Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Фенотипические и функциональные свойства мезенхимальных стромальных клеток человека в норме и при иммунопатологических заболеваниях

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ КЛИНИЧЕСКОЙ ИММУНОЛОГИИ» СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

0520135058е?

На правах рукописи Шевела Екатерина Яковлевна

Фенотипические и функциональные свойства мезенхимальных стромальных клеток человека в норме и при иммунопатологических

заболеваниях

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология

Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Научный консультант: член-корреспондент РАМН, д.м.н., профессор Черных Е.Р.

2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ.............................................................................................................6

ГЛАВА 1. МУЛЬТИПОТЕНТНЫЕ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫЕ СТРОМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ: БИОЛОГИЧЕСКИЕ И ИММУНОРЕГУЛЯТОРНЫЕ СВОЙСТВА В НОРМЕ И ПРИ ПАТОЛОГИИ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ)..............................17

1.1 Общая характеристика МСК...................................................................17

1.1.1 Идентификация МСК...................................................................................20

1.1.2 Гетерогенность МСК in vitro......................................................................24

1.1.3 МСК in vivo.....................................................................................................27

1.2 МСК и гемопоэз...........................................................................................28

1.3 Иммунорегуляторные свойства МСК....................................................29

1.3.1 Иммуносупрессорная активность МСК...................................................29

1.3.2 Иммуностимуляторная активность МСК................................................34

1.4 Регуляция функциональной активности МСК....................................36

1.5 Особенности МСК различного тканевого происхождения................39

1.6 Изменение свойств МСК при патологии...............................................43

1.7 Клиническое использование МСК..........................................................45

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ......................49

2.1. Характеристика больных, включенных в исследование.....................49

2.2. Генерация и свойства МСК........................................................................50

2.2.1 Получение и культивирование мононуклеарных и ядросодержащих

клеток...........................................................................................................................50

2.2.2. Определение числа клоногенных предшественников МСК...................52

2.2.3 Ростовые и морфометрические характеристики.....................................52

2.2.4 Оценка фенотипа МСК....................................................................................53

2.2.5 Оценка дифференцировочного потенциала МСК....................................54

2.2.6 Анализ иммуносупрессорной активности МСК.........................................56

2.2.7 Гемопоэзстимулирующая активность..........................................................57

2.2.8 Оценка продукции цитокинов.......................................................................57

2.3 Апробация ко-трансплантации ГСК и МСК у больных лимфомами 58

2.3.1 Оценка раннего восстановления лимфоцитов (PBJI)..............................59

2.3.2 Оценка субпопуляций Т-лимфоцитов методом проточной флуориметрии.............................................................................................................59

2.4 Статистическая обработка полученных результатов..........................60

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ............60

3.1 Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) взрослого организма: сравнительная характеристика МСК различного тканевого происхояедения.....................................................................................................60

3.1.1 Клоногенность, пролиферативная активность и морфометрические особенности МСК.......................................................................................................61

3.1.2 Фенотипическая характеристика и дифференцировочный потенциал МСК................................................................................................65

3.1.3 Мультиплексный анализ биологически активных медиаторов, продуцируемых мезенхимальными стромальными клетками........................71

3.1.4 Гемопоэзстимулирующая и иммуносупрессорная активность МСК.... 79

3.2 Характеристика МСК костного мозга при различных заболеваниях83

3.2.1 Клоногенность и пролиферативная активность МСК..........................84

3.2.2 Фенотипическая характеристика и дифференцировочный потенциал МСК................................................................................................88

3.2.3 Биологически активные медиаторы, продуцируемые МСК...................91

3.2.4 Оценка гемопоэзстимулирующей активности МСК.................................96

3.2.5 Исследование иммуносупрессорной активности МСК.............................99

3.3 Механизмы МСК-опосредованной иммуносупрессии.......................104

3.3.1 Активационные маркеры.............................................................................105

3.3.2 Простагландин Е2 и индоламин-2,3-диоксигеназа..................................108

3.3.3 Интерлейкин 10...............................................................................................111

3.3.4 Оксид азота......................................................................................................113

3.3.5 HLA-G...............................................................................................................114

3.4 Основной фактор роста фибробластов в коррекции нарушений МСК .......................................................................................116

3.5 Влияние МСК на иммунную реконституцию и клиническую эффективность при трансплантации ГСК у больных злокачественными лимфомами.........................................................................................................123

3.5.1 Ретроспективный анализ ко-трансплантации МСК и ГСК у больных злокачественными лимфомами............................................................................123

3.5.2 Влияние МСК на длительность периода цитопении...............................126

3.5.3 Влияние МСК на раннее восстановление лимфоцитов..........................128

3.5.4 Влияние МСК на восстановление различных субпопуляций Т-лимфоцитов...............................................................................................................130

3.5.5 Влияние МСК на реконституцию регуляторных Т-клеток...................133

3.5.6 Осложнения после ауто-ТГСК и ко-трансплантации МСК и ГСК......135

3.5.7 Влияние МСК на общую выживаемость...................................................138

ОБСУЖДЕНИЕ.................................................................................................140

ВЫВОДЫ............................................................................................................157

ЛИТЕРАТУРА...................................................................................................160

Список сокращений

МСК Мезенхимальные стромальные клетки

КМ-МСК, П-МСК, МСК, полученные из костного мозга, плаценты и жировой

Ж-МСК ткани соответственно

ИДО Индоламин-2,3-диоксигеназа

ИОД Индекс остеогенной дифференцировки

МНК Мононуклеарные клетки

CKJI Смешанная культура лимфоцитов

Ahth-CD3 Ahth-CD3 антитела

CD Кластер дифференцировки

EGF Эпидермальный фактор роста

ЕРО Эритропоэтин

FGF-basic (bFGF) Основной фактор роста фибробластов

G-CSF Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор

GM-CSF Гранулоцитарно-макрофагальный

колониестимулирующий фактор

HLA-DR DR антигены главного комплекса гистосовместимости

sHLA-G 1/5 Растворимые изоформы HLA-G 1/5

IFN-a, IFN-y Интерфероны а и у

IGF Инсулиноподобный фактор роста

IL-2, IL-4 и др. Интерлейкин-2, интерлейкин-4 и др.

LPS Липополисахарид

PGE2 Простагландин Ег

Thlи Th2 Субпопуляции Т-хелперных клеток

TLR Toll-like рецептор

VEGF Сосудистый эндотелиальный фактор роста

АИЗ Аутоиммунные заболевания

ЦП Цирроз печени

ЛХ Лимфома Ходжкина

HXJI Неходжкинская лимфома

MM Множественная миелома

AA Апластическая анемия

ГСК Гемопоэтические стволовые клетки

ТГСК Трансплантация ГСК

РВЛ Раннее восстановление лимфоцитов

Treg Регуляторные Т-клетки

ВВЕДЕНИЕ

Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) относятся к классу соматических стволовых клеток, которые характеризуются способностью к самоподдержанию и дифференцировке в клетки тканей мезодермального происхождения [44]. Будучи широко представленными во всех тканях, содержащих строму с фибробластоподобными клетками [62], эти клетки активно участвуют в поддержании и обновлении элементов соединительной ткани [192]. Особое значение придается роли МСК в формировании гемопоэтических ниш, обеспечивающих функционирование стволовых гемопоэтических клеток в костном мозге, а также в создании микроокружения, необходимого для самоподдержания, пролиферации и дифференцировки тканеспецифических стволовых и прогениторных клеток, в том числе Т-клеточных предшественников в тимусе.

В последующих работах было показано, что в определенных условиях in vitro МСК могут дифференцироваться также в клетки тканей экто- и эндодермального происхождения [44, 170], и именно с этим свойством МСК первоначально связывали терапевтический потенциал этих клеток. Действительно, позитивный эффект трансплантации МСК в моделях травмы головного и спинного мозга в совокупности с данными о способности МСК дифференцироваться в нейрональные клетки свидетельствовал о значимости процессов дифференцировки в терапевтическом потенциале МСК. Использование МСК человека также приводило к значительному регрессу симптомов заболевания в моделях множественного склероза и бокового амиотрофического склероза, воспалительных заболеваний кишечника, инфаркта, инсульта, диабета и РТПХ [40, 222, 192, 213].

Однако быстрое развитие эффекта и выявление сравнительно небольшого количества дифференцировавшихся in vivo МСК заставило усомниться в том, что клинический эффект обусловлен в первую очередь трансдифференцировкой /клеточным замещением.

Наряду с выраженным дифференцировочным потенциалом, важным свойством МСК является паракринная функция, которая заключается в способности этих клеток влиять на функционирование целого ряда клеточных элементов. Паракринная функция может реализовываться через продукцию широкого спектра различных факторов МСК, контактные взаимодействия МСК с другими клетками, а также через привлечение (с помощью молекул адгезии и хемокинов) тканеспецифических предшественников и клеток иммунной системы.

Действительно, по данным литературы, спектр продуцируемых МСК факторов включает различные гемопоэтические и негемопоэтические ростовые факторы (в-СЗР, ОМ-С8Р, УЕОБ, ЮР-1, РвР-Ь), интерлейкины (ПТЧ-у, 1Ь-2,1Ь-6,1Ь-1р, ЮТ-а) и хемокины (1Ь-8, МСР-1, М1Р-1Ь). Наряду с этим, МСК являются достаточно активными продуцентами ТЫ/провоспалительных и ТЪ2/противовоспалительных цитокинов, что подразумевает возможность как негативного, так и позитивного влияния на клетки иммунной системы.

Важно отметить, что, несмотря на преимущественное проявление супрессорной активности, в определенных условиях МСК могут обладать иммуностимулирующим потенциалом. В пользу этого утверждения свидетельствует экспрессия на поверхности МСК антигенов МНС I класса, наличие внутриклеточного пула молекул МНС II класса, экспрессия различных молекул адгезии и ТТЛв, а также способность МСК фагоцитировать апоптотические клетки [218]. Поскольку МСК в ответ на эндотоксин усиливают свою секреторную активность, очевидно, что функциональный потенциал МСК может играть значительную роль в регуляции репаративных процессов не только в физиологических условиях, но и при различных повреждающих воздействиях в ответ на различные эндо-и экзогенные ТЪЛ-лиганды. Однако физиологическое значение и

функциональные последствия фагоцитарной активности МСК остаются в настоящее время неизученными.

Паракринные эффекты лежат в основе способности МСК оказывать иммуносупрессивный/противовоспалительный эффект; выполнять трофическую функцию; поддерживать, а при необходимости рекрутировать и активировать тканеспецифические предшественники и активировать ангиогенез. Важная роль супрессорной активности МСК продемонстрирована в моделях аутоиммунных заболеваний, трофический эффект показан в моделях нейропротекции или посттравматической репарации, проангиогенная активность - в моделях инфаркта миокарда, церебрального инсульта и ишемии нижних конечностей. Дополнительными аргументами, делающими МСК привлекательными для клинического использования, является низкая иммуногенность этих клеток, способность к миграции в очаг повреждения/воспаления и антиапоптотические свойства, что в совокупности с иммуносупрессорной и гемопоэзстимулирующей активностью позволяет рассматривать МСК как потенциально активные индукторы/регуляторы репаративных процессов [8, 97, 116, 187, 211].

Еще одним примером паракринной функции может быть гемопоэзподдерживающая активность МСК, которая заключается в способности этих клеток создавать микроокружение и стимулировать пролиферацию и дифференцировку ГСК. Гемопоэзстимулирующая активность in vivo была продемонстрирована в моделях приживления гемопоэтических стволовых клеток при трансплантации костного мозга после высокодозной химиотерапии [128, 20]. Действительно, в отдельных клинических испытаниях показана эффективность МСК при солидных опухолях [118]. В настоящее время обсуждается целесообразность использования МСК с целью ускорения восстановления кроветворения при трансплантации стволовых кроветворных клеток пациентам гемобластозами после высоко дозной химиотерапии [128, 20].

Наличие одновременно с этим супрессорной активности МСК обусловило интерес к этим клеткам не только в плане повышения эффективности восстановления гемопоэза и иммунной реконституции после трансплантации ГСК, но и в плане профилактики РТПХ. С другой стороны, супрессорные свойства МСК могут неблагоприятным образом сказываться на иммунной реконституции, развитии инфекционных осложнений и выживаемости пациентов.

Несмотря на немногочисленность МСК в костном мозге (не более 0,01 - 0,001%), данная популяция клеток достаточно легко генерируется в культуре in vitro. Более того, впоследствии было показано, что источником МСК может быть не только костный мозг, но и жировая ткань, плацента, пуповинная кровь, эндометрий, пульпа молочных зубов и другие ткани [241, 92, 181, 11, 73, 32, 65, 184, 83]. Генерированные из разных тканей, МСК в целом отвечают Минимальным критериям, разработанным для стандартизации этих клеток. Тем не менее, имеются отдельные данные о фенотипических и функциональных особенностях МСК различного тканевого происхождения. Подобные наблюдения поднимают вопрос о необходимости сравнительной характеристики свойств МСК из различных тканей с целью обоснованного выбора оптимального источника МСК, что является непременным условием для успешного развития клеточных технологий.

В клинической практике, в соответствии с требования GCP, наиболее безопасным считается использование аутологичного клеточного материала, что позволяет избежать проблем гистосовместимости, этических и юридических вопросов. Однако использование аутологичных МСК пациентов при проведении клеточной терапии ставит вопрос о функциональной полноценности этих клеток при патологии. Исследования, посвященные возможностям генерации и анализу функциональной активности МСК при патологии, в частности, инфекционно-воспалительных

и онкологических заболеваниях, немногочисленны и противоречивы. Мнения различных исследователей варьируют от постулирования функциональной полноценности стромальных клеток [35, 124] или выявления нарушений отдельных их характеристик при сохранности других [212, 228, 133], до признания полной дефектности МСК [114, 166, 227]. Существуют также данные о нарушениях функционирования стромы лишь у небольшой части больных при отсутствии таковых у остальных [78, 103]. В целом анализ данные литературы не позволяет сделать однозначного заключения об особенностях функционирования МСК при той или иной патологии. Кроме того, отсутствие информации об особенностях/нарушениях функциональных свойств МСК при патологии тормозит разработку подходов направленной коррекции активности этих клеток, что приобретает особую значимость при использовании аутологичных МСК у пациентов с различными заболеваниями.

Вышесказанное определило цель настоящей работы: исследовать биологические и иммунорегуляторные свойства МСК различного тканевого происхождения, а также костномозговых МСК в норме и при иммунопатологических заболеваниях и изучить влияние МСК на эффективность восстановления гемоиммунопоэза при трансплантации гемопоэтических стволовых клеток у больных гемобластозами.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Изучить количественное содержание, фенотип и дифференцировочный потенциал МСК различного тканевого происхождения (костный мозг, жировая ткань, плацента).

2. Изучить регуляторную (иммуносупрессорную, гемопоэз-стимулирующую, цитокин-секреторную) активность МСК, выделенных из костного мозга, жировой и плацентарной ткани.

3. Охарактеризовать количественное содержание, фенотип и дифференцировочный потенциал костномозговых МСК у больных гемобластозами, аутоиммунными заболеваниями и циррозом печени.

4. Изучить иммуносупрессорную, гемопоэзстимулирующую и цитокин-секреторную костномозговых МСК у больных гемобластозами, аутоиммунными заболеваниями и циррозом печени.

5. Исследовать возможные молекулярные механизмы, опосредующие иммуносупрессорную активность МСК костного мозга, в норме и у больных гемобластозами, аутоиммунными заболеваниями и циррозом печени.

6. Изучить влияние фактора роста фибробластов (FGF) на диффернцировочный, иммуносупрессорный и цитокин-секреторный потенциал костномозговых МСК доноров в культуре in vitro и оценить возможность использования FGF для стимуляции роста и коррекции функ�