Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Влияние микроэлементов цинка, меди и селена на течение экспериментального артрита

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ МЕДИЦИНСКИЙ СТОМАТОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ им. Н. А. СЕМАШКО

На правах рукописи

ГИЛЬЦЕЕВА Гелия Нязыфовна

ВЛИЯНИЕ МИКРОЭЛЕМЕНТОВ ЦИНКА, ЩПЦ И СЕЛЕНА НА ТЕЧЕНИЕ ЭКСПЕИШЕНТАЛЫОГО АРТРИТА

14.00.25. - фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1993

//* )

О- ч V .

Работа выполнена на кафедре фармакологии и фармакогнозии ФУП Московской ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени медицинской академии им. И.М.Сеченова.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор В.В.Ряженов

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор И.Е.Ковалев доктор медицинских наук, профессор Е.Г.Изшов

Ведущая организация: Московский ордена Ленина Государственный медицинский университет им. Н.И.Пирогова.

Защита состоится "_"_1993 г. в_

часов на заседании специализированного Совета Д 084.08.01 при Московском ордена Трудового Красного Знамени медицинском стоматологическом институте им. Н.А.Семашко /Москва, 103473, ул. Каляевская, 18, строение 4/.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института по адресу: г. Москва, ул.Вучетича, д. 9-а.

Автореферат разослан "_"_1993 г.

Ученый секретарь специализированного Совета доктор медицинских наук,

профессор Л.Л.Кириченко

ОЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из важнейших проблем здравоохранения яйляется разработка и внодрапио новых сффективяых мато-дов профилактики и лечения наиболее распространенных заболеваний.

Одной из острых медицинских и социальных проблем является частота поражения, суставов иммунного и другого происхождения. По данным ВОЗ больные этими заболеваниями составляют до всех лиц, обращающихся в медицинские учрэддения; 1/3.случаев физической нетрудоспособности обусловлена данной патологией.

Несмотря на достигнутые в последние годы успехи в диагностике, профилактике и лечении одного из них ревматоидного артрита /РА/, интерес к изысканию новых средств для терапии такого рода заболеваний сохраняется. Это объясняется прежде всего тем, что применяемые лекарстенкые средства при длительном использовании, обладают многими видами отрицательного действия на организм человека, влияя, на гормональный фон, утнэтаще действуя на систему кроветворения, проявляя ульцероганные свойства и т.д./ A.A. Крель, 1983; В.А.Насонова 1987, 1989; Х.Л.Ф.Kappet 1990/.

Значимость этой проблемы требует поиска новых фармакологически активных веществ. В последние'годы повысился интерес к использованию известных эосенциальных микроэлементов /А?Э</ в лечебной практике /М.А.Азизов 1970; Г.А.Бабенко и др. 1971; А.И.Венчиков 1978, 1982; Е.С.Крисс и др. 1986/, т.к. Mä входят в состав многих ферментов и чрезвычайно важны для нормального течения различных форм метаболизма /А.П.Авцын и др. 1990.1991; Ф.Ф. Боечко 1974;В.И.Борюцко 1987; ЗНьмвел^&Ъ Q. 1980; SÜO^oid 1986; Оотрве^Л-Д® 1984/. Публикаций по применению в клинической практике РА единичны.

Кроме того, отдельные стороны патогенеза РА изучены недоста-

точно. Обобенно это касается дамунохиыического гомеостаза и минерального обмена: поведения цатохроы Р-450 зависимой микросо-мальной монооксигеназной системы печени, процессов перекионого окисления липвдов /П0.1/ и обмена мшсроялементов. Общепризнано, что ведущее место в патогенезе РА занимают иммунные нарушения. Однако при рассмотрении проблем патологии соединительной ткани возможность повреждения ее свободными радикалами /СР/, как правило не принималась во внимание, хода известно, что радикалы кислорода вызывают нарушение структуры ДНК, гиалуроновой кислоты, деструкцию эндотелиальных клеток, повышение сосудистой проницаемости. СР принимают активное участие в фагоцитозе, в метаболизме арахидоновай кислоты, синтезе простагландинов и аутоишдуниза-ции / К.Н. Агишева 1988; А.М.Герасимов 1980; Р.Н.Микунас и др. 1989/ Кроме того при РА было отмечено угнетение такой важной системы в организме как цитохром Р-450/ Ковалев И.Е. и др. 1983/. С нашей точки зрения, "привлекательность" использования микроэлементов в качестве фармакологически активных веществ прежде всего в том, что их малые нетокзичные дозы способны влиять на патологический процесс, участвуя и вызывая увеличение интенсивности обменных процессов и защитной реакции организма. Здесь же можно отметить и простоту изготовления, деишвизну, что делает весьма доступными изучаемые объекты для всякого рода опытов и наблюдений с ниш.

Для оценки эффективности различных противоревматических средств с успехом используется модель адыовантного артрита, т.к. адьпвантная болезнь - одна из наиболее адекватных моделей заболеваний с системным поракением соединительной ткани и иммуннши нарушениями / А.С.Саратиков и др. 1983; Г.Н.Липкин 1974; У&сиьебЦсг. к. 1989/.

В этой связи, целью нашей работы является направленный поиск и исследование новых комбинаций ИЗ на основе их сочетанного

действия, а именно:

- комбинаций для профилактики и лечения адьювантного артрита.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи;

- провести скрининговый поиск эффективной комбинации микроэлементов на модели адьювантного артрята/АА/;

- определить направленным поиском -зону терапевтического действия каждого Ю ;

- выявить закономерную взаимосвязь между состоянием системы цнтохром Р-450 печени и прогрессивным /регрессивным/ течением адьювантной болезни под влиянием комбинаций микроэлементов и общеизвестных препаратов, ведущих к благоприятным исходам;

- изучить динамику процессов ЖШ у- животных с АА под воздействием различных комбинаций Ю. и сравнить с традиционными антиревматическими препаратами;

- установить.характер взаимосвязи между концентрацией МЭ в биожидкостях и биотканях и снижением тяжести патологии при воздействии соединений

- изучить динамику клинических л гистологических показателей при влиянии МЭ- и традиционных препаратов в сравнении;

- рассмотреть перспективы создания комбинаций нестероидных противовоспалительных препаратов /ШШП/ с Ю с цельд разработка рекомендаций по применению микроэлементов в терапевтической практике артритов в зонах биогеохимичесюх провинций с аномальным содержанием в биосфере соединений изучаемых элементов.

Научная новизна саботы. Получены новые экспериментальные факты, отражающие особенности участия МЭ цинка, меди и селена в коррекции патологического процесса при артрите.

Впервые в эксперименте показано, -что комбинация солей цинка меди и селена по эффективности соответствует противовоспалительному действию одному из основных НПВП, применяемых при РА-вольтаре-

ну. Результаты проведенного исследования позволяют подойти с но^ вых позиций к пониманию патогенеза, определяемого иммунными процессами через взаимосвязь с системой цитохрома Р-450 печени у ' экспериментальных животных с АА. Впервые установлено, что комбинация солзй микроэлементов не только является ивдуктором системы, цитохром Р-450 печени, но и соответственно влияет на важнейший этап в иммунологических реакциях - распознованяе антигенных детерминант, т.к. этот процесс базируется на способности мембранных белков типа цитохром Р-450 связывать химические соединения»

Впервые выявлена достоверная корреляционная зависимость между интенсивностью процессов ПОЛ на мембранах лейкоцитов крови и тяжесть*? проявления адьювантной болезни под воздействием исследованных комбинаций Ю и их комплекса с НПВП /вольтареном/. комбинация Ю. проявила мощные антиоксидантные свойства.

Впервые выявлена достоверная корреляционная зависимость между интенсивностью и распространенностью РА и содержанием изучаемых /УЭ, в окружающей среде в отдельных биогеохимических провинциях. Это является весьма важным теоретическим исследованием для научного подхода поиска комплексных соединений стандартных препаратов в сочетании с 7/9 с целью оптимизации теларии тяжелык больных, данных регионов.

Оригинальным является исследование комплексного влияния на металло-лигандный гомеосгаз /МЛТ/, интенсивность коррегируг щей способности микроэлементов по отношению к клиническим проявлениям адыовангного артрита.

Таким образом теоретически и экспериментально изучены молекулярные механизмы фармакологического действия солей Н% цинка,

4»-

меди и селена и их двойных и тройной комбинации на модели. АА.

Практическая значимость.1. Проведенные исслв-

дования прзволяют прогнозировать поиск новых лекарственных препаратов, эффективных при лечении и профилактике адьювантного артрита. 3. Полученные данные расширяют и уточняют существующие представления об этиология и патогенезе адьювантного артрита и дают основания для разработки новых подходов к диагностике, медикаментозному и диетологическому лечению и про£илактике ревматоидных больных.

Основные положения, выносимые на защиту:

- концепция микроалементного лечения адьювантного артрита является эффективным направлением поиска новых лекарственных средств для патогенетической терапии артритов;

-для лечения больных, :швущих в биогеохимических провинциях обедненных медью, цинком и селеном целесообразно рекомендовать применение комплексов ШВП/типа вольтарена/ с .ЛЭ цинком, медью и селеном в определенных концентрациях;

- к механизму фармакологического действия микроэлементов на патогенез адыовантной болезни представляется возможным отнести способность цитохром Р-450 зависимой микросомальной монооксигеназной системы печени активизироваться под воздействием МЭ , Не исключено, ч то изученные комбинации могут оказывать такой эффект за счвт избирательной индукции изоформы цитохрома Р-450, окисляющей анилин и другие определенные субстраты и протективного действия в отношении канцерогенного и гепатотоксического эффекта безно/а/пи-рена /Бй/ и других веществ, которые в процессе биотрансформации

на цитохром Р-450 превращаются в высокореакционноспосойные промежуточные метаболиты, ковалентно связывающиеся с нуклеиновыми кислотами ч .белками;

- влияние микроэлементов на интенсивность процессов ПОЛ посредством снижения показатель ПИХЛЙ и0, вычисляемого через содержание ГАФКЛб и ГАФКЛс в лейкоцитах крови и ВД1 плазмы, являете*

важным звеном в иммунохикическом гомеостазе при адьювантном артрите и влияя на активизированные макрофаги и гранулоциты, НЭ ■ предотвращают выработку огромного количества высокоактивных метаболитов кислорода, и шем самым способствуют стабилизации мембраны клеток;

- стабилизация МЙГ достигается, по-видимому, путем способности //Э. вступать во взаимосвязь с эндогенными лигаднами и т.о. нейтрализовывать их повышенную активность; влияют на костный и коллагеновый метаболизм, предотвращая повышенную выработку эндогенных энзимов - коллагеназы и протеиназы, ведущих к деструкции суставов;

- количественное содержание в крови микроэлементов цинка, меди и селена может сдать дополнительным критерием для диагностики и клинического контроля РА.

Адг-обадия работы. Результаты работы представлены на 4 Всесоюзной конференции. "Био антиоксид ант" /Москва 1992/; на первом Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" /Москва 1992/; на Российской научной конференции "Создание лекарственных средств" /Москва 1992/; в законченном виде работа апробирована на совместной научной конференции кафедры фармакологии, фармацевтического факультета и кафедры фармакологии и фармакогнозии ФУП Московской Медицинской академии им. И.М.Сеченова /1992/.

Публикации.Основное содержание работы изложено в 4 публикациях.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 188 страницах машинописного текста и состоит из. введения, обзора литературы, 4 глав собственного исследования с обсуждением результатов, выводов и библиографического указателя, включающего 255

источников отечественных и 55 источников зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 33 рисунками, 12 таблицами, 10 фотографиями и одной картой.

МАГЕРИШ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

'Эксперименты выполнены на 660 белых нелинейных крысах-сам-дас с 'исходной массой 180-200 г и на 300 белых нелинейных мышах-самцах с исходной массой 20-22 г.

Для максимального удешевления исследований испытания на нелинейных крысах на модели адьювантного артрита. АА вызывали путем введения полного адыованта Фрейнда- в подушечки задних конечностей в дозе 0,05-0,1 мл, содержащей туберкулезные далочки в концентрации 3 мг/мл по методике Т.И.Ивановой однократно.

Экспериментальные исследования проведены с применением следующих методик:'

1. Развитие отека в динамике контролировали при помощи " 7150 ЫсРодЮаЕ. ¿е!еасР,

на 0,3,9,14,28 день после введения адьюванта Фрейнда и по массе отечных лапок на тех жэ сроках. Результаты сравнивали о двуня контролями: 1- ингактный, 2 - адыоваятная болезнь без, лечения и с исходными объемами каждой особи.

2. В течение всего эксперимента контрольными клиническими параметрами считали СОЭ, количество лейкоцитов и эритроцитов, которые определяли в цельной крови микромегодом в модификации Панченкова /СОЭ/ а определением количества лейкоцитов и эритроцитов подсчетом в счетной камере Горяева.

3. Активность цигохром Р-450 зависимой монооксигеназной мик-росомальной системы печена крыс измеряли через сутки полсе последнего введения испытуемых веществ. Животных забивали декадитаццги^

извлекали печень методом дифференциального центрифугирования, выделяли микросомальную фракцию. В ней определяли количество белка по методу Лоури. При построении калибровочной кривой был использован бычий сывороточный альбумин. Спектрофотометрическим методом с использованием прибора "Хитачи 556" определяли содержание цитохрома Р-450 и в5 в млкросомальной фракции печени.

Скорость окисления /п-гидроксилирования/ анилина-в микросомах в присутствии НАДФН определяли спектрофотомегрически по количеству образовавшегося п-аманофенола. Скорость окисления бенозо-/а/пирена в микросомах печени определяли по интенсивности флуоресценции образующегося 3-окси-бензо/а/пирена на фдуориметрэ "Ь(цгс1

Поуа''

Скорость гидроксилирования анилина и БП в микросомах выражали в нмоль метаболитов на 1 мг белка микросом в 1 мин.

Работу по определению активности цитохромоа Р-450 проводили на базе лаборатории фундаментальных проблем иммунофармакологаи под руководством профессора И.Е.Ковалева.

4. Количественное содержание микроэлементов в органах определяли у контрольных и леченых животных на 0,3,14,28 день посла введения адыованта Фрейвда по следующей схеме:

а/ Подготовка образцов-органов/почки, печень, суставы,кровь/: у декадитироваяных крыс путем паталого-анатомического вскрытия ввделшш исследуемые органы и взвешивали. Затем высушивали/в фарфоровых чашечках/ в вакуумном сушильном аппарате -200 /Польша/ при температура,равной 60°С и .отрицательном давлении 0,08 Ша в течении 6 часов. Поел® высушивания вновь взвешивали и измельчали в агатовой ступке до мелкого порошка, а затем проводили

высушивание до постоянного веса /0,002/ при тех же условиях.

б/ Минерализация: 0,25 /точная навеска/ высушенного порошка

о

помещали в колбы Кильдаля объемом 50 см и проводили минерализацию смесью концентрированных кислот* азотно-хлорная в соотношении 6:1. После завершения минерализации получении! раствор коли-

з

чественно переносили в медную колбу объемом 10 см и доводили до метки 1^0 дистилированной.

в/ Атомно-абсорбционное определение содержания цинка и меди в органах: содержание цинка и меди в полученных растворах устанавливали с помощью атомно-абсорбциояной спектрофотометрии /ААС/ с помощью ^-30 в плазменном режиме. Использовали систему газов воздух-ацетилен. Условия определения цинка: длина волна - 213,9 нм; ширина щели - 0,2 нм, пламя стехиометричное; для меди: длина волны -324,8 нм, ширина щели - 0,2 нм; пламя стехиометричное. Полученные результаты на содержание высушенного органа не расчитывали. Исследования проводили на базе лаборатории рссле^о^ний ¿ааьсПеннш ПРепамтоь-И Сырья м сс&ерхше. МЭ- под руководством С.А.Ластова.

Исследования, связанные с определением селена проводила на базе ГИРедМет как ААС, гак и флюоремегрическим методом.

5. Скрининг веществ на антиоксидантную активность проводили по двум интегральным показателям состояния процессов ПОЛ иАОС организма - содержанию ВДА в крова с 3,9,14 дневным адьювантным артритом и количественному содержанию ГйШГ б и ГАФКЛ с крови на тех же сроках. Количество малонового диальдегида определяли по его реакции с ткобарбитуровой кислотой. Для определения генерации АФК иввделяли общую лейкомассу /гранулоциты, моно- и лимфоциты/

в 1 мА К 0,75 мл лейкомассьг, добавляли 0,25 мл насыщенного изоосмолярного раствора водного люминола рН-7,35; смесь выдерживали 30 с в темновой камере хемилгаминометра типа радиометра ?Еоботрон 220 46" /ГДР/, адаптированного для измерения хемилюми4-нвсцешда. Измеряли максимальную XI в импульсах в 1 с до выхода на плато /за вычетом свечения плазмы/ и расчитывали ХЛК генерации АФК на стандартное чшию лейкоцитов /10 / по формуле:

п

ттгпгтг мах XI лейкомассы/в имп/с/х 10° лей-__г

/б,с/= число грануло- и моноцитов в 1 мм лейкомассы* Улейком/мм

Исследования активности ПОЛ проводили на базе ^атедры латоло-Сичесиса ММА им. И.М.Сеченова под руководством акаде-

микаРАЕН А.Х.Когана.

6. Ддя выявления динамики изменения морфоструктур органов и возможности их сравнения с нормально функционирующими органами морфометрические наблюдения проводили на 3,9,14,28 день адьюван-тной болезни. У забитых декапитированием животных брали кусочки внутренних органов и суставы задних конечностей. Материал фиксировали в формалине 10$, кусочки подвергали парафиновой заливке, применялись окраски срезов гематоксшшн-эозин, пикрофуксин.

Изучение гисгоморфологической структуры органов, наиболее часто подвергающихся патологическим изменениям при системных кол-лагенозах/ сердце, печень, почки, суставы/, проводили на базе кафедры патологической анатомии ММА им. И.М.Сеченова под руководством профессора И.М.Кодоловой.

7„Для обработки результатов исследований иепользовали стандартный пакет программОгОрЯСа" ^

, использовались методы Вилконсока-Манна-Уитна, Точный метод Фишера и критерии Стъюдента для оценки достоверности.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ЕС ОБС72: Д Е Н И Е

1. Сравнение противовоспалительной активности исследуемых комбинаций никЕоэлемвнтов и традиционных НПВО.

Исследовалась динамика клинических и морфометрических характеристик животных, подвергавшихся воздействию цинка в форме сульфата, меди в форме сульфата и селена в форме селенита натрия в концентрациях 90мкг/кг, 30 мкг/кг и 16;8 мкг/кг соответственно.

М9 вводились самостоятельно, в двойных и тройной комбинации в течение 11 дней перорально. В качестве препарата сравнения вводили в те же сроки в терапевтической дозе 8 мг/кг вольтарен перорально и внутримышечно. Кроме того исследовался комплекс воль-тарена с тройной комбинацией цанка, меди и селена.

Для исследования антиэкссудативной активности измеряли объем отечных .лапок в динамике на 0, 3, 14, 9, 28 день заболевания; массу отечных конечностей и массу тела в те же сроки/ схема 1/. Обращает на себя внимание эффективное вротивовоспалительное влияние тройной комбинации микроэлементов, которая работает на уровне вольтарена в плане снижения объема и массы лапок. Достоверно отличаются от нелеченого контроля результаты полученные при воздействии меди, двойной комбинация меди и селена и комплекса вольтарена с тройной комбинацией цинка, меда и селена.

Из клинических показателей крови определялись СОЭ, количество лейкоцитов, эритроцитов и гемоглобин. Наиболее информативным тестом оказался показатель СОЭ /схема 2/. Данный показатель практически нормализуется и приближается к интактному контролю при воздействии на животных вольгареном, комплексом вольтарена и тройной комбинации меди,, цинка и селена, тройной комбинацией м/э и

№

Масса

- 13 _

отечных лапок на /4" день ъ&Еоп&Ьания

2,0

Ю

гь 1

го

л

с: а:

Пз

с»!

а3 Е-1-

Р

О

а

Г6

а:

Схема 1

мм/г 20,0

СОЭ

на

день ъа5оле Ьанил

¿¡ен

цо 5Р

21

го

в

V)

О

5

ро

I1

-С с:

з: *

Схема 2

го.

150

100

жи Ватных на 1ки-день ъаЯолеВанця

£

I

г ™ 3-э-

Схема 3

+

+

двойной комбинация меди и селена.

Что касается массы тела животных, то при развитии адьюван-тного артрита она прогрессирующе снижается и у нелеченого контроля достигает 90-100 г при начальном весе 180-200 г. Животные, леченые вольтареном практически не отличаются от больного контроля по этому параметру. При введении тройной комбинации масса близка к интактному контролю и достоверно отличается от нелеченой группы/ схема 3/.

Исследуя динамику морфометрдческлх характеристик животных под влиянием микроэлементов и их двойных и тройной комбинации были получены результаты, подтверждающие позитивное влияние тройной комбинации меди, цинка и селена и двойной комбинации, селена и меди при введении с третьего дня заболевания. Патологических изменений во внутренних органах в данных группах не наблюдалось. Отмечалось снижение воспаления и нежный фиброз паннуса. В контрольной нелеченой группе наблюдается пролиферация синовиоцитов, слущивание их в просвет сустава, разрастание паннуса и ворсинок в полости сустава, а к 14-16 дню выделялся характерный остеомиелит, наблкдалось рассасывание кости остеокластами, скопление лейкоцитов в ностно-мозговых полостях. При лечение вольтареном заметно врастание паннуса с ворсинами в хрящ, но наблюдается стихание восааления, нежный фиброз.

Т.о. объединяя результаты, полученные при исследовании клинических и морфомвтрических показателей, можно выделить лидирующий комплекс, снимающий острое воспаление и проявивший антиэкссудативную активность - тройную комбинацию меди,цинка и селена.

2. Изучение влияния микроэлементов меди, пинка и селена и их комбинаций на систему татохтзом Р-450 зависимую печени. .

Проведенные эксперименты позволили установить, что медь, цинк и селен:, и их комбинации оказывают вьфаженное влияние на цитохром Р-450 в ыикросомах печени крыс и мышей и гексеналовый сон/продолжительность/.

Медь и селен несколько укорачивают продолжительность гексе-налового сна, т.е. по-видимому индуцируют активность цитохрома Р-450.

Цинк, напротив, удлиняет продолжительность гексеналового сна на 60^ по сравнению с контролем. Т.о. в составе комплексов есть два элемента / медь и селен/ с индуцирующей активностью и один элемент с ингибирующей активностью /табл.1/. Однако через 8 дней после прекращения инъекции указанных выше веществ и их комбинаций наблюдалась повышенная функциональная активность цитохрома Р-450, сдвиг, вызываемый цинком к этому времени полностью нормализовнвался.

Серия других экспериментов позволила установить выраженное влияние изучаемых м/э непосредственно на цитохром Р-450 в микросомах печени крыс. Так, после введения микроэлементов содержание цитохрома Р-450 и Бд особенно значительно увеличивалась при воздействии тройной комбинации меди, цинка и селена, при этом в два раза возрастала цитохром Р-450 зависимая ферментативная активность, определяемая путем измерения скорости црилинового окисления, т.е. окисления субстратов Е типа. Однако метаболизм субстрата 1 тапа Ш при этом не увеличивался. В суязи с эт^м следует отметить, что тип 1 спектральных изменений возникает при взаимодействии гидрофобной части молекулы субстрата с низкоспинновым железом гемопро-теида с переходом его в высокоспиновую форму. Тип П возникает в результате взаимодействия аминогруппы субстрата с железом гема,

находящимся как в высокоспиновом состоянии, так и в низкоспиновом. В настоящем исследовании именно поэтому была изучена монооксиге-назная активность цитохрома Р-450 в отношении известных субстратов 1 и П типов. Фйкт существенного повышения скорости окисления БП после введения животным микроэлементов весьма интересен и может имегь практическое значение. По-видимому в результате того, что комплекс трех м/э состоит из противоположнодействулцих веществ, вызывает несколько меньший по своей выраженности эффект/схема^ /.

ВсЗает вопрос, каков может быть механизм индукции анилингид-роксилазы в микросомах печени под действием м/э? Возможно, что это обусловлено избирательной индукцией изоформы цитохрома Р-450, окисляющей анилин и другие определенные субстраты; в пользу этого может говорить некоторое увеличение содержания цитохрома Р-450 в микросомах.

Установленный факт индукции цитохрома Р-450 дает веские основания для предположения позитивного влияния данной комбинации не только на симптомы воспаления, но и на патологические процессы, сопрововдагацие его. На основании выявленного эффекта не исключено создание принципиально новых средств терапии указанного патологического состояния, так кик показана также зависимость развития полиартрита и аллергической реакции от функционального состояния системы цитохрома Р-450 печени.

Исследование комбинированного применения селена,меда и цинка с вольтареном показало, что эффект усиления анилингидронсилазной активности цитохрома Р-450 сохраняется близким к таковому при применению! одних микроэлементов, однако общее содержание цитохрома Р-450 в расчете на 1 мг белка микросом снижается. БП-гддрокси-лазная активность при указанном комбинированном воздействии не отличается от контроля.

Под воздействий« отдельного препарата вольтарена в терапев-

тических дозах в течение 11 дней отмечено снижение концентрации цитохромов Р-450 и- в^, наблвдалось также ослабление акилингидро-ксилазной. активности; скорость окисления субстрата 1 типа в атом случае незначительно снижалась до сраврени® с контролем и была достоверно выше скорости окисления ЕЛ при воздействии тройной, комбинации микроэлементов в данном -эк-шрипенъг. , т.о. вольтарен оказывает ингибиругацее действие на систему цитохром Р-450 зависимую микросомальнуго монооксигеназную печени/табл 2/.

Таблица 1

ВЛИЯНИЕ ЦИНКА,МЕДИ,СЕЛЕНА. НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ . цитохрома Р-450 ПЕЧЕНИ МЫШЕЙ С57В /6 ВЕСОМ 20-22Г

Препарат

Доза

Продолжительность гексеналового наркоза 12-йдень после на- ;18-й день после нача-чала иньекдий_:ла иньекпий _

селен 8мкг/кг 15,1И,1 65,4 15,4*;е 70,9

медь 30 мкг/кг 18,7г2,4 80,9 19,4±2,4 89,4

цинк 90 мкг/кг 37,0±3,8 160,2 17,2±2,2 79,3

Таблица 2

ПОКАЗАТЕЛИ АКТИВНОСТИ СИСТЕМЫ ЦИТОХРОМА Р-450 МИКРОСОМАЛЬ-НОЙ ФРАКЦИИ ПЕЧЕНИ КРЫС ЧЕРЕЗ 24 ЧАСА ПОСЛЕ ОКОНЧАНИЯ ВВЕДЕНИЯ КОМБИНАЦИЙ

Тест :Конгроль: Вольтарен : Вольтарен, • медь,цинк _:_|_; {^дЦинк, ; селен

Цитохром Р-450

нмоль на 1мг белка 0,82^0,1 0,57*0,006 0,5840,06 1,1^0,11 нмол?на 1^мг белка О'67*0'09 °'46±0'08 °'№0'09 О-86^-1

ш^нЖ^ав!«1'0^0'09 1'73±0'12 г-001"0'1

0,401-0,07

0,54*0,07 0,57^0,07 0,59±0,04

белка в 1 мин.

нноль/нг

- 18 -

схе/чл^

(5-i

4

Г*1

рЬ

3 ч 4 —£— 1

а.

тест

¿-¡¿онтроль } 2 - шшореи ; з-Шшо/>ем,

У- Си, £ е. ' а - ци/оохром • в- ¿¿итогом ¿гУ г? - аншиит/аРо^сщо&Э! с/— 5е*зо&л1//зе#2ир/>с>*С£/лаз4

Кроме того, в данной работе было исследовано влияние на систему цитохрома Р-450 печени хронического введения комбинации циклофосфан, вольтарен и продигиазан, применяющейся в практике для лечения артритов. Отменчено снижение содержания цитохромов Р-450 и Вд аналогичное тому, которое наблюдалось при введении вольтарена, а достоверного усиления акилингадроксилазной активности не наблюдалось.

Т.О. комплекс микроэлементов селена, меди и цинка при длительном введении, крысам вызывает индукцию цитохром Р-450 зависимой, монооксигеназной микросомальной: системы печени, вольтарен при комбинированном применении с указанными микроэлементами снижает индуцирующую активность последних.

3. Изучение действия микроэлементов и их комбинаций на ПОД.

Для определения активности процессов ПОЛ нами определялось в плазме крови количество продукта дероксидации лапидов ВДА и для контроля за активацией фагоцитарной системы, которая сопровождает все воспалительные заболевания опредедгиась генерация активных форм кислорода /ГАФКЛ/.

В результате эксперимента бшш получены следующие данные:

ь

1. В процессе развитая патологии повреждение лишдного слоя мембран увеличивается, что выражается в увеличении количественного содержания ВДА;

2. Среди леченых групп, результаты разделились на группы: с минимальна л/1/ и средним^/ уровнем МДА,/таблица 3/.

К первой группе можно отнести результаты, полученные при обработке плазмы животных на 14 день заболевания, подвергнутых воздействию соединений цинка, меди отдельно, вольтарена и тройной комбинации, где уровень ИЩА был близок к интактрому контролю. Ко 2 группе отнесены результаты, полученные при введении селенита нат-рря, двойной комбинации соединений меди и селена, тройной комбинации. соединений меда,цинка,селена и самостоятельно вольтарена,.

Если сравнивать результаты с нелеченым контролем, то видна явная позитивная тенденция в плане снижения разрушительного процесса липидного слоя мембран и, вадшо, активация антиоксидантной системы организма, т.к. все элементы являются составными частями известных энзимов С0Д,ГП,КТ, активно участвующих в обезвреживании и инактивации продуктов перокаидацаи липидов.

3. У контрольных нелеченых животных к последнему дню эксперимента отмечается высокий ШШ и ШШо параллельно с относительно высоким ВДА/ ПлХЯ вычисляется через содержание ГЛФКЛ/.

4. В процессе лечения различными веществами показатели ШШГб и ШШГс ниже чем у нелеченого контроля, при этом их можно расположить в следующем убывающем порядке: вольтарен-селен-вольтарен и тройная комбинация^ комдлексе-медь. н селен- цинк-тройная комбинация.

Если рассматривать корреляционные отношения между клиническими показателями и данными, характеризующими ПОЛ, можно отметить что максимальное снижение отека соответствует невысокому содержанию МДА /но не минимальному/ и малому уровню 1ШЛ6, но не минимальному.

Таблица 3

Группа

Содержание ВДА на 14 день

Содержание МДА на 28 день

: ЕОП % : ЕОП бГ р

Интактннег 0,178*0,008 0 0,172^0,008 0

АБ/без лечения 0,423-* 0,001 100 0,451^0,015 100

медь 0,169*0,014 3,7 0,24210,013 25

цинк 0,151*0,03 11 0,240*0,02 24,4

селен 0',207*0,03 11,8 0',220*0,03 17,2

медь,селен 0,214*0,02 14,7 0,202*0,03 10,8

вольтарен, медь, цинк, селен 0,123*0,001 22,4 0,178*0,01 2,2

вольтарен 0,164*0,001 5,71 0,32510,009 54,<

4. Изучение сЬункпиональной'. взаимосвязи между патологическвд процессом и коядентгашей м/э в биотканях животных: и способность мели, пинка, селена и их комбинаций влиять на МЛГ.

Проведенные эксперименты позволяют говорить о значительном и быстром количественном изменении уровня микроэлементов в биожидкостях и биотканях животных, больных. АА. Сдвиги данных уровней в цельной крови наблюдаются раньше,чем явные клинические проявления артрита.

М^табшшзм микроэлементов видимо подвергается изменению за счет индукции выработки эндогенных лигандов, которые способствуют физиологической реакции организма на нарушение МЛГ с последующим компенсаторным перераспределением м/э между органами а тканями.

Уровень цинка в течение развития АА. достоверно уменьшается в плазме и одновременно на тех же сроках и в тех же количествах увеличивается в печени. Концентрация этого элемента увеличивается в суставах.

Что касается меди, то наши исследования подтвердили общеизвестный факт, что при заболеваниях воспалительного характера уровень

меди в сыворогке резко увеличивается, причем изменения концентрации элемента происходят одновременно со смещением биохимических параметров воспаления, таких как фибриноген и церулоплазмин сыворотки крови. Уровень меди в сыворотке резко увеличивается в процессе течения артрита, но в более поздний срок. Изменяется также количественное содержание этого элемента в сторону увеличнния в в суставах, хотя и не так значительно как'в плазме.

Концентрация селена, хотя и не столь выражено, как медная но имеет тенденцию к уменьшению в плазме с одновременным увеличением его содержания его в суставах и небольшого прироста до 7-го дня после введения адьюванта Эрейнда в печени с последующим снижением уровня селена в данной биоткани. Явное снижение уровня селена в плазме и печени происходит на 19-26 день болезни.

Количественное содержание меди, цинка и селена в печени, кро-

ВЫВОДЫ

Проведенные эксперименты позволила установить, что двойные и тройная комбинации м/э цинка, меда и селена оказывают влияние на такие важные звенья патогенеза как ''''Г, цитохром Р-450 зависимую монооксигеназную шкросомальнуго систему печени, процессы'

ШЖ и активность АОС.

Параллелйно с позитивными сдвигами в патогенезе достоверно

меняются измеряемые клинические параметры и морфологическая картина в просвете сустава. Особенно четко просматривается корреляционная зависимость показателей СОЗ и МДА, отечности задних конечностей- и активности цитохрома Р-450 в микросомах печени.

Т.о. на основании проделанной работы, можно сделать следу-кзцие выводы:

1. Концепция микроэлеменгного лечения АА является эффективным направлением поиска новых лекарственных средств для патогенетической терапии артритов;.

2. Комбинация соединений цинка, меди и селена в определенных дозах, проявила терапевтический эффект при лечении экспериментального артрита у крыс, а на основании этого можно предпологать положительный эффект при лечении РА данной комбинацией;

3. Для больных РА биогеохимических провинций, обедненных м/э недью, цинком и селеном представляется-возможным рекомендовать •комбинированнное лечение с внутримышечным применением НПВП/воль-тарена/ и м/э меди, цинка и селена перрорально;

4. Медь, цинк и селен проявляют антиоксидантные свойства, видимо за счет вхождения в структуру ферментов антиокислательной системы и активации ее. Возможно м/э ингибируице влияют также на макрофаги и гранулодагы, которые активизированы при РА а способствуют ввделению повышенного количества свободно-радикального-

кислорода.

5. Представляется возможным использовать меди сульфат и селенит натрия в качестве индукторов цитохрома Р-450 зависимо! моно-оксигеназной системы печени, иягиби1ованной при РА.

6. Перераспределение микроэлементов между органами больных животных носит закономерный характер и уровень их в плазма /сильное увеличение меди, уменьшение цинка и селена/ может служить дополнительным критерием диагностики и клинического контроля за течением заболевания.

7. Стабилизация МЛГ достигается, по-видимому, путем способности микроэлементов вступать во взаимосвязь с эндогенными ли-гандами и таким образом нейтрализовывать их повышенную активность; микроэлементы влияют на костный и коллагеновый метаболизм, предотвращая повышенную выработку энзимов, ведущих к деструкции сустава - коллагеназы и протеиназы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО TBE ДИССЕРТАЦИИ

1. Гильдеева Т.Н., Ряженов В.В. Влияние цинка сульфата на течение экспериментального ревматоидного артрита// ПРНК: Человек и лекарство. - М.-1992.-е.342.

2. Гильдеева Г.Н., Ряженов В.В. Влияние антиоксиданта селенита натрия на течение эксперимевтадвного ревматоидного артрита// 4 конференция: Биоантиоксидант.-М.-1992,- r2..-C.PSO-J?J.

3. Ряженов В.В. .Гильдеева Г.Н. Влияние соединений цинка, меди, селена на течение адьювантного артрита/УРНК: Создание лекарственных средств. - М. - 1992. -с.160.

4. Гильдеева Г.Н., Ряженов В.^.ОВлиянит микроэлементов на течение экспериментального ревматоидного артрита/Дйилэйная конференция иркутского медицинского института. Тезисы. - Иркутск,1992.