Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Влияние мезенхимальных стромальных клеток на иммунную реконституцию в посттрансплантационном периоде у больных лимфомами

На правах рукописи

БЛТОРОВ ЕГОР ВАСИЛЬЕВИЧ

ВЛИЯНИЕ МЕЗЕНХНМЛЛЬНЫХ СТРОМАЛЫ1ЫХ КЛЕТОК НА ИММУННУЮ РЕКОНСТИТУЦИЮ В ПОСТТРАНСПЛАНТАЦИОННОМ ПЕРИОДЕ У БОЛЬНЫХ ЛИМФОМАМИ

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

11 апр гоїз

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Новосибирск 2013

005051572

005051572

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт клинической иммунологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

профессор, член-корреспондент РАМН Черных Елена Рэмовна

Официальные оппоненты:

Колесникова Ольга Петровна, доктор медицинских наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт клинической иммунологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, зав. лабораторией экспериментальной иммунотерапии.

Круглеева Ольга Леонидовна, кандидат медицинских наук, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Новосибирский государствишый медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, доцент кафедры клинической иммунологии лечебного факультета.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (г. Томск).

Защита состоится 2013 г. в часов на заседании

диссертационного совета Д 001.001.01 НИИ клинической иммунологии СО РАМН по адресу: 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИКИ» СО РАМН

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат медицинских наук

Белогородцев Сергей Николаевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Злокачественные лимфомы (3JI), включающие неходжкинские лимфомы (НХЛ) и лимфому Ходжкина (JIX), а также множественная миелома (ММ) представляют собой гетерогенную группу лимфоидных опухолей, определяющих основную динамику роста заболеваемости гемобластозами," которая в некоторых неблагоприятных районах опережает общую онкологическую заболеваемость в 4,5 раза [Ковынев И.Б., 2006]. Указанные патологии характеризуются высокой частотой встречаемости, агрессивным течением у лиц молодого возраста и высокими показателями смертности [Новик А.А, 2001, Волкова М.А., 2007].

На сегодняшний день одним из наиболее эффективных методов лечения гемобластозов является аутологичная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (АТГСК) после высокодозной химиотерапии (ВДХТ) [Волкова М.А., 2007, Ljungman Р., 2006]. Тем не менее, рецидив заболевания после АТГСК возникает приблизительно у половины больных НХЛ и ЛХ [Crump M., 2008, Rapoport А.Р. 2002], а при ММ практически неизбежен, и является причиной смерти в 73 % случаев [Pasquinî М.С., 2011]. Рецидив в 20-40% случаев возникает в течение первых 2 лет [Crump M., 2008, Peniket A.J., 2003], при этом медиана выживаемости, для лимфомы Ходжкина после раннего рецидивирования не превышает 1 - 2 лет [Волкова М.А., 2007]. В связи с этим разработка методов прогнозирования исходов и повышения эффективности АТГСК представляется важной научно-практической задачей.

Исследования последних лет продемонстрировали, что эффективность АТГСК во многом определяется особенностями иммунной реконституции, в частности, сроками восстановления лимфоцитов и их отдельных субпопуляций, а также факторами, влияющими на этот процесс [Atta E.H., 2009, Porrata L.F., 2010]. При этом выяснилось, что ряд параметров, характеризующих восстановление иммунной системы (раннее восстановление лимфоцитов, количество NK-клеток и др.), обладает прогностической значимостью [Gordan L.N., 2003, Porrata L.F., 2008, Porrata L.F., 2010]. Кроме того, было показано, что важным фактором, который определяет продолжительность периода панцитопении и сроки реконституции лимфоцитов, обеспечивающих противоинфекционную и противоопухолевую защиту, является скорость и полнота приживления трансплантированных гемопоэтических стволовых клеток (ГСК).

Цитотоксическое действие химиотерапии приводит к выраженным нарушениям структуры и функции стромальных клеток костного мозга, ослабляя их гемопоэзподдерживающую активность, что негативно сказывается на приживлении ГСК и восстановлении гемо/иммунопоэза [O'Flaherty Е., 1995, Uhlman D.L., 1991]. В связи с этим перспективы повышения эффективности АТГСК связывают с использованием мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (МСК), способных улучшать приживления ГСК за счет продукции гемопоэз-стимулирующих цитокинов и формирования кроветворного микроокружения [Angelopoulou M. 2003, Battiwalla M., 2009, Majumdar M.K., 2000].

Использование МСК у пациентов с аллогенной ТГСК при гематологических, онкологических и аутоиммунных заболеваниях показало их безопасность и эффективность в восстановлении гемопоэза [Le Blanc К., 2007, Lalu М.М., 2012]. Однако наличие иммуносупрессорной активности МСК вызывает ряд опасений,

связанных с возможным неблагоприятным эффектом МСК на иммунную реконституцию.

Восстановление Т-лимфоцитов после АТГСК происходит за счет тимопоэза и гомеостатической пролиферации. Ранние исследования показали, что МСК способны ингибировать пролиферацию Т-клеток на поликлональиые стимулы и антигены [Krampera M., 2003], а также в условиях in vitro, моделирующих гомеостатическую пролиферацию (т.е. при стимуляции IL-2, IL-7 и IL-15). Однако при определенных условиях (например, низком уровне пролиферации отвечающих лимфоцитов или низких дозах МСК), мезенхимальные клетки способны усиливать пролиферативный ответ лимфоцитов на аллоантигены и стимуляцию гомеостатическими цитокинами [Le Blanc 2003, Bocelli-Tyndall 2009]. Кроме того, иммуносупрессорный эффект МСК in vitro не всегда подтверждается in vivo [Schurgers Е., 2010]. Также имеются сведения, что супрессорная активность МСК у больных злокачественными лимфомами существенно подавлена [Шевела Е.Я., 2008]. Поэтому вопрос о влиянии МСК на гомеостатическую пролиферацию Т-клеток в постгрансплантационном периоде остается открытым. Данные о влиянии МСК на тимопоэз также отсутствуют.

Согласно данным литературы, иммуносупрессорная активность МСК может быть обусловлена индукцией регуляторных Т-клеток (Трег) [Di Ianni M., 2008, English К., 2009]. Значение Трег при гемобластозах неоднозначно. Возрастание Трег в периферической крови и опухолевом микроокружении при лимфомах и выявленная способность этих клеток подавлять реакции клеточного иммунитета свидетельствует о негативной роли Трег в противоопухолевом ответе [Hilchey S.P., 2007, Mittal S., 2008]. С другой стороны, количество Трег в зоне опухолевого роста при ЛХ и HXJI коррелирует с показателями выживаемости [Carreras J., 2006, Tzankov А., 2008], что может свидетельствовать о способности Трег подавлять пролиферацию малигнизированных клонов лимфоцитов. При этом целый ряд вопросов относительно динамики восстановления Трег после АТГСК и их влияния на иммунную реконституцию/выживаемость пациентов, а также эффект МСК на реконституцию Трег остаются до настоящего времени неизученными.

Все вышеизложенное определило цель и задачи настоящего исследования.

Цель исследования:

Изучить влияние ко-трансплантации аутологичных мезенхимальных стромальных клеток на восстановление различных популяций Т-лимфоцитов, а также клинико-лабораторные показатели эффективности аутологичной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Исследовать раннее восстановление лимфоцитов, в том числе с учетом количества трансплантируемых ГСК и лимфоцитов в составе продукта сепарации у больных 3J1 в группах со стандартной АТГСК и ко-трансплантацией МСК.

2. Изучить эффективность ранней реконституции наивных Т-клеток и Т-клеток памяти в субпопуляциях CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов в группах пациентов со стандартной АТГСК и ко-трансплантацией МСК.

3. Исследовать влияние МСК больных на IL-2-стимулированную пролиферацию лимфоцитов в культуре in vitro и динамику восстановления клеток с фенотипом недавних мигрантов из тимуса (CD4+CD45RA+CD3r) в

посттрансплантационном периоде ex vivo.

4 Изучить динамику восстановления регуляторных Т-клеток в группах больных ЗЛ со стандартной АТГСК и ко-трансплантацией МСК и взаимосвязь между количеством Трег и исходами АТГСК.

5. Оценить клиника-лабораторные показатели, характеризующие эффективность АТГСК, в сопоставимых группах больных ЗЛ со стандартной АТГСК и ко-трансплантацией МСК. Научная новизна

В результате выполнения работы впервые показано, что частота пациентов с ранним восстановлением лимфоцитов в группе больных ЗЛ с ко-трансплантацией МСК достоверно выше, чем в группе пациентов со стандартной АТГСК. При этом стимулирующий эффект МСК наиболее ярко проявлялся при низком содержании CD34+rCK или лимфоцитов в продукте сепарации. Установлено, что ко-трансплантация МСК повышает эффективность иммунной реконституции как за счет Т-клеток памяти, так и наивных Т-клеток, особенно популяции CD4+ Т-лимфоцитов, а также приводит к более быстрому восстановлению клеток с фенотипом недавних мигрантов из тимуса (CD4+CD45RA+CD31+). Выявлен стимулирующий эффект МСК больных ЗЛ на IL-2-индуцированную пролиферацию лимфоцитов in vitro, при этом эффект МСК обратно коррелирует с исходной реактивностью МНК к IL-2. Впервые продемонстрировано, что реконституция Трег в постгрансплантационном периоде проявляется быстрым (в течение месяца) восстановлением относительного содержания CD4+FOXP3+ и СЭ4+С025Ы Трег, до исходно повышенного уровня и постепенным снижением до нормативных значений к исходу 12 мес. При этом ко-трансплантация МСК не оказывает значимого эффекта на содержание Трег в динамике 12 мес периода после АТГСК. Получены новые данные о взаимосвязи между повышенным содержанием Трег периферической крови в раннем посттрансплантационном периоде и неблагоприятным исходом АТГСК (развитие раннего рецидива/прогрессии заболевания). Выявлено, что наряду с повышением эффективности раннего восстановления лимфоцитов и иммунной реконституции ко-трансплантация МСК приводит к сокращению продолжительности нейтро- и тромбоцитопении, снижению в 1,75 раза частоты развития тяжелых инфекционных осложнений и не сопровождается эскалацией ПХТ-индуцированной нефро- и гепатотоксичности и ухудшением показателей 5-летнен выживаемости. Теоретическая и практическая значимость

Теоретическая значимость работы заключается в расширении представлений об иммунорегуляторной активности МСК, в частности, способности этих клеток стимулировать раннее восстановление лимфоцитов и реконституцию Т-клеток у больных ЗЛ после проведения АТГСК за счет улучшения инграфтинга ГСК и усиления периферической экспансии лимфоцитов. Способность МСК поддерживать периферическую экспансию Т-клеток в условиях индуцнрованной лимфопении подтверждается данными о более эффективном восстановлении пула Т-клеток памяти и наивных Т-лимфоцитов на этапе выхода из лейкопении и стимулирующем эффекте МСК на экспансию лимфоцитов в условиях, моделирующих гомеостатическую пролиферацию (при стимуляции лимфоцитов pIL-2). С другой стороны, данные о более быстром (к 6 мес. после АТГСК) восстановлении наивных Т-лимфоцитов с фенотипом недавних мигрантов из тимуса на фоне введения МСК не исключает позитивного влияния МСК на

тимопоэз. Полученные данные о динамике восстановления Трег после стандартной АТГСК и ко-трансплантации МСК раскрывают закономерности реконституции Трег и свидетельствуют об отсутствии стимулирующего влияния МСК больных ЗЛ на количественную экспансию Трег. В свою очередь выявленная взаимосвязь между повышенным количеством СБ4+РОХРЗ+ и С04+С025ь' Трег и развитием рецидива/прогрессии основного заболевания указывает на негативное влияние этих клеток на противоопухолевый иммунный ответ в постгрансплантационном периоде.

Практическая значимость работы заключается в выявлении позитивного влияния МСК на сокращение сроков критической цитопении и ускорение иммунной реконституции при отсутствии стимулирующего эффекта на реконституцию Трег. Эти факты в совокупности с данными о снижении частоты развития тяжелых инфекционных осложнений при отсутствии негативного эффекта МСК на выраженность ПХТ-индуцированной нефро- и гепатотокчности и показатели выживаемости обосновывают безопасность и целесообразность ко-трансплантации МСК для улучшения инграфтинга ГСК и иммунной реконституции у больных лимфомами. Другим прикладным аспектом является разработка нового метода прогнозирования раннего рецидива у больных ЗЛ на основе оценки Трег на момент выхода из лимфопении.

Положения, выносимые на защиту:

1. Ко-трансплантация аутологичных МСК у больных ЗЛ с АТГСК является эффективным способом, повышающим частоту раннего восстановления лимфоцитов с наибольшей выраженностью эффекта у пациентов с низким количеством С034ТСК или лимфоцитов в продукте афереза.

2. Ко-трансплантация аутологичных МСК у больных ЗЛ является безопасным методом повышения эффективности иммунной реконституции и приживления ГСК и не приводит к развитию негативных иммунотропных (количественной экспансии Трег) и клинических эффектов (возрастанию частоты инфекционных осложнений, эскалации ПХТ-индуцированной гепато/нефротокисичности и ухудшению показателей выживаемости).

3. Повышенное содержание Трег периферической крови больных ЗЛ на момент выхода из лимфопении является диагностически значимым маркером, позволяющим с высокой вероятностью прогнозировать развитие раннего рецидива заболевания.

Объем и структура диссертации

Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 5 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Материал изложен на 134 страницах машинописного текста, включающего 18 таблиц и 19 рисунков. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 251 литературный источник, в том числе 240 иностранных.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на Всероссийских научно-практических конференциях «Дни иммунологии в Сибири» (Иркутск, 2012), на Всероссийской научной конференции «Молекулярно-генетические основы функционирования цитокиновой сети в норме и при патологии» (Новосибирск, 2010), на 9-м ежегодном заседании Ассоциации по

иммунотерапии рака - Association for Cancer Immunotherapy (CIMT) 9th Annual Meeting (Mainz, 2011), на 3-й Международной конференции по регуляторным Т клеткам и субпопуляциям Т-хелперов и их клиническому применению при болезнях человека - The 3rd International Conference on Regulatory T Cells and Helper T Cell Subsets and Clinical Application in Human Diseases (Shanghai, 2012), a также на 8ой отчетной конференции ФГБУ «НИИ клинической иммунологии» СО РАМН (Новосибирск, 2011). Апробация диссертации состоялась 29 ноября 2012 г. на семинаре клинического отдела ФГБУ «НИИ клинической иммунологии» СО РАМН.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов

диссертационных работ.

Работа выполнена в лаборатории клеточной иммунотерапии отдела клинической иммунологии ФГБУ «НИИ клинической иммунологии» СО РАМН (руководитель лаборатории член-корреспондент РАМН, д.м.н., профессор, Е.Р. Черных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Диссертационная работа основана на результатах клинико-иммунологического обследования 167 больных, в том числе 93 мужчин и 74 женщин в возрасте от 7 до 62 лет (медиана 35 лет), которым проводилась АТГСК в отделении гематологии и трансплантации костного мозга Клиники иммунопатологии ФГБУ «НИИ клинической иммунологии» СО РАМН с 2003 по 2012 гг. У 62 пациентов диагностировались НХЛ, у 59 - ЛХ и у 46 больных - ММ.

Получение, культивирование и введение МСК. Аспират костного мозга (КМ) в объеме до 50 мл получали путём трепанобиопсии из крыла подвздошной кости или сгернальной пункции. Аспират инкубировали при 37°С в течение 40 мин. После гравитационного разделения лейковзвесь центрифугировали (1500 об./мин, 10 мин), осадок клеток ресуспендировали в питательной среде а-МЕМ («БиолоТ», С-Пб), дополненной 100 мкг/мл гентамицина и 20% FCS («БиолоТ», С-Пб, или

HyClone, США). ""

Для генерации МСК мононуклеарные клетки (МНК) аспирата КМ культивировали в пластиковых флаконах 25, 75 или 150 см2 («Nunclon», Дания) с исходной плотностью 106 клеток/см2 в питательной среде а-МЕМ, дополненной 100 мкг/мл гентамицина и 20% FCS, при 37СС в С02-инкубаторе. Через 24-48 ч. неприкрепленные к пластику клетки удаляли, фракцию адгезивных клеток культивировали до получения клеточного монослоя (80-90% площади культурального флакона). Обновление питательной среды проводили дважды в неделю. Отделение МСК от поверхности флакона при пассировании осуществляли с использованием 0,25% раствора трипсина (Sigma-Aldrich, США) и 0,02% раствора ЭДТА (ICN, США). Морфологию полученных клеток оценивали визуально с помощью фазово-контрастной микроскопии.

Для ко-трансплантации МСК криоконсервировали в 10%-ном растворе человеческого альбумина («Микроген», Россия), содержащем 10% DMSO (Sigma-Aldrich, Германия). Размораживание клеток проводили перед введением на водяной бане при 37°С, клетки отмывали в питательной среде а-МЕМ и в физиологическом растворе, ресуспендировали в 20 мл физиологического раствора

и вводили внутривенно сразу после трансплантации ГСК. Жизнеспособность размороженных клеток во всех случаях превышала 90%.

Характеристика МСК. Для оценки соответствия генерируемых ex vivo клеток минимальным критериям МСК, определенным Международным обществом клеточной терапии (2006 г.) в отдельной серии экспериментов наряду с морфологической оценкой исследовали фенотип генерируемых клеток и их способность к мультипотентной дифференцировке. Фенотипический анализ клеток методом проточной цитометрии показал, что подавляющее большинство генерируемых клеток экспрессируют характерные для МСК стромальные антигены: CD73 (86,1 ± 5,6 %), CD90 (79,9 ± 4,9 %) и CD105 (89,2 ± 4,9 %) и не экспрессируют CD34 (6,8 ± 3,2 %), а также линейные маркеры - CD3 (4,7 ± 1,3 %), CD20 (5,5 ± 1,8 %), CD14 (9,7 ± 3,4 %). Остеогенную дифференцировку индуцировали путем 14-18-дневного культивирования МСК в индукционной среде, содержащей глицерол-2-фосфат, аскорбиновую кислоту и дексаметазон. В результате генерируемые фибробластоподобные клетки КМ дифференцировались в клетки, способные к образованию внеклеточных депозитов кальция, т.е. гистохимически соответствующие остеобластам. Адипогенную дифференцировку индуцировали путем культивирования генерируемых МСК в индукционной среде, содержащей изобутилметилксантин, дексаметазон и индометацин. Культивирование клеток в течение 14 суток в адипогенной среде приводило к появлению адипоцитоподобных клеток, содержащих в цитоплазме липидные вакуоли, которые специфически окрашивались с помощью красителя масляного красного, что свидетельствовало о способности фибробластоподобных клеток КМ дифференцироваться в клетки с цитохимическими/морфологическими свойствами адипоцитов.

Методы лабораторных исследований. У больных 3JI в контрольных точках (непосредственно перед ВДХТ, на день выхода из лимфопении (лимфоциты > 0,5 х 109/л), через 6 и 12 мес. после АТГСК) и условно здоровых доноров забирали 10-20 мл венозной крови в пробирку с гепарином (конечная концентрация гепарина 50 ЕД/мл). Для исследования использовались лейковзвесь и МНК периферической крови (ПК), которые выделяли стандартно путём центрифугирования цельной гепаринизированной венозной крови в градиенте плотности фиколла-верографина (р=1,078) в течение 20 мин при 3000 об/мин с последующей двукратной отмывкой в ЗФР и полной культуральной среде (RPMI-1640 (Sigma, США), дополненной 0,3 мг/мл L-глутамина, 5мМ HEPES-буфера, 100 мкг/мл гентамицина и 10% сыворотки плодов коровы («БиоЛот», Санкт-Питербург). Забор крови и все иммунологические исследования проводились после получения письменного ннформирозанного согласия пациентов. Общее количество пациентов, включенных в контрольную группу, составило 219 сопоставимых по полу и возрасту условно здоровых доноров.

Определение количества л1ьмфоцитов и диагностика раннего восстановления лимфоцитов (РВ.П). В работе использованы результаты общего анализа крови с лейкоцитарной формулой (ПК и продукта афереза) и биохимических анализов, рутинно проводимых больным. PBJI считалось наступившим, если выход из цитопении (лейкоциты > 1 х 10 /л) наступал не позднее 15 дня после АТГСК, а количество лимфоцитов в периферической крови при этом составляло 500 и более клеток/мл.

Определение субпопуляций клеток методом проточной цитометрии. Приготовление образцов для определения относительного содержания субпопуляций клеток, экспрессирующих поверхностные CD-маркеры, проводили в'соответствии с методикой Becton Dickinson с модификациями. МНК (50 мкл, 0,5 х 10s клеток/пробу) в растворе «А» (5% желатиноля, 0,1% азида натрия, 0,02% ЭДТА, 10% сыворотки доноров АВ (IV) группы в ЗФР) помещали в цитометрические пробирки. К суспензии клеток добавляли рекомендуемое количество моноклональных антител, меченных РегСР, РЕ и F1TC, инкубировали 30 мин при 4°С. Затем клетки отмывали от антител раствором «В» (0,1% азида натрия, 0,02% ЭДТА в ЗФР), ресуспендировали и заливали 0,5 мл лизирующего раствора (FACSLyse, Becton Dickinson, США). Подготовленные пробы исследовали на лазерном проточном цитометре FACSCalibur (Becton Dickinson, США) с использованием программы Cell Quest (Becton Dickinson, США). Процент позитивных клеток, экспрессирующих соответствующие CD-маркеры, определяли в лимфоцитарном гейте (минимум 30000 событий).

Для определения субпопуляции CD4+CD25hlsh Т-клеток использовали РЕ-меченные анти-С04 (ЗАО «Сорбент-сервис», г. Москва) и FlTC-меченные анти-CD25 моноклональные антитела (Becton Dickinson, США), учитывая клетки с наибольшей интенсивностью свечения CD25. Для идентификации CD4+FOXP3+ Т-клеток использовали FlTC-меченные анти-С04 (ЗАО «Сорбент-сервис», г. Москва) и РЕ-меченные анти-РОХРЗ моноклональные антитела (Becton Dickinson, США). Пермеабилизацию проводили в течение 15 мин в темноте при комнатной температуре в 0,2%-ном растворе Tween-20 (Ferak, Германия). Для оценки субпопуляций наивных Т-клеток и Т-клеток памяти использовали РЕ- и FlTC-меченные 3hth-CD4, aiiTH-CD8, 3hth-CD45RA и anTH-CD45RO моноклональные антитела (Becton Dickinson, США), для выявления CD44;D45RA+CD3r Т-клеток -РЕ-меченные анти-С031 (eBioscience, США), РегСР-меченные анти-С04 (Becton Dickinson, США) и FlTC-меченные aimi-CD45RA моноклональные антитела

(Becton Dickinson, США).

Оценка влияния МСК на пролиферативную активность лимфог/итов.

МНК здоровых доноров или больных ЗЛ (105 клеток в 0,15 мл полной культуральной среды) стимулировали рекомбинантным интерлейкином-2 (IL-2) в дозе 100 ЕД/мл («Ронколейкин», ООО «Биотех») и культивировали в течение 72 ч в 96-луночных круглодонных планшетах при 37°С в С02-инкубаторе в отсутствие или присутствии различных доз МСК (2 х 103; 104; 5 х 104; 105 клеток/лунку). Интенсивность пролиферации оценивали через 72 ч по включению Н-тимидина, вносимого за 18 ч. до окончания культивирования в дозе 1 мкКю/луику. Подсчет радиоактивности материала производили в жидкостном сцинциляцирнном счетчике SL - 30 (Intertechnic, Франция). Оценивали спонтанную пролиферативную активность МНК, а также IL-2-стимулированную пролиферативную активность в отсутствие и присутствии МСК.

Статистическая обработка полученных результатов производилась с использованием программных пакетов Statistica 6.0 (StatSoft) и GraphPad Prism 5 (GraphPad Software Inc.). Таблицы и рисунки содержат информацию в виде среднего значения и стандартной ошибки среднего (М ± SE), медианы (Me), в отдельных случаях - интерквартилыюго диапазона или диапазона минимальных и максимальных значений. Для оценки значимости различий дискретных переменных между группами использовали критерий х2 и точный метод Фишера.

Для оценки значимости различий независимых непрерывных переменных использовали непараметрический и-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни, для сравнения зависимых выборок - критерий Вилкоксона для парных выборок. Для оценки взаимосвязи количественных показателей с качественными альтернативно распределенными признаками применяли коэффициент корреляции Спирмена. Для оценки диагностической значимости определяемых показателей использовали ИОС-анализ с расчетом площади под кривой. С целью оценки нескольких прогностических факторов применяли метод логистической регрессии. Анализ выживаемости проведен по методу Каплана-Мейера, для оценки достоверности использован ^-гапк-критерий. Различия считали достоверными при уровне значимости р<0,05. Результаты и обсуждение

Чтобы оценить влияние МСК на раннее восстановление лимфоцитов (РВЛ; > 0,5 х 109/л на 15-й день после АТГСК), был проведен сравнительный анализ частоты встречаемости пациентов с РВЛ в группах со стандартной (МСК-; п=92) АТГСК и ко-трансплантацией МСК (МСК+; п=75). МСК вводили в средней дозе 0,2 х 106 клеток/кг. Сравниваемые группы значимо не различались по возрасту, полу, статусу заболевания, показателям предлеченности, режимам мобилизации и кондиционирования, количеству вводимых гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) и абсолютному количеству лимфоцитов в продукте сепарации (таблица 1).

Таблица 1

Характеристика больных исследуемых групп_

Группы больных

Параметры МСК(-) МСК(+) Достоверность п=92 _п=75_различий*

Возраст (лет), медиана 37,5 33 0,32 (min-max)___(16-62)_

Пол: , - мужчины/женщины_54/38 (59/41 %) 39/36 (52/48 %) Рх =0,39

19(21%) 22(29%) Рх2=0,19

56 (61 %) 43 (57 %) Рх2=0,64

Статус:

- полная ремиссия

- частичная ремиссия

- прогрессия/резистентное течение 17 (18 %)_10(13%)_Ру2=0,37

Режимы мобилизации: ,

-ХТ + Г-КСФ/Г-КСФ_87/5(95/5%) 68/7(91/9%) РХг=0,33

СЭ34+ клетки, х10°/кг Р„=0 33 М ± БЕ (Ме)_5.81 ± 0,5 (4,44) 4,70 ± 0,3 (4,40)

Абсолютное количество

лимфоцитов (х109) в продукте 10,7±1,0 (8,99) 13,8 ± 1,6 (10,5) Ри=0,22 сепарации. М ± БЕ (Ме)

День выхода из лейкопении 16 2 ± 1 3 13,6 ± 0,3 Ри=0,058

(Le>l,0 х 10 /л)

Примечания: »достоверность различий: %2 -критерий хи квадрат, U -критерий Вилкоксона-Манна-Уитни.

РВЛ в группе со стандартной АТГСК наблюдалось в 56% случаев, причем эффективность РВЛ зависела от количества трансплантируемых ГСК и содержания лимфоцитов в продукте сепарации. Так, у больных, которым трансплантировали более 2,5 х 106/кг ГСК, частота РВЛ была в 2 раза выше, чем у пациентов с содержанием ГСК ниже 2,5 х 10б/кг (60 против 27%, рШФ=0,041) (рис.1 А).

Аналогичным образом (рис. 1Б), частота РВЛ у пациентов с высоким количеством лимфоцитов в продукте сепарации в 1,7 раза превышала соответствующий показатель в подгруппе больных с низким количеством лимфоцитов (Ртмф=0,041). При этом отсутствие корреляционной взаимосвязи между количеством ГСК и лимфоцитов в продукте афереза (^=-0,22, р=0,096) указывало, что оба параметра влияли на восстановление лимфоцитов независимо друг от друга.

А □ МСЖ- в □ МСЖ-

■■ МАТ . „ _ ------

Рисунок 1. РВЛ в зависимости от количества трансплантируемых ГСК (А) и абсолютного содержания лимфоцитов в продукте сепарации (Б). ЬусЬО - пациенты с низким содержанием лимфоцитов в продукте афереза (в диапазоне нижней квартили), Ьу>1Ю - пациенты с высоким содержанием лимфоцитов (в диапазоне верхней квартили).

В группе МСК(+) РВЛ регистрировалось у 73% пациентов ив 1,3 раза превышало аналогичный показатель в группе со стандартной АТГСК (Р*2=0,031) (рис. 2). Стимулирующий эффект МСК более ярко проявлялся у пациентов с низким количеством вводимых ГСК или низким содержанием лимфоцитов в продукте афереза. Так, у пациентов с низким содержанием ГСК частота РВЛ в подгруппе с ко-трансплантацией МСК была в 2,4 раза выше, чем в группе МСК(-), тогда как в у пациентов с высоким количеством трансплантированных ГСК частота РВЛ на фоне ко-трансплантации МСК увеличилась на 23% (Рис. 1 А). У пациентов с низким количеством лимфоцитов в продукте афереза частота РВЛ на фоне ко-трансплантации МСК превышала таковую в группе без МСК в 1,7 раза, тогда как у больных с высоким содержанием лимфоцитов в продукте сепарации - только на 20% (рис.1 А,Б).

Полученные данные позволяют заключить, что ко-трансплантация аугологичных МСК повышает эффективность РВЛ, особенно в подгруппах пациентов с низким количеством вводимых ГСК, или при малом абсолютном содержании лимфоцитов в продукте сепарации. Поскольку эффективность РВЛ зависит от количества трансплантируемых СБ34+ клеток и лимфоцитов, обеспечивающих соответственно лимфопоэз и периферическую экспансию

п

-92

=0.031

56 %

МСК- МСК+

Рисунок 2. РВЛ в группах МСК(-) и МСК(+).

лимфоцитов, можно полагать, что восстановление лимфоцитов на раннем этапе осуществляется с вовлечение обоих процессов, которые могут быть усилены на фоне ко-трансплантации МСК.

С целью изучения влияния МСК на реконституцию Т-клеток был проведен сравнительный анализ количества различных субпопуляций Т-лимфоцитов в группах больных со стандартной АТГСК и ко-трансплантацией МСК до начала и после проведения (на момент восстановления лимфоцитов) АТГСК.

В группе МСК(-) (п=50) абсолютное количество лимфоцитов в течение месяца после трансплантации не восстанавливалось до исходного уровня и было ниже, чем до АТГСК (0.83 ± 0,1 против 1,35 ± 0,2 х 109/л, р=0,002). Наиболее выраженные различия прослеживались в отношении наивных CD4T Т-лимфоцитов, их доля после АТГСК была ниже исходной более чем в 3 раза (3,8 ± 0,3 против 13,7 ± 2,3%; р<0,001). Содержание наивных CD8+ Т-лимфоцитов было ниже исходного в 1,7 раза (11,9 ± 1,8 против 20,2 ± 2,0%; р<0,001). Доля CD4+ и CD8+ Т-клеток памяти после АТГСК, напротив, превышала исходные показатели (27 ± 2,8 против 19 ± 1,2%; р<0,005 и 16 ± 1,4 против 11 ± 1,5%; р=0,006, соответственно) (рис.ЗА).

Учитывая лимфопению, изменения субпопуляционкой структуры Т-клеток в посттрансплантационном периоде проявлялись более низким абсолютным количеством CD4+ и CD8+ Т-клеток преимущественно за счет снижения наивных клеток в обеих субпопуляциях (0,03 ± 0,003 против 0,18 ± 0,04 х 109/л; р<0,0001 для CD4+CD45RA+T-клеток и 0,097 ± 0,02 против 0,27 ± 0,04 х 109/л; ри<0,0005 для CD8+CD45RA+ Т-клеток, соответственно). Абсолютное содержание CD4+ и CD8+ Т-клеток памяти достигало исходного уровня (соответственно 0,21 ± 0,03 против 0,23 ± 0,04 х 10У/л и 0,13 ± 0,02 против 0,18 ± 0,06 х 109/л) (рис. ЗБ).

Д □ До АТГСК Б

Рис. 3. Относительное и абсолютное содержание субпопуляций лимфоцитов в периферической крови больных лимфомами до и после стандартной АТГСК. Относительное (А) и абсолютное (Б) содержание субпопуляций лимфоцитов в периферической крови больных.

Достоверность различий: критерий Вилкоксона для парных выборок.

Таким образом, реконституция Т-клеток после стандартной АТГСК происходила преимущественно за счет Т-клеток памяти на фоне низкой интенсивности восстановления наивных Т-клеток, и в первую очередь С04+СП45ИА+ лимфоцитов.

В группе больных с ко-трансплантацией МСК (п=25) абсолютное количество лимфоцитов в течение месяца после трансплантации полностью восстанавливалось

(1,25 ± 0,3 х 109 против 1,1 ± 0,1 х Ю9/л). Восстановление лимфоцитов так же как и в группе МСК(-) происходило преимущественно за счет Т-клеток памяти. Так, процентное содержание наивных CD4+ и CD8+ Т-клеток после АТГСК было достоверно ниже по сравнению с исходным значением (4,97 ± 0,8 против 12,4 ± 1.8 %; р<0,0005 и 12.7 ± 1,9 против 20,2 ± 2,3 %; ри=0,005; соответственно), тогда как доля CD8+ Т-клеток памяти к моменту выхода из лейкопении превышала исходное значение (20,4 ± 3,5 против 11,1 ± 1,0 %; p(J=0,006). Однако в результате более эффективного восстановления общего количества лимфоцитов больные в группе МСК(+) отличались от пациентов группы МСК(-) более высоким абсолютным содержанием наивных CD4+клеток (ри<0,01) (рис.4Б) и более высоким совокупным (CD4+ и CD8+) количеством Т-клеток памяти (0,68 ± 0,1 против 0.35 ± 0,04 х 109/л; ри=0,04) (рис.4А). При этом более высокое относительное содержание наивных CD4f клеток в группе МСК(+) по сравнению с группой МСК(-) (5,1 ± 0.6 против 3,7 ± 0,4 %; ри=0,047) при отсутствии достоверных различий в содержании СВ4""Т-клеток памяти (26,4 ± 3,1 против 26,1 ± 2,5 %; ри=0,95), свидетельствовало о более интенсивном восстановлении пула наивных CD4+ Т-клеток.

Б □ МСК-" MCKf

Рис.4. Абсолютное содержание субпопуляг/ий лимфоцитов ПК больных после АТГСК в группах МС.К+ и МСК(-).

Таким образом. ко-трансплантация аутологичных МСК повышает эффективность раннего восстановления лимфоцитов как за счет Т-клеток памяти, так и наивных Т-клеток. При этом стимулирующий эффект МСК на восстановление наивных С04+Т-клеток является более выраженным.

Поскольку одним из механизмов гомеостаза Т-лимфоцитов в условиях лимфопении является периферическая экспансия Т-клегок, на следующем этапе исследовали влияние МСК на пролиферацию МНК. индуцированную IL-2, -цитокином. участвующим в поддержании гомеостатической пролиферации Т-клеток. [Cho J.H., 2007, Sprenl .Т., 2011]. Эффект МСК оценивали по индексу влияния (ИВ), который рассчитывался как отношение 1L-2 стимулированного ответа МНК в присутствии и отсутствии МСК и интерпретировали как стимулирующий при значениях ИВ > 1, и ингибирующий - при значениях ИВ < 1.

Добавление МСК в культуры МНК доноров в соотношении МСК:МНК 1:50, 1:10 и 1:2 усиливало IL-2 стимулированную пролиферации МНК соответственно на 33, 43% и 50%, однако при больших дозах МСК не влияли на пролиферацию

лимфоцитов (рис. 4). При этом между ИВМСК и уровнем ответа МНК на 4-2 отмечалась обратная корреляционная связь (Я=-0,60, р8=0,0024: при соотношении МНК:МНК=1:2). МСК больных также усиливали 1Ь-2-стимулированную пролиферацию в культурах аллогенных МНК больных. Стимулирующий эффект МСК максимально проявлялся при соотношениях МСК:МНК 1:50 и 1:10 и постепенно снижался по мере возрастания количества добавляемых МСК (рис. 4). Характерно, что ответ МНК больных на стимуляцию 1Ь-2 был достоверно ниже, чем у доноров (1879 ± 485 против 3322 ± 597 имп/мин, р11=0,048). Видимо поэтому МСК 3-х из 8-ми тестируемых пациентов, не обладающие стимулирующей активностью в культурах МНК доноров, усиливали 1Ь-2 стимулированную пролиферацию в культурах МНК больных. Так же как и в культурах МНК доноров ИВмск обратно коррелировал с уровнями ответа на 1Ь-2 (г8 = -0,56. р8=0,059; МСК

Таким образом. МСК больных ЗЛ способны усиливать ИЛ-2-

индуцированную пролиферацию

МНК. Стимулирующий эффект МСК регистрируется в относительно широком диапазоне соотношений МСК:МНК - от 1:50 до 1:2 . При этом важным фактором, детерминирующим стимулирующий эффект МСК, является реактивность отвечающих МНК на ИЛ-2. Так, стимулирующий эффект МСК более выражен в культурах МНК с низким пролиферативным ответом на 1Ь-2, т.е. на фоне снижения реактивности лимфоцитов к гомеостатическим стимулам.

Важная роль в иммунной реконституции отводится также включению тимопоэза и пополнению наивных Т-клегок за счет недавних мигрантов из тимуса. Химиотерапия оказывает повреждающее действие на эпителиальные клетки тимуса и тимопоэз, поэтому длительное время восстановление Т-лимфоцитов происходит преимущественно за счет периферической экспансии Т-клеток. Продемонстрированная более высокая эффективность восстановления не только клеток памяти, но и наивных Т-клеток, позволила предположить, что эффект МСК, участвующих в создании тимического микроокружения и поддержании функций эпителиальных клеток [1им М., 2007], может быть связан с активацией тимопоэза и/или миграцией Т-клеток из тимуса. Чтобы проверить это предположение, был проведен сравнительный анализ содержания в периферической крови наивных Т-лимфоцитов, экспрессирующих С031 (фенотипический маркер, характеризующий недавние мигранты из тимуса), в группах больных со стандартной ТГСК и котрансплантацией МСК на момент выхода из лимфопении, а также через 6 и 12 мес после АТГСК.

До АТГСК содержание СОЗГ наивных Т-клеток у больных составляло в среднем 12,7 ± 1,5 (п=26) и было достоверно снижено по сравнению со здоровыми

-»-МНК доиурйв

0.5 ■ .....

1:50 1:10 1:2 1:1

Рис. 4. Влияние МСК больных мшфомами на 1Ь-2-атшулированную пролиферацию МНК периферической крови доноров и аллогенных больных.

Результирующие кривые значений индексов влияния пролиферации МНК доноров (п=23) и аллогенных пациентов (п=12) в присутствии различных доз МСК больных (п=8). Данные представлены в виде М-ЧЕ (МНК доноров), М+БЕ (МНК больных).

донорами (28.9 ± 2,3 %; п=15; ри=0,000006), что свидетельствует о глубоком угнетении функции тимуса на фоне проведения ПХТ. Динамика СЭ31 + наивных Т-клеток в посттрансплантационном периоде была исследована у 19 пациентов в группе МСК(+) и 7 пациентов в группе МСК(-). У пациентов со стандартной АТГСК, относительное количество С[)31+ наивных Т-клеток на момент выхода из лимфопении не восстанавливалось до исходного уровня и было достоверно ниже, чем до АТГСК (4,78 ± 0,9 против 14,0 ± 1,8 %, р=0,0004) (рис. 5). В дальнейшем наблюдалось постепенное увеличение их количества. К 6 месяцам относительное содержание СБ31+ наивных Т-клеток увеличивалось до 12,8 ± 2,7 %, достигая исходных значений, к концу первого года возрастало до 17,7 ± 4,2 %, оставаясь ниже, чем у доноров (ри=0,057), хотя и достоверно выше, чем до АТГСК (р=0,043).

В группе МСК(+) на момент восстановления лимфоцитов количество С031+ наивных Т-клеток также было ниже исходного - 3,99 ±1,1 против 9,47 ± 2,7 % (р=0,091), с дальнейшим повышением к 6 месяцам до 14,5 ± 6,4 % и к 12 мес - до 23,1 ± 7,9 % (достоверно превышая исходный уровень (р=0,043). При этом, если в группе со стандартной АТГСК содержание СБ31+ наивных Т-клеток к 6 мес и исходу года было ниже или приближалось к нижнему порогу нормативных значений (ри=0,0003 и ри=0,057), то в группе МСК(+) доля С04ЧЛЭ45КА+С03Г наивных Т-клеток на период 6 и 12 мес достоверно не отличалась от нормативного уровня (ри=0,1 и ри=0,35).

Рис. 5. Относительное количество С.04*С045НА*С031+ субпопуляции наивных Т-клепюк в группах больных МСК(+) и МСК(-) до и после АТГСК. Данные представлены в виде М ± 8Е. Серым цветом выделена область значений здоровых доноров. Верхней горизонтальной пунктирной линией представлено среднее (28,9 %), нижней - минимальное значение (18 %).

# р<0,05 в сравнении с донорскими показателями по и-критерию Вилкоксона-Манна-Уитни.

Таким образом, у больных с ко-трансплантацией МСК наблюдается более быстрое восстановление наивных С031+ Т-клеток, уровень которых к 6-му месяцу не отличается от такового у доноров. Данный факт является аргументом в пользу более раннего восстановления тимопоэза на фоне ко-трансплантации МСК по сравнению со стандартной АТГСК.

Очередной этап работы был посвящен изучению особенностей восстановления Трег после ТГСК, в том числе на фоне ко-трансплантации МСК, а также анализу возможной взаимосвязи Трег с показателями выживаемости у больных лимфомами. Для изучения динамики восстановления Трег был проведен сравнительный анализ относительного и абсолютного количества этих клеток до и в течение года после проведения АТГСК.

По сравнению с донорами у больных, обследованных до начала АТГСК, относительное содержание С04+СБ25Ы и СБ4+Р0ХРЗ+ Трег было повышено (2.1±0,2 против 1,35±0,1%; ри<0.001 и 5,9±0,5 против 3,8±0,3%; р„<0,001, соответственно). Однако, из-за наличия лимфопении. абсолютные количества этих клеток были сходны с таковыми у доноров. После проведения АТГСК на момент выхода из лейкопении относительное содержание циркулирующих СИ4+С025 1 и С04+Р0ХРЗ+ Трег увеличивалось до 3,2±0,6 и 8,3±1,1%, соответственно (ри<0,05). Поскольку в этот период абсолютное число лимфоцитов не восстанавливалось до исходного уровня (0,85±0,08 против 1,49±0,17 х 109/л; ри<0,001), абсолютное количество Трег значимо не отличалось от значений в предтрансплантационном периоде. Через 6 мес после АТГСК абсолютное содержание лимфоцитов восстанавливалось до исходного уровня (1,52±0,19 х 109/л), но ниже нормативных значений. Доля С04+С025ы Т-клеток снижалась до исходного уровня (2,05 ± 0,3%), а С04+Р0ХРЗ+ - даже ниже (3,6±0,4%), достигая донорских значений. Через 12 мес, на фоне дальнейшего увеличения абсолютного количества лимфоцитов (до 1,90 ± 0,33 х 109/л), абсолютные и относительные значения Трег достоверно не отличалось от уровня у доноров. Ко-трансплантация МСК не влияла на эффективность раннего восстановления Трег после АТГСК и динамику их последующего снижения, (рис. 6 А-Б).

Рис. 6. Относительное количество С04*С025Ы (А) и СОГГОХРЗ* (Б) субпопуляций Трег в группах больных МСК(+) и МСК(-) до и после АТГСК. Серым цветом выделен интерквантильный диапазон исследуемых значений у здоровых доноров. Горизонтальной пунктирной линией представлены средние значения: 1,35 % (А) и 3,82 % (Б). Данные представлены в виде М ± 5Е. * р11<0,05 в сравнении с донорскими показателями. # р11<0,05 в сравнении со значениями до АТГСК.

Абсолютное количество Трег в обеих группах также восстанавливалось к моменту выхода из лейкопении и в течение всего последующего периода достоверно не отличалось от такового до АТГСК и нормативных значений, а также между группами.

Анализ течения поеттрансплантаниониого периода в группе 37 пациентов, находящихся под наблюдением более 12 мес.. показал, что неблагоприятные исходы (рецидив или прогрессия заболевания) в течение первых 6 мес. после АГГСК наблюдались у 8 пациентов. Сравнение количества Трег на момент выхода из лимфопении у больных с оппозитными исходами выявило, что пациенты с рецидивом/прогрессией заболевания в течение первых 6 мес. отличались более высоким относительным и абсолютным содержанием CD4+CD25m (3,7 ± 1,0 против 2,2±0,3%; ри=0,086 и 0,038 ± 0,008 против 0,022 ± 0,003 х 109/л; ри=0,039) и CD4+FOXP3+ (11,7 ± 1,9 против 7,0±0,7%; ри=0,013 и 0,15 ± 0,05 против 0,070 ± 0,01 х 109/л; ри=0,071) по сравнению с пациентами, сохранившими полную и частичную ремиссию.

Для определения прогностической значимости содержания Трег на момент восстановления лейкоцитов в прогнозе течения посттрансплантационного периода был проведен ROC-аиализ. Построение ROC-кривых выявило достаточно высокую информативность определения содержания Трег. Площадь под кривой теста оценки относительного количества CD4+FOXP3+ Т-клеток в прогнозе 6-месячного исхода составила 0,80. Относительное содержание CD4+FOXP3+ Т-клеток более 9,1% позволяло прогнозировать неблагоприятный исход через 6 мес. со специфичностью 77,4% и чувствительностью 87,5% (рис. 7).

Таким образом,

относительное содержание Трег у больных лимфомами после АТГСК достаточно быстро (в течение одного месяца) достигает исходно повышенного уровня, после чего снижается и к исходу 12 мес достигает нормативных значений. Ко-трансплантапия относительно низких доз МСК не влияет на динамику восстановления Трег после АТГСК. При этом оценка содержания Трег на момент выхода из лейкопении позволяет прогнозировать течение посттрансплантационного периода.

В заключение было изучено влияние ко-трансплантрации МСК на ряд клинико-лабораторпых показателей, характеризующих эффективность АТГСК.

Анализ сроков восстановления кроветворения показал, что ко-трансплантация МСК позволила сократить продолжительность посттрансплантационной критической нейтропении (количество нейтрофилов менее 0,5 х 109/л) с 14 до 11 дней (рц=0,024) и времени выхода из нейтропении с 17го дня до Иго (рц=0,04). По сравнению со группой МСК(-) в группе МСК(+) наблюдалось также достоверное сокращение сроков критической тромбоцитопении (III ст.. количество тромбоцитов менее 50 х 10%) с 10-ти до 6-ти суток (ри=0,013) и времени выхода из тромбоцитопении с 17-го до 12-го дня (pU=0,002).

Анализ частоты развития инфекционных осложнений в сравниваемых группах не выявил значимых различий. В обеих группах наиболее частыми

J

AUC=0.804 р=0.00<37 ©5% ДИ: 0.66-0.95

Точка отелчвкия 9,115"А. Отношение правдоподобия 3.87 Чулстпит«™*кость 87.5% Специфичность 77,4%

100% - Специфичность, %

Рис. 7. КОС-анализ диагностической значимости относительного содержания С044И0ХРЗТ клеток на момент восстановления кроветворения после АТГСК в прогнозе рецидива в течение 6 мес.

осложнениями являлись эпизоды фебрильной лихорадки без уточненного очага инфекции. Поражение слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта (стоматит, эзофагит, гастрит и/или энтеропатия) выявлялось также с одинаковой частотой. Тяжелые поражения слизистых оболочек (мукозит III-!V степени, энтеропатия III степени) в группе МСК(-) выявлялись почти в 2 раза чаще, чем в группе МСК (таблица 2). Данные различия, несмотря на отсутствие достоверности, проявлялись в виде выраженного тренда и были, по-видимому, обусловлены более эффективной реконституцией Т-клеток в раннем посттрансплантационном периоде.

Таблица 15

Структура инфекционных осложнений

МСК(-) МСК(+)

Лихорадка без уточненного очага инфекции Нет Есть 17 (19 %) 73 (81 %) 9 (13 %) 64 (87 %) 0,26

Мукозит или энтеропатия нет І-ІІ ст. ІП-ІУ ст. 18 (20 %) 47 (52 %) 26 (28 %) 18 (24 %) 44 (60 %) 12 (16 %) 0,48 0,32 0,061

Анализ 5-летней общей выживаемости и выживаемости до рецидива/прогрессии в сформированных группах не выявил различий (72 % в группе МСК(-) против 71 % в группе МСК(+), р=0,89, и 57 % (МСК-) против бб % (МСК+), р=0,80, соответственно) (рис. 8, А-Б).

............................................................................... Б ,0"

м-

а-,

і...

— МСК * --- МСК-

11

а

а.

8. С

а

- МСК +

мск-

Рисунок 8. Анализ обгцей выживаемости (А) и выживаемости до прогрессии (Б) в группах больных со стандартной АТГСК (МСК-) и ко-трансплантацией МСК (МСК+).

Представлены данные по общей выживаемости по основному заболеванию 46 человек в группе МСК(-), 46 человек в группе МСК(+).

Кривые построены по методу Каплана-Майера, сравнительный анализ кривых выживаемости проводили с использованием непараметрического Ьо£-гапк-критерия. Медиана выживаемости в обоих случаях не достигнута.

Суммируя вышесказанное, можно заключить, что ко-трансплантация ГСК и МСК приводит к сокращению сроков восстановления кроветворения, позитивно влияет на процесс иммунной реконституции, сокращая частоту тяжелых инфекций,

и не оказывает негативного эффекта на выраженность ПХТ-индуцированной

нефро- и гепатотоксичности и показатели выживаемости.

ВЫВОДЫ

1. Ко-трансплантация аутологичных МСК больным ЗЛ на фоне АТГСК повышает частоту раннего восстановления лимфоцитов. Эффект МСК наиболее выражен у пациентов с низким содержанием СЭ34+ ГСК или лимфоцитов в составе продукта афереза, что свидетельствует о стимулирующем влиянии МСК на различные факторы восстановления пула лимфоцитов, связанные с приживлением ГСК и периферической экспансией лимфоцитов, соответственно.

2. Пациенты с ко-трансплантацией МСК в раннем посттрансплантационном периоде отличаются более высоким абсолютным количеством С045Я0+ Т-клеток памяти (в 2 раза) и СМ5К/\+ наивных Т-лимфоцитов (в 1,4 раза) и относительным содержанием наивных С04+ Т-клеток (в 1,6 раза), что указывает на способность МСК усиливать восстановление обеих популяций Т-лимфоцитов с более выраженным эффектом в отношении наивных С04+ Т-клеток.

3. МСК больных ЗЛ усиливают 1Ь-2-индуцированную пролиферацию МНК в диапазоне соотношений МСК:МНК (1:2-1:50), при этом эффект МСК обратно коррелирует с исходным уровнем ответа МНК на П--2, что свидетельствует о способности МСК поддерживать экспансию лимфоцитов в условиях, моделирующих гомеостатическую пролиферацию, особенно при исходно низкой реактивности.

4. Больные ЗЛ с ко-трансплантацией МСК в отличие от пациентов со стандартной АТГСК характеризуются более быстрым восстановлением С04+С045ЯА+С031 + Т-клеток, относительное количество которых к 6-му месяцу достигает нормативного уровня, что свидетельствует о более эффективной реконституции наивных Т-лимфоцитов с фенотипом недавних мигрантов из тимуса на фоне введения МСК.

5. Как при стандартной АТГСК, так и при ко-трансплантации МСК относительное содержание С04+Р0ХРЗ+ и СП4+СП25к' регуляторных Т-клеток у больных ЗЛ восстанавливается до исходно повышенного уровня в течение месяца и постепенно снижается до нормативных значений к 12 месяцам. Сходная динамика восстановления Трег свидетельствует, что введение МСК не сопровождается количественной экспансией Трег.

6. Развитие раннего рецидива/прогрессии заболевания после АТГСК ассоциируется с более высоким содержанием СР4+РОХРЗ+ и С04+С025 Трег. Уровень Трег на момент выхода из лейкопении характеризуется высокой диагностической информативностью, что свидетельствует о взаимосвязи количества Трег с развитием рецидива и позволяет прогнозировать неблагоприятный исход АТГСК в течение 6 мес. при значениях С04+Р0ХРЗ+ Трег более 9,1 % со специфичностью 77,4 % и чувствительностью 87,5 %.

7. Ко-трансплантация аутологичных МСК больным ЗЛ на фоне АТГСК приводит к сокращению продолжительности нейтро- и тромбоцитопении. снижению в 1,75 раза частоты тяжелых инфекционных осложнений и не сопровождается нарастанием ПХТ-индуцированной нефро- и гепатотоксичности и ухудшением показателей 5-летней выживаемости, что научно обосновывает возможность применения МСК с целью повышения эффективности инграфтинга ГСК и иммунной реконституции у больных злокачественными лимфомами.

Список статей, опубликованпых по теме диссертация.

1. Черных Е.Р., Баторов ЕВ.. Шевела Е.Я., Пронкина HB., Сергеевичева В.В, Гилевич A.B., Баранова Д.С., Останин A.A., Крючкова ИВ. Влияние мезенхимальных стромальных клеток на раннее восстановление лимфоцитов у больных злокачественными лимфомами с аутологичной трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток // Бюллетень СО РАМН.- 2011,- Т.31, № 2,- С 101-107.

2. Баторов Е В . Шевела Е.Я., Крючкова И В, Сергеевичева В В., Гилевич А.В , Баранова Д.С., Черных Е.Р. Влияние мезенхимальных стромальных клеток на восстановление регуляторных Т-лимфоцитов у больных лимфомами после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток // Вестник Уральской медицинской академической науки.- 201 !.- № 2/1 (35) - С 97-98.

3. Шевела Е.Я., Баторов ЕВ., Пронкина Н.В., Тихонова М.А., Крючкова КВ., Сергеевичева ВВ., Останин A.A., Черных Е.Р., Козлов В.А. Особенности восстановления кроветворения и реконстигуции лимфоцитов у больных лимфомами с ко-трансплантацией гемопоэтических стволовых и мезенхимальных стромальных клеток//Российский иммунологический журнал.- 2011.- T.S (14), № 3-4,- С 313-321.

4. Батоиов ЕВ. Шевела ЕЯ, Тихонова М.А., Крючкова И.В., Баранова Д.С., Сергеевичева В В , Сизикова С.А., Ушакова Г.Ю., Гилевич A.B., Останин A.A., Черных Е.Р Регуляторные 'Г-клетки у больных лимфомами после аутологичной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток // Клиническая опкогематология.- 2012.-Т.5,№ 1 - С 61-67.

5. Баторов Е В , Шевела Е.Я., Крючкова И.В., Баранова Д.С., Сергеевичева В В., Сизикова С.А., Ушакова ПО., Гилевич A.B., Останин A.A., Черных Е.Р Влияние мезенхимальных стромальных клеток на клинико-лабораторные показатели эффективности трансплантации аутологичных гемопоэтических стволовых клеток у больных лимфомами // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН,- 2012,- № 3 (85), часть 2,- С. 3337.

6. Chernykh E.R., Batorov E.V., Shevela E.Y., Prankina N.V., Segeevicheva V.V., Kryuchkova I.V., Gelevich A.V., Ostanin A.A., Kozlov V.A. Mesenchimal stromal cell co-infusions increase early lymphocyte recovery and T-cell reconstitution in autologous haematopoietic stem cell transplantation // Bone Marrow Transplantation.- 2011.- Vol. 46, Suppl. 1.- P. 195-196. (P724).

7. Batorov E.. Shevela E„ Tihonova M., Pronkina N., Kryuchkova 1„ Sergeevicheva V., Gilevich A., Baranova D., Chernykh E„ Ostanin A. Mesenchymal stromal cells enhance early T-lymphocyle recovery in hematological patients following autologous hematopoietic stem cell transplantation // Association for Cancer Immunotherapy (CIMT) 9th Annual Meeting.- May, 2011.- Mainz, Germany.- Abstract Book 2011.- P. 108.

8. Batorov E.V., Shevela E.Ya., Tihonova M.A., Kryuchkova I.V., Sergeevicheva V.V., Baranova D.S., Sizikova S.A., Ushakova G.Ju., Gilevich A.V., Chernykh E.R., Ostanin A.A. Regulatory T-cells recovery in lymphoma patients following autologous hematopoietic stem cell transplantation //The 3rd International Conference on Regulatory T Cells and Helper T Cell Subsets and Clinical Application in Human Diseases. Abstract book. - 2012. - P. 73-74 (No. 002).

Подписано к печати 20.03.2013 формат - 60x84 1/8, Усл. печ. л. 1 Бумага: офсетная Печать: трафаретная Тираж: 100 экз. Номер заказа № 166 ООО " Типография ЮГУ С", ИНН 5402548639, г. Новосибирск, ул. Залесского, 4, •тел.: (333) 226-14-56, 225-04-47