Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Влияние фактора пигментного эпителия (PEDF) на состояние сетчатки, процессы неоваскуляризации в эксперименте

На правах рукописи

ТИЩЕНКО ОЛЬГА ЕВГЕНЬЕВНА

ВЛИЯНИЕ ФАКТОРА ПИГМЕНТНОГО ЭПИТЕЛИЯ (РЕБР) НА СОСТОЯНИЕ СЕТЧАТКИ, ПРОЦЕССЫ НЕОВАСКУЛЯРИЗАЦИИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

14.03.03 - патологическая физиология 14.01.07 - глазные болезни

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2010

1 АПР 2010

004599862

Работа выполнена на кафедре глазных болезней ГОУ ВПО Московского государственного Медико-стоматологического Университета на базе ФГУ МНТК «Микрохирургии глаза» им. академика С.Н. Федорова Росмедтехнологии.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Гаврилова Наталья Александровна

доктор медицинских наук, профессор Чикина Наталья Андреевна Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Онищенко Нина Андреевна доктор медицинских наук Ходжаев Назрулла Сагдуллаевич

Ведущая организация: Российский Университет дружбы народов

Защита диссертации состоится Ж Щ 2010г. в « часов

на заседании Диссертационного совета Д 001.003.01. при УРАМН НИИ общей патологии и патофизиологии Российской АМН по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, д.8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института Автореферат разослан «<$&>>

03_2010г.

Ученый секретарь \

Диссертационного совета, 1 Лариса Николаевна

'Д V-. П

кандидат медицинских наук 1« и ., I Скуратовская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время одной из важнейших медико-социальных проблем в отечественной и зарубежной офтальмологии является патология сетчатки, связанная с патологической неоваскуляризацией, которая приводит к значительному снижению зрения, слепоте и инвалидности. Функциональная реабилитация сетчатки при данной патологии в настоящее время остается актуальной задачей.

Несмотря на совершенствование лазерных и хирургических методов коррекции этих заболеваний, лечение не всегда является эффективным.

Для определения новых стратегических направлений в лечении офтальмологических заболеваний, связанных с развитием неоваскуляризции, необходимо иметь четкое представление о механизмах развития патологического ангиогенеза. Регуляция процессов формирования новообразованных сосудов, с точки зрения современных представлений, осуществляется благодаря наличию системы, связанных между собой, стимулирующих и ингибирующих факторов. Нарушение баланса в этой системе - между ангиогенными и антиангиогенными факторами приводит к развитию патологического ангиогенеза (Merimee T.J., 1990; McAvoy J.W. et al., 1990; Klagsbrun M. et al., 1991; D'Amore P.A., 1994; Mocanu C., 2003 ; Peter A., 2006; Simó R. et al., 2006).

Ключевым ангиогенным фактором в норме и патологии, благодаря его биологическим свойствам, принято считать эндотелиальный сосудистый фактор роста -VEGF (Ferrara N. et al., 1989; Aiello L.P. et al., 1994; Aiello L.P. et al., 1995; Stone J. et al., 1995; Ferrara N, 2001; Ferrara N., 2004). Большое количество экспериментальных работ подтверждают тесную связь VEGF с развитием неоваскуляризации сетчатки (Aiello L. P. et al., 1995; Alón T. et al., 1995; Shima D.T. et al., 1996).

Учитывая, что VEGF играет роль одного из ведущих факторов в развитии патологической неоваскуляризации, в настоящее время используются несколько лекарственных препаратов, блокирующих его действие. К ним относятся: пегаптаниб (Макуджен) - селективный

ингибитор VEGF-165, ранибизумаб (Луцентис) и бевацизумаб (Авастин) -блокаторы всех изоформ VEGF.

Многочисленные научно-клинические исследования, посвященные применению этих препаратов у пациентов с пролиферативной диабетической ретинопатией и экссудативной формой возрастной макулярной дегенерации, выявили их высокую эффективность: быстрый регресс новообразованных сосудов сетчатки и повышение зрительных функций (Gragoudas Е. et al., 2004; Avery R.L., 2006; Davidorf F.H. et al., 2006; Kourlas H. et al., 2007; Chen C.Y. et al., 2007).

Однако, несмотря на высокую эффективность препаратов блокирующих сосудистый эндотелиальный фактор роста, предпочтение отдается препаратам не с ингибирующим, а с регулирующим механизмом действия.

Многочисленные экспериментальные и клинические исследования свидетельствуют о том, что при формировании патологической неоваскуляризации основная роль в нарушении баланса между ангиогенными и антиангиогенными факторами принадлежит сосудистому эндотелиальному фактору роста (VEGF) и фактору пигментного эпителия (PEDF) (Ohno-Matsui К. et al., 2001; Kim S.Y. et al., 2003).

PEDF - эндогенный антиангиогенный фактор с нейротрофическим действием (Pigment Epithelium-Derived Factor-PEDF). Он ингибирует миграцию и пролиферацию эндотелиальных клеток, которые предопределяют развитие патологической васкуляризации.

При применении PEDF на изолированных культурах эндотелиальных клеток было показано его ингибирующее действие на вызванную миграцию и пролиферацию данных клеток (Stellmach V. et al., 2001; Duh E.J. et al., 2002).

В ходе экспериментальных работ при применении PEDF на моделях ретинальной и хориоидальной неоваскуляризации было выявлено подавление роста патологических сосудов (Duh E.J. et al., 2002; Apte R. et al., 2004).

На основании проведения клинических исследований было показано снижение уровней PEDF в водянистой влаге у пациентов с

пролиферативной диабетической ретинопатией (Boehm В.О. et al., 2003) и в стекловидном теле у пациентов с хориоидальной неоваскуляризацией при возрастной макулодистрофии (Holekamp N.M. et al., 2002). Кроме этого, выявлено увеличение VEGF и уменьшение PEDF в стекловидном теле у пациентов с пролиферативной диабетической ретинопатией (Ogata N., Nishikawa М. et al., 2002; Patel J.I. et al., 2006; Funatsu H. et al., 2006).

Помимо антиангиогенных свойств, PEDF обладает выраженными нейротрофическими и нейропротективными эффектами.

Было установлено, что PEDF является индуктором нейрональной дифференцировки клеток в культуре клеток ретинобластомы (Tombran-Tink J., 1989, 1991). Далее было установлено, что PEDF значительно увеличивает жизнеспособность клеток в культурах нормальных мозжечковых гранулярных клеток, не оказывая влияния на их митотическую активность (Taniwki Т. et al., 1995), способствует дифференцировке и выживанию развивающихся спинных моторных нейронов (Houenou L. et al., 1999).

PEDF обладает достаточно высокими нейротрофическими свойствами, как при хроническом, так и при остром нейротоксическом повреждении: активно защищает мозжечковые гранулярные клетки при глутаматном токсическом повреждении (Tanawaki Т. et al., 1997) и поддерживает жизнеспособность клеток в культуре ретинальных нейронов за счет уменьшения апоптоза, вызванного перекисью водорода (Cao W. et al., 1999).

PEDF поддерживает выживание фоторецепторов при наследственной дегенерации сетчатки у мышей (Cayouette М. et al., 1999), а также на модели повреждения фоторецепторов, связанной с потерей пигментного эпителия (Jablonski М.М. et al., 2000) и после воздействия повреждающих уровней освещенности (Pang I.H. et al., 2007).

При проведении клинических исследований было выявлено снижение уровня содержания PEDF в тканях глаза у пациентов с нейроретинальными дистрофическими заболеваниями (Ogata N. et al., 2004) и миопией высокой степени, особенно с хориоретинальной дистрофией (Ogata N. et al., 2005).

Поскольку PEDF является естественным антагонистом VEGF, представляется перспективным изучить применение именно этого фактора

для лечения патологической неоваскуляризации. Однако, мы не нашли в литературе обоснования целесообразности и преимущества использования PEDF по сравнению с широко применяемым в настоящее время анти-VEGF препаратом - Авастином, также не было сравнений с нейротрофическим фактором головного мозга - BDNF, который играет важную роль в развитии зрительного анализатора и регуляции функциональной активности нейронов зрительного центра (Peinado-Ramon P. et al., 1996; Lodovichi С. et al., 2000; Quigley H.A. et al., 2000; Paskowitz Daniel M. et al., 2004).

В связи с этим, актуально проведение сравнительного анализа влияния PEDF, Авастина и BDNF на состояние сетчатки и процессы неоваскуляризации в эксперименте.

Цель исследования: на основании сравнительного анализа оценить влияние PEDF, Авастина и BDNF на состояние сетчатки и процессы неоваскуляризации в эксперименте

Задачи исследования:

1. Изучить влияние рекомбинантного PEDF на состояние органотипических культур сетчатки и сравнить в условиях культивирования его нейротрофические и нейропротективные свойства с BDNF.

2. На органотипических культурах сетчатки провести сравнительный анализ антиангиогенных свойств рекомбинантного PEDF и анти-VEGF препарата - Авастина.

3. Разработать количественный метод морфометрического анализа экспериментальной модели ретинальной неоваскуляризации для выявления ее формирования, определения степени ее выраженности и оценки эффективности применения PEDF.

4. На модели ретинальной неоваскуляризации провести сравнительный анализ антиангиогенных свойств рекомбинантного PEDF и Авастина.

5. Оценить достоинства рекомбинантного PEDF для применения в клинической офтальмологии.

Научная новизна. Впервые проведен сравнительный анализ влияния рекомбинантных факторов РЕОР, ВО№ и анти- УЕСБ препарата -Авастина на свойства органотипических культур сетчатки животных. Установлено, что РЕБР также как ВБ№ обладает выраженными нейротрофическими и нейропротективными свойствами: РЕБР в дозе 0,5 и ВО№ в дозе 0,1 культуральной среды увеличивают зону

роста эксплантатов и клеточную жизнеспособность, активизируют процессы клеточной миграции и роста РШ- тубулин иммунопозитивных аксоноподобных отростков нейрональной природы; РЕБР в дозе 0,5 также как Авастин в дозе 50 обладает в культуральных условиях

выраженной антиангиогенной активностью, так как снижается экспрессия фактора фон - Виллибранта.

На экспериментальной модели ретинальной неоваскуляризации разработан морфометрический метод количественного определения средней площади васкуляризации в пределах поверхностного ретинального слоя и среднего диаметра магистральных сосудов в центральной зоне сетчатки. На основании корреляционного анализа результатов количественной морфометрии средней площади васкуляризации в пределах поверхностного ретинального слоя и иммуногистохимического анализа пролиферативной активности клеток сосудов сетчатки (определение индекса пролиферативной активности клеток сосудов сетчатки) установлено, что система морфометрического анализа может служить объективным методом количественной оценки степени выраженности патологической неоваскуляризации сетчатки в эксперименте.

На экспериментальной модели ретинальной неоваскуляризации проведен сравнительный анализ антиангиогенных свойств рекомбинантного РЕОР и анти- УЕвР препарата - Авастина и установлена высокая эффективность РЕБР. Показано, что интравитреальное введение РЕББ в дозе 0,5 ^ также как и Авастина в дозе 50 вызывает выраженное уменьшение средней площади васкуляризации в пределах поверхностного ретинального слоя, без статистически значимых различий.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные экспериментальные данные позволяют дополнить представления о РЕОР -факторе пигментного эпителия и его значительной роли в механизме развития патологического ангиогенеза.

Показано, что метод количественного анализа результатов моделирования ретинальной неоваскуляризации может использоваться для оценки формирования и степени выраженности ретинальной неоваскуляризации в эксперименте.

Установлено, что РЕБР имеет преимущества перед анти-УЕОР препаратом - Авастином, так как проявляет антиангиогенные свойства в значительно меньшей концентрации и дополнительно обладает нейротрофическими и нейропротективными функциями. Поэтому РЕБР может найти в дальнейшем применение в клинической практике для лечения тяжелых заболеваний сетчатки, связанных с патологической неоваскуляризацией.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Рекомбинантный РЕОБ в дозе 0,5 также как В ОКР в дозе 0,1 обладает выраженными нейротрофическими и нейропротективными свойствами в органотипических культурах сетчатки животных: наблюдается увеличение зоны роста эксплантатов, высокий уровень жизнеспособности клеток, а также активация процессов клеточной миграции и формирования (З-Ш-тубулин иммунопозитивных аксоноподобных отростков нейрональной природы.

2. Рекомбинантный РЕБЕ в дозе 0,5 также как Авастин 50 в органотипических культурах сетчатки животных обладает выраженными антиангиогенными свойствами о чем свидетельствует снижение уровня экспрессии фактора фон - Виллибранта.

3. Использование морфометрического метода количественной оценки ретинальной неваскуляризации путем определения средней площади васкуляризации в пределах поверхностного ретинального слоя и среднего диаметра магистральных сосудов в центральной зоне сетчатки может служить достоверным методом выявления формирования и определения

степени выраженности патологической неоваскуляризации сетчатки в эксперименте.

4. Рекомбинантный РЕББ в дозе 0,5 ^ также как Авастин в дозе 50 при интравитреальном введении животным оказывает значительный антиангиогенный эффект, выражающийся в существенном уменьшении средней площади васкуляризации в пределах поверхностного ретинального слоя на модели ретинальной неоваскуляризации.

Апробация работы: основные положения работы доложены и обсуждены на клинических конференциях Федерального государственного учреждения межотраслевой научно-технический комплекс «Микрохирургия глаза» имени академика С.Н. Федорова Росмедтехнологии совместно с кафедрой глазных болезней Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Московский государственный медико-стоматологический университет МЗ РФ, 2007, 2008, 2009 гг.; на VIII Всероссийской научно-практической конференции «Федоровские чтения -2009», Москва.

Публикации: По теме диссертации опубликовано 4 работы, из них 2 в издании, рекомендованном ВАК РФ.

Объем и структура работы: диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, 2 глав, отражающих собственные исследования, заключения, выводов, библиографического указателя, состоящего из 238 источников, из них 31 отечественных и 207 зарубежных авторов. Работа хорошо иллюстрирована 38 рисунками и 4 таблицами.

Работа выполнена на кафедре глазных болезней ГОУ ВПО Московского государственного Медико-стоматологического Университета на базе ФГУ МНТК «Микрохирургии глаза» им. академика С.Н. Федорова Росмедтехнологии (генеральный директор и зав. кафедрой, д.м.н., проф. Х.П. Тахчиди); в группе нейрогенетики и генетики развития (рук. - д.б.н. Г.В. Павлова) при дирекции Института биологии гена (директор д.б.н., профессор, академик РАН Ю.В. Ильин); в лаборатории клеточной

биологии и патологии развития (рук. - к.б.н. И.Н. Сабурина) Учреждения Российской АМН НИИ общей патологии и патофизиологии (директор -д.м.н., проф., академик РАМН A.A. Кубатиев).

Выражаю благодарность научным руководителям д.м.н., проф. H.A. Гавриловой и д.м.н., проф. H.A. Чикиной; сотрудникам группы нейрогенетики и генетики развития Института биологии гена д.б.н. Г.В. Павловой, к.б.н. A.B. Ревищину; сотрудникам лаборатории клеточной биологии и патологии развития Учреждения Российской АМН НИИ общей патологии и патофизиологии к.б.н. И.Н. Сабуриной, С.А. Сергееву, а также директору НИИ общей патологии и патофизиологии A.A. Кубатиеву за практическую помощь при выполнении работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа состояла из двух экспериментальных разделов. Первый раздел - изучение влияния PEDF на органотипические культуры сетчатки, второй -на состояние сетчатки экспериментальных животных.

Экспериментальные исследования на органотипических культурах

сетчатки

Изоляция тканей и способы культивирования сетчатки. В работе использовались семидневные крысы породы albino Wistar (п=50), из которых было получено 100 эксплантатов сетчатки. Сразу после декапитации животных производили энуклеацию, изолированные глаза промывали в 70% этиловом спирте в течение 5-10 минут и промывали в растворе Хэнкса. Вскрытие глазного яблока производили в охлажденной среде DMEM. Глазным скальпелем сначала делали прокол в области роговицы, затем ножницами для микрохирургии с загнутыми концами выполняли разрез в области лимба и удаляли ее; с помощью глазного пинцета и инъекционной иглы удаляли хрусталик и стекловидное тело; путем несильного воздействия на внешнюю поверхность глазного яблока пинцетом с гладкими кончиками отслаивали сетчатку от подлежащего пигментного эпителия, глазное яблоко при этом фиксировали пинцетом с зубцами за зрительный нерв. Идеально выделенная сетчатка имела форму «медузы», для более плоского ее прилежания выполняли 4-5 надрезов по

направлению к диску зрительного нерва. Цельную сетчатку сразу после выделения высаживали на малые чашки Петри (35мм) в 1 мл среды для культивирования. Для культивирования использовалась

модифицированная среда следующего состава: DMEM (НПП ПанЭко, С420) / F12 (НПП ПанЭко, С600) 1:1; FCS 10% ( HyClone, SH30109.03); bFGF 10 нг/мл (Sigma); EGF 10 нг/мл (Sigma); Heparin 150 мкл на 100 мл (НПП ПанЭко); Pen-strep 1% (Sigma); L-глютамин ЮОмкл на 50мл (Sigma, G-8540); инсулин-трансферин-селенит (ITC) 1:50 (НПП ПанЭко); гентамицин 5мкл на 1мл. Чашки помещали в инкубатор (Cell live) +37°С, 5% С02, 98% влажности. Смену среды производили каждые 2-3 суток, PEDF добавляли в среду в концентрации 0,5 Ц-g/ml, Авастин 50 ng/ml, BDNF 0,1 |ig/ml. Культивирование производилось в течение 30 суток, далее образцы фиксировали и хранили в забуференном растворе антифриза до окрашивания антителами.

Морфологический (микроскопический) анализ органотипических культур сетчатки включал в себя определение способности клеток выселяться, мигрировать, давать отростки и дифференцироваться. Проводили количественную оценку роста культивируемых эксплантатов с использованием индекса площади (ИП) - отношение площади эксплантата, вместе с зоной выселяющихся клеток к исходной площади эксплантата на 14, 21 и 30 сутки. Значения ИП выражали в процентах, контрольное значение ИП принимали за 100 %.

Анализ на жизнеспособность клеток эксплантата сетчатки проводился на 14,21 и 30 сутки с помощью окраски йодидом пропидия (PI) для выявления погибших клеток, а также акридинового оранжевого для окрашивания живых клеток. Посредством флуоресцентного микроскопа производили прямой подсчет жизнеспособных клеток и погибших клеток на равновеликих участках.

Илшуногистохимический анализ эксплантатов сетчатки проводили на 30-сутки культивирования, для чего использовали метод непрямого иммуногистохимического окрашивания с использованием первичных моноклональных антител к p-III тубулину (Chemicon, 1:100) и кислому глиальному фибриллярному белку - GFAP(anti-glial fibrillary acidic protein) (Sigma, 1:80) в течение 12 часов при 4°С и вторичных антител с флюуорохромными метками - техасский красный и Су2 в разведении

1:100 в течение 2 часов при комнатной температуре. Для анализа иммуногистохимических препаратов применяли метод конфокальной микроскопии.

Вестерн-блот анализ. Определяли количество экспрессируемого фактора фон-Виллебранда, который синтезируется в эндотелиальных клетках, являясь протеином специфичным для данного типа клеток. Для проведения метода приготавливали клеточные лизаты опытных и контрольных образцов при помощи Reporter Lysis Buffer. Полученный лизат центрифугировали и наносили на полиакриламидный гель (ПААГ) с раствором для прокрашивания. Для переноса на мембрану использовали режим переноса 2мА/см2 (стабилизация по току) 2 часа и напряжение не более 20В. Затем мембрану окрашивали Ponceau Red 3-5 минут на шейкере, чтобы проконтролировать наличие белка на мембране. Затем отмывали мембрану в буфере TBST 3 раза по 5 минут. Мембрану инкубировали с первичными поликлональными антителами (anti-von Willibrand Faktor разведение 1:1000) в 15 мл TBST ночь при +4°С. Затем мембрану отмывали 15 минут в TBST буфере 2 раза по 10 минут на шейкере. После этого мембрану инкубировали с вторичными антителами (antirabbit, конъюгированные с пероксидазой хрена; разведение 1:10000) 1,5 мл на 15 мл TBST ночь при +4°С. Мембрану промывали в 20 мл TBST (15 минут два раза по 10 минут на шейкере). Белки визуализировали с использованием ECL-набора по инструкции производителя (GE Healthcare).

Правильность нанесения порций белка на дорожки контролировали при помощи визуализации актина на мембране.

Экспериментальные исследования на животных

Характеристика экспериментального материала. Работа проведена на 44 крысах (88 глаз) породы albino Wistar. Животные были разделены на 4 группы, в каждой по 11 крыс, три - с воспроизведенной экспериментальной моделью патологической неоваскуляризации и контрольная группа - без моделирования патологической неоваскуляризации (контрольная группа -1). В первой экспериментальной группе животным было произведено интравитреальное введение в опытный глаз (OD) PEDF в дозе 0,5 (ig, во второй - Авастина в опытный

глаз (OD) в дозе -50 |ag, третья группа являлась второй контрольной - с экспериментальной моделью патологической неоваскуляризации без лечения (контрольная группа -2). В контрольный глаз (OS) в первой и второй экспериментальных группах вводили объем сбалансированного физиологического раствора (СФР), эквивалентный используемому опытному объему.

Модель патологической неоваскуляризации. Животных в возрасте 7 суток вместе с кормящими матерями помещались на 5 суток в герметичный инкубатор (размером 70 х 50 х 30), к которому был подключен кислородный концентратор. Насыщенность потока кислородом, поступающего в инкубатор составляла 93±3%. Открывали инкубатор ежедневно не более чем на 5 минут, вынужденно - для подмены самок, очистительных работ и подкорма. Замену суррогатных матерей производили во избежание у них респираторного дистресс синдрома. Через 5 суток экспериментальные животные были переведены в условия нормоксии и на 3 сутки содержания в этих условиях проводили интравитреапьные инъекции PEDF или Авастина.

Выведены из эксперимента животные были на 4 день после интравитреального введения PEDF или Авастина, декапитированы, глаза энуклеированы, сетчатки извлечены.

Методика приготовления и исследования цельных препаратов

сетчатки

После энуклеации глаза препарировали под бинокулярным микроскопом. Вскрытие глазного яблока и извлечение сетчатки производили по вышеописанной схеме. Цельную сетчатку фиксировали в 4% растворе параформальдегида в течение суток при температуре +4° С. После тщательной промывки в фосфатном буфере применялся метод непрямого иммуногистохимического окрашивания цельных препаратов сетчатки с использованием биотинилированного лектина в разведении 1:100 (Vector Laboratories, Inc, USA) и стрептавидина, конъюгированного с флуоресцентной меткой в разведении 1:100 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, UK) в свободноплавающем виде в течение 1 часа поочередно при комнатной температуре для визуализации сосудистой сети. Затем, после трехкратной промывки в фосфатном буфере, сетчатку

помещали на предметное стекло, покрывали глицерином и покровным стеклом.

Анализ изображений сосудов сетчатки проводили с помощью инвертированного микроскопа Olimpus КХ-100 с цифровой камерой Delta Pix 5000 и объективами 10х, 20х, 40х. С помощью разработанного количественного морфометрического метода были проведены следующие исследования: количественная оценка средней площади васкуляризации в пределах поверхностного ретинального слоя; калиброметрия - посредством измерения среднего диаметра магистральных сосудов в центральной зоне сетчатки.

Методика приготовления и исследования полутонких срезов препаратов сетчатки

После энуклеации глаза препарировали под бинокулярным микроскопом. Сетчатку фиксировали в 4% растворе формальдегида, затем проводили по батарее спиртов и ксилолов и заливали в парафин по стандартной методике. Готовили серийные парафиновые срезы толщиной 3-5 мкм, которые наносили на стекла с полилизиновым покрытием. Проводили депарафинизацию срезов (по стандартной схеме). Для иммуногистохимического исследования перед инкубацией с первичными антителами срезы обрабатывали микроволновым излучением мощностью 750 Вт, в цитратном буфере —■ 2 раза по 5 минут. Затем срезы охлаждали при комнатной температуре не менее 15-20 минут, после чего на срезы наносили первичные антитела - Ki-67 (Dako Cytomation), проводили 30 минутную инкубацию при комнатной температуре, после чего, срезы оставлялись на ночь (14-18 часов) при температуре 4°С. Затем срезы тщательно отмывались в буфере 3 раза по 15 минут, и первичные антитела визуализировали с помощью системы En Vision (DAKO) по прилагаемой прописи. После иммуногистохимических реакций срезы дополнительно окрашивались гематоксилином Майера. Производили анализ изображений срезов сетчатки, полученных с помощью инвертированного микроскопа Olimpus КХ-100 с цифровой камерой Delta Pix 5000.

Оценку числа Ki-67 позитивных клеток выражали в процентах от общего количества эндотелиоцитов (индекс пролиферативной активности клеток сосудов).

Для подтверждения возникновения патологической ретинальной неоваскуляризации у экспериментальных животных с помощью разработанных цифровых методов были проведены следующие исследования: количественная оценка площади васкуляризации в пределах поверхностного ретинального слоя в контрольной группе-1 (интактные животные) и контрольной группе-2 (модель ретинальной неоваскуляризации без лечения); измерение среднего диаметра магистральных сосудов в центральной зоне сетчатки в контрольной группе-1 и контрольной группе-2; определение пролиферативной активности клеток сосудов (индекс пролиферативной активности) в этих группах.

Для определения статистической взаимосвязи между показателями индекса пролиферативной активности сосудов и средней площади васкуляризации в пределах поверхностного ретинального слоя использовали расчет коэффициента корреляции в контрольной группе - 2 (с экспериментальной моделью без лечения). Для определения достоверности различия средних показателей использовался метод параметрической статистики - критерий Стыодента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные исследования на органотипических культурах

сетчатки

Анализ индекса площади эксплантатов сетчатки выявил достоверное увеличение индекса площади в эксплантатах, культивируемых с РЕБР и ВБИЕ по сравнению с контролем и с эксплантатами, культивируемыми с Авастином как на 14, 21 так и на 30 сутки. Выявлено, что зона роста эксплантатов, культивируемых с РЕОБ на 30 сутки культивирования увеличивается в 3 раза, по сравнению с контролем и эксплантатами, культивируемыми с Авастином, и соответствует зоне роста эксплантатов при культивировании с В БОТ (р<0,05) (рисунок 1).

14 сутки 21 сутки 30 сутки

Рис. 1. Индекс площади эксплантатов сетчатки.

По результатам анализа клеток сетчатки на жизнеспособность на

14, 21 и 30 сутки в эксплантатах контроля было выявлено наличие обширных очагов клеточной гибели, как внутри, так и на поверхности эксплантатов. В эксплантатах, культивируемых с РЕГ)Н и ГЮК'Р, очаги клеточной гибели были значительно меньше. Очаги клеточной гибели в культурах, культивируемых с Авастином, были меньше по сравнению с контролем, но больше, чем в культурах с РЕОР и ВООТ. Выявлено, что на 30 сутки культивирования с РЕОР в эксплантатах сетчатки остаются жизнеспособными в 3,3 раза больше клеток по сравнению с контролем, и в 2,5 раза больше - по сравнению с эксплантатами, культивируемыми с Авастином, по сравнению с ВО№ - в 1,2 раза меньше (р<0,05) (рисунок 2).

■ контроль ШВйЫР □ РЕОР □ Авастин

Рис.2. Жизнеспособность клеток сетчатки в эксплантатах сетчатки.

После иммуногистохимической окраски на 30 сутки культивирования в зоне расселения клеток из эксплантатов, культивируемых с РЕОЕ и ВО№, обнаружено большое количество ОЕАР-иммунонегативных- рШ-тубулин иммунопозитивных клеток с аксоноподобными тубулин-позитивными отростками,

распространяющимися за пределы тела эксплантата и образующими разветвленную сеть. В контроле и в эксплантатах, культивируемых с Авастином происходило расселение ОЕАР-позитивных клеток. Клетки, экспрессирующие рШ-тубулин, в контроле и в культурах, культивируемых с Авастином, были выявлены только в глубине эксплантатов, в небольшом количестве. Таким образом, иммуногистохимическое исследование показало, что в органотипических культурах сетчатки, при культивировании с РЕОЕ, также как и с ВО№, наблюдается формирование активных процессов клеточной миграции и роста ¡Ш1-тубулин иммунопозитивных аксоноподобных отростков нейрональной природы в отличие от контроля и эксплантатов, культивируемых с Авастином, где происходит расселение в основном только СЕАР-позитивных клеток.

При проведении Вестерн-блот анализа было выявлено, что в контроле экспрессия фактора фон-Виллибранда в 2 раза выше, чем при действии РЕОЕ и Авастина в течение 30 суток культивирования эксплантатов сетчатки, что свидетельствует о том, что РЕОЕ обладает выраженными антиангиогенными свойствами, которые сопоставимы с Авастином.

Экспериментальные исследования на животных

В результате проведения патоморфологического исследования переднего и заднего отрезка глаз экспериментальных животных после интравитреального введения РЕОЕ в дозе 0,5 цц, каких-либо признаков воспалительной или аллергической реакции выявлено не было, нетипично расположенных клеток не обнаружено, нарушений структуры сетчатки и пигментного эпителия в месте введения не определялось.

Оценка экспериментальной модели ретинальной неоваскуляризации

При проведении компьютерной обработки цифровых изображений для количественной оценки площади васкуляризации в пределах поверхностного ретинального слоя были получены следующие результаты:

контрольная группа -1 - 1,227±0,066 (пиксели); контрольная группа -2 -2,405±0,079 (пиксели).

При проведении компьютерной обработки цифровых изображений для измерения диаметра магистральных сосудов в центральной зоне сетчатки были получены следующие результаты: контрольная группа -1 -11,629±0,338 (пиксели); контрольная группа -2 - 15,465±0,58 (пиксели).

В результате проведенного анализа окраски ядер эндотелиальных клеток сосудов сетчатки, при определении индекса пролиферативной активности, были получены результаты: контрольная группа -1 -2,2±0,99%; контрольная группа-2-15,6±1,09%.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что после резкой отмены высоких концентраций кислорода в контрольной группе -2 на 7 сутки пребывания животных в условиях нормоксии наблюдается 2-х кратное увеличение средней площади васкуляризации в пределах поверхностного ретинального слоя (р<0,001) и 7-ти кратное увеличение пролиферативной активности клеток сосудов сетчатки (р<0,001) по сравнению с интактными животными из контрольной группы- 1. Увеличение диаметра магистральных сосудов в контрольной группе -2 (р<0,001) является подтверждением наличия патологического состояния, приводящего к возникновению патологической неоваскуляризации.

Между показателями индекса пролиферативной активности сосудов и средней площади васкуляризации в пределах поверхностного ретинального слоя выявлена значимая положительная взаимосвязь в контрольной группе - 2 (г=0,814). Таким образом, эти данные позволяют использовать разработанный цифровой анализ количественной оценки средней площади васкуляризации в пределах поверхностного ретинального слоя для выявления формирования ретинальной неоваскуляризации и определения степени ее выраженности.

Влияние РЕБР на состояние сетчатки животных с экспериментальной моделью ретинальной неоваскуляризации При проведении компьютерной обработки цифровых изображений для количественной оценки площади васкуляризации в пределах поверхностного ретинального слоя получены следующие результаты: (таблица 1 и рисунок 3).

Таблица 1.

Средние значения площади васкуляризации в пределах поверхностного ретинального слоя._

Контрольная группа -2 (с экспериментальной моделью без лечения) 2,405±0,079 п= 11

Опытный глаз-ОЭ Контроль-ОБ

Экспериментальная группа-1 (введение РЕБР/СФР) 1,370±0,088* п= 11 2,056±0,097 п= 11

Экспериментальная группа-2 (введение Авастина/СФР) 1,560±0,091* п= 11 2,192±0,069 п = 11

*р<0,001 - достоверность различий с контрольной группой -2 *р<0,001 — достоверность различий с контрольным глазом - ОБ п - количество глаз в группе

2,5 2 I 1,5 I 1 0,5

1 !

1

I

____

□ Экспериментальная группа-2-СЮ ■ Контрольная группа-2 й Экспериментальная группа-Т-ОЭ □ Экспериментальная группа-1-СЮ Н Экспериментальная группа-2-ОБ

Рис.3. Средняя площадь васкуляризации в пределах поверхностного ретинального слоя в экспериментальных группах.

Таким образом, на основании сравнительного цифрового анализа установлено, что при интравитреальном введении РЕОЕ или Авастина в опытные глаза (СЮ) животным с экспериментальной моделью происходит статистически достоверное снижение средней площади васкуляризации в пределах поверхностного ретинального слоя, как по сравнению с контрольными глазами (ОБ) (р<0,001) в этих группах, так и с группой животных с патологической неоваскуляризацией, которым не проводилось

лечения (р<0,001). Причем статистически достоверной разницы между данными, полученными при введении РЕББ или Авастина, установлено не было (р>0,05). На основании чего, можно говорить о наличие у РЕББ выраженных антиангиогенных свойств, сопоставимых с Авастином.

ВЫВОДЫ

1. На основании результатов экспериментальных исследований на органотипических культурах сетчатки установлено, что РЕББ в дозе 0,5 обладает выраженным нейротрофическим и нейропротекторным эффектом: при добавлении его в культуральную среду активно развиваются процессы клеточной миграции и роста (ЗШ- тубулин иммунопозитивных аксоноподобных отростков нейрональной природы; происходит увеличение в 3 раза зоны роста эксплантатов и в 2 раза клеточной жизнеспособности по сравнению с культурами при добавлении Авастина. При культивировании с РЕВБ в дозе 0,5 зона роста

эксплантатов соответствует зоне роста эксплантатов при культивировании с ВБМ% а жизнеспособность клеток меньше в 1,2 раза.

' 2. На органотипических культурах сетчатки установлено, что РЕОБ в дозе 0,5 обладает выраженным антиангиогенным эффектом,

сопоставимым с Авастином в дозе 50 ц^ш! - при добавлении их в культуральную среду в 2 раза больше снижается экспрессия фактора фон -Виллибранта по сравнению с контролем.

3. Разработанный морфометрический метод оценки состояния сетчатки позволяет проводить объективную количественную оценку формирования и степени выраженности экспериментально индуцированной ретинальной неоваскуляризации: средней площади васкуляризации в пределах поверхностного ретинального слоя и среднего диаметра магистральных сосудов в центральной зоне сетчатки.

4. На модели ретинальной неоваскуляризации установлено, что РЕОБ в дозе 0,5 и Авастин в дозе 50 при интравитреальном введении обладают выраженным антиангиогенным действием - достоверно уменьшается средняя площадь васкуляризации в пределах поверхностного ретинального слоя (р<0,001), различия между РЕБР и Авастином по степени выраженности их антиангиогенных свойств отсутствуют (р>0,05).

5. Наличие у PEDF нейротрофических и нейропротективных свойств, не уступающих BDNF, а также наличие антиангиогенных свойств, сопоставимых с Авастином, и установленная безопасность его интравитреального введения позволяет обеспечить при использовании PEDF более полный и патогенетически оправданный подход в лечении патологической неоваскуляризации при офтальмологических заболеваниях.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Тахчиди Х.П., Гаврилова H.A., Ланевская Н.И., Тищенко O.E., Сабурина И.Н., Сергеев С.А., Павлова Г.В., Рыбалкина Е.Ю., Ревищин A.B. Влияние фактора пигментного эпителия (PEDF) и Авастина на органотипические культуры сетчатки // Объединенный научный журнал. - 2008. - №11 (217). -С. 43-48.

2. Тахчиди Х.П., Гаврилова H.A., Ланевская Н.И., Тищенко O.E., Борзенок С.А., Шацких A.B., Сабурина И.Н., Сергеев С.А., Павлова Г.В., Рыбалкина Е.Ю., Ревищин A.B. Влияние фактора пигментного эпителия (PEDF) и Авастина на органотипические культуры сетчатки // VII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Федоровские чтения - 2009»: Сборник материалов (тезисы докладов). -М, 2009. -С. 548-549.

3. Тахчиди Х.П., Гаврилова H.A., Ланевская Н.И., Тищенко O.E., Борзенок С.А., Шацких A.B., Сабурина И.Н., Сергеев С.А., Павлова Г.В., Рыбалкина Е.Ю., Ревищин A.B. Сравнительная характеристика влияния фактора пигментного эпителия (PEDF) и Авастина на органотипические культуры сетчатки // Офтальмохирургия. - 2009. - №4. - С. 45-49.

4. Тищенко O.E. Патологическая неоваскуляризация сетчатки: современные методы лечения, перспективы // Офтальмохирургия. - 2010. -№2.-С. 43-46.

Tishchenko Olga Evgenyevna Pigment epithelium-derived growth factor (PEDF) influence on status of retina and processes of neovascularisation in experiment

Aberrant blood vessel growth in the retina that underlies the pathology of proliferative diabetic retinopathy and age-related macular degeneration is a result of the ischemia-driven disruption of the normally angiogenic environment of the retina. A balance between the levels of the antiangiogenic factor with neurotrophic action of pigment epithelium-derived growth factor (PEDF) and the proangiogenic vascular endothelial growth factor (VEGF) is perturbed in a range of retinal neovascular diseases.

The present study investigated the PEDF effects on murine retinal explant cultures and on a model of ischemia-induced retinopathy. The comparative analysis of antiangiogenic PEDF properties with Avastin (vascular endothelial growth factor-specific angiogenesis inhibitor), and neurotrophic properties with BDNF (brain-derived neurotrophic factor) was carried out.

This research showed that PEDF possesses the pronounced neurotrophic and neuroprotective properties similar in its manifestation to BDNF, and also has a pronounced antiangiogenic activity, in manifestation degree comparable with Avastin in retinal explant cultures. PEDF and Avastin inhibit aberrant blood vessel growth in a murine model of ischemia-induced retinopathy, and there was no statistically significant difference.

This study showed that PEDF is an excellent pharmacological tool for slowing the progression of the pathologies associated with abnormal vessel growth and the range of neurodegenerative diseases in the eye.

Формат А5

Бумага офсетная №1-80 г/м2 Усл. Печ. л.0,87. Тираж 100 экз. Заказ N 32

Отпечатано в РИО МГМСУ Изд. Лицензия ИД№04993 от 04.06.2001 года Москва, 127473 Делегатская ул., д. 20, стр. 1

Актуальность проблемы. В настоящее время одной из важнейших медико-социальных проблем в отечественной и зарубежной офтальмологии является патология сетчатки, связанная с патологической неоваскуляризацией, которая приводит к значительному снижению зрения, слепоте и инвалидности. Функциональная реабилитация сетчатки при данной патологии в настоящее время остается актуальной задачей.

Несмотря на совершенствование лазерных и хирургических методов коррекции этих заболеваний, лечение не всегда является эффективным.

Для определения новых стратегических направлений в лечении офтальмологических заболеваний, связанных с развитием неоваскуляризции, необходимо иметь четкое представление о механизмах развития патологического ангиогенеза. Регуляция процессов формирования новообразованных сосудов, с точки зрения современных представлений, осуществляется благодаря наличию системы, связанных между собой, стимулирующих и ингибирующих факторов. Нарушение баланса в этой системе - между ангиогенными и антиангиогенными факторами приводит к развитию патологического ангиогенеза (Merimee Т.J., 1990; McAvoy J.W. et al., 1990; Klagsbrun M. et al., 1991; D'Amore P.A., 1994; Mocanu C., 2003; Peter A., 2006; Simo R. et al., 2006).

Ключевым ангиогенным фактором в норме и патологии, благодаря его биологическим свойствам, принято считать эндотелиальный сосудистый фактор роста (Vascular Endothelial Growth Factor-VEGF) (Ferrara N. et al., 1989; Aiello L.P. et al., 1994; Aiello L.P. et al., 1995; Stone J. et al., 1995; Ferrara N., 2001; Ferrara N., 2004). Большое количество экспериментальных работ подтверждают тесную связь VEGF с развитием неоваскуляризации сетчатки (Aiello L. P. et al., 1995; Alon Т. et al., 1995; Shima D.T. et al., 1996).

Учитывая, что VEGF играет роль одного из ведущих факторов в развитии патологической неоваскуляризации, в настоящее время используются несколько лекарственных препаратов, блокирующих его действие. К ним относятся: пегаптаниб (Макуджен) - селективный ингибитор VEGF-165, ранибизумаб (Луцентис) и бевацизумаб (Авастин) - блокаторы всех изоформ VEGF.

Многочисленные научно-клинические исследования, посвященные применению этих препаратов у пациентов с пролиферативной диабетической ретинопатией и экссудативной формой возрастной макулярной дегенерации, выявили их высокую эффективность: происходил быстрый регресс новообразованных сосудов сетчатки, и отмечалось повышение зрительных функций (Gragoudas Е. et al., 2004; Avery R.L., 2006; Davidorf F.H. et al., 2006; Chen C.Y. et al., 2007; Kourlas H. et al., 2007).

Однако, несмотря на высокую эффективность, препараты, блокирующие сосудистый эндотелиальный фактор роста, особенно все его изоформы, продолжают вызывать некоторые опасения, связанные с их механизмом действия.

Из вышеизложенного следует актуальность изучения и разработки новых подходов в подавлении нежелательных патологических эффектов VEGF, что может стать значимым прорывом в лечении данных заболеваний.

В последнее время большой интерес вызывает антиангиогенный фактор с нейротрофическим действием - фактор пигментного эпителия (Pigment Epithelium-Derived Factor-PEDF). Он обладает мощной антиангиогенной активностью, ингибирует миграцию и пролиферацию эндотелиальных клеток, которые играют основную роль в развитии патологической васкуляризации.

При применении PEDF на изолированных культурах эндотелиальных клеток было показано его ингибирующее действие на вызванную миграцию и пролиферацию данных клеток (Stellmach V. et al., 2001; Duh E.J. et al., 2002).

В ходе экспериментальных работ при применении PEDF на моделях ретинальной и хориоидальной неоваскуляризации было выявлено подавление роста патологических сосудов (Duh E.J. et al., 2002; Apte R. et al., 2004).

На основании проведения клинических исследований было показано снижение уровней PEDF в водянистой влаге у пациентов с пролиферативной диабетической ретинопатией (Boehm В.О. et al., 2003) и в стекловидном теле у пациентов с хориоидальной неоваскуляризацией при возрастной макулодистрофии (Holekamp N.M. et al., 2002). Кроме этого, выявлено увеличение VEGF и уменьшение PEDF в стекловидном теле у пациентов с пролиферативной диабетической ретинопатией (Ogata N., Nishikawa М. et al., 2002; Funatsu H. et al., 2006; Patel J.I. et al., 2006).

Помимо антиангиогенных свойств, PEDF обладает выраженными нейротрофическими и нейропротективными эффектами.

Было установлено, что PEDF является индуктором нейрональной дифференцировки клеток в культуре клеток ретинобластомы (Tombran-Tink J., 1989, 1991). Далее было установлено, что PEDF значительно увеличивает клеточную жизнеспособность в культурах нормальных мозжечковых гранулярных клетках, не оказывая влияния на митотическую активность (Taniwki Т. et al., 1995). Помимо этого, PEDF способствует дифференцировке и выживанию развивающихся спинных моторных нейронов (Houenou L. et al., 1999).

PEDF обладает достаточно высокими нейротрофическими свойствами, как при хроническом, так и при остром нейротоксическом повреждении: активно защищает мозжечковые гранулярные клетки при глутаматном токсическом повреждении (Tanawaki Т. et al., 1997), поддерживает клеточную жизнеспособность за счет уменьшения апоптоза, вызванного перекисью водорода, в культуре крысиных ретинальных нейронов (Cao W. et al., 1999).

PEDF поддерживает выживание фоторецепторов при наследственной дегенерации сетчатки у мышей (Cayouette М. et al., 1999) и на модели повреждения фоторецепторов, связанной с потерей пигментного эпителия (Jablonski М.М. et al., 2000), а также после воздействия повреждающих уровней освещенности (Pang I.H. et al., 2007).

При проведении клинических исследований было выявлено снижение уровня содержания PEDF в тканях глаза у пациентов с нейроретинальными дистрофическими заболеваниями (Ogata N. et al., 2004) и миопией высокой степени, особенно с хориоретинальной дистрофией (Ogata N. et al., 2005).

Поскольку PEDF является естественным антагонистом VEGF, представляется перспективным изучить применение именно этого фактора для лечения патологической неоваскуляризации. Однако, мы не нашли в литературе обоснования целесообразности и преимущества использования PEDF по сравнению с широко применяемым в настоящее время анти-VEGF препаратом - Авастином, также не было сравнений с нейротрофическим фактором головного мозга - BDNF, который играет важную роль в развитии зрительного анализатора и регуляции функциональной активности нейронов зрительного центра (Peinado-Ramon P. et al., 1996; Lodovichi С. et al., 2000; Quigley H.A. et al., 2000; Paskowitz Daniel M. et al., 2004).

В связи с этим, актуально проведение сравнительного анализа влияния PEDF, Авастина и BDNF на состояние сетчатки и процессы неоваскуляризации в эксперименте.

Цель исследования: на основании сравнительного анализа оценить влияние PEDF, Авастина и BDNF на состояние сетчатки и процессы неоваскуляризации в эксперименте.

Задачи исследования: 1. Изучить влияние рекомбинантного PEDF на состояние органотипических культур сетчатки и сравнить в условиях культивирования его нейротрофические и нейропротективные свойства с BDNF.

2. На органотипических культурах сетчатки провести сравнительный анализ антиангиогенных свойств рекомбинантного PEDF и анти-VEGF препарата - Авастина.

3. Разработать количественный метод морфометрического анализа экспериментальной модели ретинальной неоваскуляризации для выявления ее формирования, определения степени ее выраженности и оценки эффективности применения PEDF.

4. На модели ретинальной неоваскуляризации провести сравнительный анализ антиангиогенных свойств рекомбинантного PEDF и Авастина.

5. Оценить достоинства рекомбинантного PEDF для применения в клинической офтальмологии.

Научная новизна. Впервые проведен сравнительный анализ влияния рекомбинантных факторов PEDF, BDNF и анти- VEGF препарата - Авастина на свойства органотипических культур сетчатки животных. Установлено, что PEDF также как BDNF обладает выраженными нейротрофическими и нейропротективными свойствами:PEDF в дозе 0,5 p,g/ml и BDNF в дозе 0,1 jag/ml культуральной среды увеличивают зону роста эксплантатов и клеточную жизнеспособность, активизируют процессы клеточноймиграции и роста J3III- тубулин иммунопозитивных аксоноподобных отростков нейрональной природы; PEDF в дозе 0,5 (xg/ml также как Авастин в дозе 50 |1§/ш1обладает в культуральных условиях выраженной антиангиогенной активностью, так как снижается экспрессия фактора фон - Виллибранта.

На экспериментальной модели ретинальной неоваскуляризации разработан морфометрический метод количественного определения средней площади васкуляризации в пределах поверхностного ретинального слоя и среднего диаметра магистральных сосудов в центральной зоне сетчатки. На основании корреляционного анализа результатов количественной морфометрии средней площади васкуляризации в пределах поверхностного ретинального слоя и иммуногистохимического анализа пролиферативной активности клеток сосудов сетчатки (определение индекса пролиферативной активности клеток сосудов сетчатки) установлено, что система морфометрического анализа может служить объективным методом количественной оценки степени выраженности патологической неоваскуляризации сетчатки в эксперименте.

На экспериментальной модели ретинальной неоваскуляризации проведен сравнительный анализ антиангиогенных свойств рекомбинантного PEDF и анти- VEGF препарата - Авастинаи установлена высокая эффективность PEDF. Показано, что интравитреальное введение PEDF в дозе 0,5 jixg также как и Авастина в дозе 50 fig вызывает выраженное уменьшение средней площади васкуляризации в пределах поверхностного ретинального слоя, без статистически значимых различий.

Теоретическая и практическая значимость.

Полученныеэкспериментальные данные позволяют дополнить представления о PEDF - факторе пигментного эпителия и его значительной роли в механизме развития патологического ангиогенеза.

Показано, что метод количественного анализа результатов моделирования ретинальной неоваскуляризации может использоваться для оценки формирования и степени выраженности ретинальной неоваскуляризации в эксперименте.

Установлено, что PEDF имеет преимущества перед анти-VEGF препаратом — Авастином, так как проявляет антиангиогенные свойства в значительно меньшей концентрации и дополнительно обладает нейротрофическими и нейропротективными функциями. Поэтому PEDF может найти в дальнейшем применение в клинической практике для лечения тяжелых заболеваний сетчатки, связанных с патологической неоваскуляризацией.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Рекомбинантный PEDF в дозе 0,5 jj.g/ml также как BDNF в дозе 0,1 (ig/ml обладает выраженными нейротрофическими и нейропротективными свойствами в органотипических культурах сетчатки животных: наблюдается увеличение зоны роста эксплантатов, высокий уровень жизнеспособности клеток, а также активация процессов клеточной миграции и формирования (З-Ш-тубулин иммунопозитивных аксоноподобных отростков нейрональной природы.

2. Рекомбинантный PEDF в дозе 0,5 |ig/ml также как Авастин 50 ng/ml в органотипических культурах сетчатки животных обладает выраженными антиангиогенными свойствами о чем свидетельствует снижение уровня экспрессии фактора фон - Виллибранта.

3. Использование морфометрического метода количественной оценки ретинальной неваскуляризации путем определения средней площади васкуляризации в пределах поверхностного ретинального слоя и среднего диаметра магистральных сосудов в центральной зоне сетчатки может служить достоверным методом выявления формирования и определения степени выраженности патологической неоваскуляризации сетчатки в эксперименте.

4. Рекомбинантный PEDF в дозе 0,5 jxg также как Авастин в дозе 50 jig при интравитреальном введении животным оказывает значительный антиангиогенный эффект, выражающийся в существенном уменьшении средней площади васкуляризации в пределах поверхностного ретинального слоя на модели ретинальной неоваскуляризации.

выводы

1. На основании результатов экспериментальных исследований на органотипических культурах сетчатки установлено, что PEDF в дозе 0,5 |a.g/ml обладает выраженным нейротрофическим и нейропротекторным эффектом: при добавлении его в культуральную среду активно развиваютсяпроцессы клеточной миграции и роста pill- тубулин иммунопозитивных аксоноподобных отростков нейрональной природы; происходит увеличение в 3 раза зоны роста эксплантатов и в 2 раза клеточной жизнеспособности по сравнению с культурами при добавлении Авастина. При культивировании с PEDF в дозе 0,5 jag/ml зона роста эксплантатов соответствует зоне роста эксплантатов при культивировании с BDNF, а жизнеспособность клеток меньше в 1,2 раза.

2. На органотипических культурах сетчатки установлено, что PEDF в дозе 0,5 p.g/ml обладает выраженным антиангиогенным эффектом, сопоставимым с Авастином в дозе 50 jig/ml - при добавлении их в культуральную среду в 2 раза больше снижается экспрессия фактора фон - Виллибранта по сравнению с контролем.

3. Разработанный морфометрический метод оценки состояния сетчатки позволяет проводить объективную количественную оценку формирования и степени выраженности экспериментально индуцированной ретинальной неоваскуляризации: средней площади васкуляризации в пределах поверхностного ретинального слоя и среднего диаметра магистральных сосудов в центральной зоне сетчатки.

4. На модели ретинальной неоваскуляризации установлено, что PEDF в дозе 0,5 |xg и Авастин в дозе 50 p.g при интравитреальном введении обладают выраженным антиангиогенным действием - достоверно уменьшается средняя площадь васкуляризации в пределах поверхностного ретинального слоя р<0,001), различия между PEDF и Авастином по степени выраженности их антиангиогенных свойств отсутствуют (р>0,05).

5. Наличие у PEDF нейротрофических и нейропротективных свойств, не уступающих BDNF, а также наличие антиангиогенных свойств, сопоставимых с Авастином, и установленная безопасность его интравитреального введения позволяет обеспечить при использовании PEDF более полный и патогенетически оправданный подход в лечении патологической неоваскуляризации при офтальмологических заболеваниях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Пролиферативные заболевания сетчатки являются первой причиной слепоты и слабовидения во всем мире, самыми распространенными из которых являются пролиферативная диабетическая ретинопатия и экссудативная форма возрастной макулярной дегенерации.

Несмотря на выдающиеся достижения в лечении этой патологии благодаря применению лазерного и хирургического лечения, эти состояния продолжают оставаться одной из ведущих причин необратимой слепоты в развитых странах.

Применение препаратов, блокирующих сосудистый эндотелиальный фактор роста, позволяет добиться быстрого регресса новообразованных сосудов сетчатки и повышения или стабилизации зрительных функций (Gragoudas Е. et al., 2004; Avery R.L., 2006; Davidorf F.H. et al., 2006; Kourlas H. et al., 2007; Chen C.Y. et al., 2007). Однако, несмотря на их высокую эффективность, требуется проведение дополнительных экспериментальных и клинических исследований, которые позволят определить не только положительные, но и возможные отрицательные побочные эффекты, связанные с механизмом действия данных препаратов (Lieth Е. et al., 2000; Marneros A.G. et al., 2005; Nishijima K. et al., 2007).

Актуальность проблемы патологической неоваскуляризации в современной офтальмологии обуславливает высокую практическую значимость изучения и разработки новых подходов, направленных на коррекцию патологических механизмов образования неососудов и нейроретинальных • повреждений. Большой интерес вызывает антиангиогенный фактор с нейротрофическим действием - фактор пигментного эпителия (Pigment Epithelium-Derived Factor-PEDF). Он обладает мощной антиангиогенной активностью, ингибирует миграцию и пролиферацию эндотелиальных клеток, которые играют основную роль в развитии патологической васкуляризации.

PEDF поддерживаетантиангиогенные свойства стекловидного тела и роговицы. В сетчатке физиологическое действие PEDF регулируется концентрацией кислорода: фактор пигментного эпителия создает условия для формирования сосудов, когда концентрация кислорода снижена, и ингибирует ангиогенез при высокой его концентрации (Dawson D.W. et al., 1999; Ogata N., Wada M. et al., 2002).

При применении PEDF на изолированных культурах эндотелиальных клеток было показано его ингибирующее действие на вызванную миграцию и пролиферацию данных клеток (Stellmach V. et al., 2001; Duh E.J. et al., 2002).

В ходе экспериментальных работ при применении PEDF на моделях ретинальной и хориоидальной неоваскуляризации было выявлено подавление роста патологических сосудов (Duh E.J. et al., 2002; Apte R. et al., 2004).

На основании проведения клинических исследований было показано снижение уровней PEDF в водянистой влаге у пациентов с пролиферативной диабетической ретинопатией (Boehm В.О. et al., 2003) и в стекловидном теле у пациентов с хориоидальной неоваскуляризацией при возрастной макулодистрофии (Holekamp N.M. et al., 2002). Кроме этого, выявлено увеличение VEGF и уменьшение PEDF в стекловидном теле у пациентов с пролиферативной диабетической ретинопатией (Ogata N., Nishikawa М. et al., 2002; Patel J.I. et al., 2006; Funatsu H. et al., 2006).

Помимо антиангиогенных свойств, PEDF обладает выраженными нейротрофическими и нейропротективными эффектами.

Было установлено, что PEDF является индуктором нейрональной дифференцировки клеток в культуре клеток ретинобластомы (Tombran-Tink J., 1989, 1991). Далее было установлено, что PEDF значительно увеличивает клеточную жизнеспособность в культурах нормальных мозжечковых гранулярных клетках, не оказывая влияния на митотическую активность (Taniwki Т. et al., 1995). Помимо этого, PEDF способствует дифференцировке и выживанию развивающихся спинных моторных нейронов (Houenou L. et al., 1999).

PEDF обладает достаточно высокими нейротрофическими свойствами, как при хроническом, так и при остром нейротоксическом повреждении; активно защищает мозжечковые гранулярные клетки при глутаматном токсическом повреждении (Tanawaki Т. et al., 1997), поддерживает клеточную жизнеспособность за счет уменьшения апоптоза, вызванного перекисью водорода, в культуре крысиных ретинальных нейронов (Cao W. et al., 1999).

PEDF поддерживает выживание фоторецепторов при наследственной дегенерации сетчатки у мышей (Cayouette М. et al., 1999) и на модели повреждения фоторецепторов, связанной с потерей пигментного эпителия (Jablonski М.М. et al., 2000) и после воздействия повреждающих уровней освещенности (Pang I.H. et al., 2007).

При проведении клинических исследований было выявлено снижение уровня содержания PEDF в тканях глаза у пациентов с нейроретинальными дистрофическими заболеваниями (Ogata N. et al., 2004) и миопией высокой степени, особенно с хориоретинальной дистрофией (Ogata N. et al., 2005).

Поскольку PEDF является естественным антагонистом VEGF, представляется перспективным изучить применение именно этого фактора для лечения патологической неоваскуляризации. Однако, мы не нашли в литературе обоснования целесообразности и преимущества использования PEDF по сравнению с широко применяемым в настоящее время анти-VEGF препаратом - Авастином, также не было сравнений с нейротрофическим фактором головного мозга - BDNF, который играет важную роль в развитии зрительного анализатора и регуляции функциональной активности нейронов зрительного центра (Peinado- Ramon P. et al., 1996; Lodovichi С. et al., 2000; Quigley H.A. et al., 2000; Paskowitz Daniel M. et al., 2004).

В связи с этим, актуально проведение сравнительного анализа влияния PEDF, Авастина и BDNF на состояние сетчатки и процессы неоваскуляризации в эксперименте.

Целью работы явилось на основании сравнительного анализа оценить влияние PEDF, Авастина и BDNF на состояние сетчатки и процессы неоваскуляризации в эксперименте.

Достижение цели осуществлялось путем решения следующих задач:

1. Изучить влияние рекомбинантного PEDF на состояние органотипических культур сетчатки и сравнить в условиях культивирования его нейротрофические и нейропротективные свойства с BDNF.

2. На органотипических культурах сетчатки провести сравнительный анализ антиангиогенных свойств рекомбинантного PEDF и анти-VEGF препарата - Авастина. 3. Разработать количественный метод морфометрического анализа экспериментальной модели ретинальной неоваскуляризации для выявления ее формирования, определения степени ее выраженности и оценки эффективности применения PEDF.

4. На модели ретинальной неоваскуляризации провести сравнительный анализ антиангиогенных свойств рекомбинантного PEDF и Авастина.

5. Оценить достоинства рекомбинантного PEDF для применения в клинической офтальмологии.

Работа состояла из двух экспериментальных разделов. Первый раздел -изучение влияния PEDF на органотипические культуры сетчатки, второй -насостояние сетчатки экспериментальных животных.

1. Экспериментальные исследования на органотипических культурах сетчатки

В работе использовались семидневные крысы породы albino Wistar. Цельную сетчатку сразу после выделения высаживали на малые чашки Петри (35мм) в 1 мл среды для культивирования. Для культивирования использовалась модифицированная среда следующего состава: DMEM (НПП ПанЭко, С420) / F12 (НПП ПанЭко, С600) 1:1; FCS 10% ( HyClone, SH30109.03); bFGF 10 нг/мл (Sigma); EGF 10 нг/мл (Sigma); Heparin 150 мкл на 100 мл (НПП ПанЭко); Pen-strep 1% (Sigma); L-глютамин ЮОмкл на 50мл (Sigma, G-8540); инсулин-трансферин-селенит (ITC) 1:50 (НПП ПанЭко); гентамицин 5мкл на 1мл. Чашки помещали в инкубатор (Cell live) +37°С, 5% С02, 98% влажности. Смену среды производили каждые 2-3 суток, PEDF добавляли в среду в концентрации 0,5 (ig/ml, Авастин 50 jag/ml, BDNF 0,1 (j,g/ml. Культивирование производилось в течение 30 суток, далее образцы фиксировали и хранили в забуференном растворе антифриза до окрашивания антителами.

С помощью микроскопического морфологического анализа производили количественную оценку роста культивируемых эксплантатов с использованием индекса площади (ИП) - отношение площади эксплантата, вместе с зоной выселяющихся клеток к исходной площади эксплантата.

Анализ на жизнеспособность клеток эксплантата сетчатки проводился с помощью окраски йодидом пропидия (PI) для выявления погибших клеток, а также использовали акридиновый оранжевый, который окрашивает живые клетки. Посредством флуоресцентного микроскопа производили прямой подсчет жизнеспособных клеток и погибших клеток на равновеликих участках.

На 30-е сутки проводили иммуногистохимическую окраску эксплантатов сетчатки, для чего использовали метод непрямого иммуногистохимического окрашивания с использованием первичных моноклональных антител к (3-III тубулину и GFAP и вторичных антител с флюуорохромнымиметками - техасский красный и Су2. Для анализа иммуногистохимических препаратов применяли метод конфокальной микроскопии.

Для анализа антиангиогенных свойств был проведен Вестерн - блот анализ.

Анализ индекса площади эксплантатов сетчатки выявил достоверное увеличение индекса площади в эксплантатах, культивируемых с PEDF и BDNF по сравнению с контролем и с эксплантатами, культивируемыми с Авастином как на 14, 21 так и на 30 сутки. Таким образом, на 30 сутки культивирования зона роста эксплантатов, культивируемых с PEDF увеличивается в 3 раза, по сравнению с контролем и эксплантатами, культивируемыми с Авастином, и соответствует зоне роста эксплантатов при культивировании с BDNF (р<0,05).

По результатам анализа клеток сетчатки на жизнеспособность на 14, 21 и 30 сутки в эксплантатах контроля было выявлено наличие обширных очагов клеточной гибели, как внутри, так и на поверхности эксплантатов. В эксплантатах, культивируемых cPEDF и BDNF, очаги клеточной гибели были значительно меньше. Очаги клеточной гибели в культурах, культивируемых с Авастином, были меньше по сравнению с контролем, но больше, чем в культурах с PEDF и BDNF. Таким образом, на 30 сутки культивирования с PEDF в эксплантатах сетчатки остаются жизнеспособными в 3,3 раза больше клеток по сравнению с контролем, и в 2,5 раза больше - по сравнению с эксплантатами, культивируемыми с Авастином, по сравнению с BDNF — в 1,2 раза меньше (р<0,05).

После иммуногистохимической окраски на 30 сутки культивирования в зоне расселения клеток из эксплантатов, культивируемых с PEDF и BDNF, обнаружено большое количество GFAP-иммунонегативных-рШ-тубулин иммунопозитивных клеток с аксоноподобными тубулинпозитивными отростками, распространяющимися за пределы тела эксплантата и образующими разветвленную сеть. В контроле и в эксплантатах, культивируемых с Авастином происходило расселение GFAP-позитивных клеток. Клетки, экспрессирующие pill-тубулин, в контроле и в культурах, культивируемых с Авастином, были выявлены только в глубине эксплантатов, в небольшом количестве. Таким образом, иммуногистохимическое исследование показало, что в органотипических культурах сетчатки, при культивировании с PEDF, также как и с BDNF, наблюдается развитие активных процессов клеточноймиграции и роста pill-тубулин иммунопозитивных аксоноподобных отростков нейрональной природы в отличие от контроля и эксплантатов, культивируемых с Авастином, где происходит расселение в основном только GFAP-позитивных клеток.

При проведении Вестерн-блот анализа было выявлено, что в контроле экспрессия фактора фон-Виллибранда в 2 раза выше, чем при действии PEDF и Авастина в течение 30 суток культивирования эксплантатов сетчатки, что свидетельствует о том, что PEDF обладает выраженными антиангиогенными свойствами, которые сопоставимы с Авастином.

2. Влияние PEDF на состояние сетчатки экспериментальных животных

Работа проведена на 44 крысах (88 глаз) породы albino Wistar. Животные были разделены на 4 группы, в каждой по 11 крыс, три - с воспроизведенной экспериментальной моделью патологической неовасакуляризации и контрольная группа - без экспериментальной модели (контрольная группа -1). В первой экспериментальной группе животным было произведено интравитреальноевведениеРЕОР в дозе 0,5 jag, во второй-авастина в дозе -50 |ig, третья группа являлась второй контрольной - с экспериментальной моделью патологической неоваскуляризации контрольная группа -2). В контрольный глаз в первой и второй экспериментальных группах вводили объем сбалансированного физиологического раствора (СФР), эквивалентный используемому опытному объему.

Создание экспериментальной модели патологической неоваскуляризации проводили следующим образом: животных в возрасте 7 суток вместе с кормящими матерями помещались на 5 суток в герметичный инкубатор (размером 70 х 50 х 30), к которому был подключен кислородный концентратор. Насыщенность потока кислородом, поступающего в инкубатор составляла 93±3%. Открывали инкубатор ежедневно не более чем на 5 минут, вынужденно - для подмены самок, очистительных работ и подкорма. Замену суррогатных матерей производили во избежание у них респираторного дистресс синдрома. Через 5 дней экспериментальные животные были переведены в комнатные условия на 3 дня, после чего проводили интравитреальные инъекции PEDF или Авастина.

Выведены из эксперимента животные были на 12 день, в экспериментальных группах - 4 день после интравитреального введения PEDF или Авастина,декапитированы, глаза энуклеированы, сетчатки извлечены.

В результате проведения патоморфологического исследования переднего и заднего отрезка глаза экспериментальных животных после интравитреального введения PEDF в дозе 0,5 fig, каких-либо признаков воспалительной или аллергической реакции выявлено не было, нетипично расположенных клеток не обнаружено, нарушений структуры сетчатки и пигментного эпителия в месте введения не выявлено.

Проводился метод непрямого иммуногистохимического окрашивания препаратов сетчатки с использованием лектина и биотин-стрептавидинового комплекса для визуализации сосудистой сети.

Затем проводили количественный морфометрический анализ изображений сетчатки, полученных с помощью инвертированного микроскопа Olimpus КХ-100 с цифровой камерой Delta Pix 5000 и объективами 10х, 20х, 40х.

С помощью разработанного морфометрического метода были проведены следующие исследования: • количественная оценка средней площади васкуляризации в пределах поверхностного ретинального слоя; калиброметрия - посредством измерения среднего диаметра магистральных сосудов в 1{ентралыюй зоне сетчатки.

Для подтверждения возникновения патологической ретинальной неоваскуляризации у экспериментальных животных с помощью морфометрического метода были проведены следующие исследования:

1. Количественная оценка ■ площади васкуляризации в пределах поверхностного ретинального слоя в контрольной группе -1 и контрольной группе -2.

2. Измерение среднего диаметра магистральных сосудов в центральной зоне сетчатки в контрольной группе -1 и контрольной группе -2.

А также, проведена оценка парафиновых полутонких срезов сетчатки, окрашенных маркером Ki-67 на пролиферативную активность клеток сосудов в этих группах (индекс пролиферативной активности). Для определения статистической взаимосвязи между показателями индекса пролиферативной активности сосудов и средней площади васкуляризации в пределах поверхностного ретинального слоя использовали расчет коэффициента корреляции в контрольной группе - 2 (с экспериментальной моделью).

При проведении морфометрического анализа цифровых изображений сетчатки для количественной оценки площади васкуляризации в пределах поверхностного ретинального слоя были получены следующие результаты: контрольная группа -1 - 1,227±0,066 (пиксели); контрольная группа -2 - 2,405±0,079 (пиксели).

При проведении морфометрического анализа цифровых изображений сетчатки для измерения диаметра магистральных сосудов в центральной зоне сетчатки были получены следующие результаты: контрольная группа -1 — 11,629±0,338 (пиксели); контрольная группа -2 - 15,465±0,58 (пиксели).

В результате проведенного анализа окраски ядер эндотелиальных клеток сосудов сетчатки, при определении индекса пролиферативной активности, были получены результаты: контрольная группа -1 - 2,2±0,99%; контрольная группа -2 - 15,6±1,09%.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что после резкой отмены высоких концентраций кислорода в контрольной группе -2 на 7 сутки пребывания животных в условиях нормоксии наблюдается 2-х кратное увеличение средней площади васкуляризации в пределах поверхностного ретинального слоя (р<0,001) и 7-ти кратное увеличение пролиферативной активности клеток сосудов сетчатки (р<0,001) по сравнению с интактными животными из контрольной группы -1. Увеличение диаметра магистральных сосудов в контрольной группе -2 (р<0,001) является подтверждением наличия патологического состояния, приводящего к возникновению патологической неоваскуляризации.

Между показателями индекса пролиферативной активности сосудов и средней площади васкуляризации в пределах поверхностного ретинального слоя выявлена значимая положительная взаимосвязь в контрольной группе — 2 (г=0,814). Таким образом, эти данные позволяют использовать разработанный морфометрический метод количественной оценки средней площади васкуляризации в пределах поверхностного ретинального слоя для выявления формирования ретинальной неоваскуляризации и определения степени ее выраженности.

Влияние PEDF на состояние сетчатки животных с экспериментальной моделью патологической неоваскуляризации

При проведении морфометрического анализа цифровых изображений сетчатки для количественной оценки площади васкуляризации в пределах поверхностного ретинального слоя получены следующие результаты: экспериментальная группа -1-OD - 1,370±0,088 (пиксели), экспериментальная группа -1-OS - 2,056±0,097 (пиксели), экспериментальная группа -2-OD -1,560±0,091 (пиксели) и экспериментальная группа -2-OS - 2,192±0,069 (пиксели).

Таким образом, на основании сравнительного морфометрического анализа установлено, что при интравитреальном введении PEDF или Авастина в опытные глаза животным с экспериментальной моделью происходит статистически достоверное снижение средней площади васкуляризации в пределах поверхностного ретинального слоя, как по сравнению с контрольными глазами в этих группах (р<0,001), так и с группой животных с патологической неоваскуляризацией, которым не проводилось лечения (р<0,001). Причем статистически достоверной разницы между данными, полученными при введении PEDF или Авастина, установлено не было (р>0,05). На основании чего, можно говорить о наличие у PEDF выраженных антиангиогенных свойств, сопоставимых с Авастином.