Экспериментальное исследование нейропротекторных свойств афобазола

Мелкумян, Диана Степановна

Диссертации по медицине → Фармакология, клиническая фармакология

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Экспериментальное исследование нейропротекторных свойств афобазола

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Мелкумян, Диана Степановна Москва 2006 г.

Ученая степень: кандидата биологических наук

ВАК РФ: 14.00.25

Автореферат диссертации по медицине на тему Экспериментальное исследование нейропротекторных свойств афобазола

На правах рукописи

МЕЛКУМЯН ДИАНА СТЕПАНОВНА

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НЕЙРОПРОТЕКТОРНЫХ СВОЙСТВ АФОБАЗОЛА

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2006

Работа выполнена в ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН (директор -академик РАМН С.Б.Середенин)

Научные руководители:

доктор медицинских наук Вальдман Елена Артуровна

кандидат биологических наук Зенина Татьяна Алексеевна

Официальные оппоненты.

доктор медицинских наук, профессор Островская Рита Ушеровна

доктор биологических наук, профессор Каменский Андрей Александрович

Ведущая организация

ГОУ ВПО

государственный университет» Росздрава

«Российский медицинский

Защита диссертации состоится «12» апреля 2006 года в_часов на заседании

диссертационного совета Д-001.024.01 при ГУ НИИ фармакологии им В.В. Закусова РАМН по адресу 125315, г. Москва, ул. Балтийская, д.8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ фармакологии им. В В. Закусова РАМН по адресу 125315, г. Москва, ул. Балтийская, д 8

Автореферат разослан «У*/» О^) 2006 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Е.А. Вальдман

2006А

5О40

Актуальность темы

Эпидемиологические данные свидетельствуют, что по распространенности инсульт занимает третье место после болезней сердца и нововобразований, являясь ведущей причиной смертности. В России ежегодно регистрируется свыше 400 тыс. случаев инсульта (Дамулин И.В. и соавт., 2003; Захаров В.В. и соавт., 2004).

В последние годы достигнут значительный прогресс в изучении патогенетических механизмов сосудистых заболеваний мозга. Ишемия головного мозга имеет следствием последовательное развитие патобиохимических реакций глутамат-кальциевого каскада, сопровождаемых активацией свободно-радикальных процессов. Гиперпродукция активных форм кислорода на фоне дефицита антиоксидантной защиты приводит к развитию «окислительного стресса». Избыточное накопление С а2* вызывает активацию внутриклеточных ферментов - фосфолипаз, протеинкиназ и эндонуклеаз, за которым следует повреждение и гибель клеток (Bcrridgc М., 1985; Hakim A. et al., 1989; Orrenius S. et al., 1992; Olney J., 1994; Гусев E. и соавт., 2001). Установлена роль апоптоза в формировании очагов поражения нервной ткани (Deshmukh М. et al., 1996). Определена роль нейротрофинов, в частности мозгового нейротрофического фактора BDNF, в защите нейронов от повреждений (de Luca A. et al., 1996).

Анализ литературных данных показывает, что биохимические механизмы повреждения нервных клеток при ишемии сходны с вызванными стрессовыми воздействиями (Ecsh Т. et al., 2002). Стрессовые события рассматриваются в качестве этиопатогенетического фактора ишемических нарушений. С другой стороны, усиление анксиогенеза отмечается в симптомокомплексе постишемических расстройств и нейродегенеративных заболеваний. Патофизиологические исследования показывают, что при ишемических повреждениях включаются эндогенные механизмы нейропротекции (Knusel В. et al., 1992; Sendtner М., 1999). Терапия инсультов также основана на применении нейропротекторных средств, в составе которых присутствуют транквилизаторы и антидепрессанты (Гусев Б. и соавт., 2001).

Таким образом, разработка и изучение новых лекарственных средств, сочетающих анксиолитические и нейропротекторные свойства, является актуальной задачей современной фармакологии.

В ГУ НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН разработан и внедрен в медицинскую практику селективный анксиолитик афобазол (Seredenin S., 2003). Накоплены сведения о наличии у афобазола нейропротекторной активности. Так, установлено, что афобазол усиливает мозговой кровоток и повышает выживаемость крыс в условиях глобальной преходящей ишемии, вызванной перевязкой сонных артерий (Силкина И.В. и со авт., 2004), снижает выраженность патоморфологических изменений «пенумбры» в условиях локальной ишемии, вызванной перевязкой средней мозговой артерии (Баласанян М.Г., 2003), снижает выраженность неврологических нарушений на модели интрацеребральной посттравматической гематомы (Галаева И. и соавт., 2005). Полученные данные подтверждают перспективность дальнейшего изучения механизмов реализации сочетанного анксиолитического и нейропротекторного эффекта афобазола, что будет способствовать расширению спектра его применения в клинической практике.

Цель в задачи исследования

Доказать наличие нейропротекторной активности афобазола в опытах in vitro и участие в механизме действия препарата мозгового нейротрофического фактора BDNF на экспериментальных моделях in vitro и in vivo.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить нейропротекторную активность афобазола на модели окислительного стресса в культуре нейронов.

2. Изучить нейропротекторную активность афобазола на модели глутаматной токсичности в культуре нейронов.

3. Исследовать влияние афобазола на активную каспазу 3 в культуре нейронов.

4. Изучить влияние афобазола на уровень BDNF в культуре нейронов.

5. Выявить изменения уровня BDNF в мозговых структурах инбредных мышей C57BL/6 и BALB/c при стрессовых воздействиях.

6. Фармакологически изучить влияние афобазола на динамику изменения содержания ВБОТ в структурах головного мозга мышей С57В1У6 и ВАЬВ/с, вызванных стрессовыми воздействиями.

Научная новизна работы

В результате впервые проведенного исследования нейропротекторной активности нового селективного анксиолитка афобазола в культуре клеток показано, что афобазол в концентрациях, близких к зарегистрированным в плазме крови, после системного введения в терапевтических дозах, обладает защитным действием при повреждении гиппокампальных нейронов перекисью водорода и плутаминовой кислотой. Установлено, что в условиях глутаматной токсичности афобазол препятствует гиперактивации каспазы-3 в культуре клеток линии НТ-22.

Впервые установлены межлинейные различия в содержании мозгового нейротрофического фактора ВВОТ в структурах головного мозга инвредных мышей с различным фенотипом эмоционально-стрессовой реакции. Показано, что у интактных животных уровень нейротрофина выше у мышей линии ВАЬВ/с. Стрессовое воздействие вызывает длительное снижение уровня ВОШ7 у мышей ВАЬВ/с, в отличие от С57ВЬ/б, у которых вслед за кратковременным снижением уровня нейротрофина, следует его восстановление до исходных значений.

Впервые показана способность афобазола повышать уровень ВО№ в культуре нейронов. Доказано, что афобазол в дозе 5 мг/кг при повторных введениях восстанавливает уровень мозгового нейротрофического фактора в коре, гипоталамусе и стриатуме мышей ВАЬВ/с, сниженный в результате стрессовых воздействий.

Одновременно установлены межлинейные различия в эффектах стрессирующих воздействий и афобазола на уровень ГОЭТ у мышей С57В1У6 и ВАЬВ/с, что подтверждает генетически детерминированные особенности механизмов формирования эмоционально-стрессовой реакции животных этих линий.

Научно-практическая значимость работы

Установленные защитные свойства афобазола и способность регулировать содержание ВГЖИ7 раскрывают механизмы его нейропротекторного и анксиоселективного эффекта и обосновывают дальнейшие фармакологические исследования с использованием 1ЯЖР в качестве мишени.

Специфика изменений НОЮТ, выявленная у животных с различной эмоционально-стрессовой реакцией, указывает на необходимость учета фенотипа ответа на стресс не только при терапии анксиолитиками, но и при проведении лечебных мероприятий, направленных на нейропротекцию.

Результаты выполненных исследований являются составляющей материалов доклинического изучения афобазола в качестве нейропротекторного средства, необходимых для представления в регистрационную систему Минздравсоцразвития РФ.

Основные сведения об апробации работы

Материалы диссертации доложены на ХП Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство», Москва (апреля 2005), на 8-й Региональной конференции Европейской коллегии по нейропсихофармакологии, Москва (апрель, 2005), на I съезде физиологов СНГ, Сочи (сентября, 2005), на 4-ой международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам», Москва (март, 2006).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 4 статьи и 5 тезисов в материалах российских и международных конференций.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на /Страницах машинописного текста и состоит из: введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 20 отечественных и 224 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 3 таблицами и 44 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования выполнены на 220 мышах-самцах инбредных линий BALB/c и C57BL/6 массой 18-20 г. В экспериментах in vitro использовали культуру клеток линии НТ-22 (иммортализованные клетки гиппокампа), любезно предоставленных профессором Ф. Виегантом из отдела молекулярно-клеточной биологии Утрехтского университета (Голландия).

Определение уровня BDNF в отделах мозга мышей ex vivo. Количественное содержание BDNF в экстрактах тканей определяли методом иммуноферментного анализа (BDNF Е^* Immunoassay System) по протоколу фирмы Promega (США). Мышей декапитировали в различные сроки в соответствии со схемами экспериментов, немедленно извлекали головной мозг и на холодной подложке выделяли гипоталамус, гиппокамп, стриатум и кору больших полушарий. Образцы замораживали в жидком азоте и хранили при -70°С для приготовления экстрактов и последующего определения количества BDNF. Концентрацию белка в экстрактах определяли с помощью модифицированного метода Лоури.

Тест *Открытое пале». Тест ярко освещенное «открытое поле» был использован в качестве стрессового фактора. «Открытое поле» представляет собой белую круглую арену диаметром 1м с белыми бортами высотой 50 см. Арена равномерно освещена четырьмя лампами по 7S Вт каждая, расположенными на высоте 1м над поверхностью поля. Все пространство арены равномерно разделено четырьмя черными концентрическими окружностями, которые в свою очередь разбиты радиусами на сектора так, что периферическая окружность состоит из 16 одинаковых криволинейных квадратов. Регистрировали число пересеченных квадратов на периферии и в центральных областях.

Культивирование клеток. Все манипуляции с клетками выполнялись в строго стерильных условиях. Клетей культивировали при 37°С, 5% С02 в среде DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium), содержащей 5% FBS (фетальной бычьей сыворотки), 2мМ L-глутамина. Смету культуральной среды производили через 24 часа после рассева и каждые последующие 3 дня. Рассев на

культуральныс флаконы общей площадью 75см2 осуществляли каждую неделю. Для эксперимента клетки рассевали с плотностью З,5х103 на лунку на 96-луночные планшеты и 280x103 на лунку на б-луночные планшеты, обработанные раствором поли-L-лизина. Клетки рассеивали в среде DMEM с 5% сывороткой FBS. Эксперименты проводились на клетках после образования монослоя.

Модель глутаматной токсичности. Глутаматную токсичность моделировали внесением в культуральную среду глутаминовой кислоты в конечной концентрации 5 мМ. Время инкубации составляло 8 часов при 37°С и 5% СОг, после чего меняли среду на нормальную и определяли жизнеспособность клеток через 24 часа с использованием МТТ-теста (Kerr et all., 1995; Tan et all., 1998). В отдельной серии экспериментов клетки инкубировали с глутаминовой кислотой в течение 24 часов.

Модель окислительного стресса. Окислительный стресс моделировали внесением в культуральную среду 1,5 мМ Н202 и инкубацией 30 минут при 37°С и 5% CQz. После этого культуральную среду, содержащую перекись водорода, заменяли на обычную и инкубировали в течение 4 часов в аналогичных условиях (Mäher et all., 1996).

Методы оценки жизнеспособности нейронов в культуре. Выживаемость культивируемых нейронов оценивали с помощью МТТ-теста и окраски по Хбхсту.

МТТ (3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолий бромид) представляет собой водорастворимую соль тетразолия желтого цвета, легко проникающую в клетки. В живых клетках МТТ превращается в нерастворимые в воде кристаллы формазана фиолетового цвета. По окончании реакции среду культивирования заменяли раствором МТТ (0,5 мг/мл) и инкубировали 30 минут при 37°С. Затем отбирали раствор МТТ из лунок и добавляли для растворения формазана DMSO (диметилсульфоксид). Далее измеряли светопоглощение на спектрофотометре Multiskan EX при длине волны 600 им (Hansen et al., 1989).

Ядерный краситель Хёхст (Hoechst 33258) окрашивает ядра всех клеток и помогает выявить морфологические изменения хроматина. Поэтому данный метод позволяет оценить соотношение клеток с повреждениями мембраны и пикнотическим ядром (некротические клетки) и клеток с нативной мембраной и характерной для апоптоза конденсацией хроматина (апоптотические клетки).

Иммунофлюоресцентный метод определения активной каспазы-3.

Клетки фиксировали 4% параформальдегидом и инкубировали с первичными поликлональными антителами к расщепленной каспазе-3 [Aspl 75] (rabbit IgG, Cell Signalling Technology, USA), со вторичными антителами goat anti-rabbit IgG, конъюгированными с флюоресцеин-изотиоцианатом (FITC). После этого стекла с клетками заключали в специальную среду Fluoromount О и рассматривали под флюоресцентным микроскопом при длине волны 365 нм (Srinivasan А. et al., 1998).

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Jandel Scientific SigmaPlot и Statistica 6.0 для Windows. Достоверность различий групповых средних определяли с помощью t-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Окислительный стресс является важным звеном повреждения нейронов при различных нейродегенеративных заболеваниях, в том числе при ишемическом инсульте. Причиной его могут быть увеличение продукции свободных радикалов или снижение защитных свойств антиоксидаятной системы (супероксиддисмутаза, катал аза, глутати онп ероксидаза и др), которые имеют место при ишемии (Kanazawa I., 2001). Нейропротекторная активность афобазола была оценена по его влиянию на выживаемость клеток НТ-22 при моделировании окислительного стресса.

Для индукции окислительного стресса использовали H202. В ее присутствии наблюдается падение уровня АТФ и повышение концентрации внутриклеточного Са2+, которая приводит к целому каскаду реакций и гибели клетки (Болдырев A.A., 2001). Кратковременная инкубация клеток с перекисью водорода (30 мин) приводила к снижению их выживаемости на 26% (р<0 05) Внесение афобазола за 24 часа до окислительного стресса в конечных концентрациях 10"* М и 10"5 М сопровождалось достоверным повышением выживаемости нейронов до контрольных значений в обеих концентрациях (рис. 1). При внесении препарата за 30 минут эффективной оказалась лишь меньшая концентрация (10"8 М), защитное действие которой было более выражено (рис.1). Внесение афобазола в

культуральную среду сразу после отмывки перекиси водорода также приводило к достоверному протекторному эффекту в концентрации Ю^М.

Полученные данные согласуются с ранее установленными, показавшими защитное влияние афобазола при стимуляции образования активных форм кислорода (Середенин и соавт., 1998). Кроме того, показано, что афобазол повышает устойчивость мембранных структур нейронов коры и стриатума к свободнорадикальным процессам, имеющим место при ишемии, и влияет на активность фермента антиоксидантной защиты клетки - катал азы (Силкина И.В., 2005). Таким образом, повышение выживаемости нейронов после внесения афобазола может быть связано с его антиоксидантными свойствами.

■

Я I

№

контроль НГО2 афобазол афобазол афобазол афобазол 10-8 М 10-5 М 10-8 М 10-5 М

Э за 24ч до ОС

■ за 30 хин до ОС

Рис.1. Защитный эффект афобазола за 24 ч и 30 мин до окислительного стресса (ОС) в культуре нейронов НТ-22 (данные МТТ-теста). * - р<0.05 по сравнению с контролем, ** - р<0.01 по сравнению с Н2О2, л - р<0.05 по сравнению с НЛ.

В следующей серии экспериментов было изучено влияние афобазола на выживаемость нейронов на модели глутаматной токсичности, имитирующей гибель нейронов при развитии ишемического инсульта и хронических нейродегенеративных заболеваний (81апсш М. е1 а1., 2000). Экзогенный глутамат блокирует обратный захват цистеина в клетках, путем ингибирования глутамат-цистеинового антипорта, который приводит к снижению уровня внутриклеточного

цистеина и глутатиона. Истощение глутатиона сопровождается накоплением свободных радикалов, избытком Са2+ и гибелью клетки (Maher Р. et all., 1996; Tan S. et al., 1998).

В экспериментах исследовали влияние афобазола в разные промежутки времени на выживаемость клеток после моделирования глутаматной токсичности. При предварительном внесении афобазола в культуру за 24 часа до повреждения защитное действие зарегистрировано в конечной концентрации 10"* М, поэтому в дальнейших экспериментах использовалась именно эта концентрация. Внесение препарата за 30 минут и сразу после глутаминовой кислоты не было эффективным. Однако добавление афобазола через 1, 16 и 20 часов после повреждения клеток приводило к выраженному защитному эффекту, при котором выживаемость нейронов не отличалась от таковой в контрольной серии.

В следующей серии экспериментов клетки инкубировали с глутаминовой кислотой в течение 24 часов до внесения афобазола для усиления повреждающего действия глутамата. Афобазол достоверно повышал выживаемость нейронов в обеих концентрациях. Причем действие препарата было одинаково и не зависело от концентраций (рис. 2).

1 120 п

S 100

t 80

i 80

X 20

s я

3 0

ЛЛЛ лл

т í

:Ичу щ

фтщ

í и, lili |р

а." Iii

л/f '

f лууйййКя.

"j" * •■■•W'VÍV*.

контроль глуттинновия афобазол 10-8 афобазол 10-5 кнелолта

Рис.2. Защитный эффект афобазола сразу после глутаматной токсичности (24ч) в культуре нейронов НТ-22 (данные МТТ-теста). ***- р<0.001 по сравнению с контролем, ллл - р<0.001 по сравнению с глутаминовой кислотой,74/4 - р<0.01 по сравнению с глутаминовой кислотой

Для иллюстрации изменений происходящих после действия глутаминовой кислоты и регистрации гибели клетки окрашивали флюоресцентным ядерным красителем Хйхст. Окрашивание клеток выявило характерные изменения в морфологии хроматина: пикноз и конденсацию, характерные для некротических и апоптотических нейронов (Kerr J. et al., 1995; Tan S. et al., 1998). Особенно отчетливо это заметно при внесении глутамата (рис. 3). Гибель нейронов в контроле составила 3,97%, при внесении глутаминовой кислоты - 34,5% (р<0.001). Инкубирование клеток с афобазолом после повреждения значительно снижало число пикнотических клеток, гибель клеток составила 7%. Внесение афобазола в клетки без повреждения не отличалось от контроля.

Рис. 3. Выявление апоптотических и некротических клеток в культуре НТ-22 при моделировании глутаматной токсичности, с использованием окрашивания по Хёхсту. А - интактные клетки; Б - клетки, инкубированные с глутаминовой кислотой (5 мМ); В - клетки, инкубированные с афобазолом (10 М) после повреждения глутаминовой кислотой; Г - клетки инкубированные с афобазолом (10* М). Увеличение Х200.

Наличие защитного действия афобазола после применения глутаминовой кислоты in vitro согласуется с результатами исследований in vivo, свидетельствующими о нейропротекторной активности препарата при его введении в 3-х и 6-ти часовой период после локальной ишемии, вызванной окклюзией средней мозговой артерии (Баласанян М., 2003; Мирзоян P.C. и соавт., 1996).

Таким образом, полученные результаты показали, что афобазол в концентрациях 10"8 М и 10"5 М обладает нейропротекторным действием при повреждении гиппокампальных нейронов перекисью водорода и глутаминовой кислотой.

Известно, что апоптоз сопровождается активацией каспазного каскада и развертыванием биохимических и морфологических изменений в клетке (Nicholson D. et al, 1997). Каспазы играют ключевую роль, расщепляя специфические белки и приводя к клеточной смерти (Wei L. et al., 2004). Среди всех эффекторных каспаз выделяется каспаза-3, т.к. она часто активируется рядом клеточных сигналов смерти (Namura S. et al., 1998).

Имеется много литературных данных об активации каспазы-3 от 12 до 48 часов после ишемии у крыс (Manabat С. et al., 2003; Zhu Н. et al., 2004) и внесение ингибиторов каспаз в этот временной промежуток значительно снижает гибель клеток (Tan S. et al., 1998). Нами было в предыдущей серии экспериментов показано, что афобазол обладает защитными свойствами через 1, 16, 20 и 24 часа после повреждения нейронов. В это время при моделировании глутаматной токсичности в культуре клеток отмечаются морфологические повреждения клеточных органелл: аппарата Гольджи, структур эндоплазматического ретикулума, митохондрий, ДНК (Behl С. et al., 1994; Kerr J. et al., 1995). Поэтому представлялось интересным установить влияние афобазола на процесс апоптоза через активную каспазу-31.

Исследования показали значительную активацию каспазы-3 в клетках, поврежденных глутаматом. Эта результаты согласуются с данными о присутствии каспазы-3 в зоне ишемического повреждения (Zhu Н.С. et al, 2004).

1 - Исследования выполнены совместно с сотрудниками Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии, лаборатории функциональной биохимии нервной системы (рук. проф. Гуляева Н.В.) Онуфриевым М.В., Степаничсвым М.Ю.

К тому же было установлено, что внесение афобазола в конечной концентрации 10 * М препятствует гиперактивации каспазы-3 (рис. 4). При этом добавление афобазола к интактным клеткам также не приводило к полному ингибированию активности каспазы-3, для которой выявлены важные неапоптотические функции. Активность каспазы-3 является основой протеолитического механизма, необходимого для реализации долговременной нейропластичности. Полное ингибирование каспазы-3 нарушает обучение реакции активного избегания у крыс (ОЫуаеуа N.. 2004). Поэтому важно не ингибировать каспазу-3, а ограничить ее гиперактивацию при патологических состояниях.

Таким образом, нейропротективные свойства афобазола при моделировании глутаматной токсичности и окислительного стресса могут быть связаны с ограничением гиперактивации эффекторной апоптотической каспазы-3.

Рис. 4. Выявление активной каспазы-3 (зеленый цвет) в культуре НТ-22 при моделировании глутаматной токсичности, с использованием специфических антител к активной каспазе-3. А - интактные клетки; Б - клетки, инкубированные с глутаминовой кислотой (5 мМ): В - клетки, инкубированные с афобазолом (Ю-8 М) после повреждения глутаминовой кислотой; Г - клетки инкубированные с афобазолом (Ю"8 М). Увеличение 200Х.

Известно, что апоптоз - это обратимый путь клеточной гибели, который на начальных стадиях может быть остановлен, в частности, с помощью нейротрофинов. Создание высоких концентраций нейротрофинов в областях мозга с развивающейся апоптотической гибелью нейронов, считается одним из перспективных подходов к терапии нейродегенеративных заболеваний, в частности ишемии (Lindsay, 1994). В связи с этим, была поставлена задача исследовать влияние афобазола в различных концентрациях на уровень нейротрофического фактора мозга - BDNF в культуре клеток НТ-22.

Данные иммуноферментного анализа показали, что афобазол достоверно увеличивает уровень BDNF в конечных концентрациях от 10"8 М до 10'5 М, причем наибольшие увеличение (на 25%) отмечено при внесении препарата в конечной концентрации 10'8 М (рис. 5).

ю с tee <оо <so <© ®

с _ о— о— о —

♦ -в- -в- -в-

я Я Я Я Я

Рис. 5. Влияние различных концентраций афобазола на уровень ВООТ в культуре клеток НТ-22. ***- р<0.001, **- р<0.01, *- р<0.05 по сравнению с контролем.

Таким образом, обнаруженная способность афобазола увеличивать уровень ВО№ может являться одной из стадий защитного действия препарата при повреждении гиппокампальных нейронов Н2О1 и глутаминовой кислотой через

ограничение гиперактивации каспазы-3. Действительно, известно, что BDNF защищает нейроны от токсического действия глутамата, редуцируя действие NO (Kume Т. et al., 1997), и снижает активность каспазы-3 в нейронах коры и стриатума (Madeddu F et al., 2004; Kim et al., 2005; Perez-Navarro E. et al., 2005)

Полученные данные о влиянии афобазола на уровень BDNF в культуре клеток НТ-22 послужили основой для дальнейшего изучения влияния афобазола на содержание нейротрофина у мышей с различным фенотипом ЭСР: пассивным freezing типом поведения - BALB/c и активным типом - C57BL/6.

Известно, что эта линии животных резко отличаются по основным нейрохимическим и нейрогуморальным механизмам стрессового ответа (Seredenin S., 2003). В свою очередь нейромедиаторы и гормоны, вовлеченные в формирование стрессовой реакции, значительно влияют на образование BDNF (Tapia-Arancibia L. et al., 2004). С другой стороны, хронобиологические исследования демонстрируют сезонные колебания в содержании эндогенных регуляторов, что так же может обусловить различия в уровнях BDNF определяемых в разное время года (Арушанян Э Б., 2005). Поэтому, для исследования влияния афобазола на уровень BDNF в экспериментах in vivo, в первую очередь, была проведена серия экспериментов по изучению содержания нейротрофина в структурах головного мозга мышей C57BL/6 и BALB/c в зимний и весенний периоды. Концентрацию BDNF определяли в гипоталамусе, гиппокампе, стриатуме и коре с помощью иммуноферментного анализа в модификации ELISA1.

Эксперимент I был выполнен в мае, эксперимент П-в декабре, эксперимент Ш - в феврале. В результате установлено, что содержание BDNF в структурах мозга мышей линий C57BL/6 и BALB/c, определенное в мае, статистически «

достоверно выше, чем в период декабря и февраля (табл. 1).

Различия в зарегистрированных уровнях BDNF в разные сезоны могут 4

объясняться повышением продукции тестостерона при переходе от зимнего к весеннему периоду (Арушанян Э.Б., 2005). Известно, что тестостерон стимулирует образование мозгового нейротрофического фактора (Rasika S. et al, 1999).

1 - Иммуноферментный анализ проводился на базе Института молекулярной генетики РАН, лаб. молекулярной генетики соматических клеток (рук. к.б.н. ЯАХривенников).

В большинстве опытов уровень ВОЫР был достоверно выше у мышей линии ВА1.В/с. Такие различия во всех исследованных структурах зарегистрированы в февральском опыте, в декабре исключение составил гиппокамп, в то время как, в весенний период различия нивелировались. Следует отметить, что соотношение ВООТ между структурами головного мозга в различные сезоны сохранялось.

Таблица 1

Зависимость уровня ВРОТ в гипоталамусе, гиппокампе, стриатуме и коре

головного мозга мышей ВАЬВ/с и С57В176 от времени проведения опыта

ВООТ/вслок (п1тк%)

линия месяц гипоталамус гмяпокамп стрматум Кора

ВАЬВ/с (п = 6) Декабрь 0,28±0,02***, ллл 0,23±0,03 0,07+0,01*, лл 0,07±0,01"' ЛЛЛ

Февраль 0,52±0,11** 0,31 ±0,1** 0,14±0,04** 0,15±0,03* **

Май 1.85±0,13*,*** 1,05±0,15Ш 0,27+0,02*, ### 0,55±0,07** #

С57В176 (п = 6) Декабрь 0,22+0,02ллл 0,21 ±0,01ллл 0,05±0,01 0,06±0,(Ю4

Февраль 0,30±0,04 0,10±0,05 0,05±0,02 0,06±0,004

Май 1,6510,14*** 1,07±0,26*** 0,3440,05*** 0,51 ±0,01** #

Данные представлены в виде М ± 8с1, где М-среднее, 8с1-станлартное отклонение, п - число животных

* - р <0,05, ** - р <0.01*** - р <0,001 по сравнению с С57ВЬ/6, лл - р <0,01, ллл - р <0,001 по сравнению с февралем одноименной линии мышей, ### - р <0,001 в мае по сравнению с декабрем и февралем одноименной линии мышей.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что при анализе изменений содержания ВООТ в структурах головного мозга лабораторных животных существенное значение имеет учет их генетических особенностей и хронобиологических факторов.

Данные об изменениях уровня ВО№ в ответ на стрессируюшее воздействие в совокупности с данными об анксиоселективном действии афобазола, послужили

основой для исследования межлинейных различий в изменениях уровня нейротрофина в ответ на эмоциональный стресс и оценки влияния препарата на изменения содержания BDNF в структурах головного мозга в ответ на стрессирующее воздействие.

В каждом эксперименте животных разделяли на 5 групп, по б мышей каждой линии в группе:

Группа 1 - исходный контроль Мышей декапитировали моментально после взятия из клетки.

Группа 2 - контроль на стрессирующее воздействие handling, включающий манипуляции с перемещением животных из клетки и в/б введением физраствора.

Группа 3 - handling и в/б введение афобазола в дозе 5мг/кг.

Группа 4- на фоне handling через 1 час после инъекции физраствора мышей помещали в ярко освещенное ОП.

Группа 5 - на фоне handling через 1 час после в/б инъекции афобазола в дозе 5 мг/кг мышей помещали в ОП.

Декапитацию производили через 1, 3 или 24 часа после последнего воздействия.

Из рис. б видно, что handling приводил к достоверному уменьшению BDNF в гипоталамусе, в гиппокампе и коре на 25%, 15% и 53% (р<0,001), соответственно у мышей BALB/c. В этих структурах афобазол статистически достоверно предотвращал наблюдаемое снижение. В стриатуме через 1 час после handling уровень нейротрофина повышался в 1,5 раза, аналогичное действие оказывал афобазол.

Помещение мышей BALB/c в ОП не приводило к дополнительному снижению содержания BDNF в гипоталамусе и в гиппокампе, а в стриатуме и коре его уровень не отличался от исходного контроля (рис. 6). Однако во всех четырех структурах афобазол способствовал повышению содержания нейротрофина на фоне стрессирующих воздействий handling и ОП на 43% в гипоталамусе, 35% (р<0,001) в гиппокампе, 72% (р<0,001) в стриатуме (р<0,001) и 15% в коре (р<0,01).

гипоталамус гшпнисамп .. стриатум нора

Рис.6. Уровень ВООТ в структурах мозга мышей ВАЬВ/с через 1 час после стрессового воздействия. р<0.001, *•- р<0.01 по сравнению с группой 1, ЛЛЛ-р<0.001 по сравнению с группой 2, ###- р<0.001, ##- р<0.01 по сравнению с группой 4

гипоталамус гшшокамп ^ стриатум кора

□ контроль

И стресс 1

" афобаэол

5мг/кг В стресс 2

■ афобаэол +ОП

Рис.7. Уровень ВВ№ в структурах мозга мышей С57В1У6 через 1 час после стрессового воздействия. ***- р<0.001, **- р<0.01 по сравнению с группой 1, ллл -р<).001, ^ р<0.01,л - р0.05 по сравнению с группой 2

У мышей C57BL/6 handling и инъекция физраствора также вызывали падение содержания нейротрофина в 1,5 раза (р<0,001) (рис. 7). Следует отметить, что исходное содержание BDNF у мышей C57BL/6 было ниже, чем у BALB/c во всех структурах, кроме стриатума Афобазол препятствовал уменьшению, вызываемому handling, однако уровень нейротрофина не достигал контрольного.

После эксперимента в ОП, на фоне handling, у C57BL/6 уровень BDNF оказался сходным с зарегистрированным в контроле в стриатуме и коре и оставался меньше исходного в гипоталамусе на 26% (р<0,001), в гиппокампе на 40% (р<0,001). Афобазол у мышей C57BL/6 не влиял на уровень нейротрофина после эксперимента в ОП (рис.7).

Анализ изменений BDNF через Зч после handling показал, что у мышей BALB/c уровень нейротрофина достоверно увеличивался в гиппокампе, коре и уменьшался в стриатуме. Афобазол достоверно увеличивал уровень BDNF во всех структурах, кроме гиппокампа. Помещение BALB/c в ОП приводило к снижению содержания BDNF в гипоталамусе, а в остальных структурах его уровень не отличался от исходного контроля. Эффекты афобазола через Зч после стрессирующих воздействий не были выражены.

У мышей C57BL/6 в Зч эксперименте уровень BDNF менялся разнонаправлено: handling вызывал увеличение, а афобазол - снижение во всех исследованных структурах. Помещение мышей в ОП также приводило к увеличению уровня BDNF в гиппокампе и коре, и к уменьшению в гипоталамусе. Афобазол достоверно увеличивал уровень нейротрофина во всех структурах, кроме стриатума.

В 24ч эксперименте у мышей BALB/c наблюдали достоверное падение уровня BDNF в 2,5 раза (р<0,001) во всех структурах, на фоне handling. Эффект однократной инъекции афобазола на уровень BDNF в этот период не проявлялся. После эксперимента в ОП содержание нейротрофина также было снижено, только в гипоталамусе афобазол способствовал его повышению (рис.8).

У мышей C57BL/6 через 24 часа после handling уровень BDNF не отличался от исходного, афобазол не вызывал изменений. Воздействие ОП приводило к увеличению содержания нейротрофина. Афобазол не влиял на уровень BDNF в стриатуме и коре, вызывал снижение в гипоталамусе и гиппокампе.

гипоталамус

>1 стриятум

Рис.8. Уровень в структурах мозга мышей ВАЬВ/с через 24 часа после

стрессового воздействия. *** - р<0.001 по сравнению с группой 1, ЛЛ- р<0.01, Л-р<0.05 по сравнению с группой 2, ## - р<0.01 по сравнению с группой 4

Полученные данные соответствуют результатам предыдущих работ, демонстрирующих падение содержания BDNF в структурах мозга после эмоционально-стрессового воздействия, а также исследованиям, в которых были установлены разнонаправленные для отдельных структур сдвиги уровня нейротрофина (Smith М. et al., 1995; Rasmusson A. et al., 2002; Tapia-Arancibia L. ct al., 2004). Получетные данные указывают на выраженные различия в изменениях уровня BDNF в структурах головного мозга в ответ на стрессирующие воздействия handling и ОП. Если у BALB/c наблюдали противоположные эффекты эмоционально-стрессового воздействия и афобазола на уровень BDNF, то у C57BL/6 в большинстве случаев таких закономерностей не выявлено. Эти результаты согласуются с данными литературы, свидетельствующими о высокой чувствительности мышей BALB/c к эмоционально-стрессовому воздействию в ОП и резистентности к таковому у C57BL/6 (Hall С., 1934). Отмеченное соответствие дополняется данными, показывающими, что в экспериментах, включающих воздействие новой обстановки, афобазол вызывал анксиолитическое действие у мышей BALB/c, не влияя на C57BL/6 (Seredenin S., 2003).

Отсутствие через 24 часа выраженных эффектов афобазола может быть объяснено недостаточностью однократного введения препарата для коррекции

вызванных стрессом изменений уровня BDNF в этот период. Для проверки выдвинутой гипотезы выполнена дополнительная серия опытов, в которой уровень BDNF исследовали у мышей, испытавших в качестве стрессирующего воздействия handling и в/б введение физраствора через каждые 6 часов в течение суток -контрольная группа. В опытной группе после взятия животных из клетки через каждые б часов в течение суток, в/б вводили афобазол в дозе 5мг/кг.

Данные о содержании BDNF, установленные через б часов после последней инъекции, приведены на рис. 9. Как видно из рисунка, стрессирующее воздействие handling приводило к достоверному снижению BDNF в гипоталамусе, стриатуме и коре мышей BALB/c на 18% (р<0,001), 21% (р<0,01) и 28% (р<0,001) соответственно. Афобазол при 4-кратном введении предотвращал наблюдаемое снижение, достоверно повышал уровень нейротрофина по сравнению с группой, которой вводили физраствор. Противоположный эффект отмечен в гиппокампе.

Зарегистрированное повышение уровня BDNF в гиппокампе может отражать процесс запоминания стрессирующего воздействия. Существует точка зрения, что увеличение содержания BDNF в гиппокампе способствует запоминанию события, вызвавшего установленный сдвиг (Tapia-Arancibia L. el al., 2004).

гипоталамус гшшоюиш ^ стрнятум кора

Рис.9. Уровень BDNF в структурах мозга мышей BALB/c после 4-х кратных воздействий handling и афобазола в течение суток. ***- pO.OOl, **- р<0.01 по сравнению с группой 1, ллл - р<0.001, ** - р<0 01 по сравнению с группой 2.

У мышей C57BL/6 на фоне handling достоверное снижение BDNF выявлено в гипоталамусе и в коре, а в гиппокампе и стриатуме его содержание увеличивалось. На фоне афобазола более высокий уровень BDNF по сравнению с воздействием handling отмечен лишь в гипоталамусе, в остальных структурах содержание нейротрофина было меньшим.

Таким образом, афобазол, при повторных введениях, препятствовал вызываемому стрессом уменьшению содержания нейротрофина в структурах головного мозга мышей BALB/c. Другая направленность влияния стрессирующих воздействий на уровень BDNF у мышей C57BL/6 подтверждает различия в механизмах формирования ЭСР у мышей этих двух линий (Seredenin S, 2003). Объяснение этих фактов требует дополнительных исследований, однако очевидно, что линия мышей BALB/c, не устойчивых к примененному виду стресса, является более адекватной моделью для выполненного эксперимента.

Установленные на мышах BALB/c противоположные влияния стрессирующего воздействия и афобазола на уровень BDNF, дают основание для заключения о связи выявленных изменений с механизмами как формирования фенотипа эмоционально-стрессового ответа с выраженной реакцией страха, так и анксиоселективного эффекта афобазола.

Поскольку нейротрофические факторы, включая BDNF, играют важную роль в механизмах нейропротекции (Sendtner М., 1999, Wellmer A. et al., 2001), полученные результаты свидетельствуют в пользу гипотезы о сочетании анксиолитических и нейропротекторных свойств афобазола и возможной реализации этих факторов, через регуляцию мозгового иейротрофического фактора BDNF.

ВЫВОДЫ

1. Афобазол в конечных концентрациях 10"8 М и 10"5 М повышает выживаемость гиппокампальных нейронов при повреждении перекисью водорода и пгутаминовой кислотой.

2. Афобазол в конечной концентрации Ю-8 М препятствует гиперактивации эффекторной апоптотической каспазы-3 в культуре клеток линии НТ-22 в условиях глутаматной токсичности

3. Афобазол в конечных концентрациях от 10"8 М до 10'5М увеличивает уровень мозгового нейротрофического фактора в культуре нейронов, максимальный эффект проявляется в концентрации 10~8М.

4. Установлены межпинейные различия в изменениях уровня BDNF у животных с различным фенотипом эмоционально-стрессовой реакции. Для мышей BALB/c характерно выраженное снижение BDNF через 1 и 24 часа после стрессовых воздействий. У мышей C57BL/6 стресс вызывает меньшее снижение уровня BDNF через 1 час, а через 24 часа содержание нейротрофина восстанавливается.

5. Афобазол в дозе 5 мг/кг в/б при однократном введении препятствует снижению уровня BDNF через 1 час после воздействия стрессирующих факторов. Эффект афобазола более выражен у мышей BALB/c. Через 24 часа после однократного введения влияние афобазола на содержание BDNF не выявлено.

6. Повторные стрессирующие воздействия handling приводят к значительному снижению содержания BDNF в гипоталамусе, коре и стриатуме мозга мышей BALB/c. Афобазол при 4х кратном введении в/б в дозе 5 мг/кг восстанавливает уровень BDNF до контрольных значений у мышей данной линии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Д.С. Мелкумян, Е.А. Вальдман, С.Б. Середенин. Влияние нового селективного анксиолитика афобазола на уровень мозгового нейротрофического фактора. // Сборник тезисов ХП Российского Национального Конгресса «Человек и лекарство». Москва, 18-22 апреля 2005, С. 682

2. D.S. Melkumyan. Effect of afobazol on brain-derived neurotrophic factor protein in brain of inbred mice exposed to emotional stress. // European Neuropsychopharmacology. Vol. 15. Suppl. 2. 2005. 8th European College of Neuropsychopharmacol., Moscow, P. 149.

3. T.A. Zenina, I.V. Gawrish, D.S. Melkumyan, T.S. Seredenina. Afobazol protects neurons against oxidative stress and glutamate toxicity in vitro. // European Neuropsychopharmacology. Vol. 15. Suppl. 2. 2005. 84 European College of Neuropsychopharmacol., Moscow, P. 246.

4. T.A. Зенина, И.В. Гавриш, Д.С. Мелкумян, Т.С. Середенина, С.Б. Середенин. Изучение нейропротекторных свойств афобазола в опытах in vitro. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.- 2005.- Т.140 (8) - С. 161-163.

5. Д.С. Мелкумян, Е.А. Вальдман, С.Б. Середенин. Содержание BDNF в мозговых структурах инбредных мышей с различными фенотипами эмоционально-стрессовой реакции. // Научные труды I съезда физиологов СНГ, Сочи ,19-23 сентября 2005 г., Т.2, С. 35.

6. Д.С. Мелкумян, Т.С. Середенина, М.А. Яркова, Е.А. Вальдман, С.Б. Середенин. Анализ содержания BDNF в структурах головного мозга инбредных мышей с различными фенотипами эмоционально-стрессовой реакции. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.- 2005.- Т. 140 (11). -С. 549-551.

7. Е.А. Вальдман, Д.С. Мелкумян, Т.С. Середенина, М.А. Яркова, С.Б. Середенин. Изменения уровня BDNF в структурах головного мозга мышей C57BL/6 и BALB/c при стрессовых воздействиях. // Психофармакология и биологическая наркология. -2005.- Т. 5. - №3. - С. 974-979.

8. Д.С. Мелкумян, Т.А. Зенина, С.Б. Середенин. Влияние афобазола на уровень BDNF в экспериментах in vitro. // Материалы 4-й международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» ,13-16 марта 2006, Москва, С.

9. С.Б. Середенин, ДС. Мелкумян, Е.А. Вальдман, М.А. Яркова, Т.С. Середенина, М.В. Воронин, А.С. Лапицкая. Влияние афобазола на содержание BDNF в структурах мозга инбредных мышей с различным фенотипом эмоционально-стрессовой реакции. //Экспериментальная и клиническая фармакология.- 2006.-(принята в печать).

Подписано в печать 09.03.2006. Формат 60x84 1/16 Бумага офисная. Печать офсетная. Усл. п.л. 1,6 Тираж 100 экз. Заказ №201

Типография Управления «Реалпроект» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского, д. 93 корп. 1. Тел. 433-12-13

aooGft

SO40

- 50 4 0

Оглавление диссертации Мелкумян, Диана Степановна :: 2006 :: Москва

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Механизмы гибели нейронов при ишемическом инсульте

1.1.1. Современные представления о биохимических изменениях при локальной ишемии

1.1.2. Механизм апоптотической гибели нейронов при ишемии 13 1Л .3. Взаимосвязь стресса, развития депрессий и нейродегенеративных заболеваний

1.2. Мозговой нейротрофический фактор — BDNF

1.2.1. Характеристика нейротрофинов

1.2.2. BDNF - член семейства нейротрофинов

1.2.3. Строение и регуляция гена BDNF

1.2.4. Рецепторы нейротрофинов

1.2.5. Экспрессия BDNF в нервной системе

1.2.6. Взаимовлияние различных факторов и экспрессии BDNF

1.2.6.1. Связь с нейромедиаторами

1.2.6.2. Связь с гормонами

1.2.7. Влияние стресса на экспрессию BDNF в различных структурах мозга

1.2.8. Фармакологические подходы к регуляции уровня BDNF

1.3. Афобазол — новый селективный анксиолитик

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Определение уровня BDNF методом иммуноферментного анализа

2.2. Тест «Открытое поле»

2.3. Моделирование окислительного стресса и глутаматной токсичности in vitro

2.3.1. Модель глутаматной токсичности

2.3.2. Модель окислительного стресса

2.4. Методы оценки жизнеспособности нейронов в культуре

2.4.1. МТТ-тест

2.4.2. Окраска флюоресцентным ядерным красителем Хёхст

2.5. Иммунофлюоресцентный метод определения активной каспазы

2.6. Статистическая обработка результатов

ГЛАВА 3. НЕЙРОПРОТЕКТОРНЫЕ СВОЙСТВА АФОБАЗОЛА В ЭКСПЕРИМЕНТАХ IN VITRO

3.1. Исследование нейропротекторного действия афобазола на модели окислительного стресса

3.2. Исследование нейропротекторного действия афобазола на модели глутаматной токсичности

3.3. Исследования влияния афобазола на активную каспазу

3.4. Изучение влияния афобазола на уровень BDNF в культуре клеток НТ

ГЛАВА 4. ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ АФОБАЗОЛА НА УРОВЕНЬ BDNF В РАЗЛИЧНЫХ СТРУКТУРАХ МОЗГА В ЭКСПЕРИМЕНТАХ IN VIVO

4.1. Исследование содержания BDNF в структурах головного мозга мышей C57BL/6 и BALB/c в различное время года

4.2. Изменения уровня BDNF в структурах головного мозга мышей C57BL/6 и BALB/c при стрессовых воздействиях

4.3. Влияние афобазола на содержание BDNF в структурах головного мозга мышей C57BL/6 и BALB/c в условиях эмоционального стресса 83 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 104 ВЫВОДЫ 116 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

5-НТ - серотонин

АФК - активные формы кислорода

МАО - моноаминоксидаза

ОП - открытое поле

ПОЛ - перекисное окисление липидов

АМРА - alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionate

BDNF - brain-derived neurotrophic factor

CaM киназа - Ca2+/calmodulin-dependent protein kinases

CREB - cyclic AMP response element binding protein

DMSO - диметилсульфоксид

ДМЕМ - Dulbecco's modified Eagle's medium

ELISA - enzyme linked immunosorbent assay

ERa - эстрогеновый рецептор

ERE - estrogen-responsive element

FBS - фетальная бычья сыворотка

IP3 - инозитолтрифосфат

LTP - долговременное потенциирование

МАРК - митоген-активированная протеинкиназа mAChRs - мускариновый ацетилхолиновый рецептор nAChRs - никотиновый ацетилхолиновый рецептор

NMDA - N-methyl-D-aspartate;

NGF - nerve growth factor n NOS — нейрональная NO-синтаза

PI-3K - фосфотидилинозитол-3-киназа

PLC-y - фосфолипаза С

PVN - paraventricular nucleus (ядра гипоталамуса)

She - sre homology collagen-like protein (адаптерные белки)

SON - supraoptic nucleus (ядра гипоталамуса)

Trk - семейство tropomiosin related kinases, "tracks"

Введение диссертации по теме "Фармакология, клиническая фармакология", Мелкумян, Диана Степановна, автореферат

Актуальность темы

В последние годы достигнут значительный прогресс в изучении патогенетических механизмов сосудистых заболеваний мозга. Ишемия головного мозга имеет следствием последовательное развитие патобиохимических реакций глутамат-кальциевого каскада, сопровождаемых активацией свободно-радикальных процессов. Гиперпродукция активных форм кислорода на фоне дефицита антиоксидантной защиты приводит к развитию «окислительного стресса». Избыточное накопление Са вызывает активацию внутриклеточных ферментов - фосфолипаз, протеинкиназ и эндонуклеаз, за которым следует повреждение и гибель клеток (Berridge М., 1985; Hakim A. et al., 1989; Orrenius S. et al., 1992; Olney J., 1994; Гусев E. и соавт., 2001). Установлена роль апоптоза в формировании очагов поражения нервной ткани (Deshmukh М. et al., 1996). Определена роль нейротрофинов, в частности мозгового нейротрофического фактора BDNF, в защите нейронов от повреждений (de Luca A. et al., 1996).

Анализ литературных данных показывает, что биохимические механизмы повреждения нервных клеток при ишемии сходны с вызванными стрессовыми воздействиями (Ecsh Т. et al., 2002). Стрессовые события рассматриваются в качестве этиопатогенетического фактора ишемических нарушений. С другой стороны, усиление анксиогенеза отмечается в симптомокомплексе постишемических расстройств и нейродегенеративных заболеваний. Патофизиологические исследования показывают, что при ишемических повреждениях включаются эндогенные механизмы нейропротекции (Knusel В. et al., 1992; Sendtner M., 1999). Терапия инсультов также основана на применении нейропротекторных средств, в составе которых присутствуют транквилизаторы и антидепрессанты (Гусев Е. и соавт., 2001).

В ГУ НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН разработан и внедрен в медицинскую практику селективный анксиолитик афобазол (Seredenin S., 2003). Накоплены сведения о наличии у афобазола нейропротекторной активности. Так, установлено, что афобазол усиливает мозговой кровоток и повышает выживаемость крыс в условиях глобальной преходящей ишемии, вызванной перевязкой сонных артерий (Силкина И.В. и соавт., 2004), снижает выраженность патоморфологических изменений «пенумбры» в условиях локальной ишемии, вызванной перевязкой средней мозговой артерии (Баласанян М.Г., 2003), снижает выраженность неврологических нарушений на модели интрацеребральной посттравматической гематомы (Галаева И. и соавт., 2005). Полученные данные подтверждают перспективность дальнейшего изучения механизмов реализации сочетанного анксиолитического и нейропротекторного эффекта афобазола, что будет способствовать расширению спектра его применения в клинической практике.

Цель исследования

Задачи исследования

1. Изучить нейропротекторную активность афобазола на модели окислительного стресса в культуре нейронов.

2. Изучить нейропротекторную активность афобазола на модели глутаматной токсичности в культуре нейронов.

3. Исследовать влияние афобазола на активную каспазу 3 в культуре нейронов.

4. Изучить влияние афобазола на уровень ВЭЫР в культуре нейронов.

5. Выявить изменения уровня ВО№ в мозговых структурах инбредных мышей С57ВЬ/6 и ВАЬВ/с при стрессовых воздействиях.

6. Фармакологически изучить влияние афобазола на динамику изменения содержания В ОМ7 в структурах головного мозга мышей С57В176 и ВАЬВ/с, вызванных стрессовыми воздействиями.

Научная новизна

В результате впервые проведенного исследования нейропротекторной активности нового селективного анксиолитка афобазола в культуре клеток показано, что афобазол в концентрациях, близких к зарегистрированным в плазме крови, после системного введения в терапевтических дозах, обладает защитным действием при повреждении гиппокампальных нейронов перекисью водорода и глутаминовой кислотой. Установлено, что в условиях глутаматной токсичности афобазол препятствует гиперактивации каспазы-3 в культуре клеток линии НТ-22.

Впервые установлены межлинейные различия в содержании мозгового нейротрофического фактора ВО№ в структурах головного мозга инбредных мышей с различным фенотипом эмоционально-стрессовой реакции. Показано, что у интактных животных уровень нейротрофина выше у мышей линйи ВАЬВ/с. Стрессовое воздействие вызывает длительное снижение уровня ВЭЫР у мышей ВАЬВ/с, в отличие от С57ВЬ/6, у которых вслед за кратковременным снижением уровня нейротрофина, следует его восстановление до исходных значений.

Впервые показана способность афобазола повышать уровень ВОМ7 в культуре нейронов. Доказано, что афобазол в дозе 5 мг/кг при повторных введениях восстанавливает уровень мозгового нейротрофического фактора в коре, гипоталамусе и стриатуме мышей ВАЬВ/с, сниженный в результате стрессовых воздействий.

Одновременно установлены межлинейные различия в эффектах стрессирующих воздействий и афобазола на уровень ВОЫР у мышей С57ВЬ/6 и ВАЬВ/с, что подтверждает генетически детерминированные различия в механизмах формирования эмоционально-стрессовой реакции животных этих линий.

Научно-практическая значимость

Установленные защитные свойства афобазола и способность регулировать содержание ВО№ раскрывают механизмы его нейропротекторного и анксиоселективного эффекта и обосновывают дальнейшие фармакологические исследования с использованием ВОМ7 в качестве мишени.

Специфика изменений ВОМ7, выявленная у животных с различной эмоционально-стрессовой реакцией, указывает на необходимость учета фенотипа ответа на стресс не только при терапии анксиолитиками, но и при проведении лечебных мероприятий, направленных на нейропротекцию.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на XII Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, апрель 2005), на 8-й Региональной конференции Европейской коллегии по нейропсихофармакологии (Москва, апрель 2005), на I съезде физиологов СНГ (Сочи, сентябрь 2005), на 4-ой международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, март 2006).

Публикации

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста и состоит из: введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающий 20 отечественных и 224 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 3 таблицами и 44 рисунками.

Заключение диссертационного исследования на тему "Экспериментальное исследование нейропротекторных свойств афобазола"

выводы

1. Афобазол в конечных концентрациях 10"8 М и 10"5 М повышает выживаемость гиппокампальных нейронов при повреждении перекисью водорода и глутаминовой кислотой.

2. Афобазол в конечной концентрации 10"8М препятствует гиперактивации эффекторной апоптотической каспазы-3 в культуре клеток линии НТ-22 в условиях глутаматной токсичности. о с

3. Афобазол в конечных концентрациях от 10" М до 10" М увеличивает уровень мозгового нейротрофического фактора в культуре нейронов, о максимальный эффект проявляется в концентрации 10" М.

4. Установлены межлинейные различия в изменениях уровня BDNF у животных с различным фенотипом эмоционально-стрессовой реакции. Для мышей BALB/c характерно выраженное снижение BDNF через 1 и 24 часа после стрессовых воздействий. У мышей C57BL/6 стресс вызывает меньшее снижение уровня BDNF через 1 час, а через 24 часа содержание нейротрофина восстанавливается.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ишемические поражения головного мозга и нейродегенеративные заболевания занимают все больший процент в структуре заболеваемости людей в развитых странах. В последние годы отмечается значительный прогресс в изучении патогенетических механизмов сосудистых заболеваний мозга. В результате морфологических и молекулярно-биологических исследований установлено участие процессов апоптоза в формировании очагов поражения нервной ткани и влияние нейротрофинов на процессы программированной клеточной смерти. Поэтому, поиск новых эффективных нейропротекторов с комплексным механизмом действия, направленным на несколько звеньев патогенетического процесса, остается актуальной задачей фармакологии.

В ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН разработан и внедрен в медицинскую практику селективный анксиолитик афобазол, проявляющий нейропротекторную активность. Полученные данные подтверждают перспективность дальнейшего изучения механизмов реализации сочетанного анксиолитического и нейропротекторного эффекта афобазола, что будет способствовать расширению спектра его применения в клинической практике. Данное исследование посвящено изучению, нейропротекторной активности афобазола и механизмов его реализации в экспериментах in vitro и in vivo.

Окислительный стресс является важным звеном повреждения нейронов при различных нейродегенеративных заболеваниях, в том числе при ишемическом инсульте. Причиной его могут быть увеличение продукции свободных радикалов или снижение защитных свойств антиоксидантной системы (супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионпероксидаза и др.), которые имеют место при ишемии (Kanazawa I., 2001). Нейропротекторная активность афобазола была оценена по его влиянию на выживаемость клеток. НТ-22 при моделировании окислительного стресса.

Для индукции окислительного стресса использовали Н2Ог. В ее присутствии наблюдается падение уровня АТФ и повышение концентрации внутриклеточного Са2+, которая приводит к целому каскаду реакций и гибели клетки (Болдырев A.A., 2001). Кратковременная инкубация клеток с перекисью водорода (30 мин) приводила к снижению их выживаемости на 26% (р<0.05). Внесение афобазола за 24 часа до окислительного стресса в конечных концентрациях 10"8 М и 10"5 М сопровождалось достоверным повышением выживаемости нейронов до контрольных значений в обеих концентрациях. При внесении препарата за 30 минут эффективной оказалась о лишь меньшая концентрация (10" М), защитное действие которой было более выражено. Внесение афобазола в культуральную среду сразу после отмывки перекиси водорода также приводило к достоверному протекторному эффекту в концентрации 10"8М.

Полученные данные согласуются с ранее установленными, показавшими защитное влияние афобазола при стимуляции образования активных форм кислорода (Середенин и соавт., 1998). Кроме того, показано, что афобазол повышает устойчивость мембранных структур нейронов коры и стриатума к свободнорадикальным процессам, имеющим место при ишемии, и влияет на активность фермента антиоксидантной защиты клетки - каталазы (Силкина И.В., 2005). Таким образом, повышение выживаемости нейронов после внесения афобазола может быть связано с его антиоксидантными свойствами.

В следующей серии экспериментов было изучено влияние афобазола на выживаемость нейронов на модели глутаматной токсичности, имитирующей, гибель нейронов при развитии ишемического инсульта и хронических нейродегенеративных заболеваний (Stanciu М. et al., 2000). Экзогенный глутамат блокирует обратный захват цистеина в клетках, путем ингибирования глутамат-цистеинового антипорта, который приводит к снижению уровня внутриклеточного цистеина и глутатиона. Истощение глутатиона сопровождается накоплением свободных радикалов, избытком Са2+ и гибелью клетки (Maher Р. et all., 1996; Tan S. et al., 1998).

В экспериментах исследовали влияние афобазола в разные промежутки времени на выживаемость клеток после моделирования глутаматной токсичности. При предварительном внесении афобазола в культуру за 24 часа до повреждения защитное действие зарегистрировано в конечной концентрации 10"8М, поэтому в дальнейших экспериментах использовалась именно эта концентрация. Внесение препарата за 30 минут и сразу после глутаминовой кислоты не было эффективным. Однако добавление афобазола через 1, 16 и 20 часов после повреждения клеток приводило к выраженному защитному эффекту, при котором выживаемость нейронов не отличалась от таковой в контрольной серии.

Для иллюстрации изменений происходящих после действия глутаминовой кислоты и регистрации гибели клетки окрашивали флюоресцентным ядерным красителем Хёхст. Окрашивание клеток выявило характерные изменения в морфологии хроматина: пикноз и конденсацию, характерные для некротических и апоптотических нейронов (Kerr J. et al., 1995; Tan S. et al., 1998). Особенно отчетливо это заметно при внесении глутамата. Гибель нейронов в контроле составила 3,97%, при внесении глутаминовой кислоты - 34,5% (р<0.001). Инкубирование клеток с афобазолом после повреждения значительно снижало число пикнотических клеток, гибель клеток составила 7%. Внесение афобазола в клетки без повреждения не отличалось от контроля.

Таким образом, полученные результаты показали, что афобазол в концентрациях 10"8М и 10"5 М обладает нейропротекторным действием при повреждении гиппокампальных нейронов перекисью водорода и глутаминовой кислотой.

Известно, что апоптоз сопровождается активацией каспазного каскада и развертыванием биохимических и морфологических изменений в клетке (Nicholson D. et al., 1997). Каспазы играют ключевую роль, расщепляя специфические белки и приводя к клеточной смерти (Wei L. et al., 2004). Среди всех эффекторных каспаз выделяется каспаза-3, т.к. она часто активируется рядом клеточных сигналов смерти (Namura S. et al., 1998).

Имеется много литературных данных об активации каспазы-3 от 12 до 48 часов после ишемии у крыс (Manabat С. et al., 2003; Zhu Н. et al., 2004) и внесение ингибиторов каспаз в этот временной промежуток значительно снижает гибель клеток (Tan S. et al., 1998). Нами было в предыдущей серии экспериментов показано, что афобазол обладает защитными свойствами через 1, 16, 20 и 24 часа после повреждения нейронов. В это время при моделировании глутаматной токсичности в культуре клеток отмечаются, морфологические повреждения клеточных органелл: аппарата Гольджи, структур эндоплазматического ретикулума, митохондрий, ДНК (Behl С. et al., 1994; Kerr J. et al., 1995). Поэтому представлялось интересным установить влияние афобазола на процесс апоптоза через активную каспазу-3.

Исследования показали значительную активацию каспазы-3 в клетках, поврежденных глутаматом. Эти результаты согласуются с данными о присутствии каспазы-3 в зоне ишемического повреждения (Zhu Н.С. et al, 2004). К тому же было установлено, что внесение афобазола в конечной концентрации 10"8 М препятствует гиперактивации каспазы-3. При этом добавление афобазола к интактным клеткам также не приводило к полному ингибированию активности каспазы-3, для которой выявлены важные неапоптотические функции. Активность каспазы-3 является основой протеолитического механизма, необходимого для реализации долговременной нейропластичности. Полное ингибирование каспазы-3 нарушает обучение реакции активного избегания у крыс (Gulyaeva N., 2004). Поэтому важно не ингибировать каспазу-3, а ограничить ее гиперактивацию при патологических состояниях.

Известно, что апоптоз — это обратимый путь клеточной гибели, который на начальных стадиях может быть остановлен, в частности, с помощью нейротрофинов. Создание высоких концентраций нейротрофинов в областях мозга с развивающейся апоптотической гибелью нейронов, считается одним из перспективных подходов к терапии нейродегенеративных заболеваний, в частности ишемии (Lindsay, 1994). В связи с этим, была поставлена задача исследовать влияние афобазола в различных концентрациях на уровень нейротрофического фактора мозга -BDNF в культуре клеток НТ-22.

Данные иммуноферментного анализа показали, что афобазол о достоверно увеличивает уровень BDNF в конечных концентрациях от 10" М до 10"5 М, причем наибольшие увеличение (на 25%) отмечено при внесении препарата в конечной концентрации 10"8 М.

Таким образом, обнаруженная способность афобазола увеличивать уровень BDNF может являться одной из стадий защитного действия препарата при повреждении гиппокампальных нейронов Н2О2 и глутаминовой кислотой через ограничение гиперактивации каспазы-3. Действительно, известно, что BDNF защищает нейроны от токсического действия глутамата, редуцируя действие NO (Kume Т. et al., 1997), и снижает активность каспазы-3 в нейронах коры и стриатума (Madeddu F. et al., 2004; Kim et al., 2005; Perez-Navarro E. et al., 2005).

Известно, что эти линии животных резко отличаются по основным нейрохимическим и нейрогуморальным механизмам стрессового ответа (Seredenin S., 2003). В свою очередь нейромедиаторы и гормоны, вовлеченные в формирование стрессовой реакции, значительно влияют на образование BDNF (Tapia-Arancibia L. et al., 2004). С другой стороны, хронобиологические исследования демонстрируют сезонные колебания в содержании эндогенных регуляторов, что так же может обусловить различия в уровнях BDNF определяемых в разное время года (Арушанян Э.Б., 2005). Поэтому, для исследования влияния афобазола на уровень BDNF в экспериментах in vivo, в первую очередь, была проведена серия экспериментов по изучению содержания нейротрофина в структурах головного мозга мышей C57BL/6 и BALB/c в зимний и весенний периоды. Концентрацию BDNF определяли в гипоталамусе, гиппокампе, стриатуме и коре с помощью иммуноферментного анализа в модификации ELISA.

Эксперимент I был выполнен в мае, эксперимент II - в декабре, эксперимент III - в феврале. В результате установлено, что содержание

БЮЫР в структурах мозга мышей линий С57ВЬ/6 и ВАЬВ/с, определенное в мае, статистически достоверно выше, чем в период декабря и февраля.

Различия в зарегистрированных уровнях ВООТ в разные сезоны могут объясняться повышением продукции тестостерона при переходе от зимнего к весеннему периоду (Арушанян Э.Б., 2005). Известно, что тестостерон стимулирует образование мозгового нейротрофического фактора (И^ка Б. е1 а1., 1999).

В большинстве опытов уровень ВОЫР был достоверно выше у мышей линии ВАЬВ/с. Такие различия во всех исследованных структурах зарегистрированы в февральском опыте, в декабре исключение составил гиппокамп, в то время как, в весенний период различия нивелировались. Следует отметить, что соотношение ВООТ между структурами головного мозга в различные сезоны сохранялось.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что при анализе изменений содержания ВОЫР в структурах головного мозга лабораторных животных существенное значение имеет учет их генетических особенностей и хронобиологических факторов.

Данные об изменениях уровня ВОЫР в ответ на стрессирующее воздействие в совокупности с данными об анксиоселективном действии афобазола, послужили основой для исследования межлинейных различий в изменениях уровня нейротрофина в ответ на эмоциональный стресс и оценки влияния препарата на изменения содержания ВОЫР в структурах головного мозга в ответ на стрессирующее воздействие.

В каждом эксперименте животных разделяли на 5 групп, по 6 мышей каждой линии в группе:

Группа 1 - исходный контроль. Мышей декапитировали моментально после взятия из клетки.

Группа 3 — handling и в/б введение афобазола в дозе 5мг/кг.

Группа 4 — на фоне handling через 1 час после инъекции физраствора мышей помещали в ярко освещенное ОП.

Группа 5 — на фоне handling через 1 час после в/б инъекции афобазола в дозе 5 мг/кг мышей помещали в ОП.

Декапитацию производили через 1, 3 или 24 часа после последнего воздействия.

Через 1ч handling приводил к достоверному уменьшению BDNF в гипоталамусе, в гиппокампе и коре на 25%, 15% и 53% (р<0,001), соответственно у мышей BALB/c. В этих структурах афобазол статистически' достоверно предотвращал наблюдаемое снижение. В стриатуме через 1 час после handling уровень нейротрофина повышался в 1,5 раза, аналогичное действие оказывал афобазол.

Помещение мышей BALB/c в ОП не приводило к дополнительному снижению содержания BDNF в гипоталамусе и в гиппокампе, а в стриатуме и коре его уровень не отличался от исходного контроля. Однако во всех четырех структурах афобазол способствовал повышению содержания нейротрофина на фоне стрессирующих воздействий handling и ОП на 43% в гипоталамусе, 35% (р<0,001) в гиппокампе, 72% (р<0,001) в стриатуме' (р<0,001) и 15% в коре (р<0,01).

У мышей C57BL/6 handling и инъекция физраствора также вызывали падение содержания нейротрофина в 1,5 раза (р<0,001). Следует отметить, что исходное содержание BDNF у мышей C57BL/6 было ниже, чем у BALB/c во всех структурах, кроме стриатума. Афобазол препятствовал уменьшению, вызываемому handling, однако уровень нейротрофина не достигал контрольного.

Анализ изменений BDNF через Зч после handling показал, что у мышей BALB/c уровень нейротрофина достоверно увеличивался в гиппокампе, коре и уменьшался в стриатуме. Афобазол достоверно увеличивал уровень BDNF. во всех структурах, кроме гиппокампа. Помещение BALB/c в ОП приводило к снижению содержания BDNF в гипоталамусе, а в остальных структурах его уровень не отличался от исходного контроля. Эффекты афобазола через Зч после стрессирующих воздействий не были выражены.

У мышей C57BL/6 в Зч эксперименте уровень BDNF менялся разнонаправлено: handling вызывал увеличение, а афобазол - снижение во всех исследованных структурах. Помещение мышей в ОП также приводило к увеличению уровня BDNF в гиппокампе и коре, и к уменьшению в гипоталамусе. Афобазол достоверно увеличивал уровень нейротрофина во-всех структурах, кроме стриатума.

Полученные данные соответствуют результатам предыдущих работ, демонстрирующих падение содержания BDNF в структурах мозга после эмоционально-стрессового воздействия, а также исследованиям, в которых были установлены разнонаправленные для отдельных структур сдвиги уровня нейротрофина (Smith М. et al., 1995; Rasmusson A. et al., 2002; Tapia-Arancibia L. et al., 2004). Полученные данные указывают на выраженные различия в изменениях уровня BDNF в структурах головного мозга в ответ на стрессирующие воздействия handling и ОП. Если у BALB/c наблюдали противоположные эффекты эмоционально-стрессового воздействия и афобазола на уровень BDNF, то у C57BL/6 в большинстве случаев таких закономерностей не выявлено. Эти результаты согласуются с данными литературы, свидетельствующими о высокой чувствительности мышей BALB/c к эмоционально-стрессовому воздействию в ОП и резистентности к таковому у C57BL/6 (Hall С., 1934). Отмеченное соответствие дополняется данными, показывающими, что в экспериментах, включающих воздействие новой обстановки, афобазол вызывал анксиолитическое действие у мышей BALB/c, не влияя на C57BL/6 (Seredenin S., 2003).

Отсутствие через 24 часа выраженных эффектов афобазола может быть объяснено недостаточностью однократного введения препарата для коррекции вызванных стрессом изменений уровня BDNF в этот период. Для проверки выдвинутой гипотезы выполнена дополнительная серия опытов, в. которой уровень BDNF исследовали у мышей, испытавших в качестве стрессирующего воздействия handling и в/б введение физраствора через каждые 6 часов в течение суток — контрольная группа. В опытной группе после взятия животных из клетки через каждые 6 часов в течение суток, в/б вводили афобазол в дозе 5мг/кг.

Данные о содержании BDNF, установленные через 6 часов после последней инъекции показали, что стрессирующее воздействие handling приводило к достоверному снижению BDNF в гипоталамусе, стриатуме и коре мышей BALB/c на 18% (р<0,001), 21% (р<0,01) и 28% (р<0,001) соответственно. Афобазол при 4-кратном введении предотвращал наблюдаемое снижение, достоверно повышал уровень нейротрофина по сравнению с группой, которой вводили физраствор. Противоположный эффект отмечен в гиппокампе.

Таким образом, афобазол, при повторных введениях, препятствовал вызываемому стрессом уменьшению содержания нейротрофина в структурах головного мозга мышей BALB/c. Другая направленность влияния стрессирующих воздействий на уровень BDNF у мышей C57BL/6 подтверждает различия в механизмах формирования ЭСР у мышей этих двух линий (Seredenin S., 2003). Объяснение этих фактов требует дополнительных исследований, однако очевидно, что линия мышей BALB/c, не устойчивых к примененному виду стресса, является более адекватной моделью для выполненного эксперимента.

Поскольку нейротрофические факторы, включая ЕЮЫР, играют важную роль в механизмах нейропротекции (Зепскпег М., 1999; Wellmer А. е1 а1., 2001), полученные результаты свидетельствуют в пользу гипотезы о сочетании анксиолитических и нейропротекторных свойств афобазола и возможной реализации этих факторов, через регуляцию мозгового нейротрофического фактора ЕЮЫР.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2006 года, Мелкумян, Диана Степановна

1. Арушанян Э.Б. Хронофармакология на рубеже веков. Ставрополь, 2005.

2. Бадыштов Б.А., Косенков Е.И., Середенин С.Б. // Бюлл. экспер. биол. -1988.-№3.-С. 289-291.

3. Баласанян М.Г. Изучение роли оксида азота в механизмах нейропротекторного и анксиолитического действия афобазола в сравнительном аспекте. // Дис. д-ра фарм. наук. Ереван. 2003.

4. Болдырев A.A. Окислительный стресс и мозг. // Биология. 2001.- Т. 7 (4).- С. 21-28.

5. Бородин П.М., Шюллер Л., Беляев Д.К. Проблемы генетики стресса. Сообщение 1. Генетический анализ поведения мышей в стрессовой ситуации // Генетика. 1976. - №12. - С. 62-71.

6. Галаева И.П., Гарибова Т.Л., Воронина Т.А., Середенин С.Б.' Исследование нейропротекторных свойств афобазола на экспериментальной модели геморрагического инсульта // Бюлл. экспер. биол. и мед. 2005. - Т. 140 (11). - С. 545-548.

7. Гусев Е.И., Скворцова В.И. Ишемия головного мозга.- М.: Медицина. -2001.-328 с.

8. Дамулин И.В., Парфенов В.А., Скоромец A.A., Яхно H.H. Нарушения кровообращения в головном и спинном мозге. Болезни нервной системы. Руководство для врачей. М.- 2003.- С. 231-302.

9. Захаров В.В., Яхно H.H. Лечение острой и хронической церебральной ишемии. // Клинические руководства и рекомендации.- 2004.- №14,- С. 88-92.

10. Ю.Мирзоян P.C., Топчан A.B. Баласанян М.Г. Локальная ишемия мозга крыс, вызванная перевязкой средней мозговой артерии. // Эксперим. и клин, фармакол.- 1996.-Т.59 (5). С.62-64.

11. Мягких М.В., Катуков В.Ю., Посыпанова Г.А., Шмырев И.И. и др. Фактор роста нервов. Нейротрофины. структура и функции. // Нейрохимия.- 1998.-Т.15 (2)-С. 106-115.

12. Незнамов Г.Г., Сюняков С.А., Чумаков Д.В., Маметова Л.Э. Новый селективный анксиолитик афобазол. // Журнал неврологии и психиатрии. 2005.- 4. - С. 35-40.

13. Середенин С.Б., Бадыштов Б.А., Никитина М.Н., Розен В.Д. Изменения уровня кортикостерона в плазме крови инбредных мышей после стресса. // Бюл. экспер. биол. и мед. -1982. №8. - С. 36-37.

14. Середенин С.Б., Бадыштов Б. А., Егоров Д.Ю. Исследование содержания продуктов перекисного окисления липидов у инбредных мышей с различным типом эмоционально-стрессовой реакции. // Бюл. экспер. биол. и мед. 1989. - N7. - С.46-48.

15. Середенин С.Б., Воронина Т.А., Незнамов Г.Г., Бледнов Ю.А. и др. Фармакогенетическая концепция анксиоселективного эффекта. // Современные проблемы фармакологии. 1998. - №11. - С. 3-9.

16. Силкина И.В., Александрии В.В., Ганьшина Т.С., Середенин С.Б., Мирзоян Р.С. Усиление кровоснабжения ишемизированного мозга под влиянием афобазола. // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2004. - Т. 67 (5). - С. 9-12.

17. Силкина И.В. Анализ цереброваскулярных и нейропротекторных эффектов афобазола. // Дисс. канд. биол. наук. Москва. 2005.

18. Скворцова В.И. Реперфузионная терапия ишемического инсульта // Consilium Medicum. 2004. - Т. 6 (8). - С.

19. Фильченков А.А. Каспазы: регуляторы апоптоза и других клеточных функций. // Биохимия.- 2003.- Т. 68.- вып. 4.- С. 453-466.

20. Чекалина Н.Д. Нейротрофические факторы и рецепторы к ним. // Нейрохимия. 1997. - Т.14. - вып.1. - С. 30-38.

21. Alderson R.F., Alterman A.L., Barde Y.A., Lindsay R.M. Brain-derived neurotrophic factor increases survival and differentiated functions of rat septal cholinergic neurons in culture. // Neuron. -1990. -V.3. P. 297-306.

22. Alt A., Nisenbaum E.S., Bleakman D., Witkin J.M. A role for AMPA receptors in mood disorders. // Biochem Pharmacol.- 2006.

23. Altar C.A., Whitehead R.E., Chen R., Wortwein G., Madsen T.M. Effects of electroconvulsive seizures and antidepressant drugs on brain-derived neurotrophic factor protein in rat brain. // Biol Psychiatry. 2003. - V. 54(7). - P. 703-709.

24. Armanini M.P., McMahon S.B., Sutherland J., Shelton D.L., Phillips H.S. Truncated and catalytic isoforms of trkB are coexpressed in neurons of rat and mouse CNS. // Neurosci. 1995. - V.7. - P. 1403-1409.

25. Astrup J., Siesjo B.K., Symon L. Thresholds in cerebral ischemia the ischemic penumbra. // Stroke. - 1981. - V. 12. - P. 723-725.

26. Barbany G., Persson H. Regulation of neurotrophin mRNA expression in the rat brain by glucocorticoids. // Eur. J. Neurosci. 1992. - V. 4.- P. 396-403. •

27. Barde Y.A., Edgar D., Thoenen H. Purification of a new neurotrophic factor from mammalian brain. // EMBO. -1982. -V.l. P. 549-553.

28. Barrett G.L. The p75 neurotrophin receptor and neuronal apoptosis. // Prog. Neurobiol. -2000. V.61. -P. 205-229.

29. Behl C., Davis J.B., Klier F.G., Shubert D. Amyloid b peptide induces necrosis rather than apoptosis. // Brain Res. 1994.- V. 645.- P. 253-264.

30. Berridge M.J. Phosphoinositides and signal transductions // Triangi. 1985. - V.3 (4). - P. 79-90.

31. Bessho Y., Nakanishi S., Nawa H. Glutamate receptor agonists enhance the expression of BDNF mRNA in cultured cerebellar granule cells. // Mol. Brain. Res. 1993. - V. 18(3).- P. 201-208.

32. Bishop J., Mueller G., Mouradian M. Alternate 5 exons in the rat brain-derived neurotrophic factor gene: differential patterns of expression across brain regions.// Mol. Brain Res. 1994. - V. 26. - P. 225-232.

33. BiVo S., Venhauser M., Carter B.D., Barde Y.A. Selective binding and internalisation by truncated receptors restrict availability of BDNF during development. // Development. 1995. - V. 121. - P. 2461-2470.

34. Bothwell M. Functional interactions of neurotrophins and neurotrophin receptors. // Annu. Rev. Neurosci. 1995. - V. 18. - P. 223-253.

35. Broadhurst P.L. The Maudsley reactive and nonreactive strains of rats: survay. Behav. Genet. 1975.- V. 5.- P. 299-319.

36. Buchman V.L., Davies A.M. Different neurotropnins are expressed and act in a developmental sequence to promote the survival of embryonic sensory neurons. //Development 118. 1993.-P. 989-1001.

37. Castren E., Zafra F.,Thoenen H., Lindholm D. Light regulates expression of brain-derived neurotrophic factor mRNA in rat visual cortex.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1992.- V. 89.- P. 9444-9448.

38. Castren E. Neurotophins as mediators of drug effects on mood, addiction and neuroprotection. // Mol. Neurobiology. 2004. - V. 29(3).- P. 289-301.

39. Chao M.V. Neurotrophins and their receptors: a convergence point for many signalling pathways. // Nat. Rev. Neurosci. 2003. - V.4. - P. 299-309.

40. Choi D. W. Calcium: still center-stage in hypoxic-ischemic neuronal death // Trends Neurosci. -1995. V. 18. - P.58-60.

41. Clement Y., Catalaayud F., Belzung C. Genetic basis of anxiety-like behaviour: A critical review. Brain Research Bulletin. 2002. - V. 57 (1). -P. 57-71.

42. Cohen, G. M. Caspases: the executioners of apoptosis. // Biochem. J. -1997.-326.- P. 1-16.

43. Conover J.C., Yancopoulos G.D. et al. Neurotrophin regulation of the developing nervous system: analyses of knockout mice. // Rev Neurosci. -1997.-V. 8(1).-P. 13-27.

44. Davies A.M., Horton A., Burton L.E. et all. Neurotrophin-4/5 is a mammalian-specific survival factor for distinct populations of sensory neurons.//Neurosci.-1993.-V. 13.-P. 4961-4967.

45. De Luca A., Welter M., Frei K. et al. Maturation-dependent modulation of apoptosis in cultured cerebellar granule neurons by cytokines and neurotrophins // Eur. J. Neurosci. 1996. - V. 8(9). - P. 1994-2005.

46. Dechant G., Barde Y.A. The neurotrophin receptor p75 (NTR): novel functions and implications for diseases of the nervous system. // Nat. Neurosci. -2002. V. 5. - P.l 131 -1136.

47. Deshmukh M., Vasilakos J., Deckwerth T. L. et al. Genetic and metabolic status of NGF-deprived sympathetic neurons saved by an inhibitor of ICE family proteases// J. Cell. Biol. 1996. - V. 135(5). - P. 1341-1354.

48. Drejer J., Sheardown M., Nielsen E.G., Honore T. Glycine reverses the effect of HA-966 on NMDA responses in cultured rat cortical neurons and in chick retina.// Neurosci. -1989. -V. 98. -P. 333-338.

49. Dugich-Djordjevic M.M., Tocco G., Willoughby D.A., Najm I. et al. BDNF mRNA expression in the developing rat brain following kainic acid induced seizure activity. // Neuron. 1992. - V. 8.- P. 1127-1138.

50. Duman R., Heninger G.R., Nestler E.J. A molecular and cellular theory of depression // Biol. Psychiatry. 1997. - V. 54. - P. 597-606.

51. Duman R. Novel therapeutic approaches beyond the serotonin receptor. // Biol. Psychiatry. 1998. - V. 44. - P. 324-335.

52. Duman R., Malberg J., Nakagawa S., D'Sa C. Neuronal plasticity and survival in mood disorders. // Psychiatry. 2000. - V. 48. - P. 713-714.

53. Duman R. Introduction: theories of depression from monoamines to neuroplasticity. In. Neuroplasticity. A new approach to the pathophysiology of depression. Ed. J.P.Olie, C.E. Silva and J.P.Macher. // Science Press Ltd.--2004.- P. 1-11.

54. Esch T., Stefano G., Fricchione G., Benson H. The role of stress in neurodegenerative diseases and mental disorders. // Neuroendocrinology Letters.-2002.- 23.-P. 199-208.

55. Egan M.F., Kojima M., Callicott J.H. et all. The BDNF val66met polymorphism affects activity-dependent secretion of BDNF and human memory and hippocampal function. // Cell. 2003. - V. 112. - P. 257-269.

56. Eichenbaum H., Dudchenko P., Wood E., Shapiro M., Tanila H. The hippocampus, memory, and place cells: is it spatial memory or a memory space? // Neuron. 1999. - V. 23. - P. 209-226.

57. Eide F.F., Vining E.R., Eide B.L. et all. Naturally occurring truncated trkB receptors have dominant inhibitory effects on brain-derived neurotrophic factor signaling. // Neurosci. 1996. - V. 16. - P. 3123-3129.

58. Erecinska M., Silver I.A. Loss of neuronal calcium homeostasis in ischemia. In: Primer on cerebrovascular diseases (Welch K.M.A., Reis D., Caplan L.R. et all.). New York. -1997. -P. 178-183.

59. Fernando P., Kelly J.F., Balazsi K., Slack R.S., Megeney L.A. caspase-3 activity is required for skeletal muscle differentiation. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2002.- 99.- P. 11025-11030.

60. Finkbeiner S., Tavazoie S.F., Maloratsky A., Jacobs K.M., Harris K.M., Greenberg M.E. CREB: a major mediator of neuronal neurotrophin responses. //Neuron. 1997. - V. 19(5). - P. 1031-1047.

61. Gibbs R.B. Levels of trkA and BDNF mRNA, but not NGF mRNA, fluctuate across the estrous cycle and increase in response to acute hormone replacement. // Brain Res. 1998. - V. 787. - P. 259-268.

62. Gibbs R.B. Treatment with estrogen and progesterone affects relative levels of brain-derived neurotrophic factor mRNA and protein in different regions of the adult rat brain. // Brain Res. 1999. - V. 844. - P. 20-27.

63. Gilad G.M., Gilad V.H., Strain, stress, neurodegeneration and longevity. // Mechan. Ageing Develop. 1995. - V. 78. - P. 75-83.

64. Gold S.M., Mohr D.C., Huitinga I. et al. The role of stress-response systems for the pathogenesis and progression of MS. // Trends Immunol. 2005.- V. 26(12).- P. 644-652.

65. Good M., Day M., Muir J.L. Cyclical changes in endogenous levels of oestrogen modulate the induction of LTD and LTP in the hippocampal CA1 region. // Eur. J. Neurosci. 1999. - V. 11. - P. 4476- 4480.

66. Gotz R., Koster R., Winkler C., Raulf F., Lottspeich F., Schartl M., Thoenen H. Neurotrophin-6 is a new member of the nerve growth factor family. // Nature. 1994. - V. 372. - P. 266-269.

67. Gould E., Tanapat P. Stress and hippocampal neurogenesis. // Biol. Psychiatry.-1999. V. 46. - P. 1472-1479.

68. Graeber M.B., Moran L.B. Mechanisms of cell death in neurodegenerative diseases: fashion, fiction and facts. // Brain Pathol. 2002. V. 12.- P. 385390.

69. Green A.R., Hainsworth A. H. and Jackson D. M. GABA potentiation: a logical pharmacological approach for the treatment of acute ischaemic stroke. //Neuropharmacol. 2000. - V. 39. - P. 1483-1494.

70. Gulyaeva N.V., Kudryashov I.E., Kudryashova I.V. Caspase activity is essential for long-term potentiation. // J. Neurosci. Res.- 2003,- V. 73.- P. 853-864.

71. Haddad G.G., Jiang C. 02 deprivation in the central nervous system: on mechanisms of neuronal response, differential sensitivity and injury // Prog. Neurobiol. -1993. -V. 40(3). P. 277-318.

72. Hakim A.M., Shoubridge E.A. Cerebral acidosis in focal ischemia. // Cerebrovasc. Brain Metab. Rev. 1989. - VI. -P. 115-132.

73. Hall C.S. Emotional behavior in the rat. // J. Comp. Phisiol.- 1934.- V.18-(2).- P. 385.

74. Hallbook F., Ibanez C.F., Persson H. Evolutionary studies of the nerve growth factor family reveals a novel member abundantly expressed in Xenopus ovary. // Neuron. 1991. - V. 6. - P. 845-858.

75. Haniu M., Talvenheimo J., Le J., Katta V., Welcher A., Rohde M.F. Extracellular domain of neurotrophin receptor trkB: disulWde structure, N-glycosylation sites, and ligand binding. // Arch. Biochem. Biophys. 1995. -V.322.-P. 256-264.

76. Hansen M.B., Nielsen S.E., Berg K. Re-examination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill. // J. Immunol. Meth.- 1989.- V. 119. P. 203-210.

77. Hansson A.C., Sommer W.H., Metsis M., Stromberg I., Agnati L.F., Fuxe-K. Corticosterone actions on the hippocampal brain-derived neurotrophic factor expression are mediated by exon IV Promoter. // J. Neuroendocrinol. -2006.-V. 18(2).-P. 104-114.

78. Hashimoto K., Shimizu E., Iyo M. Critical role of brain-derived neurotrophic factor in mood disorders. // Brain Res. Rev. 2004.- V. 45.- P. 104-114.

79. Hegstad E., Berg-Johnsen J., Haustad T.S., Hauglie-Hanssen E., Langmoen I.A. Amino-acid release from human cerebral cortex during simulated ischaemia in vitro //Acta neurochir. -1996. -V 138(2). -P. 234-241.

80. Hempstead B.L. The many faces of p75NTR. // Curr. Opin. Neurobiol. -2002. V. 12. - P.260-267.

81. Henderson C.E. Role of neurotrophic factors in neuronal development. // Curr. Opin. Neurobiol. 1996. - V.6. - P. 64-70.

82. Heumann R. Neurotrophin signaling. // Curr. Opin. Neurobiol. -1994. V.4. - P. 668-679.

83. Hirata H., Takahashi A., Kobayashi S., Yonehara S. et al. Caspases are activated in a branched protease cascade and control distinct downstream processes in Fas-induced apoptosis. // J. Exp. Med.- 1998.- V. 187.- P. 587600.

84. Hohn A., Leibrock J., Bailey K., Barde Y.A. Identification and characterization of a novel member of the nerve growth factor/brain-derived neurotrophic factor family. // Nature. 1990. - V. 344. - P. 339-341.

85. Hornbeck P. In: Current protocols in Immunology. // Coico R., John Wiley & Sons, Inc., Unit 2.1, NY. 1994.-V. 1.

86. Hughes P., Beilharz E., Gluckman P., Dragunow M. Brain-derived neurotrophic factor is induced as an immediate-early gene following N-methyl-D-aspartate receptor activation. // Neuroscience. 1993. - V.57. - P. 319-328.

87. Huopaniemi L., Keist R., Randolph A., Certa U., Rudolph U. Diazepam-induced adaptive plasticity revealed by alphal GABAA receptor-specific expression profiling. // J. Neurochem. 2004. - V. 88(5). - P. 1059-1067.

88. Hutter P., Johansson M., Saria A., Humpel C. Acute and chronic noradrenergic regulation of neurotrophin messenger RNA expression in rat hippocampus: evidence from lesions and organotypic cultures. // Neuroscience. 1996. - V. 70(1).- P. 15-29.

89. Hyman C., Hofer M., Barde Y.A., Juhasz M., Yancopoulos G.D., Squinto' S.P., Lindsay RM. BDNF is a neurotrophic factor for dopaminergic neurons of the substantia nigra. // Nature. 1991. - V.350. - P. 230-232.

90. Johnson J.E., Barde Y.A., Schwab M., Thoenen H. Brain-derived neurotrophic factor supports the survival of cultured rat retinal ganglion cells. //Neurosci. 1986. - V.6. -P. 3031-3038.

91. Kanazawa I. How do neurons die in neurodegenerative diseases? //' Trends in Molec. Medic. 2001. - V. 7 (8). - P. 339-344.

92. Kaplan D.R., Hempstead B.L., Martin-Zanca D., Chao M.V., Parada L.F. The trk proto-oncogene product: a signal transducing receptor for nerve growth factor.//Science. -1991.-V.252.-P. 554-558.

93. Kaplan D.R., Miller F.D. Neurotrophin signal transduction in the nervous system. // Curr. Opin. Neurobiol. 2000. - V. 10. - P. 381-391.

94. Katoh-Semba R., Takeuchi I.K., Semba R., Kato K. Distribution of brain-derived neurotrophic factor in rats and its changes with development in the brain. // J. Neurochem. 1997. - V. 69. - P. 34-42.

95. Katz L.C., Shatz C.J. Synaptic activity and the construction of cortical circuits. // Science. 1996. - V.274. - P. 1133-1138.

96. Kawamoto Y., Nakamura S., Nakano S., Oka N., Akiguchi I., Kimura J. Immunohistochemical localization of brain-derived neurotrophic factor in adult rat brain. //Neuroscience. 1996. - V. 74. - P. 1209-1226.

97. Kenny P.J., File S.E., Rattray M. Acute nicotine decreases, and chronic nicotine increases the expression of brain-derived neurotrophic factor mRNA in rat hippocampus. // Brain Res. Mol. Brain. Res. 2000. - V. 85(1-2). - P. 234-238.

98. Kernie S., Liebl D., Parada L. BDNF regulates eating behavior and locomotor activity in mice. // EMBO J. 2000. - V. 19(6). - P. 1290-1300.

99. Kerr J.F.R., Wyllie A.H., Currie A.R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. // Br. J. Cancer. 1972. - V. 26. - P. 239-257.

100. Kerr J.F.R., Gobe G.C., Winterford C.M., Kerr J.F.R., Harmon. B.V. Anatomical methods in cell death. // In Cell Death., Academic Press, San Diego.-P. 1-26.

101. Kesslak J.P., So V., Choi J., Cotman C.W., Gomez P.F. Learning upregulates brain-derived neurotrophic factor messenger ribonucleic acid: A mechanism to facilitate encoding and circuit maintenance? // Behav. Neurosci.- 1998.-V. 112.-P. 1012-1019.

102. Kim J.J., Yoon K.S. Stress: metaplastic effects in the hippocampus. // Trends Neurosci. 1998. - V. 21. - P. 505-509.

103. Kim S.H., Won S.J., Sohn S., Kwon H.J., Lee J.Y., Park J.H., Gwag B.J. Brain-derived neurotrophic factor can act as a pronecrotic factor through transcriptional and translational activation of NADPH oxidase. // J Cell Biol.-2002.- 159(5).-P. 821-831.

104. Kim S.T., Choi J.H., Chang J.W. et al. Immobilization stress causes, increases in tetrahydrobiopterin, dopamine and neuromelanin and oxidativedamage in the nigrostriatal system. // J. Neurochem. — 2005. V. 95(1).- P. 89-98.

105. Kim D.H., Zhao X. BDNF protects neurons following injury by modulation of caspase activity. // Neurocrit Care. 2005. - V. 3(1). - P. 7176.

106. Klein R., Nanduri V., Jing S.A., Lamballe F., Tapley P. et al. The trkB tyrosine protein kinase is a receptor for brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3. // Cell. 1991. - V. 66. - P. 395-403.

107. Klein R., Conway D., Parada L.F., Barbacid M. The trkB tyrosine protein kinase gene codes for a second neurogenic receptor that lacks the catalytic kinase domain. // Cell. 1990. - V. 61. - P.647-656.

108. Kontkanen O., Castren E. Trophic effects of selegiline on cultured dopaminergic neurons. // Brain Res. 1999. - 829. - P. 190-192.

109. Kontos H.A. Oxygen radicals in cerebral vascular injury. // Circ Res. — 1985.-V. 57(4).-P.508-16.

110. Korte M., Carroll P., Wolf E., Brem G., Thoenen H., Bonhoeffer T. Hippocampal long-term potentiation is impaired in mice lacking brain-derived neurotrophic factor. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. - V. 92. - P. 88568860.

111. Kristian T., Siesjo B.K. Changes in ionic fluxes during cerebral ischemia. In: Neuroprotectiv agents and cerebral ischemia (Green R., Cross A.R. eds.). New York. -1997. -P. 27-45.

112. Kume T., Kouchiyama H., Kaneko S., Maeda T., Kaneko S., et al. BDNF prevents NO mediated glutamate cytotoxicity in cultured cortical neurons. // Brain Res. 1997. - V. 756(1-2). - P. 200-204.

113. Kuppers E., Beyer C. Dopamine regulates brain-derived neurotrophic factor (BDNF) expression in cultured embryonic mouse striatal cells. // Neuroreport. 2001. - V. 12. - P. 1175-1179.

114. Lai K.O., Fu W.Y., Ip F.C., Ip N.Y. Cloning and expression of a novel neurotrophin, NT-7, from carp. // Mol Cell Neurosci. 1998. - V. 11. - P. 64-76.

115. Lamballe F., Klein R., Barbacid M. trkC, a new member of the trk family of tyrosine protein kinases, is a receptor for neurotrophin-3. // Cell. -1991.-V. 66.-P. 967-979.

116. Larsen J., Skalicky M., Viidik A. Does long-term physical exercise counteract age-related Purkinje cell loss? A stereological study of rat cerebellum // J. Comp. Neurol. 2000. - V. 428. - P. 213-222.

117. Lee F.S., Kim A.H., Khursigara G., Chao M.V. The uniqueness of being a neurotrophin receptor. // Curr. Opin. Neurobiol. 2001. - V.l 1. - P. 281-286.

118. Lee R., Kermani P., Teng K.K., Hempstead B.L. Regulation of cell survival by secreted proneurotrophins. // Science. 2001. - V. 294. - P. 1945-1948.

119. Leibrock J., Lottspeich F., Hohn A., Hofer M., Hengerer B., Masiakowski P., Thoenen H., Barde Y.A. Molecular cloning and expression of brain-derived neurotrophic factor. // Nature. 1989. - V. 341. - P. 149-" 152.

120. Levi-Montalcini R., Hamburger V. A diffusible agent of mouse sarcoma producing hyperplasia of sympathetic ganglia and hyperneurotization of the chick embryo. // Exp. Zool. 1953. - V.123. - P. 233-388.

121. Levi-Montalcini R. The nerve growth factor 35 years later. // Science. 1987.-V. 237.-P. 1154-1162.

122. Li Y., Maher P., Schubert D. Phosphatidylcholine-specific phospholipase C regulates glutamate-induced nerve cell death. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - V. 95. - P. 7748-7753.

123. Lin S.Y., Wu K., Levine E.S., Mount H.T., Suen P.C., Black I.B. BDNF acutely increases tyrosine phosphorylation of the NMDA receptor subunit 2B in cortical and hippocampal postsynaptic densities. // Mol. Brain Res. 1998. - V. 55. - P. 20-27.

124. Lindholm D., Castren E., Berzaghi M., Blochl A., Thoenen H. Activity-dependent and hormonal regulation of neurotrophin mRNA levels in the brain. Implications for neuronal plasticity. // J. Neurobiol. 1994. - V. 25. - P. 1362-1372.

125. Lipska B.K., Khaing Z.Z., Weickert C.S., Weinberger D.R. BDNF mRNA expression in rat hippocampus and prefrontal cortex: effects of neonatal ventral hippocampal damage and antipsychotic drugs. // Eur J. Neurosci. — 2001.- V. 14(1).- P. 135-144.

126. Liu R., Yang S., Perez E. Neuroprotective effects of a novel non-receptor-binding estrogen analogue in vitro and in vivo analysis. // Stroke. 2002.-V. 33.-P. 2485.

127. Madeddu F., Naska S., Bozzi Y. BDNF down-regulates the caspase-3 pathway in injured geniculo-cortical neurons. // Neuroreport. 2004. - V. 15(3).-P. 2045-2049.

128. Magarinos A.M., McEwen B., Fliigge G., Fuchs E. Chronic psychosocial stress causes apical dendritic atrophy of hippocampal CA3 pyramidal neurons in subordinate tree shrews. // J. Neurosci. 1996. - V. 16. -P. 3534-3540.

129. Maher P., Davis J.B. The role of monoamine metabolism in oxidative glutamate toxicity. //Neuroscience. 1996. - V. 16. - P. 6394-6401.

130. Maisonpierre P., Belluscio L., Squinto S., Ip N.Y., Furth M.E., Lindsay R.M., Yancopoulos G.D. Neurotrophin-3: a neurotrophic factor related to NGF and BDNF. // Science. 1990. - V. 247. - P. 1446-1451.

131. Manabat C., Han B.H., Wendland M., Derugin N., et al. Reperfusion differentially induces caspase-3 activation in ischemic core and penumbra after stroke in immature brain. // Stroke. 2003.- V. 34.- P. 207

132. Marmigere F., Rage F., Tapia-Arancibia L., Arancibia S. Expression of mRNAs encoding BDNF and its receptors in adult rat hypothalamus. // NeuroReport. 1998. - V. 9. - P. 1159-1163.

133. Marmigere F., Rage F., Tapia-Arancibia L. GABA-glutamate interaction in the control of BDNF expression in hypothalamic neurons. // Neurochem. Int. 2003a. - V. 42. - P. 353-358.

134. Marmigere F., Rage F., Givalois L., Arancibia S., Tapia-Arancibia L. Rapid induction of BDNF expression in the hippocampus during immobilization stress challenge in adult rats. // Hippocampus. 20036. - V.-13.-P. 646-655.

135. Matsumoto T., Numakawa T., Yokomaku D et al. Brain-derived neurotrophic factor-induced potentiation of glutamate and GABA release: different dependency on signaling pathways and neuronal activity. // Mol. Cell Neurosci. 2006. - V. 31 (1). - P. 70-84.

136. McAllister A., Katz L. & Lo D. Neurotrophins and synaptic plasticity. // Annu. Rev. Neurosci. 1999. - V. 22. - P. 295-318.

137. McCarthy N. J., Whyte M.K.B., Gilbert C. S., Evan G. I. Inhibition of Ced-3/ICE-related proteases does not prevent cell death induced by oncogenes, DNA damage, or the Bcl-2 homologue Bak.// J. Cell. Biol. -1997.- 136.-P.215-227.

138. McEwen B. Stress and hippocampal plasticity // Curr Opin Neurobiol. 1999.-V. 5. - P.205-216.

139. McCord J.M. Oxygen-derived free radicals in postischemic tissue injury//N Engl. J.- 1985.-V. 312(3).-P. 159-163

140. Meldrum B.S. GABAergic mechanisms in the pathogenesis and treatment of epilepsy. // Cerebrovasc. Dis. -1989.-P. 47-60.

141. Middlemas D.S., Lindberg R.A., Hunter T. trkB, a neural receptor, protein-tyrosine kinase: evidence for a full-length and two truncated receptors.//Mol. Cell. Biol. 1991. - V.ll.-P. 143-153.

142. Mizuno M., Yamada K., Olariu A. et al. Involvement of brain-derived neurotrophic factor in spatial memory formation and maintenance in a radial arm maze test in rats. // Neurosci. 2000. - V. 20. - P. 7116-7121.

143. Morimoto B. H., Koshland D. E. Induction and expression of long-and short-term neurosecretory potentiation in a neural cell line // Neuron. -1990.- V. 5(6).- P. 875-880.

144. Moses V. Neurotrophins and their receptors: a convergence point for many signaling pathways. // Neurosci. 2003. - V. 4. - P. 299-309.

145. Mowla S.J., Farhadi H.F., Pareek S., Atwal J.K., Morris S.J., Seidah N.G., Murphy R.A. Biosynthesis and post-translational processing of the precursor, to brain-derived neurotrophic factor. // Biol. Chem. 2001. - V.276. - №16. -P. 12660-12666.

146. Murakami S., Imbe H., Morikawa Y. et al. Chronic stress as well as acute stress reduces BDNF mRNA expression in the rat hippocampus but less robustly. // Neurosci Res. 2005. - V. 53(2).- P. 129-139.

147. Murer M.G., Yan Q., Raisman-Vozari R. Brain-derived neurotrophic factor in the control human brain, and in Alzheimer's disease and Parkinson's disease. // Prog. Neurobiol. 2001. - V. 63. - P. 71-124.

148. Namura S., Zhu J., Fink K., Endres M. et al. Activation and cleavage of caspase-3 in apoptosis induced by experimental cerebral ischemia. // J. Neurosci.- 1998.- V. 18.- P. 3659-3668.

149. Nawa H., Carnahan J., Gall C. BDNF protein measured by a novel enzyme immunoassay in normal brain and after seizure: partial disagreement with mRNA levels. // Eur. J. Neurosci. 1995. - V. 7. - P. 1527-1535.

150. Neves-Pereira M. et al. The brain-derived neurotrophic factor gene confers susceptibility to bipolar disorder: evidence from a family-based association study. // Hum. genet. 2002. - V. 71. - P. 651-655.

151. Nibuya M., Nestler E.J., Duman R.S. Chronic antidepressant administration increases the expression of cAMP response element binding protein (CREB) in rat hippocampus. // Neurosci. 1996. - V. 16(7). - P. 2365-2372.

152. Nicholson D.W., Thornberry N.A. Caspases: killer proteases. // Trends Biochem Sci. 1997. - V. 22. - P. 299-306.

153. Nicholson D.W. Caspase structure, proteolytic substrates, and function during apoptotic cell death. // Cell Death Differ. 1999. - V. 6. - P. 1028-' 1042.

154. Okazawa H., Murata M., Watanabe M., Kamei M., Kanazawa I. Dopaminergic stimulation up-regulates the in vivo expression of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) in the striatum. // FEBS Lett. 1992. -V. 313(2).-P. 138-142.

155. Olney J.W.E. New mechanisms of excitatory transmitter neurotoxicity. //' Neural. Transm. Suppi. 1994. - V. 43. - P. 47-51.

156. Oppenheim R.W., Yin Q.W., Prevette D., Yan Q. Brain-derived neurotrophic factor rescues developing avian motoneurons from cell death. // Nature. 1992. - V. 360. - P. 755-757.

157. Orrenius S., McCabe M.S., Nicotera P. Ca(2+)-dependent mechanisms of cytotoxicity and programmed cell death. // Toxicol. Lett. 1992. - V.64. -P. 357-364.

158. Patapoutian A., Reichardt L.F. Trk receptors: mediators of neurotrophin action // Curr. Opin. Neurobiol. 2001. - V. 11. - P. 272-280.

159. Patterson E., Abel T., Deuel T.A., Martin K.C., Rose J.C., Kandel E.R. Recombinant BDNF rescues deficits in basal synaptic transmission and hippocampal LTP in BDNF knockout mice. // Neuron. 1996. - V. 16(6).-P. 1137-1145. . .

160. Pellegrini-Giampietro D.P., Chtrici G., Alesiani M. et al. Excitatory amino acid release and free radical formation may cooperate in the genesis of ischemia induced neuronal damage. // J. Neurosci. - 1990. - V. 10. - P. 1035-1041.

161. Perez-Navarro E., Gavalda N., Gratacos E., Alberch J. Brain-derived neurotrophic factor prevents changed in Bcl-2 family members and caspase-3 activation induced by excitotoxicity in the striatum. // J. Neurochem. 2005. - V. 92 (3). - P. 678-691.

162. Petersen A.A., Larsen K.E., Behr G.G. et al. Brain-derived neurotrophic factor inhibits apoptosis and dopamine-induced free radical production instriatal neurons but does not prevent cell death. // Brain Res. Bull.- 2001.-V. 56(3-4).- P. 331-333

163. Pollack S.J., Harper S.J. Trk neurotrophin receptor activators. // Drug news perspect. 2002. - V. 15(5). - P. 268-277.

164. Poo M. Neurotrophins as synaptic modulators. // Nature Rev. Neurosci. -2001.-V.2.-P. 24-31.

165. Rage F., Givalois L., Marmigere F., Tapia-Arancibia L., Arancibia S. Immobilization stress rapidly modulates BDNF mRNA expression in the hypothalamus of adult male rats. // Neuroscience. 2002. - V.112. - P. 309-318.

166. Rao L., Perez D., White E. Lamin proteolysis facilitates nuclear events during apoptosis//J. Cell Biol. 1996.- V. 135.- P. 1441-1445

167. Rasika S., Alvarez-Buylla A., Nottebohm F. BDNF mediates the effects of testosterone on the survival of new neurons in an adult brain // Neuron. -1999.-V. 22(1).-P. 53-62.

168. Rasmusson A.M., Shi L., Duman R. Downregulation of BDNF mRNA in the hippocampal dentate gyrus after re-exposure to cues previously associated with footshock. // Neuropsychopharmacology. 2002. - V. 27(2). -P. 133-142.

169. Ridley D., Balfour D. The influence of nicotine on 5-HT overflow in the dorsal hippocampus in the rat. // Br. J. Pharmacol. 1997. - V. 122,- P. 192

170. Rite I., Machado A., Cano J., Venero JL Divergent regulatory mechanisms governing BDNF mRNA expression in cerebral cortex and substantia nigra in response to striatal target ablation // Exp. Neurol.- 2005. V. 192 (1). - P. 142-155.

171. Robinson R.C., Radziejewski C., Stuart D.I., Jones E.Y. Structure of the brain-derived neurotrophic factor/neurotrophin 3 heterodimer. //' Biochemistry. 1995. - V. 34. - P. 4139-4146.

172. Rocamora N., Welker E., Pascual M., Soriano E. Upregulalion of BDNF mRNA expression in the barrel cortex of adult mice after sensory stimulation. // J. Neurosci. 1996. - V. 16. - P. 4411- 4419.

173. Rosenthal A., Goeddel D.V., Nguyen T., Martin E., Burton L.E. et al. Primary structure and biological activity of human brain-derived neurotrophic factor. // Endocrinology. 1991. - V. 129(3). - P. 1289-1294.

174. Roux P, Barker P. Neurotrophin signaling through the p75 neurotrophin receptor. // Prog. Neurobiol. 2002. - V 67. - P. 203-233.

175. Saarelainen T., Hendolin P., Lucas G., Koponen E. et al. Activation of the TrkB neurotrophin receptor is induced by antidepressant drugs and is required for antidepressant-induced behavioral effects. // J. Neurosci. -2003. V. 23. - P. 349-357.

176. Schaaf M.J.M., J. de Jong, E.R. de Kloet, Vreugdenhil E. Down-regulation of BDNF mRNA and protein in the rat hippocampus by corticosterone. // Brain Res. 1998. - V. 813. - P. 112-120.

177. Segal RA, Takahashi H, McKay RD. Changes in neurotrophin responsiveness during the development of cerebellar granule neurons. // Neuron. — 1992. — V. 9. P. 1041-1052.

178. Sendtner M. Neurotrophic factors and amyotrophic lateral sclerosis. In: Neurotrophic factors. F. Hefti. Springer-Verlag: Berlin. 1999. - P. 81117.

179. Seredenin S.B. Genetic differences in response to emotional stress and tranquilizers. // Psychopharm. and boil. narc. 2003. - V. 1-2. - P. 494-509.

180. Shaywitz A., Greenberg M. CREB: a stimulus-induced transcription factor activated by a diverse array of extracellular signals. // Annu Rev Biochem.-1999.- V. 68.- P. 821-861.

181. Sheline Y. Consequences of depression in the hippocampus and other brain regions. In. Neuroplasticity. A new approach to the pathophysiology of depression. Ed. J.P.Olie, C.E. Silva and J.P.Macher, Science Press Ltd. -2004.- P. 25-37.

182. Shors T.J., Seib T.B., Levine S., Thompson R.F. Inescapable versus escapable shock modulates long-term potentiation in the rat hippocampus. // Science. 1989. - V. 244. - P. 224-226.

183. Siesjo B.K. Pathophysiology and treatment of focal cerebral ischemia. Part I: Pathophysiology // Neurosurg. 1992. -V. 77(2). - P. 169-184.

184. Silver I.A., Erecinska M.J. Ion homeostasis in rat brain in vivo: intra- and extracellular Ca2+. and [H+] in the hippocampus during recovery from' short-term, transient ischemia // Cereb. Blood Flow Metab. 1992. - V. 12(5).-P. 759-772.

185. Siuciak J.A., Lewis D.R., Wiegand S.J., Lindsay R.M. Antidepressant-like effect of brain-derived neurotrophic factor (BDNF). // Pharmacol.-Biochem. Behav.- 1997.- V. 56.- P. 131-137.

186. Sklar P. , Gabriel S.B., Mclnnis M.G., Bennett P., Lim Y.M. et al. Family-based association study of 76 candidate genes in bipolar disoder: BDNF is a potential risk locus. // Mol. Psychiatry. 2002. - V. 7(6). - P. 579-593.

187. Smith M.A., Makino S., Kvetnansky R., Post R.M. Stress and glucocorticoids affect the expression of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 mRNAs in the hippocampus // J. Neurosci. 1995a. -V.15.-P. 1768-1777.

188. Smith M.A., Makino S., Kim S.Y., Kvetnansky R. Stress increases brain-derived neurotrophic factor messenger ribonucleic acid in the* hypothalamus and pituitary // Endocrinology. 19956. - V. 136. - P. 3743-3750.

189. Sohrabji F., Miranda R.C.G., Toran-Allerand C.D. Identification of a putative estrogen response element in the gene encoding brain-derived neurotrophic factor. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. - V. 92. - P. 11110-11114.

190. Solum D.T., Handa R.J. Localization of estrogen receptor alpha (ER alpha) in pyramidal neurons of the developing rat hippocampus. // Dev. Brain Res.-2001.-V. 128.-P. 165-175.

191. Solum D.T., Handa R.J. Estrogen regulates the development of brain-derived neurotrophic factor mRNA and protein in the rat hippocampus. // J. Neurosci. -2002. V. 22. - P. 2650-2659.

192. Soppet D., Escandon E., Maragos J., Middlemas D.S., Reid S.W., Blair J.et al. The neurotrophic factors brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 are ligands for the trkB tyrosine kinase receptor. // Cell. -1991.-V.65.-P. 895-903.

193. Squinto S.P., Stitt T.N., Aldrich T.H., Davis S., Bianco S.M., Radziejewski C., et al. trkB encodes a functional receptor for brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 but not nerve growth factor. // Cell. — 1991. -V.65.-P. 885-893.

194. Symon L., Branston N.M., Strong J.J., Hope T.D. The concepts of thresholds of ischaemia in relation to brain structure and function // J.Clin.Pathol. 1977. - V. 30. - P.149-154.

195. Takeda A., Onodera H., Yamasaki Y., et al. Decreased expression of neurotrophin-3 mRNA in the rat hippocampus following transient forebrain ischemia.// Brain res. 1992. - V. 569. - P. 177-180.

196. Tan S., Wood M., Maher P. Oxidative stress induces a form of programmed cell death with characteristics of both apoptosis and necrosis in neuronal cells. //Neurochem. 1998. - V. 71(1). - P. 95-105.

197. Tao X., Finkbeiner S., Arnold D.B., Shaywitz A.J., Greenberg M.E. Ca2+ influx regulates BDNF transcription by a CREB family transcription factor-dependent mechanism. // Neuron. 1998. - V. 20. - P. 709-726.

198. Tapia-Arancibia L., Rage F., Givalois L, Arancibia S. Physiology of BDNF: focus on hypothalamic function// Neuroendocrinology. 2004. - V. 25.-P. 77-107.

199. Timmusk T., Palm K., Metsis M., Reintam T., Paalme V., Saarma M.,' Persson H. Multiple promoters direct tissue-specific expression of the rat BDNF gene. //Neuron. 1993. - V. 10. - P. 475-489.

200. Timmusk T., Persson H., Metsis M. Analysis of transcriptional initiation and translatability of brain-derived neurotrophic factor mRNAs in the rat brain. // Neurosci. 1994. - V. 177. - P. 27-31.

201. Troy C.M., Salvesen G.S. Caspases on the brain. // J. Neurosci. Res. -2002.-V. 69.-P. 145-150.

202. Tsuchida A., Nakagawa T., Itakura Y. The effects of brain-derived neurotrophic factor on insulin signal transduction in the liver of diabetic mice. // Diabetologia. 2001. - V. 44. - P. 556-566.

203. Ueyama T., Kawai Y., Nemoto K., Sekimoto M., Tone S., Senba E. Immobilization stress reduced the expression of neurotrophins and their, receptors in the rat brain // Neurosci. Res. 1997. - V. 28. - P. 103-110.

204. Vaidya V.A., Marek G., Aghajanian G., Duman R.S. 5-HT2A receptor-mediated regulation of brain-derived neurotrophic factor mRNA in the hippocampus and the neocortex. // J.Neurosci. 1997. - V. 17. - P. 27852795.

205. Ventimiglia R., Mather P.E., Jones B.E., Lindsay R.M. The neurotrophins BDNF, NT-3 and NT-4/5 promote survival and morphological and biochemical differentiation of striatal neurons in vitro. // Neurosci. 1995. -V.7.-P. 213-222.

206. Vicario-Abejyn C., Owens D., McKay R., Segal M. Role of neurotrophins in central synapse formation and stabilization // Neuroscience. 2002. - V. 3(12).-P. 965 -974.

207. Vincent J. Mood and the brain. In. Neuroplasticity. A new approach to the pathophysiology of depression. Ed. J.P.Olie, C.E. Silva and J.P.Macher,' Science Press Ltd. 2004. - P. 13-23.

208. Watanabe Y., Gould H., Cameron D. et al. Phenytoin prevents stress and corticosterone induced atrophy of CA2 pyramidal neurons. // Hippocampus. 1992.- V. 2.- P. 431-436.

209. Wei L., Ying D., Cui L., Langsdorf J., Yu S. Necrosis, apoptosis and hybrid death in the cortex and thalamus after barrel cortex ischemia in rats. // Brain Res. 2004. - 1022. - P. 54-61.

210. Wu D., Pardridge W.M. Neuroprotection with noninvasive neurotrophin delivery to the brain.- 1999.- 96.- P. 254-259.

211. Wu H., Friedman W.J., Dreyfus C.F. Differential regulation of neurotrophin expression in basal forebrain astrocytes by neuronal signals. // Neurosci. Res. 2004. - V. 76(1).- P. 76-85.

212. Xie C., Sayah D., Chen Q.S., Wei W.Z., Smith D., Liu X. Deficient long-term memory and long-lasting long-term potentiation in mice with a targeted deletion of neurotrophin-4. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. -V. 97(14).-P. 8116-8121.

213. Yan Q., Rosenfeld R.D., Matheson C.R., Hawkins N., Lopez O.T., Bennett L., Welcher A.A. Expression of brain-derived neurotrophic factor protein in the adult rat central nervous system. // Neuroscience. — 1997a. V. 78. P. 431-448.

214. Yan Q., Radeke M.J., Matheson C.R., Talvenheimo J., Welcher A.A., Feinstein S.C. Immunocytochemical localization of trkB in the central nervous system of the adult rat. // J. Comp. Neurol. 19976. - 378. - P. 135-157.

215. Zafra F., Hengerer B., Leibrock J., Thoenen H., Lindholm D. Activity dependent regulation of BDNF and NGF mRNAs in the rat hippocampus is mediated by non-NMDA glutamate receptors. // EMBO. 1990. - V. 9. - P. 3545-3550.

216. Zalewska M.M., Wilson D.F. Lipid hydroperoxides inhibit reacylation of phospholipids in neuronal membranes // J. Neurochem. 1989. - V. 52. -P. 255-260.