Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Линейно-специфический химеризм у больных гемобластозами после трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток

на правах рукописи

Желнова Евгения Ивановна

Линейно-специфический химеризм у больных гемобластозами после трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток

14.00.29 -Гематология и переливание крови

Автореферат

диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2008

003451651

003451651

Работа выполнена в Государственном учреждении Гематологический Научный центр Российской Академии Медицинских Наук

Научный руководитель:

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор В.Г. Савченко Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор А.А. Масчан кандидат биологических наук А.Б. Судариков

Ведущее научное учреждение:

Московский Научно-Исследоватеяьский Онкологический институт им. П.А. Герцена

на заседании диссертационного Совета Д 001.042.01 при Государственном учреждении Гематологический Научный центр Российской Академии Медицинских Наук по адресу: 125167 Москва, Новозыковский проезд, д. 4а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного Учреждения Гематологический Научный центр Российской Академии Медицинских Наук

Автореферат разослан « »_2008 года

Защита состоится

2008г. в.

Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат медицинских наук

Е.Е. Зыбунова

Актуальность проблемы

Аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) широко используется как эффективный метод терапии гематологических заболеваний, солидных опухолей и ряда наследственных болезней с середины 80-х годов XX века. Наибольшее распространение этот метод получил в лечении злокачественных заболеваний крови, таких как острые лейкозы, хронический миелолейкоз, лимфопролиферативные заболевания.

Успех аллогенной ТГСК, тем не менее, ограничивают многочисленные пострансплантационные осложнения, в том числе те из них, которые возникают на фоне сложных клеточных взаимодействий между иммунокомпетентными клетками донора и реципиента, а также клетками органов-мишеней хозяина. К ним относятся отторжение трансплантата, развитие реакций «трансплантат против хозяина» (РТПХ), и «трансплантат против лейкоза» (РТПЛ), возникновение посттрансплантационных рецидивов основного заболевания. Каждое из перечисленных осложнений может привести к гибели больного. Поэтому изучение динамики приживления донорских гемопоэтических стволовых клеток (гемопоэтического химеризма) и определение ее связи с перечисленными осложнениями посттрансплантационного периода играет важнейшую роль для правильной оценки состояния больного и проведения дальнейших лечебных мероприятий.

Следует отметить, что особую актуальность исследование посттрансплантационного гемопоэтического химеризма приобрело в связи с развитием новых подходов к проведению аллогенной ТГСК: а именно, развитием трансплантации после немиелоаблативных режимов кондиционирования или режимов пониженной интенсивности.

Несмотря на то, что исследование гемопоэтического химеризма после аллогенной трансплантации проводится в течение многих лет, развитие новых методов ТГСК и использование трансплантации для лечения целого ряда новых патологий выявило, что до сих пор целый ряд вопросов остается нерешенным. Так, например, не определены стандартные сроки и частота исследования гемопоэтического химеризма. Нет так же единого мнения

о важности изучения и отдельного мониторирования химеризма в различных клеточных популяциях, в особенности - популяции Т-лимфоцитов, играющих основную роль в развитии таких посттрансплантационных реакций, как РТПХ и РТПЛ. Так же не изучено значение химеризма в популяциях В-лимфоцитов и гранулоцитов периферической крови после ТГСК и его влияние на персистенцию минимальной остаточной болезни при разных формах гемобластозов. Нет данных проспективных исследований, которые позволили бы выявить значение исследований химеризма ядросодержащих клеток костного мозга реципиентов после ТГСК в сравнении с химеризмом клеточных популяций лейкоцитов периферической крови.

Более того, до настоящего момента нет общего подхода и не выработана единая стратегия по лечению больных в зависимости от типа обнаруженного химеризма в разные сроки после ТГСК при различных заболеваниях. Нет единого мнения о сроках проведения таких терапевтических мероприятий, как отмена иммуносупрессии, трансфузии донорских лимфоцитов (ТДЛ) при обнаружении персистенции хозяйского кроветворения после аллогенной ТГСК.

Таким образом, актуальность работы заключается как в определении закономерностей установления гемопоэтического химеризма после аллогенной ТГСК в разных режимах кондиционирования, так и в детальном изучении роли различных клеточных популяций в течении посттрансплантационного периода у больных разными видами опухолевых заболеваний крови.

Цель исследования: динамическое исследование реконституции кроветворной и иммунокомпетентной ткани у больных гемобластозами после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток

Задачи исследования

1. Изучить зависимость установления типа гемопоэтического химеризма у больных гемобластозами после аллогенной ТГСК от режимов

предтрансплантационного кондиционирования, источника стволовых клеток, основного заболевания, вида профилактики РТПХ.

2. Определить тип химеризма и темпы его установления в различных клеточных популяциях периферической крови (Т, В- лимфоцитах, гранулоцитах) и в популяции мононуклеаров костного мозга реципиентов аллогенных гемопоэтических стволовых клеток.

3. Выявить влияние различных типов линейно-специфического химеризма на вероятность развития острой и хронической РТПХ и рецидив основного заболевания после аллогенной ТГСК.

4. Изучить взаимосвязь между установлением различных типов химеризма и персистенцией минимальной остаточной болезни у пациентов, перенесших алло-ТГСК

5. Провести сравнение информативности исследований гемопоэтического химеризма в клеточных популяциях периферической крови и мононуклеарах костного мозга у больных после аллогенной ТГСК.

6. Разработать алгоритм ведения пациентов с длительно сохраняющимся смешанным гемопозтическим химеризмом или убывающим донорским химеризмом после аллогенной ТГСК с целью профилактики развития посттрансплантационного рецидива.

Научная новизна

В настоящей работе проведено проспективное исследование линейно-специфического гемопоэтического химеризма у больных гемобластозами, перенесших аплогенную ТГСК. Выявлено влияние типа химеризма на развитие важнейших осложнений посттрансплантационного периода (острой и хронической РТПХ, рецидивов основного заболевания). Изучено влияние типа гемопоэтического химеризма на персистенцию остаточного лейкемического клона у больных после аллогенной ТГСК.

Научно-практическая ценность

Разработан протокол исследования гемопоэтического химеризма и минимальной остаточной болезни у больных после аллогенной ТГСК

в зависимости от основного заболевания и типа химеризма в разные сроки после трансплантации.

Предложен алгоритм ведения больных с персистирующим смешанным или убывающим донорским химеризмом с использованием отмены иммуносупрессш и проведением трансфузий донорских лимфоцитов (ТДЛ) как методов профилактики посттрансплантационного рецидива.

Положения, выносимые на защиту

1. Восстановление донорского гемопоэза после аллогенной ТГСК происходит во всех исследованных популяциях клеток вне зависимости от примененного режима кондиционирования (миелоаблативного или пониженной интенсивности).

2. Определение смешанного гемопоэтического химеризма в любой клеточной популяции является фактором высокого риска развития посттрансппантационного рецидива.

3. Исследование типа химеризма в раздельных клеточных популяциях (а именно - в остаточной популяции мононуклеаров периферической крови) позволяет выявить группу пациентов с наибольшим риском развития посттрансплантационных рецидивов.

4. Быстрое установление полного донорского химеризма во всех клеточных популяциях и его длительное и продолжительное существование коррелирует с развитием острой РТПХ у подавляющего большинства пациентов.

5. Разработанный алгоритм ведения больных со смешанным гемопоэтическим химеризмом позволяет предотвратить развитие рецидива у большинства пациентов.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, 1 работа находится в печати.

Апробация диссертации

Основные положения работы доложены на Международной Гематологической школе «Лейкозы и лимфомы. Терапия и фундаментальные исследования». (Москва в 2003г, в 2005г, в 2007г.), Всероссийском декаднике по гематологии (Москва, 2006г.)

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 143 страницах, состоит из введения, обзора литературы, методической главы, главы собственных результатов, обсуждения, заключения, выводов и указателя литературы. Работа иллюстрирована 23 таблицами, 12 диаграммами, 6 графиками, 8 рисунками. Диссертация выполнена в отделении высокодозной химиотерапии гемобластозов и трансплантации костного мозга ГНЦ РАМН (руководитель член-корреспондент РАМН, проф. В.Г. Савченко), совместно с лабораторией генной инженерии ГНЦ РАМН (заведующий к.б.н. A.B. Мисюрин).

Соавторами работ, опубликованных по теме диссертации являются сотрудники ГНЦ РАМН - член - корр. РАМН В.Г. Савченко, д.м.н. E.H. Паровичникова, д.м.н. проф. Л.С.Любимова, д.м.н. Л.П.Менделеева, к.б.н. А.В.Мисюрин, к.м.н. ИАДемидова, д.м.н. Л.П.Порешина, к.м.н Р.С.Кутьина, к.м.н, А.П.Шпакова, к.м.н. И.В.Гальцева, к.б.н. Е.Ю.Садовникова, И.Б. Капланская, H.H. Калинин, T.Hahn, C.Ambrosone, Ph. McCarthy, к.м.н. Н.Е.Митиш, к.м.н.Г.А.Клясова, к.м.н. Е.О.Грибанова, О.С.Покровская, к.м.н. Л.А.Кузьмина, Л.Л.Сперанская, к.б.н. ТАГаранжа, И.Э.Костина.

Содержание работы

Характеристика больных

В настоящей работе приводятся результаты исследования линейно-специфического химеризма у 31 больного. Всем пациентам была проведена трансплантация аллогенного костного мозга. Трансплантация была выполнена в клинике высокодозной химиотерапии гемобластозов и трансплантации костного мозга(руководитель отделения

член - корр. РАМН, профессор, д.м.н. В.Г.Савченко) Гематологического Научного Центра (директор - академик РАМН и РАН А.И.Воробьев).

Все пациенты поступали в отделение трансплантации костного мозга с верифицированным диагнозом, после проведения полного обследования. Больным острыми лейкозами предварительно проводилась индукционная и консолидационная полихимиотерапия, на момент выполнения ТКМ все они находились в первой или последующих ремиссиях. Пациенты с ХМЛ получали терапию гидроксимочевиной и/или интерфероном а. Для пациентов МДС трансплантация гемопоэтических стволовых клеток являлась терапией первой линии, предварительной полихимиотерапии не проводилось.

Донорами гемопоэтических стволовых клеток во всех случаях были родные братья или сестры больных, идентичные по антигенам тканевой гистосовместимости I и II класса и совместимые по результатам проведения реакции смешанной культуры лимфоцитов.

Все больные были разделены на 2 группы. В первую вошли 20 человек, которым проводилась аллогенная ТГСК в миелоаблативном режиме. Среди них было 10 мужчин, 10 женщин. Медиана возраста составила 29 лет (19-45). Во вторую - 11 человек, которым была проведена трансплантация в режиме пониженной интенсивности. Среди них было 4 мужчин и 11 женщин. Медиана возраста составила 37 лет (18-55). Всем пациентам проводилась профилактика реакции трансплантат против хозяина иммуносупрессивными препаратами: циклоспорином, метотрексатом, преднизолоном.

Для всех больных после ТКМ контрольными сроками для исследования клеточного происхождения кроветворения были +30, +60, +90 дни и далее каждые 3 месяца в течение первого года наблюдения. У каждого пациента забирались образцы костного мозга и периферической крови. Исследовались следующие клеточные популяции: гранулоциты, Т-лимфоциты (несущие маркер СОЗ), В-лимфоциты (несущие С019) и остаточная клеточная популяция мононуклеаров после отделения Т и В-лимфоцитов. Эти клеточные популяции выделялись из периферической крови. Также в исследовании использовался костный мозг без разделения на клеточные популяции. Таким

образом, в каждый срок исследования у каждого больного проводилось определение химеризма 5 клеточных линий.

В случае необходимости (при отмене иммуносупрессии, трансфузиях донорских лимфоцитов, проведении ПХТ по поводу рецидива) образцы костного мозга и периферической крови забирались чаще. В среднем каждому больному было выполнено 21 (5-30) исследование периферической крови и костного мозга.

Методы исследования

I. Выделение клеточных популяций

Выделение клеточных популяций проводилось в отделении высокодозной терапии лейкозов и трансплантации костного мозга. Руководитель отделения член-корреспондент РАМН Савченко В.Г. Методика разработана совместно с к.б.н. Е.Ю. Садовниковой. В работе использовались биологические среды и гибридома, предоставленные лаб.физиологии кроветворения ГНЦ РАМН (руководитель, проф. д.м.н. Дризе Н.И.)

Первоначально из периферической крови, с использованием разделения в градиенте плотности фикола, выделялись гранулоциты и мононуклеары. Гранулоциты пускались в дальнейшую обработку, а мононуклеары замораживались в среде а-МЭМ и буфер PBS + 20% ДМСО. В дальнейшем проводилось размораживание проб и разделение их на клеточные популяции. Для выделения популяции Т-лимфоцитов, несущих CD3, и популяции B-лимфоцитов, несущих CD19, использовались методики позитивного непрямого и прямого выделения на магнитных микрочастицах, соответственно инструкции, предложенной фирмой Dynal.

II. Попимеразная цепная реакция (ПЦР)

Молекулярное исследование костного мозга и периферической крови выполнялось в лаборатории генной инженерии ГНЦ РАМН (зав. лаб. к.б.н. A.B. Мисюрин).

С целью изучения динамики приживления костного мозга и гемопоэтического химеризма у больных после аллогенной трансплантации

в работе был использован метод амплификации гипервариабельных участков генома с помощью ПЦР.

Для исследования приживления костного мозга у больных после трансплантации были выбраны фрагменты ДНК, которые могли бы служить индивидуальными маркерами, позволяющими эффективно отличать клетки донора от клеток реципиента - гипервариабельные участки генома с изменяющимся числом копий

(hypervariable number of tandem repeats - VNTR и short number of tandem repeats - STR).

Анализ полученных после проведения ПЦР продуктов амплификации осуществлялся методом электрофореза в полиакриламидном геле 6-9% концентрации и дальнейшего просвечивания в ультрафиолетовом свете после прокрашивания бромистым этидием. Гели фотографировались на цифровой фотоаппарат Olympus С 3040 Zoom в проходящем ультрафиолете, далее визуализировались на PC Pentium 4 с помощью программы DigiDoc-lt (фирма BioRad). Эта программа позволяет оценивать в процентном соотношении относительное количество амплифицированной ДНК по интенсивности свечения в УФ всех олигонуклеотидов, полученных в материале от одного пациента (в каждом отдельном треке). Далее полученные данные заносились в таблицы Exel и переводились в диаграммы для большей наглядности.

Основные понятия

При оценке результатов исследования мы пользовались следующими понятиями, принятыми Международным регистром трансплантации костного мозга (IBMTR):

Полный донорский химеризм - обнаружение 100% ДНК донора. Смешанный химеризм - обнаружение двух типов ДНК - хозяина и реципиента в определенной клеточной популяции: от 5% до 95% ДНК донора/реципиента.

Расщепленный химеризм - одна или несколько клеточных линий полностью хозяйские, другие (одна или несколько) полностью донорские.

и

Возрастающий донорский химеризм устанавливается при выявлении увеличения числа донорских клеток более чем на 5% от предыдущего уровня. Убывающий донорский химеризм выявляется, если число клеток, принадлежащих донору уменьшилось более чем на 5% по сравнению с предыдущим образцом.

Стабильный смешанный химеризм диагностируется при обнаружении относительно постоянного соотношения клеток донора и реципиента (колебания менее 5%) в двух и более последовательно исследованных образцах крови или костного мозга.

Результаты исследования

/. Результаты клинических исследований В настоящее исследование был включен 31 больной. 20 пациентам была выполнена трансплантация аллогенных гемопопоэтических стволовых клеток в миелоаблативном режиме. 11 больным трансплантация была проведена с использованием режима пониженной интенсивности.

Приживление донорских стволовых клеток произошло у всех пациентов. Не было выявлено статистически достоверных различий в сроках восстановления кроветворения у пациентов после трансплантации в миелоаблативном режиме и в режимах пониженной интенсивности.

Длительность периода миелотоксического агранулоцитоза и критической тромбоцитопении была одинаковой для обеих групп больных (21/32 и 44/48 дней соответственно). С другой стороны мы выявили статистически достоверно более частое возникновение стоматитов и геморрагических циститов у больных, которым была проведена трансплантация аллогенного костного мозга в стандартном миелоаблативном режиме (р<0,0001). Также было выявлено значимое преобладание инфекционных осложнений в ранние сроки после ТКМ, а именно фебрильной лихорадки без четких очагов инфекции, в этой группе больных (р<0,0001).

Про веденный анализ данных позволил выявить, что острая реакция трансплантат против хозяина при применении кондиционирования в режимах

пониженной интенсивности возникает чаще, чем при применении стандартного миелоаблативного режима (р<0,0001). Данные приведены в таблице №1.

Таблица №1. Частота распространения острой и хронической реакции трансплантат против хозяина при различных режимах.

Режим кондиционирования

Миелоаблативный режим п - 20 Режим пониженной интенсивности П - 11 Р

ОРТПХ 1 (15%) 5 (45%) р<0,0001

ХРТПХ 12 (60%) 8 (72%)

Такие отличия в возникновении ОРТПХ для различных режимов предтрансплантационной подготовки, по-видимому, связаны с использованием разной профилактики РТПХ. Так при трансплантации в миелоаблативном режиме применялась профилактика тремя препаратами (метотрексат, преднизолон, циклоспорин), а при ТГСК в режимах пониженной интенсивности использовалась профилактика двумя препарата (метотрексат и циклоспорин). Различий в частоте встречаемости хронической РТПХ выявлено не было. Однако при более детальном анализе хронической «реакции трансплантат против хозяина» были обнаружены некоторые различия. Так, при трансплантации в миелоаблативном режиме большинство пациентов, у которых отмечалась экстенсивная форма реакции «трансплантат против хозяина», страдали хроническим миелолейкозом и лишь у одного пациента с острым лейкозом отмечалась хрРТПХ (р<0,05). С другой стороны, при трансплантации в режимах пониженной интенсивности, у 72% больных была отмечена экстенсивная форма хрРТПХ. Все больные, которые были проанализированы в этой группе, страдали острыми лейкозами и продвинутыми формами МДС.

При сравнении различных режимов подготовки и развития посттрансплантационных рецидивов принципиальных отличий выявлено не было. Так же не было выявлено принципиальных различий е общей и безрецидивной выживаемости при сравнении этих режимов. Данные приводятся на диаграммах 1,2.

Диаграмма №1. Общая выживаемость.

Миелоаблативный режим Режимы пониженной интенсивности

и

ол+мдс

о

10 20 30 <С 60 ео 70 Т1гге

«20 30 <030а0 70 ® Тктв

Диаграмма №2. Безрецидивная выживаемость.

Миелоаблативный режим

Режимы пониженной интенсивности

о

10 30 30 40 90 70 60

ТУТЙ

О Ю 20 30 40 50 ео 70 Гтв

Таким образом, принципиальных отличий общей и безрецидивной выживаемости, сроков восстановления кроветворения, структуры осложнений при анализе миелоаблативного режима и режимов пониженной

интенсивности выявлено не было. Поэтому в дальнейшем мы приняли решение анализировать результаты лабораторных исследований гемопоэтического химеризма для всей группы пациентов (31 человек) без разделения по режимам кондиционирования.

//. Результаты лабораторных исследований

Из исследования не был исключен ни один больной. У всех пациентов удалось получить образцы крови и костного мозга. Во всех случаях периферическая кровь была успешно разделена на клеточные популяции, и было выделено достаточное количество ядросодержащих клеток для проведения ПЦР. Среднее количество ядросодержащих клеток в образцах составило - 25,4 х 106 (1,2 х 106 - 74 х 106).

При анализе полного донорского или смешанного химеризма в различных клеточных популяциях мы обнаружили, что в некоторых из них смешанный химеризм определялся несколько чаще, хотя статистически достоверных различий получено не было.

В таблице N2 2 приведены данные по фракциям, в которых хотя бы один раз за исследование определялся смешанный химеризм.

Таблица № 2. Появление смешанного химеризма хотя бы один раз за весь период исследования в различных клеточных популяциях.

Т- лимфоци ты В- лимфоци ты Остаточная популяция мононуклеаров Г ранулоциты Мононуклеары костного мозга

13/14 12/14 14/14 8/14 12/14

Наибольшее число случаев смешанного гемопоэтического химеризма было зафиксировано на тридцатый день после трансплантации, причем чаще всего смешанный химеризм в эти сроки был зафиксирован в Т-клеточной популяции лимфоцитов.

Нами было выявлено, что на вероятность возникновения смешанного химеризма в тех или иных клеточных популяциях на всех сроках проведения исследования не влияет ни возраст больных, ни источник и количество стволовых клеток, ни объем проведенного ранее лечения, ни режим кондиционирования.

В результате проведенных исследований выявлено, что к 30 дню только у 65% больных устанавливается полный донорский химеризм. Начиная с 30 дня после ТКМ, у 3-29% больных в течение года отмечается персистарование хозяйского кроветворения по различным клеточным популяциям.

Нами так же были замечены некоторые различия в динамике становления полного донорского химеризма по различным популяциям. Мы обратили внимание, на то, что динамика установления гемопоэтического химеризма во фракции мононуклеаров, выделенных из костного мозга, полностью совпадала с таковой для фракции гранулоцитов. С другой стороны, было обнаружено, что по лимфоидным фракциям восстановление полного донорского кроветворения происходит медленнее, чем во фракциях мононуклеаров из костного мозга и гранулоцитов. Т.е. реконституция кроветворной ткани происходит быстрее, чем иммунокомпетентной (смешанный химеризм в гранулоцитах к 6 и 9 мес определялся у 9% и 4% больных, в то время как в лимфоидной популяции - у 18% и 16%). На диаграмме № 3 приводится графическое отображение этого факта.

Диаграмма №3. Темпы установления донорского химеризма в различных клеточных популяциях.

Убывание хозяйского кроветворения во

фракциях гранулоцитов и иононуклмров Убывание хозяйского кроветворения в

костного мозга лимфоидных фракциях

Весдателе ТГСК

III. Течение посттрансплантационного периода в зависимости от типа гемопоэтического химеризма

В качестве основных событий посттрансплантационного периода нами были проанализированы, следующие: острая и хроническая РТПХ, рецидив основного заболевания, смерть, связанная с рецидивом или процедурой трансплантации.

Показано, что наиболее часто рецидив основного заболевания возникает у пациентов, у которых хотя бы однажды в одной из клеточных популяций определялся смешанный химеризм (р=0,005). При изучении влияния типа химеризма на возникновение рецидива основного заболевания было выявлено, что только в одном случае полного донорского химеризма по всем клеточным фракциям у пациентки развился рецидив острого недифференцированного лейкоза (14%). В то же время у пациентов со смешанным химеризмом рецидив обнаруживался в 8 из 14 случаев (57%).

Также статистически достоверно (р<0,0001) выявлена зависимость развития острой РТПХ у пациентов, у которых полный донорский химеризм фиксировался по всем клеточным линиям во все сроки наблюдения. При этом ни у одного больного, у которого развилась острая РТПХ, не было

зафиксировано смешанного химеризма ни в одной из клеточных популяций (р<0,0001). Для хронической «реакции трансплантат против хозяина» такой зависимости выявлено не было.

Полученные данные приводятся в таблице № 3.

Таблица №3. Зависимость возникновения РТПХ и рецидивов от типа гемопоэтического химеризма.

Полный донорский химеризм во всех клеточных популяциях во всех исследованиях за 12 мсс Смешанный химеризм хотя бы в ОДНОЙ ИЗ клеточных популяций хотя бы в одном исследовании за 12 мес Р

ОРТПХ (до +90) 6/17 0/14 <0,0001

ХРТПХ 12/17 8/14

Рецидив 1/17 8/14 <0,0005

В дальнейшем мы проанализировали группу больных, у которых определялся смешанный химеризм и развился рецидив. Выявлено, что в большинстве случаев это были больные, страдающие острыми лейкозами и миелодиспластическим синдромом. Таким образом, при наличии смешанного химеризма рецидивы статистически достоверно чаще развивались у больных острыми лейкозами и МДС (р< 0,0005).

Особое значение также имеет длительное существование смешанного гемопоэтического химеризма после ТГСК. Мы проанализировали общую и безрецидивную выживаемость, а также смертность среди пациентов, у которых к концу года наблюдения все еще сохранялся смешанный химеризм (стабильный персистирующий или вновь появившийся после полного донорского). Было выявлено, что общая выживаемость в этой группе больных достоверно менее длительная (р<0,0001), чем у пациентов,

у которых к году после проведенной ТГСК установился стабильный полный донорский химеризм.

Обнаружено, что на 30 день после ТГСК у 50% больных с ХМЛ отмечался смешанный химеризм. У 25-35% больных с ХМЛ отмечалась персистенция небольшого количества хозяйского кроветворения по различным клеточным популяциям на протяжении первого года наблюдения. Только у одного из этих пациентов развился рецидив заболевания, в то время как у всех больных ОЛ+МДС со смешанным химеризмом развился рецидив в ранние сроки, за исключением больных, которым была отменена иммуносупрессия.

IV. Смешанный химеризм в различных клеточных популяциях

Нами был проведен сравнительный анализ для оценки зависимости установления полного донорского химеризма или появления смешанного химеризма в каждой из клеточных популяций от всех анализируемых нами предтрансплантационных параметров: пола, возраста, основного заболевания пациента, режима кондиционирования, источника стволовых клеток, наличия до трансплантации курсов химиотерапии или иммуносупрессии. В результате проведенных расчетов не найдено статистически значимых отличий для установления типа химеризма в различных клеточных популяциях от перечисленных выше факторов. Мы также проанализировали влияние присутствия смешанного химеризма в каждой из клеточных популяций по отдельности на общую выживаемость, риск возникновения рецидива лейкоза, появление острой или хронической РТПХ и смерти.

В результате проведенного анализа была выявлена статистически значимая зависимость между присутствием смешанного химеризма в одной клеточной популяции к концу наблюдения (один год после ТКМ) и возникновением рецидива лейкоза. Это популяция мононуклеаров периферической крови после удаления из нее Т и В клеток, которую в нашем исследовании мы называем остаточной популяцией мононуклеаров. Было обнаружено, что длительное сохранение смешанного химеризма или появление смешанного химеризма после полного донорского (убывающий

донорский химеризм) именно в этой популяции к 12 месяцам после трансплантации статистически значимо (р<0,0001) влияет на безрицидивную выживаемость пациентов. В нашем исследовании мы наблюдали два случая, когда появление смешанного химеризма в остаточной популяции мононуклеаров отмечено на 2-3 месяца раньше, чем появление смешанного химеризма в других клеточных популяциях и гораздо ранее (на 6 месяцев), чем появление развернутого костномозгового рецидива. Определение смешанного химеризма именно в остаточной популяции клеток опережает сроки развития рецидива на б мес, тогда как в других популяциях этот срок составляет 1 мес.

V. Гэмопоэтический химеризм и минимальная остаточная болезнь

Минимальная резидуапьная болезнь с помощью цитогенетических и молекулярно-биологических методов контролировалась у 13 человек из 31, вошедшего в исследование. Среди них было двое пациентов с острыми лейкозами (1 - ОЛЯ, 1 - ОПЛ); пятеро больных МДС; и шесть пациентов сХМЛ.

Все пациенты, у которых признаки минимальной остаточной болезни не выявлялись, живы до настоящего момента и находятся в полной ремиссии, в том числе и те больные, у которых определялся стабильный персистирующий смешанный химеризм в течение нескольких месяцев. Следует отметить, что к году наблюдения после аллогенной ТГСК у всех этих пациентов установился стойкий полный донорский химеризм во всех клеточных популяциях. К сожалению, группа больных, в которой удалось одновременно контролировать гемопоэтический химеризм и минимальную остаточную болезнь, была недостаточно велика. Это не позволило нам провести статистический анализ с целью выявления возможной зависимости между персистенцией лейкемического клона и типом гемопоэтического химеризма у больных после аллогенной ТГСК.

В таблице № 4 приведены цитогенетические и молекулярные маркеры, которые изучались у наших больных одновременно с контролем химеризма в клеточных популяциях.

Таблица № 4. Цитогенетаческие и молекулярные маркеры, исследуемые для контроля минимальной резидуальной болезни.

Диагноз Количество больных Маркеры

цитогенетические молекулярные

Острые лейкозы 2 Ц9;22) 4(15,17) Ьсг-аЫ (р210) РМиВАИа

мдс 5 Ц9;22), с!е1(9), ¡ИЗ) моносомия 7, множественные хромосомные абберации

ХМЛ 6 Н9;22) Ьсг-аЫ (р210)

У 8 пациентов постоянно определялся полный донорский химеризм по всем клеточным популяциям. Ни в одном случае минимальная резидуальная болезнь выявлена не была.

У пяти пациентов в разные сроки наблюдения выявлялся смешанный гемопоэтический химеризм. Из них у двух пациентов при определении убывающего донорского химеризма обнаруживалась минимальная резидуальная болезнь. Один больной страдал хроническим миелолейкозом, другой - МДС. У пациента с ХМЛ химерный онкоген ВС1Ъ-АВ1-при определении молекулярным методом (качественная ОТ-ПЦР), был выявлен одновременно с обнаружением смешанного химеризма во всех клеточных популяциях. При этом цитогенетаческие методы позволили выявить минимальную остаточную болезнь (используемый метод -стандартная цитогенетика, множественные хромосомные абберации) только через 30 дней. У второго пациента, больного МДС, признаки минимальной

болезни, выявленные с помощью метода FISH , определялись одновременно с появлением смешанного химеризма во всех лимфоидных популяциях.

У трех пациентов с ХМЛ в течение нескольких месяцев определялся стабильный смешанный донорский химеризм. При этом минимальная резидуальная болезнь никогда не определялась.

Методические рекомендации.

1. Разработана методика выделения клеточных субпопуляций из периферической крови пациентов, с помощью метода иммуномагнитной селекции. Определена клеточная субпопуляция, в которой определение смешанного химеризма принципиально для возникновения рецидива (популяция клеток после удаления гранулоцитов, Т и В - лимфоцитов).

2. Особое значение имеет выявленная ассоциация полного донорского химеризма с развитием РТПХ для группы больных после ТГСК в режимах кондиционирования пониженной интенсивности. Высокая степень корреляции полного донорского химеризма с РТПХ послужила еще одним фактором в пользу модификации режима профилактики этого осложнения - добавлению третьего препарата (мофетил микофенолата) к стандартной схеме.

3. Принципиальным оказалось определение смешанного химеризма, и в последствии развитие посттрансплантационного рецидива у больных с острыми лейкозами при миелоаблативной трансплантации, при использовании трехкомпонентной схемы профилактики РТПХ (метотрексат, преднизолон, циклоспорин). С другой стороны было показано, что для больных с ОЛ, которым была проведена трансплантация в этом режиме не характерно развитие ни острой, ни хронической РТПХ. Эти данные помогли разработать схему профилактики РТПХ при миелоаблативном режиме. При миелоаблативной трансплантации у больных ХМЛ используется трехкомпонентная схема профилактики РТПХ, а у больных с острыми лейкозами - двухкомпонентная.

4. Учитывая полученные нами данные, мы попытались разработать рекомендации по срокам и показаниям исследования химеризма у пациентов после трансплантации аллогенного костного мозга.

Диаграмма № 4. Алгоритм ведения больных с различными типами гемопоэтического химеризма.

Полный донорский химсризм

хмп/оп/мдс

+-30 Acta» юта.

+00я«иь -100S

+ 9) день - 1СОХ

>¿1

Кснтрсиц кхжш» зпем^гям пкм 12 гас 1 pea aBwc

СМЕШАННЫЙ ХИМЕРИЗМ

При выявлении смешанного химеризма для ХМЛ - начиная от +60 дня дпяОМЛ/МДС- начиная от+30 дня

Заключение.

Изучение гемопоэтического химеризма у пациентов после аллогенной ТГСК по-прежнему остается не только рутинным исследованием, но и полем для дальнейших научных разработок. Предпосылками этому являются как дальнейшее совершенствование методов трансплантации (применение низкодозных и немиелоаблативных режимов кондиционирования), так и использование ТГСК как метода терапии целого ряда заболеваний опухолевой и неопухолевой природы, таких, как солидные опухоли, системные заболевания соединительной ткани. Особое значение приобретает изучение химеризма в различных клеточных популяциях, поскольку в результате проведения этих исследований происходит накопление новых данных о роли определенных субпопуляций клеток в противоопухолевом ответе и развитии системных аллоиммунных реакций, таких, как РТПХ и РТПЛ.

Становится очевидным, что становление и динамика донорского химеризма, полного или смешанного, во фракционированных клеточных популяциях имеет различное значение для пациентов с разными видами заболеваний, как было показано, в том числе, и в нашем исследовании. Следует также отметить, что изучение динамики гемопоэтического химеризма,

как фактора, влияющего на развитие посттрансплантационных рецидивов у больных острыми лейкозами и МДС, сыграло важную роль в разработке схемы поэтапной противорецидивной терапии, включающей отмену иммуносупрессии

и проведение ТДЛ. Исследование значения типа донорского химеризма в возникновении таких осложнений аллогенной ТГСК, как острая и хроническая РТПХ при разных заболеваниях, учитывалось нами также при разработке схем профилактики, включающих различные иммуносупрессивные препараты.

До сих пор продолжается активная работа исследователей, посвященная совершенствованию методов изучения гемопоэтического химеризма, оптимизации сроков исследования, выбору материала

(периферическая кровь, клеточные популяции, костный мозг) для анализа при различных видах ТГСК и при различных заболеваниях. Несомненно, дальнейшее накопление данных в этой области приведет не только к стандартизации подходов к изучению посттрансплантационного кроветворения, но и позволит усовершенствовать саму процедуру ТГСК, ведение пациентов после трансплантации, и, в целом, приведет к улучшению результатов лечения пациентов с тяжелыми заболеваниями системы крови.

Выводы:

1. Восстановление донорского кроветворения происходит в одни и те же сроки у больных гемобластозами, перенесших аллогенную ТГСК после миелоаблативного режима кондиционирования, и у пациентов, подвергнутых трансплантации в режиме пониженной интенсивности

2. Не выявлено статистически значимых различий в скорости установления полного донорского химеризма в клетках, принадлежащих миелоидной и лимфоидным популяциям, однако отмечена тенденция к более раннему установлению полного донорского химеризма в гранулоцитарной фракции.

3. Обнаружена высокая корреляция возникновения посттрансплантационных рецидивов с определением смешанного гемопоэтического химеризма хотя бы в одной клеточной популяции у больных в течение года после аллогенной ТГСК (р = 0,005).

4. Наиболее значительной оказалась ассоциация смешанного гемопоэтического химеризма с возникновением рецидива для пациентов, страдающих острыми лейкозами и МДС группы высокого риска (р = 0,0005).

5. При исследовании значения химеризма в отдельных клеточных популяциях, обнаружена статистически значимая зависимость между определением смешанного химеризма в популяции мононуклеаров периферической крови после отделения Т- и B-лимфоцитов и развитием посттрансплантационного рецидива (р<0,0001).

6. Выявлена высокая степень корреляции между быстрым установлением полного донорского химеризма во всех клеточных популяциях

(в течение 1 месяца после ТГСК), его постоянным существованием и развитием острой РТПХ (р < 0,0001).

7. При исследовании химеризма в различных клеточных популяциях периферической крови не было выявлено статистически значимых различий по сравнению с исследованием химеризма в ядросодержащих клетках костного мозга

Список опубликованных работ по теме диссертации:

1. E.Zhelnova, I.Demidova, L.Lubimova et.al. Lineage-specific chimerism

in patients with high-risk haematological malignancies after HSCT as predictor of relapse.

Bone Mrrow Transpl 2005, vol 35, suppl 2, p 356, abstr R1170

2. I.Demidova, E.Zhelnova, L.Lubimova, A.Misiurin, A.Poreshina, R.Kutina, V.Savchenko. Cell lineage specific chimerism in patients in early phase after myeloablative and reduced-intencity stem cell transplantation. Haematologica 2005; 90(s2), p377, abstr 0959

3. I.Demidova, E.Zhelnova, L.Lubimova, A.Poreshina, R.Kutina, E.Parovichnikova V.Savchenko.

Severe chronic GvHD in patients after reduced-intencity allogeneic haemopoietic stem cell transplantation and treatment modalities. Mrrow Transpl 2006, vol 37, p 94, abstr P 472

4. E.Zhelnova, I.Demidova, L.Mendeleeva, L.Lubimova, A.Misurin,, E.Parovichnikova V.Savchenko.

Haemotopoietic chimerism in patients with haematological malignancies treated with donor lymphocyte infusions for relapse after allogeneic stem cell transplantation

Mrrow Transpl 2006, vol 37, p 104, abstr P 502

5. Е.И.Желнова, Л.П.Менделеева, Л.С.Любимова, И.А.Демидова, Е.Н. Паровичникова, Л.П.Порешина, Р.М.Кутьина, А.П.Шпакова, И.Б. Капланская, Н.Н. Калинин, В.Г.Савченко

Эффективность трансфузий лимфоцитов донора и длительного применения интерлейкина-2 у пациента с рецидивами острого лейкоза после трансплантации аллогенного костного мозга. Тер. архив 2007, №8, том 79, стр.67-69

6. Е.И.Желнова, ИАДемидова, И.В.Гальцева, Л.С.Любимова, А.В.Мисюрин, В.Г. Савченко

Количественный анализ гемопозтического химеризма у больных после аллогенной трансплантации стволовых клеток крови методом иммуномагнитной селекции и ПЦР-амплификации гипервариабельных участков ДНК.

Отдана в печать в редакцию журнала «Молекулярная медицина» в 2007 году.

7. T.Hahn, E.Zhelnova, I.Demidova, V.Savchenko, C.Ambrosone,

Ph. McCarthyGluthation-S-transferase M1 (GTSM) deletion polymorphisms predict regimen-related toxicity after autologous and allogeneic blood and bone marrow transplantation. Blood 2007;110:1982

8. Л.П.Менделеева, Н.Е.Митиш, ГАКлясова, Л.С.Любимова, Е.О.Грибанова, О.С.Покровская, Е.И.Желнова, Л.А.Кузьмина, Л.Л.Сперанская, ТА.Гаранжа, И.Б.Капланская, И.Э.Костина, В.Г.Савченко

Инфекции в течение первых 100 дней после трансплантации гемопоэтических

клеток у больных гемобластозами.

Гематология и трансфузиология, 2007,т.52, №4, с.8-15.

9. Л.П.Менделеева, О.С.Покровская, Е.О. Грибанова, Т.В. Гапонова, Е.И. Желнова, М.В. Гапонова, Е.И. Желнова, М.В. Анухина, Е.С. Урнова, Е.Ю. Варламова, Н.Н. Калинин, Е.М. Грицов, В.Г. Савченко Высокодозная химиотерапия с последующей аутотрансплантацией у пожилых больных множественной миеломой.

Клиническая геронтология, 2007, №4, с.20-24

10. E.Zhelnoval, Т. Hahn 2, PL McCarthy2,1. Demidoval, A. Misiurinl, E. Parovitchnikoval, V. Savchenkol

Treatment related toxicity after hematopoietic stem cell transplantation and deletion polymorphisms in Glutathione-S-Transferase M1 (GSTM1) and Glutathione-S-Transferase T1 (GSTT1) in different ethnic populations of patients.

Bone Mrrow Transp! 2008, vol 39, p 99, abstr P462

11. L.Mendeleeva, L.Lubimova, l.Demldova,, E.Zhelnova, Y.OIshanskaja, E.Parovichnikova V.Savchenko.

Donor lymphocyte infusions in aplasia after reinduction chemotherapy for acute leukaemia relapse after allogeneic stem cell transplantation. Bone Mrrow Transpl 2008, vol 39, p 174, abstr P647

Подписано в печать 20.10.08. Тираж 100 экз. Формат 60x84/16. Объем 1,75 печ. листа.

Отпечатано в типографии «Униграф» 248600, г. Калуга, ул. Баженова, 2, тел/факс (4842) 573187