения сохраняется более высокая функциональная активность сетчатки, чем при использовании рекомбинантного фактора; при использовании клеточной системы экспрессии НЕК 293 высокий функциональный результат сохраняется и в более отдаленные сроки наблюдения - на 30 сутки амплитуда а- и -в-волны ЭРГ выше, чем у животных с клеточной конструкцией 07-1М в 1,5 и 1,6 раза, соответственно, и выше, чем у животных с супрахориоидальным введением рекомбинантного ВЭ№ в 1,3 раза.

6. Наиболее активно репаративные процессы при лазерном повреждении сетчатки происходят при супрахориоидальном введении клеточных систем экспрессии особенно НЕК 293; на 30 сутки эксперимента средний размер первичных очагов дегенерации в опытных глазах животных с клеточными системами экспрессии С7-1М и НЕК -293 меньше, чем в

контрольных, соответственно, в 1,3 и 1,5 раза и в опытных глазах с рекомбинантным BDNF в 1,5 раза.

7. Рекомбинантный BDNF в дозе 100 нг и клеточные системы его экспрессии G7-1M и НЕК 293 в дозе 500 000 являются безопасными, не оказывают токсического действия на ткани глаза, не вызывают аллергических реакций и реакций иммунного отторжения при интравитреальном и супрахориоидальном способах их введения; в условиях ретинального повреждения BDNF обладает нейропротекторными свойствами, степень выраженности которых зависит от способа доставки фактора, концентрации и длительности его пребывания в тканях глаза.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Гаврилова H.A., Ланевская H.H., Бакаева Л.М., Борзенок С.А., Павлова Г.В., Ревищин A.B., Рыбалкина Е.Ю., Сабурина И.Н, Сергеев С.А. Влияние нейротрофического фактора головного мозга - BDNF на органотипические культуры сетчатки // Юбилейная научно-практическая конференция "Федоровские чтения - 2007": Материалы. - М.- 2007.- С.240.

2. Сергеев С.А., Кошелева Н.В., Бакаева Л.М., Ревищин A.B., Семенова М.Н., Сабурина И.Н. Влияние нейротрофического фактора головного мозга (BDNF) на эксплантаты сетчатки крыс и человека in vitro// III Международный междисциплинарный Конгресс «Нейронаука для медицины и психологии». -Судак., Крым, Украина. - 2007.- С. 180.

3. Гаврилова H.A., Ланевская Н.И., Бакаева Л.М., Борзенок С.А., Павлова Г.В., Ревищин A.B., Рыбалкина Е.Ю., Сабурина И.Н., Влияние нейротрофического фактора головного мозга - BDNF на органотипические культуры сетчатки // Обьедененный тучный журнал, 2008,- №13 (219).- С. 23-28.

4. Гаврилова H.A., Ланевская Н.И., Бакаева Л.М., Борзенок С.А., Павлова Г.В., Ревищин A.B., Рыбалкина Е.Ю.,Шацких A.B. Сабурина И.Н, Сергеев С.А. Влияние нейротрофического фактора головного мозга - BDNF на органотипические культуры сетчатки // Юбилейная научно-практическая конференция "Федоровские чтения - 2008": Материалы. - М.- 2008.- С. 319.

5. Гаврилова H.A., Ланевская Н.И., Бакаева Л.М., Борзенок С.А., Павлова Г.В., Ревищин A.B., Рыбалкина Е.Ю.,Шацких A.B. Сабурина И.Н, Сергеев С.А. Влияние нейротрофического фактора головного мозга - BDNF на органотипические культуры сетчатки // Офтальмохирургия, 2009, №1,- С. 44-47.

Bakaeva Larisa Mevledinovna

Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) influence on o status of retina in experiment

Now one of the major medical social problems in ophthalmology is the retina and optic nerve pathology leading to considerable decrease of sight, blindness and physical inability. Functional rehabilitation of a retina and an optic nerve it case of various genesis pathology remains now an actual problem of ophthalmology.

In the presents research we studied effects recombinant BDNF (brain-derived neurotrophic factor) and cellular systems of its expression G7-1M and HEK 293 on retinal explants of rats, the human being and on model of laser damage of animals a retina. In this study we have shown that BDNF and cellular systems of its expression G7-1M and HEK 293 possesses expressed neurotrophic and neuroprotective properties; cellular systems of its expression G7-1M and HEK 293 possess high viability and ability to active migration in the conditions of laser damage of a retina. Also it is established that recombinant BDNF and cellular systems of its expression G7-1M and HEK 293 are safe, do not render toxic action on ocular tissue, do not cause allergic reactions and reactions of immune rejection.

This research has shown that application of recombinant BDNF and cellular systems of its expression G7-1M and HEK 293 is one of effective methods of treatment for a sevare disease retina and optic nerve.

Формат А5

Бумага офсетная №1-80 г/м2 Усл. Печ. л.0,87. Тираж 100 экз. Заказ N32

Отпечатано в РИО МГМСУ Изд. Лицензия ИД№04993 от 04.06.2001 года Москва, 127473 Делегатская ул., д. 20, стр. 1

Актуальность проблемы. В настоящее время одной из важнейших медико-социальных проблем в отечественной и зарубежной офтальмологии является патология сетчатки и зрительного нерва, приводящая к значительному снижению зрения, слепоте и инвалидности.

Функциональная реабилитация сетчатки и зрительного нерва при патологии различного генеза в настоящее время остается актуальной задачей офтальмологии.

Одной из основных причин слепоты и слабовидения в настоящее время в развитых странах является центральная инволюционная дистрофия (Beatty S. et al., 2001; Perry W.Y., 2002; Thornton J. et al., 2005; Clemons Т.Е. et al, 2005). В возрасте старше 40 лет заболевание развивается в 25-40% случаев, старше 60 лет - в 58-100% случаев (Klein R., Klein В., 2002). Первичная инвалидность при центральной инволюционной дистрофии регистрируется у лиц в работоспособном возрасте в 11% случаев, в возрасте старше 60 лет - в 28% случаев (Либман Е. С. И др., 2006). Многочисленные исследования, проведенные в последние годы, указывают на прогрессирующее увеличение числа пациентов с центральной инволюционной дистрофией сетчатки (Либман Е.С. и др., 2000; La-Heij Е.С., 2001; Мошетова Л. К. и др., 2006). Korner-Stiefbold U., 2001.

Патология глазного дна воспалительной этиологии также является одной из основных причин инвалидности по зрению, что обусловливает социальную значимость этой группы заболеваний (Либман Е.С.и др., 2000; Южаков A.M. и др., 2000; Архипова Л.Т., 2006). В восстановительном лечении нуждаются от 50 до 90 % инвалидов по зрению при крайне незначительной реализации этой потребности в большинстве регионов - не более 13 % (Либман Е.С. и др., 2000; 2005).

За последнее десятилетие отмечено повышение в 2 раза уровня инвалидности с частичной атрофией зрительного нерва. Возросла доля трудноустранимой приобретенно-наследственной офтальмопатологии. У детей основными причинами слепоты и слабовидения остаются частичная атрофия зрительного нерва, дистрофия сетчатки и амблиопия, которые в детской глазной патологии составляют от 19,4 до 32,4% (Либман Е. С., 2000).

Несмотря на успехи, достигнутые в современной офтальмологии, слабовидение, слепота и инвалидность по зрению продолжают неуклонно возрастать. За последние 20 лет численность слепых и слабовидящих во всем мире увеличилась на 12 миллионов человек (Либман Е. С. И др., 2006).

Поиск и разработка новых методов лечения является актуальной проблемой офтальмологии.

Большие возможности для восстановления структуры и функции поврежденных тканей открывает регенеративная медицина с использованием нейротрофических факторов.

BDNF - это белок с молекулярной массой 13 килоДальтон, который принадлежит к классу цитокинов, семейству факторов роста и подсемейству нейротрофинов; экспрессируется в глиальных и, преимущественно, в нейрональных клетках. Впервые этот фактор был описан в 1987 г.

BDNF играет важную роль в развитии и функционировании ЦНС и существенное имеет значение в развитии ее различных патологических состояний. В работах, посвященных исследованиям нейродегенеративных заболеваний, ишемических повреждений и травм ЦНС установлено, что BDNF обладает выраженными нейропротективными свойствами, угнетает клеточный апоптоз, препятствует гибели нейронов и стимулирует рост холинэргических нервных волокон.

Результаты проведения первых зарубежных экспериментальных исследований свидетельствуют о том, что BDNF в условиях патологии и повреждения выполняет функции нейропротектора и сохраняет жизнеспособность фоторецепторов и ганглиозных клеток сетчатки. Однако, незначительное число исследований, их единообразие (используемые экспериментальные модели, в основном - глаукомная и повреждение зрительного нерва, способ введения фактора - интравитреальный) и некоторая, при этом, противоречивость полученных результатов (уменьшение количества TrkB рецепторов ганглиозных клеток сетчатки при интравитреальном введении BDNF животным без офтальмопатологии; увеличение жизнеспособности клеток при повторных инъекциях по результатам одних авторов и некоторый дозозависимый эффект по результатам других авторов) позволяют только сделать предположение о том, что BDNF является реальным претендентом на роль нейропротектора в лечении патологии заднего отрезка глаза. Для подтверждения этого предположения и получения в дальнейшем рекомендаций по внедрению BDNF в клиническую практику необходимо проведение детальных, всесторонних исследований его влияния на ткани глаза в условиях без повреждения, повреждения и патологии различного генеза, при различных дозах и способах его введения. Необходимо выявить наиболее оптимальные и полезные свойства BDNF в различных условиях и исключить его возможные отрицательные эффекты.

В настоящее время в различных областях биологии и медицины широко проводятся исследования, направленные на изучение возможностей применения генетически модифицированных клеток с трансфицированными генами нейротрофических факторов (BDNF, NT-3, GDNF и т.д.).

Решающим условием успешной генотерапии является обеспечение эффективной доставки, то есть трансфекции чужеродного гена в клетки-мишени, обеспечение длительного функционирования его в этих клетках и создание условий для полноценной работы гена.

Предполагается, что применение методов генно-клеточной терапии в офтальмологии может быть одним из самых приоритетных направлений, так как в этой области риск нежелательной трансфекции (переноса генетической информации) из-за относительной изолированности структур глазного яблока и риск онкогенеза, так как большинство клеток в тканях глаза не претерпевают деления, являются минимальными.

Результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о том, что генно-клеточные конструкции с геном BDNF, также как и рекомбинантный BDNF, в условиях патологии и повреждения выполняют нейропротективные функции и сохраняют жизнеспособность фоторецепторов и ганглиозных клеток сетчатки. Однако единичное число исследований позволяет сделать тоже только предположение о возможности применения генно-клеточных конструкций в лечении патологии заднего отрезка глаза. Кроме того, в работах используются только аденовирусные и аденовирусоассоциированные векторы, перед мировой же практикой в настоящее время стоит серьезная проблема замены вирусных векторов на более безопасные носители. В связи с этим необходимо проведение дальнейших, более детальных и всесторонних исследований, направленных на оптимизацию генно-клеточных конструкций, изучение возможности' их применения в условиях повреждения и патологии различного генеза, различной степени выраженности, при различных дозах и способах введения.

В связи с этим- цель исследования - изучить влияние рекомбинантного BDNF и клеточных систем-его экспрессии на состояние сетчатки в эксперименте.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Изучить влияние рекомбинантного BDNF на состояние органотипических культур сетчатки.

2. Оценить характер изменений биоэлектрической активности интактной сетчатки экспериментальных животных и состояние ее структурной организации при интравитреальном и супрахориоидальном способах введения рекомбинантного BDNF и клеточных систем его экспрессии.

3. Определить сроки жизнеспособности (переживания) клеточных систем экспрессии BDNF в тканях глаза и особенности их функционирования при различных способах введения в нормальных условиях и в; условиях лазерного повреждения сетчатки.

4. Изучить динамику биоэлектрической активности сетчатки при различных способах введения рекомбинантного BDNF и клеточных систем его экспрессии на модели лазерного повреждения.

5. Оценить морфофункциональное состояние сетчатки после: ее лазерного повреждения в зависимости от применения рекомбинантного BDNF, клеточных систем его экспрессии и различных способов их введения.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

На основании проведения исследования влияния рекомбинантного BDNF на состояние органотипических культур сетчатки животных и человекам и применения различных способов культивирования установлено, что при. его концентрации 100 нг/мл увеличивается клеточная жизнеспособность в культурах, развиваются процессы активной, клеточной миграции и роста (3-1II-. тубулин иммунопозитивных аксоноподобных отростков нейрональной природы.

Установлено^ что рекомбинантный BDNF, особенно при супрахориоидальном способе введения, способствует активному восстановлению ретинального электрогенеза при его угнетении в результате инструментальной травмы предварительно интактной сетчатки; клеточные системы экспрессии BDNF при супрахориоидальном введении вызывают повышение ее функциональной активности до суперномальных значений с последующей нормализацией; показателей.

В условиях рети налы юго повреждения выявлено; что BDNF обладает нейропротекторными свойствами, степень выраженности которых, зависит от способа доставки фактора, концентрации и длительности его пребывания в тканях глаза.

Установлено, что генно-инженерные конструкции типа G7-1M и НЕК 293 обладают высокой жизнеспособностью при интравитреальном способе их введения и способностью к активной миграции к зоне повреждения.

Выявлено, что при супрахориоидальном способе введения рекомбинантного BDNF угнетение функциональной активности сетчатки при ее лазерном повреждении является менее выраженным и развивается в более отдаленные сроки.

Показано, что при супрахориоидальном использовании клеточных систем экспрессии BDNF - G7-1M и НЕК 293, в течение первых двух недель сохраняется более высокая функциональная активность сетчатки, чем при использовании рекомбинантного фактора; при применении клеточной системы экспрессии НЕК 293 высокий функциональный результат сохраняется и в более отдаленные сроки наблюдения.

На основании данных гистоморфометрического анализа установлено; что наиболее активно репаративные процессы при лазерном повреждении сетчатки происходят при супрахориоидальном введении клеточных систем, экспрессии BDNF, особенно НЕК 293.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Впервые в экспериментальной офтальмологии в качестве клеточных систем экспрессии BDNF для изучения влияния фактора на состояние сетчатки использованы генно-инженерные конструкции типа G7-1M и НЕК 293.

Установлено, что рекомбинантный BDNF в дозе 100 нг и клеточные системы его экспрессии G7-1M и НЕК 293 в дозе 500 000 при интравитреальном и супрахориоидальном способах их введения являются безопасными - не оказывают токсического действия на ткани глаза, не вызывают аллергических реакций и реакций иммунного отторжения при интравитреальном и супрахориоидальном способах их введения; что в условиях ретинального повреждения BDNF обладает нейропротекторными свойствами, степень выраженности которых зависит от способа доставки фактора, концентрации и длительности его пребывания в тканях глаза и наиболее высокий морфофункциональный результат наблюдается при использовании клеточных систем экспрессии BDNF.

Полученные результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о целесообразности и перспективности проведения дальнейших исследований^ связанных с использованием BDNF в клинической практике, и являются базой для разработки практических подходов его использования в офтальмологии.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. В органотипических культурах сетчатки животных и человека при их культивировании с рекомбинантным BDNF в- концентрации 100 нг/мл повышается, уровень клеточной жизнеспособности; увеличивается зона; роста; активируются процессы клеточной миграции: и формирования (З-Ш-тубулин иммунопозитивных аксоноподобных отростков; .

2. Генно-инженерные конструкции? G7-1 М и НЕК 293; используемые в качестве клеточных систем экспрессии BDNF, обладают высокой- жизнеспособностью и способностью к активной миграции в условиях лазерного повреждения сетчатки.

3. При интравитреальном и: супрахориоидальном? способах введения, рекомбинантный BDNF в, дозе: 100 нг и клеточные системы его экспрессии G7-1М и НЕК 293 в дозе 500 ООО являются безопасными, так как не вызывают аллергических реакций, реакций иммунного отторжения и не токсичны для тканей глаза; наличие у BDNF в условиях ретинального повреждения? нейропротекторных свойств, степень выраженности? которых, зависит от способа доставки фактора, концентрации и длительности его пребывания в тканях глаза:

4. Процесс активного восстановления электрогенеза? при его угнетении в результате инструментальной травмы, предварительно интактной сетчатки, при? интравитреальном и супрахориоидальном способах введения BDNF; повышение функциональной активности сетчатки до суперномальных значений с последующей нормализацией показателей при супрахориоидальном введении клеточных систем экспрессии BDNF.

5. Наличие при применении рекомбинантного BDNF, особенно супрахориоидальном способе его введения, менее выраженного и более отсроченного эффекта угнетения функциональной активности сетчатки при ее лазерном повреждении; при супрахориоидальном применении клеточных систем экспрессии BDNF - на ранних сроках более высокой функциональной активности сетчатки, чем при использовании рекомбинантного фактора; при применении клеточной системы экспрессии НЕК 293 - более высокого функционального результата на протяжении длительного периода времени.

6. Наличие при лазерном повреждении сетчатки активно протекающих репаративных процессов при супрахориоидальном введении клеточных систем экспрессии BDNF, особенно НЕК 293.

Апробация работы

Основные положения диссертации* доложены и обсуждены на совместных научно-практических конференциях ФГУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова Росмедтехнологии» и кафедры глазных болезней ГОУ ВПО Московского государственного медико-стоматологического университета, на юбилейной научно-практической конференции1 "Федоровские чтения - 2007" (Москва, 2007), на 8-ой Всероссийской научно-практической конференции "Федоровские чтения - 2008" (Москва, 2008). Апробация диссертации проведена на научно-клинической конференции ФГУ МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова Росмедтехнологии» (протокол клинической конференции от 16 октября 2009г.)

ПУБЛИКАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, из них 1 в журнале, рекомендованном ВАК РФ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста, содержит 32 рисунка, 3 таблицы. Работа состоит из введения, обзора литературы, трех глав собственных исследований, заключения и выводов. Библиография включает 251 литературных источников, из них 51 отечественных и 200 зарубежных авторов.

ВЫВОДЫ

1. В органотипических культурах сетчатки при культивировании с BDNF в концентрации 100 нг/мл увеличивается клеточная жизнеспособность, развиваются процессы активной клеточной миграции и роста [З-Ш-тубулин иммунопозитивных аксоноподобных отростков нейрональной природы; зона роста эксплантатов на 21 и 30 сутки больше, чем в контроле, соответственно, в 2 и 3 раза.

2. Рекомбинантный BDNF, особенно при супрахориоидальном способе введения, способствует активному восстановлению электрогенеза сетчатки при его угнетении в ответ на инструментальную травму предварительно интактной сетчтакщклеточные системы экспрессии BDNF при супрахориоидальном введении вызывают повышение ее функциональной активности - амплитуда в-волны ЭРГ увеличивается до суперномальных значений с нормализацией показателей к 21 суткам.

Изменений структуры сетчатки, нетипично расположенных клеток при интравитреальном и супрахориоидальном способах введения рембинантного BDNF и клеточных систем его экспрессии не выявлено.

3. Клеточные системы экспрессии BDNF - G7-1M и НЕК 293 обладают высокой жизнеспособностью, особенно при интравитреальном способе введения (до 30 суток) и способностью к активной миграции в зону повреждения сетчатки.

4. При супрахориоидальном способе введения рекомбинантного BDNF угнетение функциональной активности сетчатки при ее лазерном повреждении является менее выраженным и развивается в более отдаленные сроки - на 7 сутки эксперимента амплитуда а- и в-волн ЭРГ в опытных глазах выше, чем в контрольных на 23 и 21%, соответственно; на 14 сутки - на 14% и 28%; на 30 сутки наблюдаются менее существенные различия.

5. При супрахориоидальном способе введения клеточных систем экспрессии BDNF - G7-1M и НЕК 293 в течение первых двух недель после лазерного повреждения сохраняется более высокая функциональная активность сетчатки, чем при использовании рекомбинантного фактора; при использовании клеточной системы экспрессии НЕК 293 высокий функциональный результат сохраняется и в более отдаленные сроки наблюдения - на 30 сутки амплитуда а- и -в-волны ЭРГ выше, чем у животных с клеточной конструкцией G7-1M в 1,5 и 1,6 раза, соответственно, и выше, чем у животных с супрахориоидальным введением рекомбинантного BDNF в 1,3 раза.

6. Наиболее активно репаративные процессы при лазерном повреждении сетчатки происходят при супрахориоидальном введении клеточных систем экспрессии BDNF, особенно НЕК 293; на 30 сутки эксперимента средний размер первичных очагов дегенерации в опытных глазах животных с клеточными системами экспрессии G7-1M и НЕК -293 меньше, чем в контрольных, соответственно, в 1,3 и 1,5 раза и в опытных глазах с рекомбинантным BDNF в 1,5 раза.

7. Рекомбинантный BDNF в дозе 100 нг и клеточные системы его экспрессии G7-1М и НЕК 293 в дозе 500 000 являются безопасными, не оказывают токсического действия на ткани глаза, не вызывают аллергических реакций и реакций иммунного отторжения при интравитреальном и супрахориоидальном способах их введения; в условиях ретинального повреждения BDNF обладает нейропротекторными свойствами, степень выраженности которых зависит от способа доставки фактора, концентрации и длительности его пребывания в тканях глаза.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Работа состояла из двух экспериментальных разделов.

Первый раздел работы был посвящен изучению влияния BDNF на органотипические культуры сетчатки. В работе было использовано 72 эксплантата сетчатки человека.Преимуществами роллерного метода культивирования являются максимальная сохранность цитоархитектоники и межклеточных взаимоотношений; отсутствие клеточного влияния культуральной среды. В связи с тем, что, несмотря на значительные преимущества, роллерный метод культивирования имеет некоторые недостатки (отсутствие ясной морфологической картины в центре «ретинальных телец» и высокая трудоемкость) в работе был использован второй метод культивирования - в прикрепленном виде.

BDNF добавлялся в среду в концентрации 100 нг/мл - эффективная концентрация, которая была определена предварительно в экспериментах с культивацией клеток сетчатки и определением их жизнеспособности. Культивирование производилось в течение 30 суток.

Для оценки полученных результатов проводился микроскопический морфологический анализ - определялась способность клеток выселяться, мигрировать, давать отростки и дифференцироваться. Для количественной оценки роста культивируемых эксплантатов использовался индекс площади (ИП) - отношение площади эксплантата, вместе с зоной выселяющихся клеток к исходной площади эксплантата. Значение ИП выражалось в процентах, контрольное значение ИП принималось за 100 %. Проводился анализ клеток на жизнеспособность с использованием флуорохромных красителей (акридинового оранжевого - окрашивает живые клетки и пропидия йодистого - окрашивает ядерную ДНК гибнущих клеток) путем определения отношения количества жизнеспособных клеток к общему числу клеток. Оба исследования проводились на 7, 14, 21 и 30 сутки культивирования. Затем проводилось иммуногистохимическое исследование (метод непрямого иммуногистохимического окрашивания) с использованием коктейля моноклональных мышиных антител к маркеру нейробластов - (3-Ш тубулину и поликлональных кроличьих антител к маркеру глиальных клеток - кислому глиальному фибриллярному белку - GFAP; затем смеси вторичных антител к иммуноглобулину кролика, меченых Техасским красным (красное свечение при зеленом освещении) и антител к иммуноглобулину мыши меченых Су 2 (зеленое свечение при синем освещении).

В течение первых 5-7 суток культивирования происходило оседание и распластывание эксплантатов сетчатки человека по дну культуральной чашки; небольшое количество клеток выселялось из эксплантата на дно. По результатам анализа клеток сетчатки на жизнеспособность на 7 сутки в эксплантатах, культивируемых без BDNF, было выявлено наличие обширных очагов клеточной гибели, как внутри, так и на поверхности эксплантатов. В эксплантатах, культивируемых с BDNF, очагов клеточной гибели были значительно меньше.

На 14 день культивирования происходило дальнейшее выселение клеток из эксплантата на дно культуральной чашки и их расселение по значительной территории. По результатам окраски на жизнеспособность в эксплантатах сетчатки, культивируемых без BDNF, наблюдалось значительное расширение зон клеточной гибели внутри эксплантатов и разрушение неприкрепленных краевых участков эксплантатов; нарушение структуры и некроз в краевых зонах. В прикрепившихся эксплантатах при культивировании с BDNF, в отличие, от контроля, очагов клеточной гибели найдено не было. Выявлено небольшое количество погибших клеток в краевых участках эксплантата, не прикрепившихся к дну чашки. В эксплантатах, культивируемых с BDNF, начинали формироваться многочисленные длинные разветвленные отростки, выходящие за пределы эксплантатов. В контроле формировалось незначительное количество коротких отростков.

На 17 и, особенно, на 21 сутки культивирования продолжалось выселение клеток из эксплантата на дно чашки. В эксплантатах, культивируемых с BDNF, происходило дальнейшее увеличение числа отростков, их длины и разветвленности. В эксплантатах, культивируемых без BDNF, число и длина отростков практически не увеличивались. Окраска на жизнеспособность показала, что в эксплантатах, культивируемых с BDNF, на 21 сутки наблюдается небольшое расширение зон клеточной гибели, тогда как в контроле остается лишь небольшое количество живых клеток вблизи кровеносных сосудов и на поверхности эксплантатов.

На 30 сутки культивирования в зоне расселения клеток из эксплантатов, культивируемых с BDNF, образовывались пучки сильно разветвленных отростков, длина которых была значительно больше, чем на 21 сутки. На препаратах, иммуногистохимически окрашенных на GFAP и Tubulin, определялось наличие утолщений на тубулин позитивных отростках. В эксплантатах, культивируемых в присутствии BDNF, было найдено большое количество GFAP иммунонегативных - (ЗШ-тубулин иммунопозитивных клеток с аксоноподобными тубулин-позитивными отростками, распространяющимися за пределы тела эксплантата. За пределами эксплантата волокна распространялись по поверхности выселившихся клеток, но за зону их распространения не выходили. Образование обширных сетей отростков вне эксплантата наблюдалось в местах наибольшей плотности выселившихся клеток. Наличие экспрессии {3111-тубулина свидетельствует о принадлежности данных клеток к нейрональному ряду. В контроле клетки, экспрессирующие [З-Ш-тубулин, были выявлены только в глубине эксплантатов и в очень незначительном количестве. Аксоноподобные (З-Ш-тубулин позитивные отростки были очень тонкие, определялись только в теле эксплантата и никогда не выходили за его пределы, в отличие от опыта.

В эксплантатах сетчатки крыс, культивируемых с BDNF и без него, получены результаты сходные с результатами, полученными на сетчатке человека.

По результатам количественного анализа установлено, что индекс площади эксплантатов, культивируемых с BDNF, на 14, 21 и 30 сутки инкубации достоверно увеличивается соответственно на 25, 40 и 70%. В контроле этот показатель остается практически без изменений.

Количественный анализ жизнеспособности клеток сетчатки показал, что в эксплантатах, культивируемых с BDNF, через 30 суток культивирования жизнеспособными остаются 64% клеток, в контроле клеточная жизнеспособность не превышала 10%.

В условиях роллерного культивирования на 14 день инкубации в эксплантатах сетчатки с BDNF наблюдалось образование длинных, не разветвленных отростков, выходящих за пределы культивируемого образца при концентрации BDNF в культуральной среде - 100 нг/мл. В контроле и при меньшей концентрации BDNF (50 нг/мл) видимых различий обнаружено не было.

Таким образом, по результатам исследования было установлено, что в органотипических культурах сетчатки при культивировании с BDNF в концентрации 100 нг/мл развиваются процессы активной клеточной миграции и роста (З-Ш-тубулип иммунопозитивных аксоноподобных отростков нейрональной природы; на 21 и 30 сутки, соответственно, увеличиваются, по сравнению с контролем, зона роста эксплантатов в 2 и 3 раза, клеточная жизнеспособность - в 3 и 4 раза.

Второй раздел работы - изучение влияния BDNF на состояние сетчатки экспериментальных животных.

Работа проводилась на 55 кроликах (110 глаз) породы Шиншилла серый (половозрелые животные, весом 2,5-3,0 кг). Проведено два экспериментальных исследования, каждое из которых включало несколько серий экспериментов.

В первом экспериментальном фрагменте работы проводилось исследование результатов применения рекомбинантного BDNF и клеточных систем его экспрессии при интравитреальном и супрахориоидальном способах введения. Было выполнено две серии экспериментальных исследований. В пеой серии эксперимента было произведено однократное введение рекомбинантного BDNF в дозе 100 нг в 0,1 мл сбалансированного физиологического р-ра (СФР) интравитреально (4 глаза) и супрахориоидально (4 глаза) в такой же дозе в 0,02 мл СФР. Во второй серии эксперимента интравитреально и супрахориоидально вводили виде суспензии клеточные системы экспрессии нейротрофического BDNF - G7-1M в дозе 500 тыс. в 0,1 и 0,02 мл СФР, соответственно (3 и 4 глаза) и НЕК 293 в количестве 500 тыс. в 0,1 и в 0,02 мл СФР, соответственно (3 и 4 глаза). В контрольный глаз вводили 0,02мл. СФР (4 глаза).

Во втором экспериментальном фрагменте работы проводилось исследование влияния рекомбинантного BDNF и клеточных систем его экспрессии на состояние сетчатки животных с лазерным повреждением (очаговыми дистрофическими изменениями) сетчатки при интравитреальном и супрахориоидальном способах введения. Было выполнено две серии экспериментальных исследований. В первой серии эксперимента на следующий день после лазерного повреждения BDNF вводили интравитреально (7 кроликов - 7 глаз) в дозе 100 нг в 0,1 мл сбалансированного физиологического р-ра (СФР) и в такой же дозе в 0,02 мл СФР супрахориоидально (7 кроликов - 7 глаз). Во второй серии эксперимента интравитреально и супрахориоидально вводили клеточные системы экспрессии нейротрофического BDNF - G7-1M в дозе 500 тыс. в 0,1 и 0,02 мл СФР, соответственно (3 глаза и 7 глаз) и НЕК 293 в виде суспензии в количестве 500 тыс. в 0,1 и 0,02мл СФР, соответственно (3 глаза и 6 глаз).

В контрольный глаз на всех этапах и во всех сериях работы вводили объем сбалансированного физиологического раствора, эквивалентный используемому опытному объему в каждом конкретном случае.

В работе использовалась модель лазерного повреждения - модель очаговых дистрофических изменений сетчатки. С помощью аргоновой лазерной установки производилось лазерное повреждение обоих глаз. Коагуляты наносились в нижней половине глазного дна, по 200 коагулятов на каждом экспериментальном глазу. Средняя мощность излучения составляла 300 мВт, длительность экспозиции 0,1 сек, диаметр пятна 200 мкм.

Повреждение сетчатки при сверхпороговом лазерном воздействии характеризуется, как правило, нарушением ультраструктуры клеток вплоть до изменения архитетектоники хориоретинальной области. Повреждение сетчатки как результат прямого термического воздействия развивается в пигментном эпителии, сопровождается некрозом ядер в наружном зернистом слое, некрозом внутренних и наружных сегментов фоторецепторов (Seiler М. et al., 1991).

Используемые в работе клеточные системы экспрессии BDNF были разработаны в лаборатории нейрогенетики и генетики развития Института биологии гена РАН (д.б.н. Павлова Г.В., к.б.н. Рыбалкина Е.Ю., к.б.н. Ревищин А.В.)

Клеточная система экспрессии BDNF - G7-1M - генно-инженерная конструкция на основе вектора CaSper, которая содержит ген человеческого мозгового нейротрофического фактора, поставленный под промотор гена белка теплового шока, благодаря которому он активируются при температуре 37°С. Конструкция вводится в эмбрионы дрозофилы линии Df(l)w67c23(2)- Методом блот-гибридизации по Саузерну подтверждается, что конструкция с геном BDNF встраивается в геном линии G7-1M, методом блот-гибридизации по Нозерну -наличие экспрессии встроенного гена и установлено, что экспрессия мРНК, индуцированная повышением температуры до температуры теплового шока -37°С происходит на всех стадиях эмбрионального развития. Для ксенотрансплантации используются диссоциированные клетки нервной системы личинок.

Преимуществами клеточной системы экспрессии BDNF - G7-1M - промотор являются невирусное происхождение и наличие регулируемой структуры -активация при температуре 37°С, что обеспечивает высокий уровень синтеза продукта и кратковременность действия системы - срок жизни трансгенных эмбриональных нервных клеток менее месяца, отсутствие склонности клеток -носителей к делению, оказывает антиглиозное действие (Павлова Г.В., 2009).

Клеточная система экспрессии НЕК 293 - генно-инженерная конструкция, синтезированная на основе вектора EGFP-N1, содержащего CMV промотор и маркерный ген флуоресцентного белка GFP (зеленый); в вектор встраивается нейральный человеческий ген BDNF. В результате чего получается конструкция, несущая гены BDNF и GFP под общим CMV промотором. Клетки линии НЕК293 трансфицированы плазмидой, содержащей химерный ген BDNF/GFP и ген устойчивости к неомицину (NEO). Трансфекция проводится с помощью реагента «ExGen 500 in vitro Transfection Reagent» (Fermentas) в соответствии с протоколом фирмы. Для получения стабильно трансфицированных клеток проводится селекция на среде содержащей неомицин (500 мкг/мл). Все отобранные клетки при анализе на флуоресцентном микроскопе имеют зеленое свечение при рассматривании с системой фильтров для FITC. Анализ полученных культур проводился методом Саузерн-блот анализа. Для проверки нормальной транскрипции РНК проведился Нозерн-блот анализ, свидетельствующий о том, что ген BDNF нормально работает во всех вариантах. Данная конструкция обеспечивает более длительную продукцию нейротрофического фактора и также, как G7-1M оказывает антиглиозное действие (Павлова Г.В., 2009).

Для визуализации клеточный материал перед трансплантацией окрашивался ядерным люминесцентным красителем бизбензимидом.

В ходе эксперимента животных обследовали с использованием традиционных методик биомикроскопии и офтальмоскопии, производились фоторегистрация глазного дна и электроретинографические исследования для объективной оценки степени и характера изменений функционального состояния сетчатки.

Клиническая оценка состояния переднего отрезка глаза проводилась по признакам наличия или отсутствия воспалительной и аллергической реакций. Клиническая оценка состояния глазного дна проводилась по признакам купирования отека в области поврежденного участка, степени пигментации коагулятов, которые оценивали по бальной системе, разработанной Н.В.Пак (2004 г.). Электрофизиологические исследования в первом экспериментальном фрагменте проводили до введения, на 1-е, 7-е, 14-е и 21 сутки после введения BDNF, во втором - до коагуляции, на 7-е, 14-е и 30 сутки после введения BDNF. Выведены животные из эксперимента в первом фрагменте были на 21 сутки, во втором - на 14-е и 30-е сутки. На энуклеированных глазах проводилось патогистологическое исследование и морфометрический микроскопический анализ (измерения были проведены на 20-30 срезах, содержащих лазерное повреждение). Для визуализации клеточного материала при его супрахориоидальном введении производили окрашивание ядерным люминесцентным красителем бизбензимидом. Морфологические и иммуногистохимические исследования проводились в лаборатории нейрогенетики и генетики развития Института биологии гена РАН (к.б.н. Ревищин А.В.).

Клинически за все время наблюдения за животными со стороны переднего отрезка глаза, как в опыте, так и в контроле патологических изменений не наблюдалось. Отмечалось только наличие умеренной гиперемии конъюнктивы, преимущественно в зоне вмешательства, сохранявшейся в течение 4-5 дней. При офтальмологическом обследовании на глазном дне после введения BDNF и клеточных систем его экспрессии не было выявило никаких изменений.

По результатам электрофизиологического исследования в первые сутки после введения во всех экспериментальных группах отмечалось угнетение функциональной активности наружных слоев сетчатки. Было выявлено умеренное снижение амплитуды а-волны ЭРГ на 15-20% и в-волны - на 25-30% от индивидуальной исходной нормы. Существенных отличий по данным ЭРГ в опыте и контроле в указанный период времени выявлено не было, что позволило нам расценить полученные результаты как ответную реакцию наружных слоев сетчатки на интраокулярную инъекцию. На 7 сутки в первой серии эксперимента в опытных глазах наблюдалось постепенное восстановление электрогенеза, на 14 сутки амплитуда а- и в-волн приближалась к исходному уровню, более активно процесс восстановления происходил при супрахориоидальном введении BDNF. На 7-14 сутки во второй серии эксперимента наблюдалось наличие умеренных супернормальных значений амплитуды в-волны ЭРГ, на 21 день амплитуда в-волны соответствовала исходным значениям. В контроле на 7 сутки было выявлено наличие более выраженной депрессии - а-волна ЭРГ была снижена на 20-25% от исходных значений, в-волна - на 30-35%. Восстановление электрогенеза наблюдалось на 21 сутки.

В результате проведения гистологических исследований при интравитреальном и супрахориоидальном способах введения BDNF никаких изменений структуры сетчатки выявлено не было, нетипично расположенных клеток в супрахориоидальном пространстве и стекловидном теле не обнаружено, нарушений структуры сетчатки и пигментного эпителия в месте введения не выявлено. При интравитреальном введении клеток G7-1M и НЕК 293 с трансгеном BDNF в стекловидном теле было выявлено наличие единичных, рассеянно расположенных клеток; основная масса клеточного материала была расположена в непосредственной близости от внутренней поверхности сетчатки или на ней. Клетки распределялись единично и группами, плотность их распределения резко уменьшалась по мере удаления от места введения. В ткани сетчатки эктопически расположенных нетипичных клеток обнаружено не было. При супрахориоидальном введении клеточных систем G7-1M и НЕК 293 с трансгеном BDNF, окрашенных бизбензимидом, на 21 день после трансплантации определялось наличие единичных клеток с люминесцентным свечением, расположенных в хориоидее, в наружных и внутренних слоях сетчатки, но в основном определялось лишь остаточное диффузное свечение в ткани сетчатки, что свидетельствует о разрушении трансплантируемого клеточного материала.

Таким образом, на основании клинико-функциональных и морфологических исследований нами было установлено, что рекомбинантный BDNF в дозе 100 нг и клеточные системы его экспрессии G7-1M и НЕК 293 в дозе 500 тыс. не оказывают токсического действия на ткани глаза, не вызывают аллергических реакций и реакций иммунного отторжения без проведения иммуносупрессии и являются оптимальными для интравитреального и супрахориоидального введения. Выявлено, что жизнеспособность клеточных систем экспрессии более продолжительная при интравитреальном способе введения (не менее 21 дня), располагаются они в непосредственной близости от внутренней поверхности сетчатки или на ней и не мигрируют. Установлено, что рекомбинантный BDNF, особенно при супрахориоидальном способе его введения, быстро компенсирует возникающую ответную реакцию сетчатки на травмирующее инструментальное воздействие, клеточные системы экспрессии BDNF при супрахориоидальном способе введения, несмотря на более короткий период жизнедеятельности, вызывают повышение ее функциональной активности.

Во втором экспериментальном фрагменте работы проводилось исследование влияния рекомбинантного BDNF и клеточных систем его экспрессии на состояние сетчатки животных с лазерным повреждением сетчатки при интравитреальном и супрахориоидальном способах введения.

Через сутки после лазерной коагуляции отмечалось наличие поверхностной и глубокой сосудистой инъекции, которая сохранялась в течение 4-5 дней, других изменений со стороны переднего отрезка глаза выявлено не было на протяжении всего срока наблюдения. Достоверных различий по состоянию глазного дна и каких-либо временных различий между опытными и контрольными глазами выявлено не было.

В первой экспериментальной серии была получена следующая динамика электрогенеза сетчатки. На 7 сутки после лазерного повреждения при интравитреальном способе введения BDNF амплитуда а- и b-волны ЭРГ на OD составляла в среднем 58% и 85% от исходной величины, на OS - 45% и 70% соответственно. На 14 и 30 сутки эксперимента угнетение ЭРГ продолжало постепенно увеличиваться. При интравитреальном способе введения в опытных глазах сохранялись незначительно более высокие значения амплитуды а- и вволн. Наиболее значительная разница между опытом и контролем наблюдалась при супрахориоидальном способе введения BDNF. Амплитуда а- и в-волны в опыте составляла на 7 сутки 61% и 89% от исходной величины, на 14 сутки - 52% и 78%, соответственно, в контроле - на 7 сутки 48% и 68%, на 14 сутки - 38 и 50%. На 30 "сутки показатели ЭРГ при супрахориоидальном способе введения были на 10% выше, чем при интравитреальном.

Полученные данные по ретинальному электрогенезу в первой серии эксперимента свидетельствуют о том, что при использовании BDNF, особенно супрахориоидальном способе его введения угнетение функциональной активности сетчатки при ее лазерном повреждении является менее выраженным, чем в контрольной группе и развивается в более отдаленные сроки. На 7 сутки эксперимента амплитуда а- и в-волн ЭРГ в опытных глазах выше, чем в контрольных на 23 и 21%, соответственно; на 14 сутки - на 14% и 28%; менее существенные различия (10%) наблюдаются на 30 сутки.

Во второй серии эксперимента наиболее высокая функциональная активность сетчатки в течение первых двух недель сохранялась при использовании клеточных систем экспрессии BDNF, разница с контролем являлась статистически достоверной. На 7 сутки эксперимента при введении G7-1М амплитуда а- и b-волны ЭРГ на OD составляла в среднем 70% и 93% от исходной величины, на OS - 1% и 67% соответственно; при введении НЕК 293 -на OD - 63% и 96% от исходной величины, на OS - 48% и 63% соответственно. В течение следующей недели наблюдалось незначительное снижение ЭРГ на экспериментальных глазах - амплитуда а- и -в-волны на 14 сутки при введении G7-1M составляла 61% и 80% соответственно, при введении НЕК -293 - 62% и 88%. На 30 сутки показатели ЭРГ у животных с клеточной конструкцией НЕК -293 снижались, но продолжали оставаться на достаточно высоком уровне, амплитуда а- и -в-волны была выше, чем у животных с клеточной конструкцией G7-1M в 1,5 и 1,6 раза, соответственно, и выше, чем при супрахориоидальном способе введения рекомбинантного BDNF 1,3 раза.

Таким образом, данные ЭФИ второй серии экспериментов свидетельствуют о том, что при использовании клеточных систем экспрессии BDNF - G7-1M и НЕК 293, в течение первых двух недель сохраняется более высокая функциональная активность сетчатки, чем при использовании рекомбинантного фактора; при использовании НЕК 293 высокий функциональный результат наблюдается и в отдаленные сроки наблюдения.

При проведении микроскопического анализа срезов сетчатки экспериментальных животных в опытных и контрольных глазах в зонах лазерного воздействия было выявлено наличие дегенеративных изменений. По размерам и степени выраженности поражения участки существенно различались. Наблюдалось наличие небольших (50-300 микрометров) участков, соответствующих единичному локальному лазерному поражению и, в ряде случаев участков, расположенных по периферии, с глубокой дегенерацией и значительной площадью поражения.

Дегенеративные очаги представляли собой хорошо ограниченное нарушение архитектоники с вовлечением в процесс всех слоев сетчатки, сопровождающееся разрушением и дезорганизацией фоторецепторного слоя, большинства нейронов в наружном и внутреннем ядерных слоях.

Формирование крупных очагов дегенерации на периферии могло быть связано со случайным повреждением сосуда, в результате чего развивается ишемическая дегенерация дистально расположенных областей сетчатки, кровоснабжаемых данным сосудом. В связи с этим дополнительно для объективной оценки полученных результатов эксперимента нами отдельно производился анализ первичных (менее 300 микрометров) очагов дегенерации.

В первой серии эксперимента в результате морфометрического анализа было выявлено, что на 14 сутки эксперимента средний размер первичных очагов дегенерации в опытных глазах был меньше, чем в контрольных, при интравитреальном способе введения рекомбинантного BDNF - в 5 случаях из 7, при супрахориоидальном - во всех. Статистически достоверные различия между опытом и контролем наблюдались в 28% и 57% случаев, соответственно. На 30 сутки эксперимента по результатам морфометрического анализа достоверных различий по размерам зон первичной лазерной дегенерации выявлено не было. Нетипично расположенных клеток в супрахориоидальном пространстве и стекловидном теле не было обнаружено, нарушений структуры сетчатки и пигментного эпителия в месте введения BDNF выявлено не было.

Во второй серии эксперимента при супрахориоидальном введении клеточных систем экспрессии BDNF, независимо от типа конструкции, средний размер первичных очагов дегенерации на 14 сутки в опытных глазах был меньше, чем в контрольных у всех животных. Статистически достоверные различия между опытом и контролем были выявлены в 57% и 67% случаев, соответственно. На 30 сутки эксперимента средний размер первичных очагов дегенерации в опытных глазах животных с клеточными системами экспрессии G7-1M и НЕК -293 был меньше, чем в контрольных, соответственно, в 1,3 и 1,5 раза и опытных глазах с рекомбинантным BDNF в 1,5 раза

При интравитреальном введении клеток G7-1M и НЕК 293 с трансгеном BDNF в стекловидном теле было выявлено наличие единичных, рассеянно расположенных клеток; основная масса клеточного материала была расположена в непосредственной близости от внутренней поверхности сетчатки или на ней. Клетки распределялись единично и группами, плотность их распределения увеличивалась по направлению к заднему полюсу глаза, до зоны лазерного повреждения. В ткани сетчатки были обнаружены эктопически расположенные нетипичные клетки. При супрахориоидальном введении клеточных систем G7-1М и НЕК 293, окрашенных бизбензимидом, на 14 сутки после трансплантации было выявлено наличие немногочисленных клеток с люминесцентным свечением, расположенных в хориоидее, в наружных и внутренних слоях сетчатки, на 30 сутки в основном определялось остаточное диффузное свечение ткани сетчатки, что свидетельствует о разрушении трансплантируемого клеточного материала к этому сроку.

Таким образом, на основании данных иммуногистохимических исследований установлено, что при интравитреальном и супрахориоидальном способах введения BDNF никаких изменений структуры сетчатки не наблюдается жизнеспособность клеточных систем экспрессии BDNF - G7-1M и НЕК 293, как и в нормальных условиях более продолжительная при интравитреальном способе введения (до 30 суток), располагаются они в непосредственной близости от внутренней поверхности сетчатки или на ней, способны к миграции, тропны к очагу поражения.

На основании данных ЭРГ установлено, что при использовании рекомбинантного BDNF, особенно супрахориоидальном способе его введения угнетение функциональной активности сетчатки при ее лазерном повреждении является менее выраженным и развивается в более отдаленные сроки; на 7 сутки эксперимента при супрахориоидальном способе введения BDNF амплитуда а- и в-волн ЭРГ в опытных глазах выше, чем в контрольных на 23 и 21%, соответственно; на 14 сутки - на 14% и 28%; менее существенные различия наблюдаются на 30 сутки. При супрахориоидальном использовании клеточных систем экспрессии BDNF - G7-1M и НЕК 293, в течение первых двух недель после лазерного повреждения сохраняется более высокая функциональная активность сетчатки, чем при использовании рекомбинантного фактора, независимо от типа клеточной системы; при использовании НЕК 293 высокий функциональный результат сохраняется и в более отдаленные сроки наблюдения - амплитуда а- и -в-волны выше, чем у животных с клеточной конструкцией G7-1М в 1,5 и 1,6 раза, соответственно, и выше, чем при супрахориоидальном способе введения рекомбинантного BDNF в 1,3 раза.

На основании данных гистоморфометрического анализа установлено, что на 14 сутки эксперимента при интравитреальном и супрахориоидальном способах введения BDNF средний размер первичных очагов дегенерации в опытных глазах в 28% и 57% случаев, соответственно, достоверно меньше, чем в контрольных; при супрахориоидальном введении клеточных систем экспрессии

BDNF - G7-1M и НЕК 293 в 57% и 67% случаев, соответственно; на 30 сутки эксперимента средний размер первичных очагов дегенерации в опытных глазах животных с клеточными системами экспрессии G7-1M и НЕК -293 меньше, чем в контрольных, соответственно, в 1,3 и 1,5 раза и опытных глазах с рекомбинантным BDNF в 1,5 раза.

Полученные результаты измерений свидетельствуют о том, что наиболее активно репаративные процессы при лазерном повреждении сетчатки происходят при супрахориоидальном введении клеточных систем экспрессии BDNF, особенно НЕК 293.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о безопасности рекомбинантного BDNF и клеточных систем его экспрессии G7-1M и НЕК 293 при интравитреальном и супрахориоидальном способах их введения; о том, что в условиях ретинального повреждения BDNF обладает нейропротекторными свойствами, степень выраженности которых зависит способа доставки фактора, концентрации и длительности его пребывания в тканях глаза. Наиболее высокий морфофункциональный результат наблюдается при использовании клеточных систем экспрессии BDNF, вероятно, в связи с тем, что поддерживается высокий уровень содержания фактора на протяжении длительного периода времени; при использовании клеточной системы экспрессии G7-1M, в отличие от НЕК -293, результаты являются менее стабильными, что может быть связано с нестабильностью самой систем.

97