Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Характеристика иммунокомпетентных и гемопоэтических стволовых клеток в продукте афереза у больных гемобластозами

На правах рукописи

Баторова Дарья Сергеевна

ХАРАКТЕРИСТИКА ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ И ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК В ПРОДУКТЕ АФЕРЕЗА У БОЛЬНЫХ ГЕМОБЛАСТОЗАМИ

14.01.21 - гематология и переливание крови 14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Новосибирск - 2014

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном

учреждении высшего профессионального образования «Новосибирский

государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Поспелова Татьяна Ивановна

доктор медицинских наук, профессор

член-корреспондент РАН Черных Елена Рэмовна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Зарнцкий Андрей Юрьевич (Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный медицинский исследовательский центр имени В. А. Алмазова» Министерст ва здравоохранения Российской Федерации, директор Института гематологии)

доктор медицинских наук Повещенко Александр Федорович

(Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии», заведующий лабораторией физиологии протективной системы)

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства» (г. Санкт-Петербург)

заседании диссертационного совета Д 208.062.04 на базе Новосибирского государственного медицинского университета (630091, г. Новосибирск, Красный проспект, 52; тел.: (383) 229-10-83)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Новосибирского государственного медицинского университета (630091, г. Новосибирск, Красный проспект, 52; тел.: (383) 229-10-83; http://www.ngmu.ru/dissertationy350)

Автореферат диссертации разослан 2015 г.

Защита диссертации состоится

часов на

Ученый секретарь диссертационного совета

К.Ю. Макаров

РОССИЙСКАЯ г 0СУДЛРС1 ВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА

2015 _

—ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Гемобластозы относятся к числу часто встречающейся онкологической патологии. Они составляют около 5 % в общей структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями, но в возрастной группе до 30 лет их доля достигает 30 % и более, обусловливая особое социальное значение. Преобладание агрессивных форм у лиц молодого возраста обусловливает увеличение смертности, в частности от неходжкинских злокачественных лимфом, на 2—4 % в год [Поддубная И.В., Демина Е.А., 2004; Воробьев А. И., 2003; Волкова М. А.,2007]. Перечисленные факторы требуют совершенствования существующих методов терапии.

Аутологичная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (АТГСК) после высокодозовой химиотерапии является эффективным методом лечения гематологических заболеваний. В мире ежегодно выполняется более 30000 АТГСК [Савченко В. Г., 2012; Pasquini М.С., Wang Z„ 2013]. До 90% приходится на долю лимфопролиферативных заболеваний и острых лейкозов (OJ1) [Gratwohl A. et al., 2013], для большинства из которых при рецидиве и первично-рефрактерном течении проведение высокодозовой химиотерапии с АТГСК является терапией выбора [Ljungman P. et al., 2006]. Однако рецидив заболевания после АТГСК остается основной причиной смерти [Pasquini M. С., Wang Z., 2013].

Восстановление пула Т-клеток в течение первых месяцев после АТГСК происходит путем гомеостатической пролиферации трансплантируемых зрелых лимфоцитов. Удаление из продукта сепарации негемопоэтических клеток приводит к удлинению периода лимфопении и увеличению риска инфекционных осложнений в постгрансплантационном периоде [Diviné M. et al., 1999; Friedman J., Lazarus H. M., Кос O. N„ 2000; Singh R. К. et al., 2007]. При этом количество реинфузируемых лимфоцитов и их субпопуляций (CD8+-клеток, NK-клеток) коррелирует со сроками выхода из лимфопении [Hiwase D. К. et al., 2008; Atta Е. H. et al., 2009; Kim D. G. et al., 2006], а раннее восстановление лимфоцитов является фактором увеличения показателей выживаемости после АТГСК [Porrata L. F. et al., 2010]. Реинфузируемые клетки являются не только источником экспансии периферических лимфоцитов, но и продуцентами цитокинов, в частности интерлейкина-7 (ИЛ-7) и

интерлейкина-15 (ИЛ-15), необходимых для быстрого восстановления лимфоцитов [Porrata L. F. et al., 2010; Melenhorst J. J. et al., 2012].

Вместе с тем, не до конца ясна роль регуляторных Т-клеток (Трег) в патогенезе гемобластозов: описано подавление ими как противоопухолевого иммунного ответа [Mittal S. et al., 2008; Szczepanski M. J. et al., 2009], так и пролиферации малигнизированных лимфоцитов [Tzankov A. et al., 2008; Carreras J. et al., 2006]. Не изучено влияние трансплантируемых Трег на процессы иммунологической реконституции и исход терапии. Есть данные, что восстановление этих клеток после аллогенной трансплантации идет путем периферической экспансии Трег донора [MatsuokaK. et al., 2010]. Также описана сниженная чувствительность Трег к режимам мобилизации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), что может привести к относительно большему их содержанию в продукте афереза [Samuel Е. R. et al., 2014].

Мобилизацию ГСК в периферическую кровь (ПК) проводят с помощью препаратов гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ). Используемые дозы Г-КСФ влияют на клеточный состав лейкоцитов и на продукцию цитокинов [Sloand Е. М. et al., 2000; Jun Н. X., Jun С. Y., Yu Z. X., 2004]. При использовании конъюгированного с полиэтиленгликолем Г-КСФ (ПЭГ-Г-КСФ) для мобилизации ГСК доноров происходит активация и экспансия субпопуляций лимфоцитов, отличных от таковых при мобилизации стандартным препаратом Г-КСФ [Morris Е. S. et al., 2004; Morris Е. S., MacDonald К. Р., Hill G. R„ 2006], однако конкретные изменения в клеточном составе продукта сепарации в зависимости от используемого препарата Г-КСФ до настоящего времени не изучены.

Вышеизложенное определило цель и задачи настоящего исследования.

Цель исследования. На основе изучения особенностей субпопуляционного состава и функциональной активности клеток в продуктах сепарации у больных гемобластозами в зависимости от клинической формы, режима мобилизации и исхода трансплантации гемопоэтических стволовых клеток оценить клиническую и прогностическую значимость количественных и функциональных параметров трансплантируемых клеток.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Исследовать относительное содержание различных субпопуляций лейкоцитов в продукте афереза и периферической крови больных гемобластозами.

2. Оценить содержание клеток с регуляторной активностью и их взаимосвязь с количественными и функциональными показателями иммунокомпетентных клеток продукта сепарации.

3. Охарактеризовать субпопуляционный состав и продукцию цитокинов клетками продукта сепарации больных с различными формами гемобластозов (лимфомы, множественная миелома, острые лейкозы).

4. Исследовать влияние лекарственной формы препарата гранулоцитарного колониестимулирующего фактора на субпопуляционный состав и продукцию цитокинов клетками продукта сепарации больных лимфомами и множественной миеломой.

5. Изучить количественные и функциональные параметры иммунокомпетентных и стволовых кроветворных клеток продукта афереза у больных гемобластозами с различными исходами аутологичной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.

Научная новизна. Впервые продемонстрировано, что по сравнению с периферической кровью продукт афереза у больных гемобластозами содержит более высокое относительное количество СОЗ+ Т-клеток и С04+ клеток за счет избирательного накопления СЕ>4+ и С08+ Т-клеток памяти и более низкое количество СБ8+ наивных клеток и В-лимфоцитов. При этом мобилизация и сепарация не приводят к возрастанию в продукте афереза Трег. Охарактеризовано содержание различных субпопуляций клеток с супрессорной активностью (Трег, незрелые миелоидные клетки) в продукте афереза и продемонстрирована связь между более высоким содержанием СЕ)4+РОХРЗ+ клеток и незрелых форм гранулоцитов с более низким относительным количеством эффекторных Т-лимфоцитов и моноцитов.

Впервые выявлены различия в составе и функциональной активности аутологичных продуктов афереза в зависимости от нозологической формы заболевания. Показано, что продукты сепарации больных ОЛ отличаются более высоким содержанием С04+СВ25|" Трег, более низким количеством гранулоцитов, более высокой продукцией провоспалительных цитокинов и

5

меньшим относительным содержанием покоящихся ГСК. Продукты сепарации больных множественной миеломой (ММ) содержат значимо более высокое количество Сй19+ В-лимфоцитов и отличаются более низкой продукцией провоспалительных цитокинов.

Впервые продемонстрировано, что при использовании ПЭГ-Г-КСФ клетки продукта сепарации отличаются более высоким количеством Трег и более низким содержанием моноцитов, более высокой продукцией ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7 и содержат большее количество пролиферирующих гемопоэтических клеток-предшественников, чем образцы сепарата при использовании стандартного (неконьюгированного) Г-КСФ.

Установлено, что у больных ММ развитие рецидива ассоциировано с более высоким содержанием С019+ В-клеток в продукте сепарации (> 2,5 %). Также впервые установлено, что больные ОЛ с развитием рецидива после АТГСК отличаются значимо более высоким относительным содержанием С08+С045Я0+ Т-клеток. Впервые описана обратная связь между продукцией клетками продукта сепарации ИЛ-2 и сроками восстановления лимфоцитов после АТГСК.

Теоретическая и практическая значимость. Теоретическая значимость работы заключается в расширении и систематизации данных о факторах, ассоциированных с вариабельностью субпопуляционного состава и функциональной активности клеток, содержащихся в продукте сепарации. Факторами, влияющими на состав и функции трансплантируемых клеток в составе продуктов афереза, являются селективное обогащение определенных клеточных субпопуляций в процессе самой процедуры сепарации, клиническая форма заболевания и тип используемого препарата Г-КСФ. Выявленная взаимосвязь между количеством СЭ4+РОХРЗ+ Трег, незрелых миелоидных клеток и отдельных субпопуляций клеток (СЭ16+ ЫК-клетки, СЭЗ+, СБ4+ Т-клетки, моноциты) продукта афереза указывает на потенциальное влияние клеток с регуляторной активностью на иммунную реконституцию. Описанные в работе ассоциации более высокого содержания СЭ19+ В-клеток и С08+С0451Ю+ Т-клеток в продуктах сепарации больных ММ и ОЛ с развитием рецидива могут иметь значение для дальнейшего изучения патогенеза этих заболеваний.

Практическая значимость работы заключается в выявлении более высокого содержания в продукте афереза С04+С025Ь'8Ь и С04+ТОХРЗ+ Трег при мобилизации с использованием ПЭГ-Г-КСФ, что обусловливает необходимость сравнительных исследований исходов АТГСК при использовании различных лекарственных форм Г-КСФ. Другим прикладным аспектом является выявление высокой прогностической значимости содержащихся в продукте сепарации В-лимфоцитов в оценке исходов АТГСК у больных ММ. Кроме того, выявленное более высокое содержание С08+СЭ451Ю+ Т-клеток в продуктах сепарации у больных ОЛ с последующим развитием рецидива позволяет рассматривать данный маркер в качестве потенциального предиктора неблагоприятного исхода при остром лейкозе.

Положения, выносимые на защиту

1. Селективное обогащение определенных клеточных субпопуляций в процессе процедуры сепарации, нозологическая форма заболевания и тип используемого препарата Г-КСФ являются факторами, влияющими на субпопуляционный состав и цитокин-секреторную активность продукта сепарации у больных гемобластозами при проведении АТГСК.

2. Регуляторные Т-клетки не подвержены селективному накоплению в процессе процедуры сепарации, характеризуются наиболее высоким содержанием в образцах сепаратов больных ОЛ, у больных лимфомами и ММ их количество увеличивается при использовании для мобилизации ПЭГ-Г-КСФ. Более высокий уровень СЭ4+РОХРЗ+ Трег и незрелых миелоидных клеток в продукте сепарации больных гемобластозами ассоциирован с меньшим количеством С016+ ЫК-клеток, СОЗ+, СЭ4+ Т-лимфоцитов и СО 14+НЬ А-ОЯ+ моноцитов.

3. Развитие рецидива основного заболевания после АТГСК ассоциировано со значимо более высоким количеством СБ19+ В-клеток в продуктах афереза у больных ММ и более высоким относительным количеством С08+ клеток памяти в продуктах сепарации у больных ОЛ.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на 5-м Международном симпозиуме «Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток у детей и взрослых», посвященном памяти Р.М.Горбачевой (Санкт-Петербург, 2011), на Всероссийской научно-

7

практической конференции «Дни иммунологии в Сибири» (Иркутск, 2012), на Конгрессе гематологов России (Москва, 2012). Апробация диссертации состоялась 30 июня 2014 г. на расширенном заседании сотрудников кафедры терапии, гематологии и трансфузиологии ФПК и ППВ, кафедры акушерства и гинекологии и кафедры педиатрии Новосибирского государственного медицинского университета с участием членов диссертационного совета Д 208.062.04.

Внедрение. Исследование относительного содержания СЭ19+ В-клеток в продуктах афереза больных множественной миеломой внедрено в практику работы отделения гематологии с блоком трансплантации костного мозга клиники иммунопатологии ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии» (г. Новосибирск). Материалы диссертации получили отражение в учебном процессе на кафедре терапии, гематологии и трансфузиологии ФПК и ППВ Новосибирского государственного медицинского университета.

Диссертация выполнена в соответствии с планом НИР ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава России (номер государственной регистрации 01200952283).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 6 статей в научных журналах и изданиях, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов для публикаций материалов диссертации.

Объем и структура диссертации. Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, 3 глав, обсуждения полученных результатов, выводов и практических рекомендаций. Материал изложен на 122 страницах машинописного текста, включающего 24 таблицы и 11 рисунков. Указатель литературы содержит 174 литературных источника, в том числе 166 иностранных.

Личный вклад автора. Весь материал, представленный в диссертации, собран, обработан и интерпретирован лично автором.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование одобрено комитетом по этике Новосибирского

государственного медицинского университета (протокол № 21 от 18.02.2010).

Дизайн исследования представлен на рисунке 1.

Рисунок 1 - Дизайн исследования

Работа выполнена в отделении гематологии с блоком трансплантации костного мозга клиники иммунопатологии, в лаборатории клеточной иммунотерапии отдела клинической иммунологии ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии» (НИИФКИ) (руководитель лаборатории член-корреспондент РАН, доктор

медицинских наук, профессор Е. Р. Черных); на кафедре терапии, гематологии и трансфузиологии ФПК и ППВ Новосибирского государственного медицинского университета (заведующий кафедрой доктор медицинских наук, профессор Т. И. Поспелова).

Диссертационная работа основана на результатах клинико-иммунологического обследования 55 больных неходжкинскими лимфомами (HXJI, п= 12), лимфомой Ходжкина (JIX, п= 15), множественной миеломой (ММ, п = 17) и OJI (п = 11) в возрасте от 19 до 58 лет, находившихся на стационарном лечении в отделении гематологии с блоком трансплантации костного мозга клиники иммунопатологии НИИФКИ с 2010 по 2012 гг.; АТГСК проведена 50 из них. В исследование не были включены больные лимфомами с поражением костного мозга. Мобилизацию ГСК проводили с использованием различных режимов химиотерапии с последующим введением препаратов Г-КСФ 5-10 мкг/кг/день у 40 больных. ПЭГ-Г-КСФ применялся у 15 больных.

Процедуру афереза начинали по достижении концентрации ГСК 1 х 104 CD34+ клеток/мл ПК и продолжали до получения > 2,0 х 106 CD34+ клеток/кг, используя сепараторы клеток крови AS ТЕС 204 (Fresenius) и Spectra LRS 07 (СОВЕ).

ГСК трансплантированы больным HXJI, JIX и ММ (п = 40) в средней дозе 5,50 ±0,4 х 106 клеток/кг (2,2-13,9 х 106 клеток/кг), больным ОЛ (п = 10) -7,70 ±1,8 х 106 клеток/кг (3,1-20,0 х 106 клеток/кг). Пациенты получали режимы кондиционирования: BEAM (п = 25) и мелфалан 150-200 мг/м2 (п = 25).

Методы лабораторных исследований. У больных в день сепарации и на день выхода из лимфопении после АТГСК из центрального венозного катетера или кубитальной вены забирали 10-20 мл крови в пробирки BD Vacutainer с Li-гепарином (Becton Dickinson, Нидерланды). Для изучения клеточного состава продукта сепарации забирали 1 мл содержимого из пакета для криоконсервации сразу после окончания процедуры афереза. Для исследования использовалась лейковзвесь, полученная путем гравитационного разделения.

Определение количества лимфоцитов. В работе использованы результаты общего анализа крови, рутинно проводимого больным на автоматическом

гематологическом анализаторе Hema-Screen 18 (Hospitex Diagnostics, Италия). Подсчет лейкоцитарной формулы производился с помощью микроскопии препарата, окрашенного по Романовскому-Гимза.

Определение субпопуляций клеток методом проточной цитометрии. Исследовали МНК ПК и продукта сепарации в течение 1 часа после получения. Приготовление образцов для определения относительного содержания субпопуляций клеток, экспрессирующих поверхностные и внутриклеточные маркеры, проводили в соответствии с методикой Becton Dickinson и исследовали на лазерном проточном цитометре FACSCalibur (Becton Dickinson, США) с использованием программы CellQuest (Becton Dickinson, США). Процент позитивных клеток, экспрессирующих соответствующие CD-маркеры, определяли в лимфоцитарном гейте (минимум 30 ООО событий). Для определения субпопуляций Т-, NK-, В-лимфоцитов и моноцитов использовали FITC-, РЕ- и РегСР-меченные моноклональные антитела против антигенов CD3, CD4, CD8, CD45RA, CD45RO, CD25, CD127, FOXP3, CD16, CD19, CD14 (eBioscience и Becton Dickinson, США).

Определение клеточного цикла в CD34*-клетках. Клетки метили РЕ-меченными анти-СОЭ4 антителами (Becton Dickinson, США), фиксировали и пермеабилизировали стандартно. Клетки инкубировали с РНКазой (20мкг/мл) в течение 30 минут, добавляли пропидиум иодид 50 мкг/мл или 7-актиноаминомицин D 20 мкг/мл. Образцы анализировали на проточном цитометре FACSCalibur с использованием программы CellQuest. Относительное содержание клеток с гипердиплоидным (клетки в S/M фазах) и с гиподиплоидным (апоптотические клетки) набором ДНК определяли по степени флуоресценции по каналу FL-3.

Оценка секреторной активности мононуклеарных клеток (МНК) продукта сепарации. Спектр и концентрацию секретируемых цитокинов изучали в супернатантах МНК, полученных в стандартизованных условиях культивирования (10° МНК; 48 ч). Оценивался уровень спонтанной и стимулированной продукции медиаторов в ответ на липополисахарид Е. coli в дозе 10 мкг/мл (ЛПС, Sigma-Aldrich, США). Определение концентраций цитокинов в культуральных супернатантах проводили методом протеомного анализа на двухлучевом лазерном автоматизированном анализаторе BioPlex

и

Protein Assay System (BioRad, США) с использованием набора Human Cytokine 17-Plex Panel (ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-13, ИЛ-17, Г-КСФ, IFN-y, MCP-1, MIP-ip, ФНО-а).

Статистическая обработка полученных результатов производилась с использованием программ Statistica 6.0 (StatSoft) и GraphPad Prism 5 (GraphPad Software Inc.). Для оценки значимости различий дискретных переменных использовали критерий %2 (Р^2) и точный метод Фишера (Ртмф)- Для оценки значимости различий независимых непрерывных переменных использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни (Ри). Для оценки значимости различий зависимых выборок использовали критерий Вилкоксона для парных выборок. Для оценки взаимосвязи количественных показателей с качественными альтернативно распределенными признаками применяли коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Для оценки диагностической значимости показателей использовали ROC-анализ с расчетом площади под кривой. Анализ выживаемости проведен по методу Каплана-Мейера с оценкой достоверности по log-rank-критерию. Различия считали достоверными при уровне значимости р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Чтобы оценить изменения клеточного состава в процессе процедуры сепарации, был проведен сравнительный анализ субпопуляционного состава МНК ПК и продукта афереза. По сравнению с ПК продукт афереза характеризовался более высоким содержанием CD3+ Т-клеток, CD14+HLA-DR+ моноцитов и меньшим количеством CD19+ В-клеток (таблица 1).

Таблица 1 - Относительное содержание субпопуляций МНК в ПК и продукте сепарации больных гемобластозами

МНК ПК (n = 46) Продукт сепарации (n = 55) P*

CD3\ % 63,1 ± 3,568 (68,0) 69,2 ±2,181 (71,0) 0,037

CD4\ % 38,3 ±2,194 (39,0) 42,4 ± 1,574(46,0) 0,012

CD4+CD45RA+, % 12,4 ±0,983 (12,0) 10,7 ± 1,023 (9,0) 0,37

CD4+CD45RO+, % 22,7 ± 1,264 (23,0) 29,8 ± 1,291 (30,8) 0,00001

CD8\ % 22,8 ± 1,680(21,0) 21,3 ± 1,473 (20,0) 0,71

CD8+CD45RA+, % 13,8 ± 1,173(12,5) 9,8 ± 0,743 (9,0) 0,0021

мнк ПК (п = 46) Продукт сепарации (п = 55) р*

CD8+CD45RO\ % 7,7 ±0,671 (6,6) 9,8 ± 0,875 (8,3) 0,013

CD19\ % 6,1 ± 1,083(5,0) 3,6 ± 0,748 (2,0) 0,023

CD16+, % 12,7 ±2,137 (10,0) 7,2 ± 1,322(4,0) 0,085

CD14+HLA-DR+, % 52,1 ±4,773 (51,3) 62,8 ± 2,828 (69,0) 0,015

CD4+CD45RA7CD4+CD45RO+ 0,6 ± 0,054 (0,47) 0,4 ± 0,059 (0,29) 0,002

CD8+CD45RA+/CD8+CD45RO+ 2,1 ±0,189(1,75) 1,4 ±0,146 (0,92) 0,0001

CD4+CD25hlgl\ % 2,1 ±0,205(1,77) 1,8 ±0,134 (1,56) 0,11

CD4+CD25+CD127", % 6,1 ±0,741 (4,90) 5,4 ± 0,306 (5,0) 0,74

CD4+FOXP3+, % 7,1 ±0,594(7,0) 6,6 ± 0,508 (6,0) 0,91

Примечание. * р - критерий Вилкоксона для парных выборок. Данные в виде М ± БЕ (Ме).

При сравнительном исследовании субпопуляций Т-клеток в продукте сепарации обнаружено более высокое относительное содержание CD4+ лимфоцитов за счет CD4+CD45RO+ клеток памяти, количество CD4+CD45RA+ наивных клеток не отличалось. Количество CD8+ клеток в продукте афереза и ПК было одинаковым, при этом содержание CD8+CD45RA+ наивных клеток в продукте афереза было значимо ниже, a CD8+CD45RO+ клеток памяти - выше. Соотношение наивных клеток к клеткам памяти в обеих субпопуляциях - CD4+ hCD8+- в продукте сепарации было значимо ниже, чем в ПК (см. таблица 1).

Для оценки содержания Трег был проведен сравнительный анализ 3 субпопуляций этих клеток. Относительное содержание Трег в продукте афереза и ПК не различалось (см. таблица 1).

Полученные данные позволяют заключить, что процедура афереза сопровождается изменением пула сепарируемых лимфоцитов: увеличением содержания CD3+ Т-клеток и CD4+ клеток за счет избирательного накопления клеток памяти. Также увеличивается количество моноцитов. При этом продукты афереза содержат меньшее количество CD8+ наивных клеток и В-лимфоцитов. Сепарация не приводит к возрастанию в продукте афереза Трег.

Для исследования возможной взаимосвязи между количеством Трег с количественными и функциональными показателями иммунокомпетентных клеток было проведено сравнительное исследование содержания субпопуляций клеток и продукции цитокинов в образцах сепаратов с высоким (более

медианы) и низким (менее медианы) количеством Трег. Различий в содержании субпопуляций МНК в зависимости от количества С04+С025,п и С04+С025+С0127 клеток не выявлено. Продукты афереза с более высоким содержанием С04+ГОХРЗ+ клеток характеризовались пониженным количеством СЭ16+ Ж-клеток (3,1% ±0,8% против 11,8% ±2,4%, Ри< 0,001), а также тенденцией к снижению количества моноцитов (56,2 % ± 4,6 % против 69,2 % ± 2,7 %, ри = 0,065). При проведении корреляционного анализа выявлена обратная зависимость между количеством С04+Р0ХРЗ+ клеток и содержанием 1МК-клеток (г = -0,59, р = 0,000004; п = 52), моноцитов (г = -0,40, р = 0,006; п = 45) и - на уровне тенденции -цитотоксических Т-лимфоцитов (г = -0,27, р = 0,056; п = 52).

Супрессорный эффект также могут оказывать миелоидные предшественники. Продукты афереза с высоким (больше медианы) количеством ранних форм нейтрофилов (промиелоциты + миелоциты) содержали более низкое количество СЭЗ+ лимфоцитов (62,5 % ± 3,2 % против 76,2% ±2,3%, ри< 0,005), СБ4+ Т-клеток (39,3% ±2,0% против 45,7 % ± 2,3 %, ри < 0,05) и С014+НЬА-0Я+ моноцитов (57,5 % ± 3,5 % против 68,3 % ± 4,2 %, ри < 0,05).

Оценка продукции цитокинов не показала каких-либо различий в зависимости от содержания Трег и незрелых форм гранулоцитов.

Таким образом, более высокое относительное количество СБ41РОХРЗ+ клеток было ассоциировано со сниженным содержанием ЫК-клеток и моноцитов. Более высокое содержание промиелоцитов и миелоцитов ассоциировалось с более низким содержанием СОЗ+ Т-лимфоцитов в целом, СЕ)4+ клеток и моноцитов.

Для сравнительной оценки субпопуляционного состава и цитокинового профиля клеток продукта афереза больных в зависимости от нозологической формы пациенты были разделены на 3 группы: НХЛ и ЛХ, ОЛ, ММ. Сравниваемые группы больных лимфомами и ОЛ значимо не различались по возрасту, полу, режимам мобилизации и количеству сепарированных ГСК. Группа больных ММ была значимо старше пациентов с лимфомами и ОЛ: (47,8 ± Г,5) лет против (31,0 ± 1,5) лет (ри < 0,001) и (33,1 ± 3,9) лет (ри = 0,006) лет соответственно.

В продуктах афереза больных ММ по сравнению с сепаратами пациентов с ОЛ было больше миелоцитов (9,0 % ± 2,7 % против 2,1 % ± 1,0 %, ри < 0,05), юных нейтрофилов (8,5 % ± 2,0 % против 1,6 ± 0,6 %, ри < 0,05) и гранулоцитов в целом (31,4% ±6,2% против 8,4% ±1,8%, ри<0,05). Также в группе больных ММ отмечено наиболее высокое относительное содержание СЭ19+ В-клеток по сравнению с показателями пациентов с лимфомами и ОЛ: (4,6 ±0,7)% против (3,8 ±1,4)%, ри<0,05, и (1,5 ±0,3)%, ри<0,05, соответственно. Относительное количество СЕ)4+С025Ь' Трег было выше в группе ОЛ по сравнению с больными ММ (2,3 % ± 0,3 % против 1,6 % ± 0,2 %, Ри < 0,05). Относительное количество других исследуемых субпопуляций лимфоцитов было сходным во всех 3 группах.

Изучена продукция цитокинов клетками продуктов сепарации при исследуемых заболеваниях. Значимые различия представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Продукция цитокинов клетками продукта афереза больных лимфомами, ОЛ и ММ

Цитокины Лимфомы (п = 24) ММ (п= 15) ОЛ (п = 10) Рл-ол* Рмм-ол*

ИЛ-1 лпс, пг/мл 2738 ± 235 2306 ± 222 3360 ± 290 0,096 0,009

ИЛ-6 лпс. пг/мл 9765 ± 1033 10297 ±811 13226 ±611 0,028 0,013

ФНО-а лпс, пг/мл 2600 ±721 1259 ±234 3723 ±1111 0,16 0,004

ИЛ-8 сл.. пг/мл 4347 ±146 4683 ± 436 5105 ±413 0,045 0,14

МПМЬс,,., пг/мл 2829 ±317 3139 ±438 4272 ± 478 0,028 0,086

1РЫ у лпс, пг/мл 1352 ±96 1251 ±116 1619 ±90 0,13 0,016

ИЛ-4лпс., пг/мл 14,6 ± 0,611 13,6 ±0,723 16,8 ±0,768 0,045 0,008

Г-КСФлпс.. пг/мл 4246 ±381 3952 ± 506 6017 ± 749 0,031 0,020

Примечания: 1. *Рл-ол- различия между группами лимфом и ОЛ. 2. *Рмм-ол- различия между группами ОЛ и ММ. 3. Значимость различий: и-критерий Манна-Уитни. Значения в виде М ± БЕ.

МНК больных ОЛ по сравнению с клетками пациентов с лимфомами характеризовались более высокой спонтанной продукцией ИЛ-8 и М1Р-16. ЛПС-стимулированная продукция ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-а, у, ИЛ-4 и Г-КСФ также была выше в культурах клеток больных ОЛ по сравнению с МНК

15

пациентов с лимфомами и ММ. Клетки продуктов сепарации пациентов с лимфомами значимо не отличались по цитокин-секреторной активности от клеток больных ММ.

Проведено исследование пролиферативной активности ГСК. Наибольшее число покоящихся СОЭ4+-клеток (в Со/в) фазах) обнаружено в продуктах сепарации больных ММ: (97,2 ±0,6)% против (93,7 ±2,0)%, ри = 0,019, по сравнению с больными ОЛ. Наибольшее количество пролиферирующих (в Б, в2/М фазах) С034+-клеток наблюдалось в продуктах сепарации больных ОЛ: (6,0 ± 2,0) % против (2,6 ± 0,5) %, ри=0,068, по сравнению с больными ММ.

Таким образом, продукты сепарации больных ОЛ характеризовались наиболее высоким содержанием СЕ)4+С0251" Трег и наиболее низким относительным количеством гранулоцитов и В-клеток; обладали наиболее высокой провоспапительной активностью и содержали максимальное количество пролиферирующих ГСК. Продукты сепарации больных ММ отличались наибольшим количеством гранулоцитов и СР19+ В-клеток, наименьшим содержанием С04+С025ы Трег и содержали наиболее высокое относительное количество покоящихся ГСК.

Чтобы оценить влияние типа используемого Г-КСФ на параметры клеток, был проведен сравнительный анализ образцов сепарата, полученных при использовании несвязанной формы Г-КСФ и ПЭГ-Г-КСФ среди больных лимфомами и ММ (п = 44).

Продукт афереза при использовании ПЭГ-Г-КСФ содержал более высокое относительное количество С04+С025И'8И (2,0 % ± 0,3 % против 1,5 % ± 0,2 %, ри < 0,05), СЭ4+РОХРЗ+ Трег (8,6 % ± 0,8 % против 5,8 % ± 0,7 %, Ри<0,01) и более низкое количество С014+НЬА-0Я+ моноцитов (54,9 % ± 4,3 % против 65,0 ± 3,4 %, ри < 0,05). Клетки продуктов сепарации, полученные при использовании ПЭГ-Г-КСФ, характеризовались более высокой спонтанной продукцией ИЛ-7 (3,6 пг/мл ± 0,7 пг/мл против 1,8 пг/мл ± 0,3 пг/мл, ри < 0,05), ЛПС-стимулированной продукцией ИЛ-2 (28,6 пг/мл ± 2,3 пг/мл против 20,5 пг/мл ± 1,3 пг/мл, ри = 0,01) и ИЛ-4 (15,3 пг/мл ± 0,4 пг/мл против 13,5 пг/мл ± 0,7 пг/мл, ри< 0,05), и более низким уровнем ЛПС-стимулированной продукции ИЛ-8 (4694 пг/мл ± 358 пг/мл против 5156 пг/мл ± 255 пг/мл, ри = 0,0052).

При изучении распределения СЭ34+ ГСК по фазам клеточного цикла обнаружено, что в продуктах сепарации больных, получавших ПЭГ-Г-КСФ, содержится более низкое количество покоящихся СОЭ4+-клеток (0(Д}|) (93,8 % ± 1,7 % против 97,4 % ± 0,5 %, ри = 0,04) и более высокое количество делящихся СОЭ4+-клеток (Б, С2/М) (5,6% ±1,4% против 2,6% ±0,5%, Ри = 0,03).

Таким образом, мобилизация ГСК с использованием ПЭГ-Г-КСФ ассоциирована с более высоким содержанием в продукте афереза Трег и более низким относительным количеством моноцитов. Эти особенности состава были сопряжены с более низкой провоспалительной активностью клеток сепарата (продукция ИЛ-8) и более высокой способностью к продукции цитокинов, поддерживающих гомеостатическую пролиферацию Т-лимфоцитов (ИЛ-2 и ИЛ-7) и гуморальный иммунный ответ (ИЛ-4). При использовании ПЭГ-Г-КСФ продукты афереза содержали большее количество пролиферирующих ГСК.

Чтобы оценить прогностическую ценность параметров продукта сепарации, была проведена сравнительная оценка количественных и функциональных показателей клеток в зависимости от исхода АТГСК.

АТГСК была проведена 23 больным лимфомами, 17 пациентам ММ и 10 больным ОЛ, медиана наблюдения - 31,1 мес. За это время рецидив или прогрессия были зафиксированы у 5 больных лимфомами, у 7 - ММ и 6 - ОЛ. Трехлетняя безрецидивная выживаемость составила 78 % в группе больных лимфомами, 65 % - у пациентов с ММ и 40 % - у больных ОЛ. Медиана выживаемости для лимфом не достигнута, для ММ - 29,6 мес., для ОЛ -14,5 мес.

Продукты сепарации 5 больных лимфомами, у которых развился рецидив после АТГСК, значимо не отличались по субпопуляционному клеточному составу и продукции цитокинов от пациентов в ремиссии.

Пациенты с рецидивом ММ (п = 7) после АТГСК отличались более высоким содержанием С019+ В-лимфоцитов: (6,0 ± 1,0) % против (3,2 ± 0,8) % у больных, сохранивших ремиссию болезни (п = 10), рц = 0,039.

Для оценки значимости содержания СБ19+ В-клеток в сепаратах больных ММ в прогнозе рецидива после АТГСК был проведен ЯОС-анализ. Выявлена высокая информативность определения содержания В-клеток. Площадь под

17

кривой составила 0,80 (р = 0,04). Учитывая важность прогноза рецидива при его действительном наличии (т. е. чувствительность теста), пороговой точкой выбрано значение CD19+ В-клеток, равное 2,5 %, при этом чувствительность составила 100 %, специфичность - 60 %.

Все пациенты с OJI (п = 10) на момент АТГСК находились в полной ремиссии; 6 больных с развившимся рецидивом болезни после трансплантации значимо не отличались от больных в ремиссии по возрасту и количеству реинфузируемых ГСК. При этом пациенты с рецидивом после АТГСК отличались значимо более высоким содержанием в продукте сепарации CD8+ клеток памяти (14,8 % ± 2,9 % против 5,8 % ± 1,5 %, ри = 0,042).

Учитывая описанную взаимосвязь между ранним восстановлением лимфоцитов и исходами АТГСК у больных лимофмами, была проведена оценка клеточного состава продукта сепарации в зависимости от показателей выхода из лимфопении. Больные лимфомами и ММ были разделены на группы в зависимости от наличия или отсутствия раннего восстановления лимфоцитов (количество лимфоцитов в ПК > 0,5 х 109/л не позднее 15-го дня после АТГСК). Безрецидивная выживаемость в течение 1-го года после АТГСК у больных с более ранним выходом из лимфопении составила 77 % (п = 22), с более поздним - 33 % (п = 6), р (log-rank) = 0,047.

Срок восстановления лимфоцитов обратно коррелировал со спонтанной продукцией клетками продуктов сепарации ИЛ-2 (г = -0,35, р = 0,032; п = 37). Пациенты, имевшие более низкий уровень продукции ИЛ-2 клетками продукта сепарации, позже выходили из лимфопении после АТГСК.

ВЫВОДЫ

1. Продукты афереза у больных гемобластозами характеризуются большим относительным содержанием Т-лимфоцитов (за счет CD4+ клеток), CD4+CD45RO+ и CD8+CD45RO+ Т-клеток памяти и HLA-DR+ моноцитов по сравнению с мононуклеарными клетками периферической крови, а при цитологическом исследовании - повышенным содержанием (до 11 %) незрелых форм гранулоцитов. Указанные отличия свидетельствуют о селективном накоплении отдельных субпопуляций клеток в процессе процедуры сепарации периферических гемопоэтических стволовых клеток.

2. Сепарация периферических гемопоэтических стволовых клеток у

больных гемобластозами не приводит к накоплению регуляторных Т-клеток в продукте афереза. Тем не менее, количество различных субпопуляций клеток, обладающих супрессорной активностью (CD4+FOXP3+ Трег, незрелые миелоидные клетки) находится в обратной взаимосвязи с содержанием CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов, NK-клеток и моноцитов, что свидетельствует о влиянии регуляторных клеток на функциональную активность эффекторных клеток продукта афереза.

3. Продукты сепарации больных острыми лейкозами характеризуются наиболее высоким содержанием CD4+CD25hl Трег и наиболее низким количеством гранулоцитов и покоящихся гемопоэтических стволовых клеток; продукты сепарации больных острыми лейкозами характеризуются наиболее высокой спонтанной продукцией ИЛ-8 и MlP-lb и ЛПС-индуцированной продукцией ИЛ-1, ИЛ-4, ИЛ-6, Г-КСФ, ФНО-а, IFN-y; продукты афереза больных множественной миеломой характеризуются наиболее высоким количеством CD19+ В-клеток и незрелых миелоидных клеток, что свидетельствует о взаимосвязи нозологической формы заболевания с количественными и функциональными параметрами продукта афереза.

4. По сравнению с несвязанной формой Г-КСФ использование ПЭГ-Г-КСФ для мобилизации гемопоэтических стволовых клеток ассоциировано с более высоким количеством CD4+CD25hlgh и CD4+FOXP3+ Трег, более низким содержанием HLA-DR+ моноцитов, а также более высокой пролиферативной активностью CD34+ клеток и продукцией ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7 клетками продукта афереза, что указывает на важное значение типа Г-КСФ в детерминировании количественного состава и функциональной активности клеток в продукте сепарации.

5. Выявленная взаимосвязь между более высоким количеством CD19+ В-клеток в продукте сепарации и рецидивом аутологичной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток при множественной миеломе, более высоким содержанием CD8+CD45RO+ Т-клеток и рецидивом при остром лейкозе, более низкой продукцией ИЛ-2 с более поздним выходом из лимфопении, а также между отсроченным восстановлением лимфоцитов и худшей безрецидивной выживаемостью при лимфомах и множественной миеломе обосновывает возможность использования параметров продукта

19

сепарации для прогнозирования исхода аутологичной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Рекомендуется проводить оценку относительного количества СЭ19+ В-лимфоцитов в продукте сепарации больных множественной миеломой для прогноза развития рецидива заболевания после АТГСК, содержание этих клеток > 2,5 % ассоциировано с неблагоприятным течением с чувствительностью 100 % и специфичностью 60 %.

2. Рекомендуется проводить оценку относительного количества С08+С0451Ю+ Т-клеток памяти в продуктах сепарации больных острыми лейкозами, более высокое их содержание (> 16 %) позволяет прогнозировать развитие рецидива заболевания после АТГСК.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сравнительная характеристика субпопуляционного состава продукта афереза и периферической крови у больных гемобластозами / Д. С. Баранова (Баторова), И. В. Крючкова, Н. В. Пронкина, Е. В. Баторов, М. А. Тихонова,

A. В. Гилевич, В. В. Сергеевичева, С. А. Сизикова, Г. Ю. Ушакова, Т. И. Поспелова // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2011. - № 2/1 (35). -С. 94-95.

2. Сравнительная характеристика субпопуляционного состава и цитокин-продуцирующей функции клеток продукта сепарации у больных лимфомами и острыми лейкозами / Д. С. Баранова (Баторова), Л. В. Сахно, И. В. Крючкова, Н. В. Пронкина, М. А. Тихонова, Е. В. Баторов, А. В. Гилевич, В. В. Сергеевичева, С. А. Сизикова, Г. Ю. Ушакова, А. А. Останин, Т. И. Поспелова, Е. Р. Черных // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН, - 2012. - № 3 (85). - С. 29-32.

3. Субпопуляционный состав и цитокин-секреторная функция клеток продукта сепарации у больных лимфомами / Д. С. Баранова (Баторова), Л. В. Сахно, И. В. Крючкова, Н. В. Пронкина, Е. В. Баторов, М. А. Тихонова, А. В. Гилевич,

B. В. Сергеевичева, С. А. Сизикова, Г. Ю. Ушакова, А. А. Останин, Т. И. Поспелова, Е. Р. Черных // Современная онкология. - 2012. - Т. 14, № 2. - С. 14-19

4. Регуляторные Т-клетки у больных лимфомами после аутологичной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток / Е. В. Баторов, Е. Я. Шевела, М. А. Тихонова, И. В. Крючкова, Д. С. Баранова (Баторова), В. В. Сергеевичева,

C. А. Сизикова, Г. Ю. Ушакова, А. В. Гилевич, А. А. Останин, Е. Р. Черных //

Клиническая онкогематологии. - 2012. - Т.5, № 1. - С. 61-67.

5. Влияние клинических факторов на показатели функциональной активности тимуса у больных гемобластозами / Е. В. Баторов, Е. А. Блинова, М. А. Тихонова, Ю. А. Лопатникова, И. В. Крючкова, Д. С. Баторова, В. В. Сергеевичева, С. А. Сизикова, Г. Ю. Ушакова, А. А. Останин, Е. Р. Черных // Гематология и трансфузиология. - 2014. - Т.59, № 3. - С. 16-21.

6. Регуляторные Т-клетки аутологичного продукта афереза у больных лимфомами / Е. В. Баторов, М. А. Тихонова, Д. С. Баторова, И. В. Крючкова,

B. В. Сергеевичева, С. А. Сизикова, Г. Ю. Ушакова, А. В. Гилевич, А. А. Останин, Е. Р. Черных // Российский иммунологический журнал. - 2014. - Т.8 (17), № 3. -

C. 506-508.

7. Характеристика регуляторных Т-клеток периферической крови и продукта афереза у больных гемобластозами / Д. С. Баранова (Баторова), И. В. Крючкова,

H. В. Пронкина, Е. В. Баторов, М. А. Тихонова, А. В. Гилевич, В. В. Сергеевичева, С. А. Сизикова, Г. Ю. Ушакова, Е. Р. Черных, Т. И. Поспелова // Дни иммунологии в Санкт-Петербурге материалы 14-го Всероссийского научного Форума с международным участием имени академика В.И. Иоффе // Медицинская иммунология. - 2011. - Т. 13, № 4-5. - С. 447-448.

8. Состав и цитокинпродуцирующая функция клеток продукта афереза больных лимфомами и острыми лейкозами / Д. С. Баторова, Л. В. Сахно, И. В. Крючкова, Н. В. Пронкина, М. А. Тихонова, А. В. Гилевич, В. В. Сергеевичева,

C. А. Сизикова, Г. Ю. Ушакова, А. А. Останин, Т. И. Поспелова // Материалы 2-го Конгресса гематологов России // Гематология и трансфузиология. - 2014. - Т. 59, № 1. Приложение 1. - С. 80.

9. Autologous stem cell transplantation (ASCT) for acute myeloid leukemia (AML): A 10-year single centre experience / I. V. Kruchkova, V. V. Sergeevicheva,

D. S. Baranova (Batorova), G. Yu. Ushakova, A. D. Kulagin, S. A. Sizikova,

I. A. Lisukov, A. V. Gilevich, V. A. Kozlov // Cellular Therapy and Transplantation. -2010. - Vol. 3, N 9. - P. 69-70.

Аутологичная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (АТГСК) при остром миелоидном лейкозе (ОМЛ): 10-летний опыт / И. В. Крючкова, В. В. Сергеевичева, Д. С. Баранова (Баторова), Г. Ю. Ушакова, А. Д. Кулагин, С. А. Сизикова, И. А. Лисуков, А. В. Гилевич, В. А. Козлов II Клеточная терапия и трансплантация. - 2010. - Т. 3, № 9. - С. 69-70.

10. Autograft cell content and cytokine production in apheresis products collected

using different forms of G-CSF in patients with hematological malignancies /

D. S. Baranova (Batorova), I. V. Kruchkova, N. V. Pronkina, E. V. Batorov, M. V. Tichonova, A. V. Gilevich, V. V. Sergeevicheva, S. A. Sizikova, G. Yu. Ushakova, Т. I. Pospelova, A. A. Ostanin, E. R. Chemykh // Cellular Therapy and Transplantation. -2011.-Vol.3, N 12.-P. 22.

Состав и продукция цитокинов клетками аутологичных продуктов афереза, мобилизованных с использованием различных форм Г-КСФ у больных гемобластозами / Д. С. Баранова (Баторова), И. В. Крючкова, Н. В. Пронкина,

E. В. Баторов, М. А. Тихонова, А. В. Гилевич, В. В. Сергеевичева, С. А. Сизикова, Г. Ю. Ушакова, Т. И. Поспелова, А. А. Останин, Е. Р. Черных // Клеточная терапия и трансплантация. - 2011. - Т. 3, № 12. - С. 22.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АТГСК - аутологичная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток

Г-КСФ - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор

гск - гемопоэтические стволовые клетки

ил - интерлейкин

лпс - липополисахарид

лх - лимфома Ходжкина

мм - множественная миелома

МНК - мононуклеарные клетки

нхл - неходжкинские лимфомы

ол - острый лейкоз

ПК - периферическая кровь

ПЭГ -полиэтиленгликоль, пэгилированный

Трег - регуляторные Т-клетки

ФНО-а - фактор некроза опухоли-а

CD - кластер дифференцировки

IFNy - интерферон у

NK - естественные киллеры

MIP-1B - макрофагальный воспалительный белок-1В

TGF-p - трансформирующий фактор роста р

Отпечатано в типографии Новосибирского государственного технического университета 630073, г.Новосибирск, пр. К. Маркса, 20, Тел./факс (383) 346-08-57 Формат 60 х 84/16. Объем 1.0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ 2370. Подписано в печать 10.12.2014 г.

, - - 2 7 О О

\ J

J

и

2014270184