Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Нейропсихотропные свойства веществ пептидной природы, влияющих на систему факторов роста нервной ткани

005059029

Елизарова Ольга Сергеевна

НЕЙРОПСИХОТРОПНЫЕ СВОЙСТВА ВЕЩЕСТВ ПЕПТИДНОЙ ПРИРОДЫ, ВЛИЯЮЩИХ НА СИСТЕМУ ФАКТОРОВ РОСТА НЕРВНОЙ ТКАНИ

14.03.06. - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2013

1 о МДГ1 ¿013

005059029

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учрежден«и «Научно-исследовательском институте фармакологии имени В.В. Закусова» Российской академии медицинских наук (ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В.Закусова» РЛМН)

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор Гарибова Таисия Леоновна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории токсикологии ФГБУ «НИИ фармакологии

имени В.В. Закусова» РАМН Коваленко Лариса Петровна

доктор биологических наук, руководитель лаборатории эволюции механизмов памяти кафедры высшей нервной деятельности Биологического факультета

МГУ имени М.В.Ломоносова Иноземцев Анатолий Николаевич

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И.Пирогова» Минздрава Российской Федерации

Защита диссертации состоится «_»_2013 года в .... часов на заседании

диссертационного совета Д.001.024.01, созданного на базе ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В.Закусова» РАМН по адресу: 125315 Москва, ул. Балтийская, д.8.

С диссертацией можно ознакомиться в ученой части ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В.Закусова» РАМН.

Автореферат разослан «_»

2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Вальдман Елена Артуровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. В настоящее время с увеличением продолжительности жизни населения, ухудшением экологической обстановки отмечается рост больных с патологиями, сопровождающимися нейродегенеративными процессами, такими как болезнь Альцгеймера (БА), различные деменции, инсульты, тяжелые депрессивные расстройства и др. Прогресс в определении механизмов нейродегенеративных заболеваний способствует расширению сфер поиска новых эффективных лекарственных средств. Один из актуальных подходов к созданию препаратов с нейропсихотропной активностью базируется на современных представлениях о механизмах эндогенного регулирования функций нейронов и их регенерации.

Среди известных эндогенных белков, осуществляющих передачу сигналов между различными клетками организма, в неврологии особое внимание уделяется факторам роста нервной ткани (ФРНТ), включающим следующие подсемейства: нейротрофины (фактор роста нервов - NGF, мозговой нейротрофический фактор - BDNF и др.), семейство глиалыюго нейротрофического фактора (GDNF, артемин и др.), нейропоэтические цитокины (в частности, цилиарный нейротрофический фактор - CNTF) и другие факторы роста (например, эритропоэтин - ЭПО) (Reichardt L.F., 2001; Одинак М.М. и Цыган Н.В., 2005). Регуляция функций нейротрофинов в мозге рассматривается как один из перспективных путей воздействия на ряд патологических состояний центральной нервной системы.

Нейротрофин BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor) широко представлен в структурах мозга и осуществляет регуляцию различных физиологических процессов в центральной нервной системе (ЦНС) как в норме, так и при патологии: обладает антиапоптотическими свойствами (Bonni A. et al., 1999), участвует в нейрогенезе (Scharfman Н. et al., 2005) и обеспечении синаптической пластичности (Bekinschtein P. et al., 2008). В экспериментальных и клинических исследованиях показано, что содержание BDNF в мозге значительно увеличивается при ишемическом инсульте (Bejot Y. et al., 2011), что связывают с его активным участием в обеспечении пластичности после повреждения (Ploughman М. et al., 2009). Высказаны «нейротрофиновые теории» развития болезни Альцгеймера и тяжелых депрессивных расстройств, основанные на снижении BDNF в мозге и сыворотке крови (Duman R.S. et al., 2006; Castren E. et al., 2007). Показано, что введение BDNF непосредственно в структуры мозга животным на моделях ишемического инсульта (Tsukahara Т. et al., 1994), БА (Nagahara А.Н. et al., 2009) или депрессии (Chen В. et al., 2001; Shirayama J. et al., 2002), приводит к коррекции состояния и поведения животных. Кроме того, известно, что BDNF контролирует физиологические функции нейромедиаторных систем: глутаматергической (Caldeira M.V. et al., 2007), ГАМК-ергической (Guo S. et al., 2008), серотонинергической (Vaidya V.A. et al., 1997). Вместе с тем, терапевтическое использование самого BDNF ограничивается его нестабильностью в биологических жидкостях, плохой способностью проникать через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), возможностью иммунной реакции, наличием побочных эффектов за счет его плейотропности.

Актуальным подходом к регуляции системы ФРНТ в ЦНС, в частности BDNF, является создание (конструирование и синтез) низкомолекулярных миметиков рецепторов к цитокинам, например, TrkB рецепторов BDNF (Longo F.M. et al., 2007; Massa S.M. et al., 2010; Гудашева T.A. и др., 2012, 2013), или использование известного цитокина, усиливающего экспрессию BDNF. Таким веществом может являться эритропоэтин (ЭПО). Этот гемопоэтический ростовой фактор, обладая способностью угнетать апоптоз клеток-

предшественников эритроцитов и стимулировать их пролиферацию и дифференцировку, в виде рекомбинаитного эритропоэтин человека (РЭЧ) успешно используется в клинической практике для лечения анемий различного генеза. Помимо влияния на эритропоэз, ЭПО обладает широким спектром защитных функций. Показано, что при различных повреждениях ЦНС наблюдается активный синтез астроцитами эритропоэтина, который оказывает нейропротективное действие (Buemi М. et al., 2002), ингибируя апоптоз, стимулируя пролиферацию нейронов и ангиогенез. В последнее десятилетие стало известно, что ЭПО вызывает индукцию экспрессии генов нейротрофинов BDNF и NGF в различных структурах мозга, тем самым также способствуя дифференцировке и поддержанию жизнеспособности периферических и центральных нейронов (Viviani В. et al., 2005; Zhang F. et al., 2006). В экспериментальных и клинических исследованиях показано, что РЭЧ эффективен при ишемическом инсульте (Ehrenreich Н. et al., 2002; Ehrenreich Н. et al., 2009), геморрагическом инсульте (Tseng M.Y. et al., 2009; Turner J. et al., 2010), травмах головного мозга (Talving P. et al., 2010). Вместе с тем, эффект нативного РЭЧ, как нейропротектора, выявляется только в очень высоких дозах, вызывающих ряд побочных эффектов (кроветворение и антителообразование). Для РЭЧ выделена изоформа с меньшим содержанием сиаловых кислот (низкосиалированный РЭЧ, нсРЭЧ), являющаяся аналогом т.н. «мозгового» эритропоэтина (NeuroEPO). Известно, что включение веществ в наночастицы может существенно изменять профиль их распределения (Воронина Т.А. и др., 2008; Гельперина С.Э. и др., 2009; Wohlfart S. et al., 2012), и это показано в т.ч. и для РЭЧ (Солев И.Н. и др., 2011). Для доставки белков и пептидов в мозг, особый интерес представляют полимерные наночастицы на основе полилактидной-ко-гликолевой кислоты (poly(lactic-co-glycolic) acid, PLGA) с модифицированной поверхностью.

В ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН в течение нескольких десятилетий проводится работа по созданию и изучению механизмов действия нейропсихотропных лекарственных препаратов, в частности, с нейропротективной активностью (Воронина Т.А., 2006; Середенин С.Б. и Воронина Т.А., 2007; Гарибова Т.Л. и др., 2008; Островская Р.У. и Гудашева Т.А., 2009; Ковалев Г.И. и др., 2009; Мирзоян Р.С. и др., 2011; Жердев В.П. и др., 2012). В отделе химии института сконструирован и синтезирован новый низкомолекулярный миметик BDNF - гексаметилендиамид бис(Лг-моносукцинил-£-серил-£-лизина), ГСБ-106. По своей последовательности, его дипептидный фрагмент совпадает с центральными участками бета-изгиба 4-й петли BDNF, а ацильные группы представляют собой биоизостеры предшествующих этим участкам аминокислотных остатков. Показана способность димерного замешенного дипептида ГСБ-106 избирательно приводить к фосфорилированию TrkB рецептора (Гудашева Т.А. и др., 2012, 2013).

Цель исследования. Изучить нейропсихотропные свойства дипептида ГСБ-106, активирующего рецепторную систему BDNF и гликопротеида ЭПО в наносомалыюй форме, стимулирующего синтез BDNF.

Основные задачи исследования.

1. Исследовать нейропротективную активность димерного замещенного дипептида ГСБ-106: на моделях геморрагического инсульта и болезни Альцгеймера.

2. Изучить антидепрессивный эффект ГСБ-106 на моделях депрессивноподобного состояния.

3. Изучить антиамнестический и противогипоксический эффекты ГСБ-106.

4. Исследовать наночастицы для транспорта эритропоэтина через ГЭБ на различных типах полимеров, определить физико-химические характеристики наносомалыюго эритропоэтина.

5. Исследовать нейропротективную активность нсРЭЧ на PLGA наночастицах на моделях геморрагического инсульта и болезни Альцгеймера в сравнении с нативным нсРЭЧ.

6. Изучить влияние нсРЭЧ на PLGA наночастицах на кроветворение в сравнении с нативным РЭЧ.

Научная новизна. Выявлены нейропсихотропные свойства веществ, воздействующих на систему BDNF. Показано, что гексаметилендиамид бис(1Ч-моносукцинил-Ь-серил-Ь-лизина), ГСБ-106, при внутрибрюшинном (в/б) введении в опытах на крысах обладает нейропротективными свойствами на модели геморрагического инсульта (ГИ), вызванного интрацеребральной посттравматической гематомой (ИПГ) и модели болезни Альцгеймера, вызванной интрацеребровентрикулярным введением амилоида-[3(25-35). Установлено, что у крыс с интрацеребральной посттравматической гематомой ГСБ-106 уменьшает гибель животных, ослабляет неврологический дефицит, нормализует ориентировочно-исследовательское поведение. На модели болезни Альцгеймера, у крыс с амилоидом-Р(25-35) ГСБ-106 корректирует нарушения долгосрочной пространственной памяти в водном лабиринте Морриса. У соединения ГСБ-106 впервые выявлен антиамнестический эффект на модели амнезии условной реакции пассивного избегания (УРПИ), вызванной максимальным электрошоком (МЭШ), и противогипоксические свойства на моделях гипоксии с гиперкапнией в гермообьеме и гемической гипоксии, вызванной нитритом натрия. В опытах на беспородных мышах-самцах на моделях иммобилизационного стресса (тесты вынужденного плавания по Porsolt и подвешивания за хвост по Steru) ГСБ-106 оказывает антидепрессивное действие.

Для доставки ЭПО в мозг получена новая наносомальная форма низкосиалированного рекомбинантного эритропоэтина человека на полилактид-ко-гликолидных наночастицах с человеческим сывороточным альбумином (ЧСА), способная преодолевать ГЭБ и оказывать нейропротективное действие. На модели геморрагического инсульта нсРЭЧ на PLGA НЧ корректирует состояние, поведение и память у крыс с ИПГ, а на модели болезни Альцгеймера нсРЭЧ на PLGA НЧ ослабляет нарушения долгосрочной пространственной памяти у крыс с амилоидом-(3(25-35) в водном лабиринте Морриса. Методами морфометрии и магнитно-резонансной томографии (МРТ) показана способность нсРЭЧ на PLGA НЧ уменьшать зону повреждения мозга у крыс с ИПГ. В отличие от препарата РЭЧ (Эральфон® 5000 МЕ/кг), у нсРЭЧ включенного в PLGA НЧ в эквивалентной дозе не выявлено влияния на эритропоэз.

Научно-практическая значимость. Полученные результаты о способности замешенного димерного дипептида ГСБ-106 проявлять нейропротективное действие, оказывать антидепрессивный, антиамнестический и противогипоксический эффекты, открывают перспективу дальнейшего исследования нейропсихотропных свойств данного соединения и возможность создания на его основе нового лекарственного средства. Разработанный состав наносомалыгой формы нсРЭЧ на основе PLGA, методология сорбции эритропоэтина и оценки физико-химических параметров полученного комплекса могут быть полезными при создании наносомальных лекарственных форм, позволяющих улучшать проницаемость через гематоэнцефалический барьер, сохраняя структуру биологически активных веществ. Выявленный нейропротективный эффект нсРЭЧ на PLGA наночастицах

открывает перспективу фармакологической разработки наносомальных форм нсРЭЧ, как нейропротекторов.

Личный вклад автора. Автором самостоятельно выполнены все эксперименты, проведен анализ литературы по теме исследования, проанализированы результаты, проведена статистическая обработка результатов и описание полученных данных, сформулированы выводы. При непосредственном участии автора подготовлены публикации по результатам работы.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на III Всероссийском научно-практическом семинаре для молодых ученых «Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии» (Волгоград, 2011), XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2012), VII международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» (Москва, 2012), IV Съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, из них: 6 статей опубликованы в ведущих рецензируемых научных журналах, определенных Высшей аттестационной комиссией, 5 тезисов опубликованы в материалах Всероссийских и международных конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, раздела с описанием материалов и методов исследования, двух глав посвященных результатам исследования, их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 181 страницах машинописного текста, иллюстрирована 30 таблицами и 43 рисунками. Библиографический указатель включает 24 отечественных и 531 иностранных источников.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Замещенный димерный дипептид [гексаметилендиамид бис(М-моносукцинил-L-серил-Ь-лизина), ГСБ-106] при внутрибрюшинном введении в опытах на крысах обладает нейропротективным действием на моделях геморрагического инсульта и болезни Альцгеймера.

2. ГСБ-106 при системном введении мышам проявляет отчетливый антидепрессивный эффект в тестах поведенческого отчаяния по Porsolt и подвешивания мышей за хвост по Steru.

3. ГСБ-106 обладает антиамнестическим эффектом на модели амнезии условной реакции пассивного избегания, вызванной максимальным электрошоком и проявляет противогипоксическое действие, продлевая жизнь мышей в условиях гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме и гемической гипоксии.

4. Среди пяти различных видов наночастиц на основе полилактидов с сорбированным на них низкоеиалированным рекомбинантным эритропоэтином человека отобрана экспериментальная форма наночастиц на основе PLGA (Resomer 502Н) с 1% человеческим сывороточным альбумином, преодолевающая неповрежденный и поврежденный инсультом ГЭБ, и на модели интрацеребральной посттравматической гематомы показана её способность проникать в мозг.

5. Низкосиалированный рекомбинантный эритропоэтин человека на PLGA наночастицах обладает нейропротективным действием на модели геморрагического инсульта, вызванного интрацеребральной посттравматической гематомой, корректируя поведение и память крыс с ИПГ и уменьшая объем зоны мозга, поврежденной гематомой, а на модели болезни Альцгеймера улучшает пространственную память.

6

6. Низкосиалированный рекомбинантный эритропоэтин человека сорбированный на PLGA наночастицах, не влияет на процесс кроветворения у крыс при повторном 3-х дневном внутривенном или внутрибрюшинном введения в дозе 0,05 мг/кг, эквивалентной терапевтической (5000МЕ/кг) для рекомбинантного эритропоэтина человека.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные животные

В исследовании были использованы самцы белых нелинейных крыс массой 200-220 г и самцы белых беспородных мышей массой 20-25 г, полученные из сертифицированных питомников РАМН, содержавшиеся в условиях вивария ФГБУ «НИИ фармакологии им. В.В. Закусова» РАМН. Содержание животных соответствовало правилам лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ 351.000.3-96 и 51000.4-96), приказу МЗСР РФ №276 от 19.06.2003г.

Вещества, используемые в исследовании

В исследовании были использованы следующие вещества: димерный замещенный дипептид гексаметилендиамид бис^-моносукцинил-^-серил-Ь-лизина) ГСБ-106 (синтезирован в ФГБУ «НИИ фармакологии им. В.В. Закусова» РАМН); нсРЭЧ (ООО «Протеиновый контур»); препарат РЭЧ «Эральфон» 5000 ME (ЗАО «ФармФирма «Сотекс»), скополамин и хлоралгидрат (Sigma); ß-Амилоид (25-35) (Sigma).

При получении НЧ были использованы гомоиолимеры молочной кислоты (PLA с вязкостью т)=0,34 и 0,68 дл/г) марки Lactel® (Absorbable Polymers, DURECT Corporation, USA) и сополимеры молочной и гликолевой кислот (Resomer 502Н и 752Н, Boehringer Ingelheim, Germany). ПАВ (все - Sigma, USA): полоксамер 188 (Pluronic® F-68), поливиниловый спирт 30-70 кДа, декстран (ММ 70 кДа) и человеческий сывороточный альбумин. Прочие растворители и реактивы поставлены компанией Sigma (Сент-Луис, США). При исследовании проницаемости ГЭБ использованы параформальдегид, сахароза, стрептавидин, флуоресцентный краситель Су2, детергент (0,3% Triton Х100), бис-бензимид (bis-Benzimide) все Sigma (Сент-Луис, США); биотинилированный лектин (Griffonia Simplicifolia Isolectin В4, Vector Laboratories, Inc, USA. B-1205).

Аптиамнестическое действие веществ оценивали, вызывая амнезию условной реакции пассивного избегания. УРПИ вырабатывали у крыс, помещая животных в установку Passive avoidance фирмы Lafayette Instrument Со (США) на освещенную платформу перед входом в темную камеру, где крыса получала однократное болевое раздражение электрошоком (0,6 мА, 10 с) и регистрировали латентное время рефлекса (Воронина Т.А. и др., 1987). Тест на воспроизведение УРПИ осуществляли через 24 часа после обучения, с регистрацией в течение 3 мин латентного периода захода крысы в темную камеру и количества не зашедших туда животных в %. Амнезию УРПИ у крыс вызывали максимальным электрошоком непосредственно после обучения через корниальные электроды (I = 43 мА, частота 50Гц, продолжительность 0,3 сек).

Противогипоксическое действие веществ оценивали в опытах на мышах на моделях гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме, помещая животных в герметически закрываемые банки объемом 200 см , и на модели гемической гипоксии, вызванной введением нитрата натрия (300 мг/кг, в/б) через 45 минут после введения исследуемых веществ. Регистрировали продолжительность жизни животных.

Антидепрессивное действие веществ оценивали в опытах на мышах в тестах вынужденного плавания (Porsolt et al., 1979) и подвешивания за хвост (Steru L., et al., 1985) с

7

регистрацией времени иммобилизации в течение 6-и минут. В тесте вынужденного плавания животные подвергались неизбегаемому плаванию при помещении в установку, которая представляет собой цилиндрическую емкость (d=10 см, h=25 см) наполненную водой (27 °С). В тесте подвешивания за хвост мышей привязывали за хвост к горизонтальной перекладине, подвергая аверсивной неизбегаемой ситуации.

Исследование неврологического статуса. Неврологический статус у крыс определяли по шкале Stroke-index McGrow в модификации И.В. Ганнушкиной (Ганнушкина И.В., 1977). Отмечалось количество животных с легкой симптоматикой до 2,5 баллов (вялость движений, слабость конечностей, односторонний полуптоз, тремор, манежные движения) и тяжелыми проявлениями неврологических нарушений от 3 до 10 баллов (парезы и параличи конечностей, боковое положение).

Моделирование геморрагического инсульта. Крысам, наркотизированным хлоралгидратом (400 мг/кг, в/б), осуществляли деструкцию мозговой ткани в области внутренней капсулы с последующим введением в место повреждения крови, взятой из-под языка животного (0,02 - 0,03 мл), формируя интрацеребральную посттравматическую гематому (Макаренко А.Н. и др., 1999). Исследовали динамику развития ГИ в течение 14 дней с регистрацией гибели крыс, показателей поведения и состояния животных, используя комплекс традиционных для экспериментальной нейропсихофармакологии методов (Воронина Т.А. и др., 2012).

Метод морфометрии. Морфометрическое исследование объема поврежденной ИПГ зоны мозга проведено совместно с сотрудниками ФГБУ «Научный центр неврологии» РАМН. Крыс с ИПГ декапитировали, извлекали мозг, фиксировали, просветляли и готовили срезы на вибротоме (vibratome series 1000 sectioning system Tecnical Product international inc. USA) с шагом 100 мкм. Каждый второй вибротомный срез фиксировали на предметных стеклах с желатиной, окрашивали 0,2% метиленовым синим, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации, просветляли в ксилоле и заключали в бальзам. Сканирование проводили на слайд-приставке Epson perfection VI00 PHOTO. Площадь измеряли в программе "Imege J" в мм2. Объем зоны повреждения определяли по формуле: где

d - толщина пары срезов; S„ - измеренная площадь серийного среза в мм2; £ - сумма объемов повреждения на срезах.

Метод магнитно-резонансной томографии. МРТ-исследование выполнено на базе биологического факультета ФГБОУ ВПО «МГУ им. М.В. Ломоносова». МРТ мозга крыс с ИПГ проводили через 7 и 14 суток после операции. Животных наркотизировали хлоралгидратом (400 мг/кг в/б) и закрепляли на столике с системой подогрева. МРТ проводилась на установке Brucker BioSpin 70/30 (Германия): поле Во = 7.05 Тл; диаметр отверстия 310 мм; свободный доступ для генерации изображений 154 мм; частота переменного магнитного поля 500 МГц; максимальное разрешение 200 мкм; Толщина слоя сбора информации 0,5 мм, расстояние между плоскостями срезов - 1 мм.

Модель болезни Альцгеймера. С целью моделирования БА (Maurice Т. et al., 1996, Степаничев М.Ю. и др., 2005) крысам под наркозом (хлоралгидрат 400 мг/ кг, в/б) с помощью стереотаксиса вводили интрацеребровентрикулярно билатерально предварительно агрегированный (4 суток при 37°С) амилоид -ß(25-35) в дозе 7,5 нмоль в каждый желудочек в соответствие с координатами (АР - 1 мм, L - 1.5 мм, Н - 3.5 мм) (Paxinos G. & Watson С. 2006). Через 40 дней проводили тестирование крыс.

Водный лабиринт Морриса. Бассейн диаметром 190 см (Morris R.G.M., 1984) заполненный водой температурой 24±2°С делился на 4 сектора (А, В, С и D). В целевом

8

секторе помещалась платформа диаметром 12 см, погруженная на 1,5 см ниже уровня воды. В течение 120 секунд регистрировали время нахождения крысой платформы. Обучение проводили в течение 2-х дней, предъявляя по 3 сессии с разных стартовых позиций. Воспроизводили навык через 48 часов после последней процедуры обучения.

Подсчет числа ретикулоцитов. Каплю крови, взятой из хвостовой вены крысы наносили на предварительно окрашенное бриллиантовым крезиловым синим стекло, готовили мазок и помещали во влажную камеру на 3-5 мин при 37°С (Гуляева С.И. и др., 2009). При микроскопии подсчитывали не менее 1000 эритроцитов и среди них ретикулоциты.

Определение проницаемости ГЭБ для паночастиц. Работа выполнена при участии научно-исследовательской лаборатории ООО «НПК «Наносистема». Проницаемость ГЭБ оценивалась на нормальных животных и крысах с ИПГ. PLGA НЧ, меченые красителем Dil (в 1% Pluronic F68) вводили в/в через 30 минут, 1 и 4 часа после ИПГ, через 2 ч крыс усыпляли летальной дозой хлоралгидрата. Кровеносную систему промывали транскардиально сначала фосфатным буфером в физ. растворе (PBS, pH 7,4) а затем фиксирующим раствором (4% раствор параформальдегида в PBS). Мозг извлекали, погружали в фиксирующий раствор и охлаждали (при +4 С, 12 ч), пропитывали 30% раствором сахарозы в PBS (24 ч, при 4 С), замораживали и резали на микротоме (40 мкм). Часть срезов монтировали на предметном стекле и покрывали глицерином. Фотографировали на флуоресцентном микроскопе Olympus 1X81. Часть срезов окрашивали биотинилированным лектином в PBS с детергентом 1:100, помещали в стрептавидин, конъюгированный с флуоресцентным красителем Су2.

Получение и изучение физико-химических свойств наносомалыюй формы нсРЭЧ. Работа выполнена совместно с сотрудниками НИЛ ООО «НПК «Наносистема». Получение НЧ-плацебо осуществляли методом гомогенизации под давлением с последующим испарением органической фазы (Ueda M. & Kreuter J., 1997), после чего НЧ лиофильно высушивали. В качестве стабилизаторов НЧ использовали различные поверхностно-активные вещества (ПАВ): человеческий сывороточный альбумин или поливиниловый спирт (ПВО). Для сорбции нсРЭЧ на лиофильно высушенных НЧ-плацебо к 10 мг НЧ добавляли 1 мл раствора нсРЭЧ (0,60 мг/мл) и перемешивали 1 ч на магнитной мешалке (250 об/мин). В ряде случаев частицы предварительно отмывали от ПАВ. Перед введением к НЧ добавляли Полоксамер 188 до 1%. Визуализацию полимерных НЧ проводили на базе НИЦ «Курчатовский институт» методами электронной и атомно-силовой микроскопии (АСМ). При АСМ измерения проводили в полуконтактном режиме. Определение размеров, поверхностных зарядов и полидисперсности НЧ проводили методом динамического светорассеяния (Nanosizer NanoZS, Malvern Instruments). Определение концентрации нсРЭЧ проводили методом спектрофотометрии (спектрофотометр Thermo Scientific HELIOS ZETA, Англия). НЧ отделяли от свободного нсРЭЧ центрифугированием (центрифуга Avanti J-30 I, 30 мин при скорости 20000 об/мин, 4-8 °С. Степень десорбции эритропоэтина в присутствии различных ПАВ проводили, добавляя к НЧ с нсРЭЧ, 1 мл воды, либо раствор PBS, 1% -ный раствор F-68 или 1%-ный раствор F-68 в PBS. После центрифугирования отделяли супернатант и в нем спектрофотометрически определяли концентрацию десорбированного нсРЭЧ (см. выше). Для оценки агрегационной устойчивости коллоидной системы лиофилизованный образец НЧ ресуспендировали в дистиллированной воде и определяли

размеры и полидисперсность НЧ при различной температуре (4° и 20°С) через 0, 1, 2, 3 и 4 часа, а также с перемешиванием образца и без перемешивания.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы «Biostatistics III» с использованием методов Стьюдента, Фишера, х2 и непараметрического критерия Манна-Уитни, Вилкоксона, и дисперсионного непараметрического критерия Крускала-Уоллиса.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

НЕЙРОПСИХОТРОПНЫЕ СВОЙСТВА ГСБ-106, ДИПЕПТИДНОГО МИМЕТИКА BDNF

Целью исследования настоящего раздела работы явилось изучение нейропсихотропных свойств синтезированного в ФГБУ «НИИ фармакологии» РАМН нового димерного замещенного дипептида, миметика 4-й петли мозгового нейротрофического фактора (BDNF), избирательно активирующего TrkB рецепторы - гексаметилендиамид бис^-моносукцинил-¿-серил-/.-лизина), соединения ГСБ-106.

1. Исследование нейропротекторных свойств ГСБ-106 на модели геморрагического инсульта

Изучение нейропротективного эффекта соединения ГСБ-106 проводили в опытах на крысах на модели геморрагического инсульта, вызванного интрацеребральной посттравматической гематомой. Изучение динамики неврологических нарушений показало, что у ложнооперированных (ЛО) животных в течение 14-и суток после операции не наблюдалось гибели и неврологических нарушений. В контрольной группе крыс с ИПГ отмечены неврологические нарушения как с легкой до 2,5 баллов, так и тяжелой симптоматикой от 3,5 до 10 баллов. В группе животных с ИПГ, получавших димерный дипептид ГСБ-106 (0,05 мг/кг/3 дня, в/б) регистрировалось статистически достоверное уменьшение суммы баллов по шкале Stroke-index (Рис.1.А) на 7-е сутки наблюдения по сравнению с контрольной группой с ИПГ. У крыс с ИПГ в сравнении с ЛО животными наблюдалось значительное ухудшение координации движений, характеризующееся увеличением числа падений с вращающегося стержня, а на фоне введения ГСБ-106 у крыс отмечалось уменьшение количества падений на 7-й день наблюдения (Рис. 1 .Б).

9

5 1-

I

1-е 7-е 14-е

Сутки после операции

1-е сутки ■ Контроль ло I Контроль ИПГ 3 ИПГ+ ГСБ-106 0,05 мг/кг

7-е сутки

Рис.1. Влияние соединения ГСБ-106 (0,05 мг/кг/3 дня, в/б) на неврологические нарушения (А) и координацию движений в тесте вращающегося стержня (Б) у крыс с ИПГ на 1-е и 7-е сутки после операции; ип - достоверность отличий от ЛО, Р<0,01; и - достоверность отличий от ЛО, Р<0,05; * -достоверность отличий от группы крыс с ИПГ, при Р<0,05 (г критерий Стьюдента)

Установлено, что к 14-му дню наблюдения все ЛО животные выжили, а на фоне ГСБ-106, к концу эксперимента выжило 73,3% крыс, что на 53,3% больше, чем в контрольной группе животных с ИПГ (Рис.2).

Рис.2. Влияние ГС Б-106 на выживаемость крыс с ИПГ; 8 - достоверность отличий от ЛО, при Р<0,05, * -достоверность отличий от группы крыс с ИПГ, при Р<0,05 (точный критерий Фишера)

■ Контроль ЛО

■ Контроль ИПГ

□ ИПГ + ГСБ-106 0,05 мг/кг

■ ИПГ + ГСБ-106 0,1 мг/кг

Таким образом, на модели ГИ, вызванного ИПГ, ГСБ-106 в дозе 0,05 мг/кг/3 дня при в/б введении оказывал протективный эффект, сокращая количество погибших от инсульта животных и ослабляя неврологические дефициты у крыс с ИПГ.

2. Изучение нейропротективных свойств ГСБ-106 на модели болезни Альцгеймера, вызванной внутрижелудочковым введением амилоида-В(25-35)

Крыс через 40 дней после в/ж введения амилоида-р(25-35) (ар(25-35)) обучали пространственной ориентации в водном лабиринте Морриса. При регистрации изменения времени поиска платформы между последней сессией обучения и воспроизведением показано, что у всех ЛО животных статистически достоверно уменьшалось время нахождения скрытой платформы (Рис.3) при запуске с обеих позиций (А и В). В группе крыс, которые после в/ж введения аР(25-35) получали физиологический раствор, не было отмечено изменений во времени отыскания скрытой платформы между последней сессией обучения и воспроизведением с обеих позиций, что свидетельствует о нарушении долговременной пространственной памяти у этих крыс. У животных, которые после введения аР(25-35) получали ГСБ-106 (0,1 мг/кг/10 дней, в/б), в сравнении с контрольными крысами с аР(25-35), было отмечено статистически достоверное уменьшение времени поиска платформы при воспроизведении с позиции А и тенденция к его уменьшению при воспроизведении с позиции В (Рис.3).

Рис. 3. Влияние ГСБ-106 (0,1 мг/кг/10 дней в/б) на время отыскания скрытой платформы в водном лабиринте Морриса у крыс на модели болезни Альцгеймера, вызванной амилоидом Р(25-35); * достоверность отличий от сессии обучения, при Р<0,05 (критерий Стьюдента)

Воспроизведение

Контроль Контроль ГСБ-106 + Контроль Контроль ГСБ-106 + ЛО А0(25-35) Ар(2Б-35) ЛО А (5(25-35) АР(25-35) Стартовая позиция А Стартовая позиция В

Таким образом, ГСБ-106 (0,1 мг/кг/10 дней, в/б) ослаблял нарушения долговременной пространственной памяти у крыс на модели БА, вызванной аР(25-35), уменьшая время отыскания скрытой платформы в водном лабиринте Морриса.

3. Изучение антидепрессивных свойств ГСБ-106

Изучение антидепрессивных свойств соединения ГСБ-106, проводилось в тестах вынужденного плавания по РогеоК и подвешивания за хвост по 81еги.

3.1. Изучение антидепрессивной активности ГСБ-106 в тесте вынужденного плавания

Установлено, что ГСБ - 106 при субхроническом введении в дозе 0.1 или 1.0 мг/кг в/б корректировал поведение животных в тесте вынужденного плавания, статистически достоверно уменьшая время эпизодов иммобилизации у мышей в сравнении с контрольной группой в 1.3 и 1.2 раза соответственно (Табл.1).

Таблица 1

Влияние ГСБ-106 на время иммобилизации мышей в тесте вынужденного плавания

Группа животных Доза в мг/кг, в/б Режим введения Время иммобилизации (М±вЕМ), с

Контроль Физ. р-р 5-и кратно 278,38±12,02

ГСБ-106 0,1 5-и кратно 231,41±И,22*

Контроль Физ. р-р 4-х кратно 271,73±13,37

ГСБ-106 1,0 4-х кратно 205,76± 11,02"

Примечание: * - достоверность отличий от контроля, при Р<0,05 ^-критерий Стьюдента)

3.2. Изучение антидепрессивного эффекта ГСБ-106 в тесте подвешивания за хвост Установлено, что ГСБ-106 при субхроническом (4 дня) в/б введении в дозах 1 и 1.5 мг/кг статистически достоверно уменьшал в 1.3 раза время иммобилизации мышей в тесте подвешивания за хвост (Рис.4).

Рис.4. Влияние ГСБ-106 при 4-х дневном субхроническом в/б введении на время иммобилизации мышей в тесте подвешивания за хвост; по горизонтали: доза ГСБ-106; * - достоверность отличий от контроля, при Р<0,05 ^-критерий Стьюдента)

Я ГСБ-106 ■ Контроль

Таким образом, ГСБ-106 при субхроническом внутрибрюшинном введении беспородным мышам в дозах 0,1; 1,0 и 1,5 мг/кг обладает антидепрессивным действием в тестах депрессивноподобного состояния: поведенческого отчаяния по РогеоИ подвешивания мышей за хвост по 81еги.

4. Изучение аитиамнестических и противогипоксических свойств ГСБ-106

При изучении антиамнестического эффекта ГСБ-106 на модели амнезии УРПИ, вызванной МЭШ установлено, что в контрольной группе крыс с МЭШ при воспроизведении УРПИ через 24 часа после обучения только 37,5% животных помнили об ударе током и не

ОД 0,5 1,0 1,5

мг/кг мг/кг мг/кг мг/кг

заходили в темную камеру, где ранее получили удар током, тогда как в группе интактных животных этот показатель составлял 100% (Рис.5).

л Контроль (физиологический р-р 0,9%)

а Контроль с МЭШ

i МЭШ + ГСБ-106 ОД мг/кг

Lj МЭШ + ГСБ-1061 мг/кг

Рис. 5. Влияние ГСБ-106 на амнезию условной реакции пассивного

вызванной достоверность контроля (без Р<0,05; * -

избегания, МЭШ; * -отличий от МЭШ), при достоверность

отличий от контроля с МЭШ, при Р<0,05 (точный критерий Фишера)

В группе крыс с МЭШ, получавших ГСБ-106 (1,0 мг/кг/4 дня) количество животных, не зашедших в темную камеру статистически достоверно увеличивались до 87,5% в сравнении с контрольной группой с МЭШ.

Таким образом, ГСБ-106 (1,0 мг/кг/4 дня) при в/б введении обладает антиамнестическим эффектом на модели амнезии УРПИ, вызванной МЭШ.

Изучение противогипоксической активности ГСБ-106 показало, что при однократном в/б введении в дозе 1,0 мг/кг вещество обладает противогипоксическим действием на моделях гемической гипоксии, вызванной нитритом натрия и гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме, статистически достоверно увеличивая продолжительность жизни животных по сравнению с контрольной группой в 1,1 и 1,26 раза (р<0,05) соответственно.

ИССЛЕДОВАНИЕ НАНОСОМАЛЬНОЙ ФОРМЫ ЭРИТРОПОЭТИНА

Целью настоящего раздела явилось осуществить с помощью полилактид-ко-гликолидных наночастиц доставку нсРЭЧ в мозг и изучить его нейропсихотропные свойства.

I. Оценка физико-химических свойств наносомальной формы нсРЭЧ

Наночастицы были получены методом гомогенизации под давлением с последующим испарением органической фазы. Для стабилизации НЧ использовали следующие ПАВ: ПВС или ЧСА. В целях сохранения биологической активности нсРЭЧ было предложено предварительное получение НЧ-плацебо и их лиофилизация. В последующем, нсРЭЧ сорбировали на лиофильно высушенных НЧ ex tempore. Физико-химические параметры НЧ, и степень сорбции на них нсРЭЧ представлены в табл. 2.

Таблица 2

Полимер ПАВ Средний размер, нм ^-потенциал, мВ Полидисперсность (PDI) Степень сорбции, %

PLA (11=0,34 г/л) ПВС 0,5% 191,9±0,9 -18,9±2,05 0,103±0,02 25,67±2,6

PLA (т|=0,68г/л) ПВС 0,5% 203,3±1,2 -23,8±2,34 0,086±0,02 23,4±2,0

Resomer 502Н ПВС 1% 140,9±0,47 -5,04±0,220 0,101±0,01 69,4±1,2

Resomcr 502Н ЧСА 1% 90,09±0,46 -30Д±1,56 0,216±0,01 81,07±8,1

Resomer 752Н ЧСА 1% 93,42±0,73 -24,4±2,30 0,196±0,01 60,18±6,0

Примечание: г\ - истинная вязкость полимера

На Рис.6 представлены данные о зависимости эффективности сорбции нсРЭЧ от структуры выбранного полимера и типа ПАВ. Так, если предварительное отделение НЧ от ПВС позволило значительно повысить эффективность сорбции на них нсРЭЧ, то отмывка НЧ от ЧСА существенно понижала ее.

Рис.6. Влияние наличия свободного ПАВ в инкубационной среде на сорбцию нсРЭЧ на различных видах

наночастиц; по вертикали -степень сорбции нсРЭЧ на поверхности НЧ в %; по горизонтали - тип полимера и ПАВ

Выбор образца НЧ для проведения биологических исследований основывался на следующих критериях: малый размер частиц и индекс полидисперсности, высокая степень сорбции нсРЭЧ и отсутствие химических компонентов, не разрешенных к инъекционному применению, на основании которых были отобраны PLGA НЧ на основе полимера Resomer 502 Не 1% ЧСА в качестве стабилизатора размером 90,09±0,46 нм, эффективность сорбции нсРЭЧ на которых составляла 81,07±8,1%. Исследование агрегационной устойчивости выбранных НЧ показало, что суспензия стабильна при 4° и 20°С в течение 4-х часов, размер наночастиц не изменяется и не образуется агломератов в растворе после лиофильного высушивания и ресуспендирования.

Визуализацию полимерных наночастиц (Resomer 502Н) осуществляли методами ЭМ и АСМ. На рис.7 (а и в) видно, что НЧ имеют правильную сферическую форму и узкое распределение по размерам. Первая (Рис.7.а) микрофотография сделана сразу после приготовления образца. При более длительной его выдержке на подложке происходит значительное увеличение размеров частиц и образование однородной массы полимера, что можно наблюдать на микрофотографии (Рис.7.б), сделанной через 48 часов после приготовления.

PLA PLA

(1=0.34) (П=0,68) ПВС 0,5% ПВС 0,5% НЧ отмыты от свободного ПАВ

Resomer Resomer Resomer 752 Н 502Н 502Н ЧСА 1%

ПВС 1% ЧСА 1%

а НЧ от свободного ПАВ не отмыты

а б в

Рис.7. Микрофотографии РЬОА наночастиц на основе полимера Кезошег502Н с 1% ЧСА методом электронной микроскопии сразу после приготовления образца (а) и по прошествии 48 часов с момента приготовления (б), и атомно-силовая микроскопия свежеприготовленного образца (в)

Таким образом, можно заключить, что выбранный образец PLGA наночастиц по своим физико-химическим характеристикам отвечает требованиям к НЧ, необходимым для проведения биологических исследований.

2. Изучение проникновения PLGA наночастиц через гемато-энцефалический барьер

Исследование проникновения в мозг PLGA НЧ, меченых флуоресцентным красителем Dil (1,Г-диоктацецил-3,3,3',3'-тетраметилиндо-карбоцианина перхлорат), проводилось у животных без патологии и у крыс с ИГ1Г в различные интервалы времени после моделирования ГИ. Результаты представлены в виде серии фотографий (Рис. 8). Видно, что меченые PLGA НЧ обнаруживаются в тканях мозга здоровых животных (Рис. 8.А). У крыс с ИГ1Г максимальное число меченых PLGA НЧ проникает через ГЭБ после введения через 30 мин после инсульта (Рис. 8.Б) а затем их количество снижается с увеличением интервала времени от моделирования ИПГ до введения НЧ (Рис. 8.В и Г) до 4-х часов.

Г

50 um К

200 pm Г 200 pm

Рис.8. Флуоресцентная фотография среза мозга контрольной крысы без патологии (А) после введения PLGA наночастиц меченых флуоресцентным красителем Dil и мозга крысы с ИПГ с введением PLGA наночастиц меченых флуоресцентным красителем Dil, через 30 минут (Б), 1 час (В) и 4 часа (Г) после ИПГ

Таким образом, установлено, что PLGA НЧ с модифицированной поверхностью проникают через нормальный и поврежденный ИПГ ГЭБ, при этом наибольшее количество НЧ в тканях мозга наблюдается в 1-й час после ИПГ, а наименьшее - через 4 часа после операции.

3. Исследование нейропротекторных свойств наносомального эритропоэтина на модели геморрагического инсульта

Изучение динамики неврологических нарушений и выживаемости крыс с ИПГ, показало что у JIO животных в течение 14-и суток после операции не наблюдалось гибели и неврологических нарушений. На фоне повторного 3-х дневного введения нсРЭЧ, включенного в PLGA НЧ к концу эксперимента выжило 77,8% крыс, что на 37,8% больше, чем в контрольной группе животных с ИПГ. Менее выраженным эффектом обладал

нативный нсРЭЧ, на его фоне к 7-м суткам выжило 52,6% крыс. На 7-е сутки после операции у ЛО животных не наблюдались тяжелые неврологические нарушения - манежные движения, парезы, параличи. Подобные нарушения отмечались в контрольной группе крыс с ИПГ у 37,5% животных (Рис. 9). Нативный нсРЭЧ не оказывал существенного влияния на проявления неврологического дефицита у крыс с ИПГ, а в группе животных с ИПГ, получавших нсРЭЧ на РЬОА НЧ регистрировалось существенное уменьшение количества животных с тяжелым неврологическим дефицитом до 7,14%.

Рис. 9. Влияние нсРЭЧ и нсРЭЧ, сорбированного на РЬОА НЧ (0,05 мг/кг/3 дня, в/б) на тяжелые неврологические нарушения у крыс с ИПГ;" - достоверность отличий от ЛО, при Р<0,05; * - достоверность отличий от группы крыс с ИПГ, при Р<0,05 (точный критерий Фишера)

■ Контроль/10

■ Контроль ИПГ

■ ИПГ + нсРЭЧ 0,05 мг/кг

■ ИПГ + нсРЭЧ РЦСА 0,05 мг/кг

Изучение влияния веществ на обучение УРПИ показало, что животные во всех группах обучились УРПИ, т.к. при его воспроизведении через 24 ч все 100% крыс помнили об ударе током в темной камере и не заходили туда. При воспроизведении УРПИ через 7 дней после обучения 100% ЛО крыс не заходили в темную камеру, а в контрольной группе крыс с ИПГ только 50% животных осуществляли рефлекс пассивного избегания. НсРЭЧ на РЬОА НЧ, в отличие от нативного нсРЭЧ, предупреждал развитие амнезии УРПИ на 7-е сутки у 100% крыс с ИПГ (Рис.10).

Рис. 10. Влияние нсРЭЧ и нсРЭЧ, сорбированного на РЬОА НЧ (0,05 мг/кг/3 дня, в/б) на воспроизведение условной реакции пассивного избегания у крыс с ИПГ; * - достоверность отличий от ЛО, при Р<0,05; - достоверность отличий от группы крыс с ИПГ, при Р<0,05 (точный критерий Фишера)

9 Контроль ло

0 Контроль ИПГ

■ ИПГ + нсРЭЧ 0,05 мг/кг

■ ИПГ+ нсРЭЧ Р1ЛА 0,05 мг/кг

Морфометрические исследования объема поврежденной зоны мозга показали, что у контрольной группы крыс с ИПГ наблюдалось значительное повреждение тканей мозга объемом в среднем 17,49±4,94 мм3, а у ЛО животных заметных повреждений отмечено не было. В группе крыс, получавших нсРЭЧ на РЬОА НЧ, объем очага поражения был значительно меньше, и составлял 5,01±1,9 мм3 (р<0,05). Защитный эффект нсРЭЧ на РЬвА НЧ рассчитывали с использованием коэффициента эффективности защиты (КЭЗ) по формуле: КЭЗ=(Уо-Ув)/Уо*100% = (17,49-5,01)/17,49*100% =71,36%, где Уа- объем повреждения у контроля с ИПГ, У„ - объем повреждения у группы, получавшей нсРЭЧ на РЬОА НЧ (0,05 мг/кг/3 дня, в/б).

1-е сутки 7-е сутки

КЭЗ у крыс с ИПГ, которым вводили нсРЭЧ на РЬОА НЧ составил 71,36%, что свидетельствует о высокой эффективности действия препарата. На рисунке 11 представлены срезы головного мозга крыс с ИПГ в области наибольшего поражения. Видно, что у крыс с ИПГ, получавших нсРЭЧ на РЬОА НЧ (слева) область поражения (темно-синяя окраска) значительно меньше, чем у контрольных крыс с ИПГ (справа).

МРТ-исследование мозга крыс с ИПГ представлено на рисунке 11. Видно, что зоны повреждения структур мозга у животных в контрольной группе с ИПГ имеют больший размер, чем у крыс с ИПГ, получавших нсРЭЧ на РЬОА НЧ. В контрольной группе крыс с ИПГ так же наблюдаются очаги воспаления в поврежденной области.

ипг+нсрэч |>1д;л

Контроль ИНГ

Рис.11. МРТ-исследование головного мозга крыс с ИПГ (слева); сравнение максимальной зоны повреждения у крыс с ИПГ на срезах мозга, окрашенных метиленовым синим, масштаб 3 мм (справа)

Таким образом, на модели ГИ, вызванного ИПГ, нсРЭЧ (0,05 мг/кг/3 дня в/б), включенный в РЬОА наночастицы в отличие от нативного нсРЭЧ, оказывал нейропротективное действие: сокращал количество погибших от инсульта животных и количество животных с тяжелым неврологическим дефицитом, корректировал нарушения памяти, вызванные ИПГ. Морфометрически и МРТ-исследованием показана способность нсРЭЧ на РЬОА НЧ значительно уменьшать зону мозга, поврежденную ИПГ.

4. Изучение нейропротективных свойств наноеомального эритропоэтина на модели болезни Альцгеймера

Крыс через 40 дней после в/ж введения а(3(25-35) обучали пространственной ориентации в водном лабиринте Морриса. При регистрации времени поиска платформы между последней сессией обучения и воспроизведением показано, что у всех ЛО животных статистически достоверно уменьшалось время нахождения скрытой платформы (Рис.12). Это свидетельствует об отсутствии нарушений пространственной памяти у ЛО крыс. В контрольной группе крыс с а|3(25-35) не было отмечено статистически значимых изменений времени отыскания скрытой платформы. А в группе животных, которые после в/ж введения

аР(25-35) получали нсРЭЧ на РЬОА НЧ (0,01 мг/юг/10 дней, в/в), было отмечено статистически достоверное уменьшение времени поиска скрытой платформы в водном лабиринте Морриса.

Таким образом, показано, что после 10-и дневного в/в введения нсРЭЧ на РЬвА НЧ крысам на модели БА, вызванной а(3(25-35), отмечалась коррекция нарушений долговременной пространственной памяти у животных, проявляющаяся в уменьшении времени отыскания скрытой платформы в водном лабиринте Морриса.

140 -_-,,.„!■! , ----------------------

1120 Иг^-----т ^

}: 1 КI

Контроль Контроль А0(25-35)

ЛО АР125-35) нсРЭЧ+Р1бА

■ Обучение * Воспроизведение

5. Изучение влияния нсРЭЧ, на Р1ХА наночастицах на эритропоэз

Изучение влияния нсРЭЧ на РЬОА НЧ на эритропоэз проводили в опытах на крысах в сравнении с препаратом Эральфон® (ЗАО «ФармФирма «Сотекс», Россия). Вещества (нсРЭЧ на РЬОА НЧ 0,05 мг/кг; Эральфон 5000 МЕ/кг и физиологический раствор) вводили в/б или в/в ежедневно однократно в течение 3-х дней.

Подсчет числа ретикулоцитов в крови (рис. 13) показал, что РЭЧ (Эральфон*) статистически достоверно увеличивал гемопоэз при обоих способах введения в дозе 5000 МЕ, тогда как нсРЭЧ на РЬОА в эквивалентной дозе не вызывал увеличения числа юных кровяных клеток у крыс.

Рис.13. Влияние РЭЧ и нсРЭЧ на РЬОА НЧ на кроветворение у крыс; по вертикали - отношение числа ретикулоцитов к эритроцитам крови в %; по горизонтали — способ введения (в/в или в/б); достоверность отличий от контрольной группы, получавшей физиологический раствор при р<0,05 (критерий Стъюдента)

Таким образом, полученные данные свидетельствуют об отсутствии возможности возникновения эритроцитоза и ассоциированного с ним риска тромбообразования при терапии нсРЭЧ, сорбированным на РЬОА НЧ.

Рис.12. Влияние нсРЭЧ, сорбированного на РЬОА НЧ (0,01 мг/юг/10 дней, в/в) на отыскание скрытой платформы в лабиринте Морриса у крыс после билатерального внутрижелудочкового введения а|3(25-35); - достоверность отличий от сессии обучения, при Р<0,05 (критерий Стьюдента)

введение введение

в РЦЗА нсРЭЧ |0,05мг/кг| в Эральфон, 5000 ЕД/кг ы Физиологический р-р

Заключение

В работе были исследованы нейропсихотропные свойства дипептида ГСБ-106, активирующего рецепторную систему BDNF и гликопротеида ЭПО в наносомальной форме, способного стимулировать экспрессию BDNF. В результате проведенной экспериментальной работы показано, что оригинальный миметик мозгового нейротрофического фактора ГСБ-106 обладает нейропротективными свойствами на модели геморрагического инсульта, уменьшая гибель и неврологический дефицит у крыс с интрацеребральной посттравматической гематомой, ослабляет нарушения долговременной пространственной памяти у животных после внутрижелудочкового введения амилоида (3(25-35). На моделях иммобилизационного стресса (тесты вынужденного плавания по Porsolt и подвешивания за хвост по Stem) выявлено антидепрессивное действие замещенного дипептида. В исследовании показано, что изучаемое соединение обладает противогипоксическим эффектом на моделях гемической гипоксии и гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме. На модели амнезии УРПИ, вызванной МЭШ показано антиамнестическое действие вещества. Таким образом, соединение ГСБ-106 обладает нейропсихотропными свойствами, характеризующимися нейропротективной активностью, антидепрессивным, антиамнестическим и противогипоксическим эффектами.

Для изучения нейропсихотропных свойств регуляторного гликопротеида ЭПО с целью его доставки в мозг была получена и охарактеризована наносомальная форма нсРЭЧ на основе PLGA. Показана способность полученных НЧ проникать через ГЭБ на модели ГИ, исследованы нейропсихотропные свойства и влияние нсРЭЧ на PLGA НЧ на кроветворение. Установлено, что нсРЭЧ на PLGA НЧ обладает более выраженными нейропротективными свойствами, чем нативный нсРЭЧ. Наносомальный нсРЭЧ нормализовал состояние и когнитивные функции, снижал гибель животных с ИПГ. Методами МРТ и морфометрии показана способность нсРЭЧ на PLGA НЧ значительно уменьшать зону повреждения мозга у крыс с ИПГ. На модели болезни Альцгеймера, вызванной в/ж введением а(3(25-35) введение наносомального нсРЭЧ приводило к коррекции нарушений долговременной пространственной памяти у крыс с патологией. Кроме того, показано, что нсРЭЧ на наносомах в отличие от нативного РЭЧ (Эральфон®) не влияет на гемопоэз.

Таким образом, осуществлены два подхода к воздействию на систему факторов роста нервной ткани: исследованы вещества, прямо или косвенно воздействующие на TrkB рецепторы или экспрессию BDNF. Показано, что сконструированный на основе 4-й петли BDNF димерный замещенный дипептид, агонист TrkB рецепторов, обладает нейропсихотропными свойствами, сопоставимыми с нативным BDNF при введении этого нейротрофина в структуры мозга. Использование полимерных наночастиц позволило доставить нсРЭЧ в ЦНС и получить эффекты, сходные с мозговым ЭПО, обладающим как собственной нейропротективной активностью, так и влияющим на экспрессию нейротрофинов. Эти эффекты соединений проявляются в низких дозах при системном введении животным.

Выводы

1. Замещенный димерный дипептид [гексаметилендиамид бис(1\|-моносукпшшл-Ь-серил-Ь-лизина), ГСБ-106] при внутрибрюшинном введении в дозе 0,05 мг/кг/3 дня обладает нейропротективным действием у крыс с интрацеребральной посттравматической гематомой, уменьшая гибель животных, ослабляя неврологический дефицит и нормализуя ориентировочно-исследовательское поведение. На модели болезни Альцгеймера, вызванной внутрижелудочковым введением амилоида-(3(25-35) ГСБ-106 (0,1 мг/кг/10 дней, внутрибрюшинно) ослабляет нарушения долговременной пространственной памяти в водном лабиринте Морриса

2. ГСБ-106 при внутрибрюшинном введении обладает антидепрессивным действием в тестах поведенческого отчаяния по РогеоЬ (0,1 и 1.0 мг/кг, 4-5 дней) и подвешивания мышей за хвост по 81еги (1.0 и 1.5 мг/кг, 4 дня).

3. ГСБ-106 обладает антиамнестическим эффектом, ослабляя у крыс амнезию условной реакции пассивного избегания, вызванную максимальным электрошоком (1,0 мг/кг/4 дня, внутрибрюшинно) и противогипоксическим действием (1,0 мг/кг/1 день, внутрибрюшинно), увеличивая продолжительность жизни мышей на моделях гемической гипоксии и гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме.

4. Получены 5 различных видов наночастиц на основе полилактидов с сорбированным на них низкосиалированным рекомбинантным эритропоэтином человека, охарактеризованы их физико-химические свойства. Отобрана экспериментальная форма наночастиц на основе РГОЛ ([^еяотег 502Н) с 1% человеческим сывороточным альбумином, размером 90,09±0,456 нм и степенью сорбции низкосиалированного рекомбинантного эритропоэтина человека 81,07±8,1%, способная проникать в мозг, в том числе поврежденный у крыс после геморрагического инсульта

5. Низкосиалированный рекомбинантный эритропоэтин человека на РЬОА наночастицах (0,05 мг/кг/3 дня, внутрибрюшинно), в отличие от нативного низкосиалированного рекомбинантного эритропоэтина, оказывает нейропротективное действие на модели геморрагического инсульта, уменьшая гибель крыс, ослабляя неврологический дефицит, улучшая обучение и память животных. Морфометрическими исследованиями и магнитно-резонансной томографией показана способность низкосиалированного рекомбинантного эритропоэтина человека на РЬвА наночастицах уменьшать объем зоны мозга, поврежденной интрацеребральной посттравматической гематомой. На модели болезни Альцгеймера, вызванной внутрижелудочковым введением амилоида-Р(25-35), низкосиалированный рекомбинантный эритропоэтин человека на РЬОА наночастицах (0,01 мг/кг/10 дней, внутривенно) ослабляет нарушения долговременной пространственной памяти в водном лабиринте Морриса.

6. Низкосиалированный рекомбинантный эритропоэтин человека, сорбированный на РЬвА наночастицах на фоне 3-х дневного внутривенного или внутрибрюшинного введения в дозе, эквивалентной 5000 МЕ/кг рекомбинантного эритропоэтина человека, не влияет на процесс кроветворения у крыс.

Практические рекомендации

1. Учитывая выявленные нейропсихотропные свойства соединения ГСБ-106, характеризующиеся нейропротективным, антидепрессивным, антиамнестическим и противогипоксическим эффектами, рекомендуется углубленное доклиническое изучения фармакологического спектра действия этого вещества с целью создания лекарственного средства.

2. Предлагается использовать для транспорта в мозг низкосиалированного рекомбинантного эритропоэтина человека наночастицы на основе полилактидной-ко-гликолевой кислоты с человеческим сывороточным альбумином в качестве стабилизатора.

3. Рекомендуется дальнейшее доклиническое изучение низкосиалированного рекомбинантного эритропоэтина человека на полилактид-ко-гликолидных наночастицах с модифицированной поверхностью в качестве нейропротективного средства.

Список публикаций по теме диссертации

1. Солев, И.Н. Разработка технологии получения наноформ рекомбинантного эритропоэтина человека [Текст] / И.Н. Солев, О.С. Елизарова, В.Ю. Балабаньян, В.В. Тарасов, Р.Н. Аляутдин // Фармация. - 2011. - №6. - С. 36-38.

2. Елизарова, О.С. Эффект рекомбинантного эритропоэтина человека, иммобилизованного на полимерных носителях на модели интрацеребралыюй посттравматической гематомы, геморрагического инсульта [Текст] / О.С. Елизарова, И.Н. Солев, С.А. Литвинова, В.В. Тарасов // Вестник ВолГМУ: приложение «Материалы III Всероссийского научно-практического семинара для молодых ученых «Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии». -Волгоград: изд-во ВолГМУ, 2011. - С. 31-32.

3. Балабаньян, В.Ю. Нейропротекторный эффект человеческого рекомбинантного эритропоэтина, сорбированного на полимерных наночастицах, на модели интрацеребральной посттравматической гематомы (модель геморрагического инсульта) [Текст] / В.Ю. Балабаньян, И.Н. Солев, О.С. Елизарова, Т.Л. Гарибова, С.А. Литвинова, Т.А. Воронина // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2011. - Т.74, № 10. -С. 12-15.

4. Елизарова, О.С. Изучение антидепрессивных свойств дипептидного миметика мозгового нейротрофического фактора ГСБ-106 в условиях иммобилизационного стресса [Текст] / О.С. Елизарова, С.А. Литвинова, Т.Л. Гарибова, Т.А. Воронина, Т.А. Гудашева // Сборник материалом конгресса «XIX Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». - Москва, 2012. - С. 373.

5. Балабаньян, В.Ю. Применение полимерных систем доставки для транспорта пептидов с нейротрофической активностью через гемато-энцефалический барьер [Текст] / В.Ю. Балабаньян, О.С. Елизарова, И.Н. Солев, В.И. Швец // Материалы Международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» 20-22 марта 2012г. - М„ 2012.- С. 192.

6. Елизарова, О.С. Изучение нейропротекторного эффекта низкосиалированного рекомбинантного эритропоэтина человека, включенного в наночастицы на основе сополимера молочной и гликолевой кислот у крыс с интрацеребральной посттравматической гематомой [Текст] / О.С. Елизарова, С.А. Литвинова, В.Ю. Балабаньян, И.В. Барсков, C.B. Новикова, Е.В. Стельмашук // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2012. - № 8. - С. 7-10.

7. Литвинова, С.А. Изучение антиамнестических и противогипоксических свойств дипептидного миметика мозгового нейротрофического фактора ГСБ-106 [Текст] / С.А. Литвинова, О.С. Елизарова, A.B. Тарасюк // Материалы IV съезда фармакологов России «Инновации в современной фармакологии». - Казань, 2012 г. - С. 118.

8. Елизарова, О.С. Изучение нейропротективных свойств низкосиалированного рекомбинантного эритропоэтина, включенного в наночастицы на основе сополимера молочной и гликолевой кислот на модели геморрагического инсульта [Текст] / О.С. Елизарова, С.А. Литвинова // Материалы IV съезда фармакологов России «Инновации в современной фармакологии». - Казань, 2012 г. - С. 63.

9. Елизарова, О.С. Эффективность в отношении экспериментального геморрагического инсульта у крыс новой коллоидной формы низкосиалированного эритропоэтина на основе полилактидов [Текст] / О.С. Елизарова, В.Ю. Балабаньян, Е.В. Шипуло, О.О.

Максименко, JI.B. Ванчугова, С.А. Литвинова, Т.Л. Гарнбова, Т.А. Воронина, С.Э. Гельперина // Химико-фармацевтический журнал. - 2012. -№ 10. - С. 49-52.

10. Солев, И.Н. Изучение участия BDNF и NGF в механизме нейропротекторного эффекта наноформ рекомбинантного эритропоэтина человека [Текст] / И.Н. Солев, В.Ю. Балабаньян, И.А. Волчек, О.С. Елизарова, С.А. Литвинова, Т.Л. Гарибова, Т.А. Воронина // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2013 - Т. 155, № 2. -С. 210-214.

11. Балабаньян, В.Ю. Направленный транспорт низкосиалированного рекомбинантного эритропоэтина человека с использованием полимерных наночастиц через гематоэнцефалический барьер [Текст] / В.Ю. Балабаньян, A.M. Ульянов, О.С. Елизарова, И.Н. Солев, С.А. Литвинова, Т.Л. Гарибова, Воронина Т.А. // Российский химический журнал. - 2013. - T. LVI, № 3-4. - С. 67-75.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

BDNF (brain-derived neurotrophic factor) мозговой нейротрофический фактор

PLA (polylactic acid) полилактидная кислота

PLGA (poly(lactic-co-glycolic) acid) полилактидная-ко-гликолевая кислота

ар амилоид-Р

АСМ атомно-силовая микроскопия

БА болезнь Альцгеймера

в/б внутрибрюшинно

в/в внутривенно

в/ж внутрижелудочково

ГИ геморрагический инсульт

ГСБ-106 гексаметилендиамид бис(Ы-моносукцинил-Ь-серил-Ь-лизина)

ГЭБ гематоэнцефалический барьер

ИПГ интрацеребральная посттравматическая гематома

ЛО ложнооперированные

МРТ магнитно-резонансная томография

МЭШ максимальный электросудорожный шок

нсРЭЧ низкосиалированный рекомбинантный эритропоэтин человека

НЧ наночастицы

ПАВ поверхностно-активное вещество

ПВС поливиниловый спирт

РЭЧ рекомбинантный эритропоэтин человека

УРПИ условная реакция пассивного избегания

ФРНТ факторы роста нервной ткани

ЦНС центральная нервная система

ЧСА человеческий сывороточный альбумин

ЭПО эритропоэтин

Подписано в печать 25.04.2013. Формат 60x90 1/16 Бумага офс. Печать офс. Объем 1,5 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 000478

ООО «Мирея» Москва, ул. Потешная, д.6/2, www.mireya.ru,