Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Влияние микроэлементов цинка, меди и селена на течение экспериментального артрита

РГб од

1 Я ДПР 1393

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ МЩЩИНСКИЙ СТОМАТОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ им. Н.А.СЕМАШКО

На правах рукописи

ГИЛЬДЕЕВА Гелия Нязыфовна

ВЛИЯНИЕ МИКРОЭЛЕМЕНТОВ ЦИНКА, 1.ЩИ И СЕЛЕНА НА ТЕЧЕНИЕ ЭКСПЕРШЕНТАШОГО АРТРИТА

14.00.25. - фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1993

Работа выполнена на кафедре фармакологии и фармакогнозии ФУП Московской ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени медицинской академии им. И.М.Сеченова.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор В.В.Ряженов

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор И.Е.Ковалев доктор медицинских наук, профессор Е.Г.Изшов

Ведущая организация: Московский ордена Ленина Государственный медицинский университет им. Н.И.Пирогова.

Защита состоится "_"_1993 г. в_

часов на заседании специализированного Совета Д 084.08.01 при Московском ордена Трудового Красного Знамени медицинском стоматологическом институте им. Н.А.Семашко /Москва, 103473, ул. Каляевская, 18, строение 4/.

С диссертацией молено ознакомиться в библиотеке института по адресу: г. Москва, ул.Вучетича, д. 9-а.

Автореферат разослан " V" й^Ы.б^ 1993 г.

Ученый секретарь специализированного Совета доктор медицинских наук,

профессор Л.Л.Кириченко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ *

Актуальность проблемы. Одной из важнейших проблем здравоохранения яйляется разработка и внедрение новых эффективных методов профилактики и лечения наиболее распространенных заболеваний.

Одной, из .острых медицинских и социальных проблем является частота поражения суставов иммунного и другого происхождения. По данным ВОЗ больные этими заболеваниями составляют до 25% всех лиц, обращающихся в медицинские учреждения; 1/3 случаев физической нетрудоспособности обусловлена данной патологией.

Несмотря на достигнутые в последние годы успехи в диагностика, профилактике и лечении одного из них - ревматоидного артрита /РА/» интерес к изысканию новых средств для терапии такого рода заболеваний сохранится. Это объясняется преэде всего тем, что применяемые лекарстенные средства при длительном использовании, обладают многими видами отрицательного действия на организм человека, влияя на гормональный фон, угнетающе действуя на систему кроветворения, проявляя ульцерогенные свойства и т.д./ A.A. Крель, 1983; В.А.Насонова 1987, 1989; Х.Л.Ф.Каррей 1990/.

Значимость этой проблемы требует поиска новых фармакологически активных веществ. В последние годы повысился интерес к использованию известных эссенциальных микроэлементов Мэ>/ в лечебной практике ДЯ.А.Азизов 1970; Г.А.Бабенко и др. 1971; А.И.Венчиков 1978, 1982; Е.С.Крисс и др. 1986/, т.к. МЭ. входят в состав многих ферментов и чрезвычайно вачшы для нормального течения различных форм метаболизма /А.П.Авцш и др. 1990.1991; Ф.Ф. Боечко 1974;В.И.Борюцко 1987; ЗЯ/цтвеЛ^&г Q. 1980; ZfotyMiC. 1986; Оатрве^А® 1984/. Публикаций по применению в клинической практике РА единичны.

Кроме того, отдельные стороны патогенеза РА изучены недоста-

точно. Обобенно это касается иммунохимического гомеостаза и минерального обмена: поведения цитохром Р-450 зависимой микросо-мальной иоаооксигеназной системы печени, процессов перекисного окисления лищдов /ПОЛ/ и обмена микроялементов. Общепризнано, что ведущее место в патогенезе РА занимают иммунные нарушения. Однако при рассмотрении проблем патологии соединительной ткани возможность повреждения ее свободными радикалами /СР/, как правило не принималась во внимание, хогя известно, что радикалы кислорода вызывают нарушение структуры ДНК, гиалуроновой кислоты, деструкцию эндотелиальных клеток, повышение сосудистой проницаемости. СР принимают активное участие в фагоцитозе, в метаболизме арахидоновай кислоты, синтезе простагландинов и аутоиммуниза-цаи / К.Н. Агишева 1988; А.М.Герасимов 1980; Р.Н.Микунис и др. 1989/ Кроме того при РА было отмечено угнетение такой важной системы в организме как цитохром Р-450/ Ковалев И.Е. и др. 1983/. С нашей точки зрения, "привлекательность" использования микроэлементов в качестве фармакологически активных веществ прежде всего в том, что их малые нетокаичные дозы способны влиять на патологический процесс, участвуя и вызывая увеличение интенсивности обменных процессов и защитной реакции организма. Здесь же можно отметить и простоту изготовления, дешивизну, что делает весьма доступными изучаемые объекты для всякого рода опытов и наблюдений с ниш.

Для оценки эффективности различных противоревматических средств с успехом используется модель адьювантного артрита, т.к. адьювантная болезнь - одна из наиболее адекватных моделей заболеваний с системным поражением соединительной ткани и иммуннкки нарушениями / А.С.Саратиков и др. 1983; Г.Н.Лишшн 1974;

А 1989/.

В этой связи, целью нашей работы является направленный поиск и исследование новых комбинаций МЭ на основе их сочетанного

действия, а именно:

- комбинаций для профилактики и лечения адьювантного артрита.

Для достижения поставленной- цели необходимо было решить следующие задачи:

- провести скрининговый поиск эффективной комбинации микроэлементов на модели адьювантного артрита/АА/;

- определить направленным поиском -зону терапевтического действия каждого Ю ;

- выявить закономерную взаимосвязь медцу состоянием системы цитохром Р-450 печени и прогрессивным /регрессивным/ течение адьговантной болезни под влиянием комбинаций микроэлементов и общеизвестных препаратов, ведущих к благоприятным исходам;

- изучить динамику процессов ПОЛ у животных с АА под воздействием различных комбинаций МЭ. и сравнить с традиционными ан-тиревматичесними препаратами;

- установить.характер взаимосвязи между концентрацией МЭ в биожидкостях и биотканях и снижением тяжести патологии при воздействии соединений МЭ<;

- изучить динамику клинических и гистологических показателей при влиянии МЭ' и традиционных препаратов в сравнении;

- рассмотреть перспективы создания комбинаций нестероадных противовоспалительных препаратов /НПВП/ о МЗ о цельд разработки рекомендаций по применению микроэлементов в терапевтической практике артритов в зонах биогеохимических провинций с аномальным содержанием в биосфере соединений изучаемых элементов.

Научная новизна работы. Получены новые экспериментальные факты, отражающие особенности участия /43 цинка, меди и селена в коррекции патологического процесса при артрите.

Впервые в эксперименте показано, что комбинация солей цинка меди и селена по эффективности соответствует противовоспалительному действию одному из основных НПВП, применяемых при РА-вольтаре-

ну. Результаты проведенного исследования позволяют подойти с но-» вых позиций к пониманию патогенеза, определяемого иммунными процессами через взаимосвязь с системой цитохрома Р-450 печени у ' экспериментальных животных с АА. Впервые установлено, что комбинация солей микроэлементов не только является индуктором системы, цитохром Р-450 печени, но и соответственно влияет на важнейший зтап в иммунологических реакциях - распознование антигенных детерминант, т.к. этот процесс базируется на способности мембранных белков типа цитохром Р-450 связывать химические соединения.

Впервые выявлена достоверная корреляционная, зависимость между интенсивностью процессов П01 на мембранах лейкоцитов крови и тяжестьц проявления адыовантной болезни под воздействием исследованных комбинаций № и их комплекса с НПВП /вольтареном/, комбинация №. проявила мощные антиоксидантные свойства.

Впервые выявлена достоверная корреляционная зависимость между интенсивностью и распространенностью РА и содержанием изучаемых ЦЭ, в ¿кружащей среде в отдельных биогеохимических провинциях. Это является весьма важным теоретическим исследованием для научного подхода поиска комплексных соединений стандартных препаратов в сочетании с Ю с целью оптимизации тепарии тяжелых: больных, данных регионов.

Оригинальным является исследование комплексного влияния на металло-лигаадный гомеостаз ДШГ/, интенсивность коррегируЕ: -щей способности микроэлементов по отношению к клиническим проявлениям адыовантного артрита.

Таким образом теоретически и экспериментально изучены молекулярные механизмы фармакологического действия солей НЪ цинка, меди и селена и их двойных и тройной комбинации на модели АА.

Практическая значимость.1. Проведенные иссле-

дования прзволяют прогнозировать поиск новых лекарственных препаратов, эффективных при лечении и профилактике адьювантного артрита. 3. Полученные данные расширяют и уточняют существующие представления об этиялогии и патогенезе адьювантного артрита и дают основания для разработки новых подходов к диагностике, медикаментозному и диетологическому лечению и профилактике ревматоидных больных.

Основные положения, выносимые на защиту:

- концепция микроялементного лечения адьювантного артрита является эффективным направлением поиска новых лекарственных средств для патогенетической терапии, артритов;

-для лечения больных, живущих в биогеохимических провинциях обедненных медью, цинком и селеном целесообразно рекомендовать применение комплексов НПВП/типа вольтарена/ с № щщком, медью и селеном в определенных концентрациях;

- к механизму фармакологического действия микроэлементов на патогенез адыовантной болезни представляется возможным отнести способность цитохром Р-450 зависимой микросомальной монооксигеназной системы печени активизироваться под воздействием М5 . Не исключено, ч то изученные комбинации могут оказывать такой эффект за счет избирательной индукции изоформы цитохрома Р-450, окисляющей анилин и другие определенные субстраты и протективного действия в отношении канцерогенного и гепатотоксического эффекта безно/а/пи-рена /БП/ и других веществ, которые, в процессе биотрансформации

на цитохром Р-450 превращаются в высокореакционноспосойные промежуточные метаболиты, ковалентно связывающиеся с нуклеиновыми кислотами ибелхами;

- влияние микроэлементов на интенсивность процессов ПОЛ посредством снижения показатель ПИХЛ^ ис, вычисляемого через содержание ГАФКЛб и ГАФКЛс в лейкоцитах крови и ЩИ плазмы, являете

важным звеном в иммунохикическом гомеостазе при адьювантном артрите и влияя на активизированные макрофаги и гранулоциты, НЭ предотвращают выработку огромного количества высокоактивных метаболитов кислорода, и шем самым способствуют стабилизации мембраны клеток;

- стабилизация MIT достигается, по-видимому, путем способности Ю. вступать во взаимосвязь с эндогенными лигаднами и т.о. нейтрализовывать их повышенную активность; ://Э влияют на костный и коллагеновый метаболизм, предотвращая повышенную выработку эндогенных энзимов - коллагеназы и протеиназы, ведущих к деструкции суставов;

- количественное содержание в крови микроэлементов цинка, меди и селена может сдать дополнительным критерием для диагностики и клинического контроля РА.

Апг.обамя работы. Результаты работы представлены на 4 Всесоюзной конференции "Биоантиоксидант" Досква 1992/; на первом Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" /Москва 1992/; на Российской научной конференции "Создание лекарственных средств" Д'осква 1992/; в законченном виде работа апробирована на совместной научной конференции кафедры фармакологии фармацевтического факультета и кафедры фармакологии и фармакогнозии ФУП Московской Медицинской академии им. И.М.Сеченова /1992/.

Публикации.Основное содержание работы изложено в 4 публикациях.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 188 страницах машинописного текста и состоит из. введения, обзора литературы, 4 глав собственного исследования с обсуждением результатов, выводов и библиографического указателя, включающего 255

источников отечественных и 55 источников зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 33 рисунками, 12 таблицами, 10 фотографиями и одной картой.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

■Эксперименты выполнены на 660 белых нелинейных крысах-сам-цас с исходной массой 180-200 г а на 300 белых нелинейных мышах-самцах с исходной массой 20-22 г.

Для максимального удешевления исследований испытания на нелинейных крысах на модели адьювантного артрита. АА вызывали путем введения полного адьюванта Фрейвда- в подушечки задних конечностей. в дозе 0,05-0,1 мл, содержащей туберкулезные палочки в концентрации 3 мг/мл по методике Т.И.Ивановой однократно.

Экспериментальные исследования проведены с применением следующих методик:"

1. Развитие отека в динамике контролировали при помощи " 7150 Р£&Щзтоте&г-" Що ЬаИВ ЫоРод1сай ¿ешск аррь^из

на 0,3,9,14,28 день после введения адьюванта Фрейнда и по массе отечных лапок на тех же сроках. Результаты сравнивали с двуня контролями: 1- интактный, 2 - адьювантная болезнь бег, лечения и с исходными объемами каждой особи.

2. В течение всего эксперимента контрольными клиническими параметрами считали СОЭ, количество лейкоцитов и эритроцитов, которые определили в цельной крови микрометодоы в модификации Панченкова /СОЭ/ и определением количества лейкоцитов и эритроцитов подсчетом в счетной камере Горяева.

3. Активность цитохром Р-450 зависимой монооксигеназной мик-росомальной системы печени крыс измеряли через сутки полсе последнего введения испытуемых веществ. Животных забивали декапитацг

извлекали печень методом дифференциального центрифугирования, выделяли микросомальную фракцию. В ней определяли количество белка по методу Лоури. При построении калибровочной кривой был использован бычий сывороточный альбумин. Спектрофотометрическим методом с использованием прибора "Хитачи 556" определяли содержание цитохрома Р-450 и в§ в микросомальной фракции печени.

Скорость окисления /п-гидроксилирбвания/ анилина-в микросомах в присутствии НАДФН определяли спектрофотометрически по количеству образовавшегося п-аминофенола. Скорость окисления бенозо /а/пирена в микросомах печени определяли по интенсивности флуорес-цееттаи образующегося З-окси-бензо/а/пирена на флуориметре "Вси^с/

Яоуа"

Скорость гидроксилирования анилина и БП в микросомах выражали в нмоль метаболитов на 1 мг белка микросом в 1 мин.

Работу по определению активности цитохромов Р-450 проводили на базе лаборатории фундаментальных проблем иммунофармакологии под руководством профессора И.Е.Ковалева.

4. Количественное содержание микроэлементов в органах определяли у контрольных и леченых животных на 0,3,14,28 день посла введения адьюванта Фрейнда по следующей схеме:

а/ Подготовка образцов-органов/почки, печень, суставы,кровь/: у декапитированных крыс путем паталого-анатомического вскрытия ввделяли исследуемые органы и взвешивали. Затем высушивали/в фарфоровых чашечках/ в вакуумном сушильном аппарате -200 /Польша/ при температура,равной 60°С и отрицательном давлении 0,08 МПа в течении 6 часов. Поел® высушивания вновь взвешивали и измельчали в агатовой ступке до мелкого порошка, а затем проводили

высушивание до постоянного веса /0,002/ при тех же условиях.

б/ Минерализация: 0,25 /точная навеска/ высушенного порошка помещали в колбы Кильдаля объемом 50 см и проводили минерализацию смесью концентрированных кислот? азотно-хлорная в соотношении 6:1. После завершения минерализации полученный раствор коли-

q

чественно переносили в медную колбу объемом 10 см и доводили до метки HgO дистилированной.

в/ Атомно-абсорбционное определение содержания цинка и меди в органах: содержание цинка и меди в полученных растворах устанавливали с помощью атомно-абсорбционной спектрофотометрии /ААС/ с помощью № -30 в плазменном режиме. Использовали систему газов воздух-ацетилен. Условия определения цинка: длина волна - 213,9 нм; ширина щели - 0,2 ны, пламя стехиометричное; для меди: длина волны - 324,8 нм, ширина щели - 0,2 нм; пламя стехиометричное. Полученные результаты на содержание высушенного органа не расчитывали. Исследования проводили на базе лаборатории ргследоазниа ¿¡ещ+сЛепны" препаратсьъсырья м щев*зние. МЭ- под руководством С.А.Листова.

Исследования, связанные с определением селена проводили на базе ГИРедМет как ААС, так и флюореметрическим методом.

5. Скрининг веществ на антиоксидантную активность проводили по двум интегральным показателям состояния процессов ПОЛ иАОС организма - содержанию ВДА в крови с 3,9,14 дневным адьювантным артритом и количественному содержанию Р/ЙКЛ б и ГАФКЛ с крови на тех же сроках. Количество малонового диальдегида определяли по его реакции с ту.обарбитуровой кислотой. Для определения генерации АФК иввделяли общую лейкомассу /гранулоциты, моно- и лимфоциты/

в 1 ым3. К 0,75 мл лейкомассы, добавляли 0,25 мл насыщенного изоосмолярного раствора водного лшинола рН-7,35; смесь выдерживали 30 с в темновой камере хемилгаминометра типа радиометра ?Еоботрон 220 46" /ГДР/, адаптированного .для измерения хемилюми-}-несценции. Измеряли максимальную XI в импульсах в 1 с до выхода

на плато /за вычетом свечения плазмы/ и расчитывали ХДК генерал

ции АШК на стацдартное чипдю лейкоцитов /10 / по формуле:

тттгутг мах ХЛ лейкомассы/в имп/с/х 10 лей-__г.

/б, число грануло- и моноцитов в 1 мм лейкомассы V /лейком/мм0

Исследования активности ПОЛ проводили на базе патологической

физиологии кафедры ММА им. И.М.Сеченова под руководством акаде-

микаРАЕН А.Х.Когана.

6. Для выявления динамики изменения морфоструктур органов и возможности их сравнения с нормально функционирующими органами морфометрические наблюдения проводили на 3,9,14,28 день адьюван-тной болезни. У забитых декапитированием животных брали кусочки внутренних органов и суставы задних конечностей. Материал фиксировали в формалине 10$, кусочки подвергали парафиновой заливке, применялись окраски срезов гематоксилин-эозин, пикрофуксин.

Изучение гистоморфологической структуры органов, наиболее часто подвергающихся патологическим изменениям при системных кол-лагенозах/ сердце, печень, почки, суставы/, проводили на базе кафедры патологической анатомии ММА им. И.М.Сеченова под руководством профессора И.М.Кодоловой.

7.Для обработки результатов исследований иепользовали стандартный пакет программ „ ¿Н^НЯЦС- 92$-рЯ1с" и ^тЖЯсЬ

, использовались методы Вилконсона-Мална-Уитни. Точный метод Фишера и критерий Стъйдента для оценки достоверности.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ 0БСУЖ2 Ж Е Н И Е

1. Сравнение противовоспалительной активности исследуемых комбинаций иикроэлементов и традиционных НПВС.

Исследовалась динамика клинических и морфометрических характеристик животных, подвергавшихся воздействию цинка в форме сульфата, меди в форме сульфата и селена в форме селенита натрия в концентрациях ЭОмкг/кг, 30 мкг/кг и 16,-8 мкг/кг соответственно.

М вводились самостоятельно, в двойных и тройной комбинации в течение 11 дней перорально. В качестве препарата сравнения вводили в те же сроки в терапевтической дозе 8 мг/кг вольтарен перорально и внутримышечно. Кроме того исследовался комплекс воль-тарена с тройной комбинацией цинка, меди и селена.

Для исследования аятиэкссудативной активности измеряли объем отечных лапок в динамике на 0, 3, 14, 9, 28 день заболевания; массу отечных конечностей и массу тела в те же сроки/ схема 1/. Обращает на себя внимание эффективное зротивовоспалительное влияние тройной комбинации микроэлементов, которая работает на уровне вольтарена в плане снижения объема и массы лапок. Достоверно отличаются от нелеченого контроля результаты полученные при воздействии меди, двойной комбинации меди и селена и комплекса вольтарена с тройной комбинацией цинка, меди и селена.

Из клинических показателей крови определялись СОЭ, количество лейкоцитов, эритроцитов и гемоглобин. Наиболее информативным тестом оказался показатель СОЭ /схема 2/. Данный показатель практически нормализуется и приближается к интактному контролю при воздействии на животных вольтареном, комплексом вольтарена и тройной комбинации меди, цинка и селена, тройной комбинацией м/э и

до

Масса отечных лапок на /4м день ьа5опе5ания

2.0

1.0

£

ГЪ

а; р •

-й-

.Р: с

-аг-

га

сх,

а

го

с

г *

«г

а*

"Ъ р

И) с % +

ч-

Си &

а а:

Схема 1

мм/г 20,0

СОЭ

на

день ъайоле Ьанил

{5,0

цо $0

-С с:

ЛЕЕ

Схема 2

Тела жиВотнык на Ми-день ъйдолеВания

150

100

■С:

3 о

1Г

5:

о-

оп

I

го

§ •I-

о п> 3 ч-

г ми -З-э-

в

5:5

Схема 3

о

двойной комбинации меди и селена.

Что касается массы тела животных, то при развитии адьюван-тного артрита она прогрессирующе снижается и у нелеченого контроля достигает 90-100 г при начальном весе 180-200 г. Животные, леченые вольтареноы практически не отличаются, от больного контроля по этому параметру. При введении тройной комбинации масса близка к интактному контролю и достоверно отличается от нелеченой группы/ схема 3/.

Исследуя динамику морфометрических характеристик животных под влиянием микроэлементов и их двойных и тройной комбинации были получены результаты, подтверждающие позитивное влияние тройной комбинации мэди, цинка и селена и двойной комбинации селена и меди при введении с третьего дня заболевания. Патологических изменений во внутренних органах в данных группах не наблюдалось. Отмечалось снижение воспаления и нежный фиб-£оз паннуса. В контрольной нелеченой группе наблюдается пролиферация синовиоцитов, слущивание их в просвет сустава, разрастание паннуса и ворсинок в полости сустава, а к 14-16 дню выделялся характерный остеомиелит, наблюдалось рассасывание кости остеокластами, скопление лейкоцитов в костно-мозговых полостях. При лечение вольтареном заметно врастание паннуса с ворсинами в хрящ, но наблюдается стихание воспаления, нежный фиброз.

Т.о. объединяя результаты, полученные при исследовании клинических и морфометрических показателей,, можно выделить лидирующий комплекс, снимающий острое воспаление и проявивший антиэкссудативную активность - тройную комбинацию меди,цинка и селена.

2. Изучение влияния микроэлементов меди, пинка и селена и их комбинаций на систему цитохтом Р-450 зависимую печени.

Проведенные эксперименты позволили установить, что медь, цинк и селени и их комбинации оказывают выраженное влияние на цитохром Р-450 в микросомах печени крыс и мышей и гексеналовый сон/продолжительность/.

Медь и селен несколько укорачивают продолжительность гексе-налового сна, т.е. по-видимому индуцируют активность цитохрома Р-450.

Цинк, напротив, удлиняет продолжительность гексеналового сна на 60$ по сравнению с контролем. Т.о. в составе комплексов есть два элемента / медь и селен/ с индуцирующей активностью и один элемент с ингибирукхцей активностью /табл.1/. Однако через 8 дней после прекращения инъекции указанных выше веществ и их комбинаций наблюдалась повышенная функциональная активность цитохрома Р-450, сдвиг, вызываемый цинком к этому времени полностью нормализовывался.

Серия других экспериментов позволила установить выраженное влияние изучаемых м/э непосредственно на цитохром Р-450 в микросомах печени крыс. Так, после введения микроэлементов содержание цитохрома Р-450 и особенно значительно увеличивалась при воздействии тройной комбинации меди, цинка и селена, при этом в два раза возрастала цитохром Р-450 зависимая ферментативная активность, определяемая путем измерения скорости ддилинового окисления, т.е. окисления субстратов Н типа. Однако метаболизм субстрата 1 тлпа БП при этом не увеличивался. В срязи с эт^м следует отметить, что тип 1 спектральных изменений возникает при взаимодействии гидрофобной части молекулы субстрата с низкоспинновым железом гемопро-теида с переходом его в высокоспиновую форму. Тип Я возникает в результате взаимодействия аминогруппы субстрата с железом гема,

находящимся как в внсокоспиновом состоянии, так и в низкоспиновом. В настоящем исследовании именно поэтому была изучена монооксиге-назная активность цитохрома Р-450 в отношении известных субстратов 1 и П типов. Фйкт существенного повышения скорости окисления Ш после введения животным микроэлеметнов весьма интересен и может иметь практическое значение. По-видимому в результате того, что комплекс трех м/э состоит из противоположнодействутацих веществ, вызывает несколько меньший по своей выраженности эффект/схема /.

Всает вопрос, каков может быть механизм ивдукции анилингид-роксилазы в микросомах печени под действием м/э? Возможно, что это обусловлено избирательной индукцией изоформы цитохрома Р-450, окисляющей анилин и другие определенные субстраты; в пользу этого может говорить некоторое увеличение содержания цитохрома Р-450 в микросомах.

Установленный факт индукции цитохрома Р-450 дает веские основания для Предположения позитивного влияния данной комбинации не только на симптомы воспаления, но и на патологические процессы, сопровождающие его. На основании выявленного эффекта не исключено создание принципиально новых средств терапии указанного патологического состояния, так рак показана также зависимость развития полиартрита и аллергической реакции от функционального состояния системы цитохрома Р-450 печени.

Исследование комбинированного применения селена,меди и цинка с вольтареном показало, что эффект усиления аяилингидроксилазной активности цитохрома Р-450 сохраняется близким к таковому при применениии одних микроэлементов, однако общее содержание цитохрома Р-450 в расчете на 1 мг белка макросом снижается. ЕП-гидрокси-лазная активность при указанном комбинированном воздействии не отличается от контроля.

Под воздействием отдельного препарата вбльтарена в терапев-

тических дозах в течение 11 дней отмечено снижение концентрации цитохромов Р-450 и в^, наблюдалось также ослабление анилингидро-ксилазной.активности; скорость окисления субстрата 1 типа в этом случае незначительно снижалась по сравнению с контролем и была достоверно выше скорость окисления Ш при воздействии тройной комбинации микроэлементов в данном микроэлементе. Т.о. вольтарен оказывает ингибиругащее действие на систему цитохром Р-450 зависимую микросомальную монооксигеназную печени/табл 2/.

Таблица 1

ВЛИЯНИЕ ЦИНКА,МЕДИ, СЕЛЕНА НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ЦИ-цитохрома Р-450 ПЕЧЕНИ МЫШЕЙ С57В /6 ВЕСОМ 20-22Г

Препарат

Доза

: Продолжительность гекоеналового наркоза : 12-йдень после на- ;18-й день после нача-

: чала инъекций

мин

ла инъекций мин : %

селен 8мкг/кг 15,ШД 65,4 15,4^8 70,9

медь 30 мкг/кг 18,7г2,4 80,9 19,4+2,4 89,4 цинк 90 мкг/кг 37,0±3,8 160,2 17,2^2,2 79,3

Таблица 1

ПОКАЗАТЕЛИ АКТИВНОСТИ СИСТЕМЫ ЦИТОХРОМА Р-450 МИКРОСОМАЛЬ-НОЙ ФРАКЦИИ ПЕЧЕНИ КРЫС ЧЕРЕЗ 24 ЧАСА ПОСЛЕ ОКОНЧАНИЯ ВВЕДЕНИЯ КОМБИНАЦИЙ

Тест :Контроль: Вольтарен : Вольтарен, : медь,цинк _:_|_; щ^дЦинк, ; селен

Цитохром Р-450

нмоль на 1мг белка 0,82^0,1 0,57*0,006 0,58*0,06 1,14*0,11 шоль^на 1^мг белка 0,67-^0,09 0,46*0,08 0,67-^0,09 0,8610,1

шГнТКшй1-0910'09 1'73±0'12

'Й^Ем^й 0,54*0,07 0,57±0,07 0,59±0,04 0,40*0,07 белка в 1 мин.

£ i

ннт/нг

г1-

I

а. ^ ' ' " с лП\еат

1 - ¿ентРОАЬ • 2- Шьтарен ; 3 - ШшаРем, Си, То, -У- Си,2л,Яе. : а- ци/похром Р~У50 • в-цитохррм6Г/ <2 - aнwцurucrPc¿cшa5aJ

Кроме того, в данной работе было исследовано влияние на систему цитохрома Р-450 печени хронического введения комбинации циклофосфан, вольтарен и продигиазан, применяющейся в практике для лечения артритов. Отменчено снижение содержания цитохромов Р-450 и Вд аналогичное тому, которое наблюдалось при введении вольтарена, а достоверного усиления анилингидроксилазной активности не наблвдалось.

Т.О. комплекс микроэлементов селена, меди и цинка при длительном введении крысам вызывает индукцию цитохром Р-450 зависимой. монооксигеназной микросомальной: системы печени, вольтарен при комбинированном применении с указанными микроэлементами снижает ицдуцирущую активность последних.

3. Изучение действия микроэлементов и их комбинаций на НОЛ.

Для определения активности процессов ПОЛ нами определялось в плазме крови количество продукта пероксидации липидов ВДА и для контроля за активацией фагоцитарной системы, которая сопровож-жает все воспалительные заболевания определилась генерация активных форм кислорода /ГАФКЛ/.

В результате эксперимента бшш получены следующие данные:

1. В процессе развития патологии повреждение липидного слоя мембран увеличивается, что выражается в увеличении количественного содержания ВДА;

2. Среди леченых крупп результаты разделились на группы: с минимальным/1/ и средним^/ уровнем ВДА./таблица 3/.

К первой группе можно отнести результаты, полученные при обработке плазмы животных на 14 день заболевания, подвергнутых воздействию соединений цинка, меди отдельно, вольтарена и тройной комбинации, где уровень ВДА был близок к интактрому контролю. Ко 2 группе отнесены результаты, полученные при введении селенита нат-рря, двойной комбинации соединений меди и селена, тройной комбинации. соединений меди,цинка,селена и самостоятельно вольтарена,.

Если сравнивать результаты с нелеченым контролем, то ввдна явная позитивная тенденция в плане снижения разрушительного процесса липидного слоя мембран и,видимо, активация антиоксвдантной системы организма, т.к. все элементы являются составными частями известных энзимов С0Д,ГП,КТ, активно участвующих в обезвреживании и инактивации продуктов перокшдации липидов.

3. У контрольных нелеченых животных к последнему дню эксперимента отмечается бысокий ПИХЯб и ПИХЛс параллельно с относительно высоким ВДА/ ПиХЛ вычисляется через содержание ГФФКЛ/.

4. В процессе лечения различными веществами показатели ШШ16 и ПИХЛс ниже чем у нелеченого контроля, при этом их можно расположить в следующем убывающем пордцке: вольтарен-селен-вольтарен и тройная комбинацияв комплексе-ыедьи селен- цинк-тройная комбинация.

Если рассматривать корреляционные отношения меаду клиническими показателями и данными, характеризующими ПОЛ, можно отметить что максимальное снижение отека соответствует невысокому содержанию МДА /но не минимальному/ и малому уровню ПИХЛб, но не минимальному.

Таблица 3

Группа

Содержание МДА на 14 день

Содержание ВДА на 28 день

: ЕОП % • ЕОП %

Интактнке 0,178*0,008 0 0,172^0,008 0

АБ/без лечения 0,423-'0,001 100 0,451*0,015 100

медь 0,169*0,014 3,7 0,24210,013 25

цинк 0,151*0,03 11 0,240*0', 02 24,4

селен 0,207*0,03 11,8 0,220*0,03 17,2

медь,селен 0,214*0,02 14,7 0,202*0,03 10,8

вольтарен, медь, цинк, селен 0,123±0,001 22,4 0,178*0,01 2,2

вольтарен 0,164-10,001 5,71 0,325* 0,009 54,

4. Изучение Функциональной', взаимосвязи между патологические процессом и концентрацией м/э в биотканях животных и способность меди, пинка, селена и их комбинаций влиять на МЛГ.

Проведенные эксперименты позволяют говорить о значительном и быстром количественном изменении уровня микроэлементов в биожидкостях и биотканях животных, больных АА. Сдвиги данных уровней в цельной крови наблюдаются раньше,чем явнна клинические проявления артрита.

Метаболизм микроэлементов видимо подвергается изменению за счет индукции выработки эндогенных лигандов, которые способствуют физиологической реакции организма на нарушение МЛГ с последующим компенсаторным перераспределением м/э между органами и тканями.

Уровень цинка в течение развития АА достоверно уменьшается в плазме и одновременно на тех же сроках и в тех же количествах увеличивается в печени. Концентрация этого элемента увеличивается в суставах.

Что касается меди, то наши исследования подтвердили общеизвестный факт, что при заболеваниях воспалительного характера уровень

меди в сыворотке резко увеличивается, причем изменения концентрации' элемента происходят одновременно со смещением биохимических параметров воспаления, т,аких как фибриноген и церулоплазмин сыворотки крови. Уровень меди в шторотке резко увеличивается в процессе течения артрита, но в более поздний срок. Изменяется также количественное содержание этого элемента в сторону увеличвния в в суставах, хотя и не так значительно как' в плазме.

Концентрация селена, хотя и не столь выражено, как медная но имеет тенденции к уменьшению в плазме с одновременным увеличением его содержания его в суставах и небольшого прироста до 7-го дня после введения адьюванта Шрейцда в печени с последующим снижением уровня селена в данной биоткани. Явное снижение уровня селена в плазме и печени происходит на 19-26 день болезни.

Количественное содержание меди, цинка и селена в печени, кро-

ВЫВОДЫ

Проведенные эксперименты позволили установить, что двойные и тройная комбинации м/э цинка, меди и селена оказывают влияние на такие важцыа звенья патогенеза как ?'"Т, цитохром Р-450 зависимую монооксигеназную микросомальнуга систему печени, процессы'

ПОЛ и активность АОС.

Парачлелйно с позитивными сдвигами в патогенезе достоверно

меняются измеряемые клинические параметры и морфологическая картина в просвете сустава. Особенно четко просматривается корреляционная зависимость показателей СОЗ и МДА, отечности задних конечностей и активности цитохрома Р-450 в микросомах печени.

Т.о. на основании проделанной работы, можно сделать следующие выводы:

1. Концепция микроэлементного лечения АА является эффективным направлением поиска новых лекарственных средств для патогенетической терапии артритов;.

2. Комбинация соединений цинка, меди и селена в определенных дозах проявила терапевтический эффект при лечении экспериментального артрита у крыс, и на основании этого можно предпологать положительный эффект при лечении РА данной комбинацией;

3. Для больных РА биогеохимических провинций, обедненных м/э недью, цинком и селеном представляется возможным рекомендовать •комбинированнное лечение с внутримышечным применением НПВП/воль-тарена/ и м/э меди, цинка л селена перрорально;

4. Медь, цинк и селен проявляют антиоксидантные свойства, видимо за счет вхождения в структуру ферментов антиокислительной системы и активации ее. Возможно м/э ингибирухще влияют также на макрофаги и гранулоциты, которые активизированы при РА и способствуют выделению повышенного количества свободно-радикального-

кислорода.

5. Представляется возможным использовать меди сульфат и селенит натрия в качестве индукторов цитохрома Р-450 зависимой, моно-оксигеназной системы печени, ингибщованной при РА.

6. Перераспределение микроэлементов между органами больных, животных носит закономерный характер и уровень их в плазме /сильное увеличение меди, уменьшение цинка и селена/ может служить дополнительным критерием диагностики и клинического контроля за течением заболевания.

7. Стабилизация МЛГ достигается, по-видимому, путем способности микроэлементов вступать во взаимосвязь с эндогенными ли-гавдами и таким образом нейтрализовывать их повышенную активность; микроэлементы влияют на костный и коллагеновый метаболизм, предотвращая повышенную выработку энзимов, ведущих к деструкции сустава — коллагеназы и протеиназы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гильдеева Г.Н., Ряженов В.В. Влияние цинка сульфата на течение экспериментального ревматоидного артрита// ПРНК: Человек и лекарство. - М.-1992.-С.342.

2. Гильдеева Г.Н., Ряженов В.В. Влияние антиоксиданта селенита натрия на течение эксперимезтавнного ревматоидного артрита// 4 конференция: Биоантиоксидант.-М.-1992.

3. Ряженов В.В. .Гильдеева Г.Н. Влияние соединений цинка, меди, селена на течение адьговантного артрита//РНК: Создание лекар--ственных средств. - М. - 1992. -с.160.

4. Гильдеева Г.Н., Ряженов В.^.ОВлиянии микроэлементов на течение экспериментального ^ревматоидного артрита/Дйилейная конференция иркутского медицинского института. Тезисы. - Иркутск,1992.