Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Роль регуляторных T клеток CD4+CD25+FOXP3+ в развитии острой "реакции трансплантат против хозяина" у детей после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток

На правах рукописи.

У

ои^4•^■-

Корсунский Илья Анатольевич

Роль регуляторных Т клеток С04+СЭ25+РОХРЗ+ в развитии острой «реакции трансплантат против хозяина» у детей после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток

14.00.29 - гематология и переливание крови 14.00.36-аллергология и иммунология

Автореферат 1 5 ОКТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Москва 2009

003479759

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии» Росздрава. (директор - член-корр. РАМН, проф. А.Г. Румянцев)

Научные руководители:

Член-корр. РАМН, доктор медицинских наук, профессор Румянцев Александр Григорьевич.

Доктор медицинских наук, профессор Быковская Светлана Нюневна.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Афанасьев Борис Владимирович.

доктор медицинских наук, профессор Козлов Иван Генрихович.

Ведущая организация: Гематологический научный центр РАМН.

Защита диссертации состоится «_»_2009 года в_часов на заседании

диссертационного совета Д 208.050.01 в ФГУ «ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии» Росздрава по адресу: 11797, Москва, Ленинский проспект 117, корпус 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии» Росздрава по адресу: 119571, Москва, Ленинский проспект 117, корпус 2 и на сайте www.niidg.ru

Автореферат разослан « »_2009 года.

Учёный секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Чернов В.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) является эффективным методом лечения ряда гематологических, онкологических и аутоиммунных заболеваний (Румянцев А. Г., 1997). Одним из самых часто встречающихся ранних осложнений ТГСК является острая «реакция трансплантат против хозяина». «Реакция трансплантат против хозяина» (РТПХ) инициируется после пересадки клеток аллогенного костного мозга (КМ), когда пересаженные клетки здорового донора распознают антигенные детерминанты па антигенпрезентирующих клетках реципиента. Т-лимфоциты донора, специфически активированные клетками хозяина, пролиферируют, секретируют каскад цитокииов (так называемый «цитокиновый шторм»), и дифференцируются в эффекторные Т-клетки, которые обычно атакуют кожу, печень и гастроинтестинальный тракт реципиента (Румянцев А.Г., Масчан A.A., 2003). Острая РТПХ развивается в результате атаки клеток реципиента цитотоксическими CD8+ Т-лимфоцитами донора, сопровождается элиминацией лимфоцитов реципиента и тяжёлым иммунодефицитом (Rus V. et al, 1995).

Изучение влияния регуляторных Т-клеток CD4+CD25+ Foxp3+ (Трег) донора на поведение CD8+ Т-лимфоцитов реципиента показало, что именно Т per CD4+CD25+Foxp3+ могут блокировать активацию донорских CD8+ Т-клеток и, следовательно, препятствовать этой субпопуляции Т-лимфоцитов индуцировать острую РТПХ (Porada C.D. et al, 2006). Напротив, в хронической РТПХ происходит активация CD4+ донорских Т-клеток, которые стимулируют субпопуляцию аутореактивных В лимфоцитов реципиента, что приводит к нарушению аутотолерантности (Morris S.C. et al, 1990).

Для приживления клеток донора и профилактики развития РТПХ, проводится химио- и иммуносупрессивная терапия. Однако применение иммуносупрессантов и миелоаблативной терапии сопряжено с глобальной депрессией иммунной системы, повышенной склонностью больного к инфекции и неоплазии, то есть, с резким ухудшением качества жизни. Специфические методы терапии РТПХ смогли бы разрешить одну из самых серьёзных проблем трансплантологии. Достижения в изучении супрессорной функции Т клеток и возможности их применения в клинике открывают перспективы для решения этой задачи.

Цель исследования

Изучение роли регуляторных Т лимфоцитов CD4+CD25+FOXP3+ в развитии и тяжести течения острой «реакции трансплантат против хозяина» у детей после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.

Задачи исследования:

1. Оценить частоту манифестации и степень тяжести острой РТПХ у детей с онкологическими и гематологическими заболеваниями после ТГСК, а также определить её связь с типом трансплантации (родственная/неродственная) и источником ГСК (костный мозг, стволовые клетки крови).

2. Изучить влияние содержания регуляторных Т клеток трансплантата на последующее развитие острой «реакции трансплантат против хозяина» у детей.

3. Провести количественный анализ регуляторных Т лимфоцитов периферической крови ребёнка и его связь с клиническим состоянием пациента в динамике острой РТПХ.

4. Оценить возможность и перспективы коррекции острой РТПХ с помощью выращенных ex vivo регуляторных Т лимфоцитов.

Научная новизна

Впервые показано, что количественное содержание регуляторных Т клеток в трансплантате напрямую связано с клиническим состоянием детей в посттрансплантационный период. Результаты свидетельствуют о прямой связи малого количества регуляторных Т клеток в донорском трансплантате с повышенной частотой и тяжестью острой РТПХ у реципиента.

Впервые показано, что низкая концентрация регуляторных Т клеток в периферической крови реципиента связана с повышенной частотой манифестации и тяжелыми (III-IV) стадиями острой РТПХ у детей после аллогенной ТГСК в постгрансплантационный период.

Показана перспектива, безопасность и целесообразность профилактики и/или лечения острой РТПХ с помощью ex vivo выращенных регуляторных Т лимфоцитов.

Практическая значимость исследования

Данное исследование отражает частоту манифестации основного осложнения ТГСК и тяжесть его течения, что позволяет более обоснованно подходить к вопросу планирования работы гематологических отделений. Прежде всего, планирования затрат на уход за больными в послеоперационном периоде.

Количество регуляторных Т лимфоцитов в субпопуляционном составе трансплантата является значимым прогностическим фактором состояния больного в ранний постгрансплантационный период, что позволяет лучше планировать работу отделения трансплантации и с более высокой достоверностью прогнозировать вероятность манифестации и тяжесть острой РТПХ.

Мониторинг регуляторных Т клеток периферической крови пациента во время его нахождения в больнице является ещё одним лабораторным критерием состояния ребёнка, помочь в более точном определении степени тяжести острой РТПХ и помочь в корректировке лечения.

Результаты данного исследования являются основанием для исследования эффекта введения больным выращенных ex vivo регуляторных Т клеток. Внедрение в практику

Результаты работы применены для планирования работы отделения трансплантации костного мозга РДКБ. Апробация работы

Апробация состоялась 10.08.2009 на объединённой научно-практической конференции сотрудников отдела координации и планирования научно-исследовательских работ ФГУ «ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии» Росздрава, отделения трансплантации костного мозга ГУ РДКБ Росздрава.

Материалы диссертации представлены на VI симпозиуме «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний» (Москва, 2009 год), I международной конференции «Иммунотерапия и иммуномониторинг раковых заболеваний» (Киев, 2009 год).

По материалам диссертации опубликовано 6 работ в журналах, в том числе 2 во включённых в перечень изданий ВАК. Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста, состоит из введения, 8 глав, заключения, выводов, практических рекомендации, библиографического указателя, включающего 130 литературных источников, в том числе 4 отечественных и 126 иностранных и приложений. Работа иллюстрирована 20 таблицами и рисунками.

Работа выполнена в ФГУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии» Росздрава (директор - член-корр. РАМН, д.м.н., профессор А. Г. Румянцев) на базе Российской детской клинической больницы Росздрава (главный врач - д.м.н., профессор Н. Н. Ваганов).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Основу работы составило изучение связи количества регуляторных Т клеток в донорском трансплантате/периферической крови реципиента и его клинического состояния. В

первой части работы было обследовано 19 больных детей в возрасте от 9 месяцев до 16 лет (табл. 1), а также 9 здоровых доноров гемопоэтических стволовых клеток (табл. 3). Вторая часть работы включила в себя ретроспективный анализ данных, полученных в процессе комплексного обследования 277 детей в возрасте от 9 месяцев до 17 лет, в том числе 100 девочек и 177 мальчиков с различными поражениями костного мозга (табл. 2) после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. Обследование и наблюдение больных осуществлялось в отделении трансплантации костного мозга (зав. отд. - д. м. н, Скоробогатова Е. В.), отделении полихимиотерапии (зав. отд. - к. м. н. Литвинов Д. В.), отделении общей гематологии (зав. отд. - к. м. н. Масчан М. А.) Российской Детской Клинической Больницы (главный врач - проф. Ваганов Н. Н.) и отделе клеточных технологий и тканевой регенерации ЦНИЛ Российского Государственного Медицинского Университета (научный руководитель - проф. Быковская С. Н.)

При обследовании применялись следующие методы: клинико-анамнестический, иммунологическое исследование состава крови методом проточной цитометрии, общий и биохимический анализы крови, эзофагогастродуоденофиброскопия с прицельной биопсией слизистой оболочки желудка и последующим исследованием биоптатов. Таблица 1. Включённые в клинико-лабораторное исследование пациенты.

пол количество (всего 19)

девочки 3

мальчики 16

возраст

до Зх лет 5

4-7 3

8-12 7

13-16 4

диагноз

ОМЛ 4

АА 3

ОЛЛ 3

МДС 2

ХМЛ 2

АЛД 1

АФ 1

лейкодистрофия Краббе-Бенеке 1

лимфома 1

МПС 1

ОМЛ - острый миелобластный лейкоз, АА - апластическая анемия, ОЛЛ - острый лимфобластный лейкоз, МДС - миелодиспластический синдром, ХМЛ - хронический миелобластный лейкоз, АЛД - адренолейкодистрофия, АФ - анемия Фанкони, МПС -мукополисахаридоз

Диагноз Количество (всего 277) %

АА 78 28,2

ОМЛ 72 26

АФ 16 5,8

ОЛЛ 32 11,6

ТКИН 5 1,8

ХМЛ 18 6,5

ГФЛГЦ 11 4

мдс 6 2,2

Лимфома 4 1,4

ХММЛ 3 1,1

СВО 3 1,1

ОбифЛ 6 2,2

МПС 9 3,2

юммл 7 2,5

пид 2 0,7

ЛНЛ 1 0,4

пнг 1 0,4

АЛД 1 0,4

СКА 1 0,4

лейкодистрофия 1 0,4

Таблица 3. Доноры н реципиенты ГСК, включённые в исследование связи количества

регулнторных Т клеток в трансплантате и последующей острой РТПХ.

Пол Возраст (лет) Диагноз реципиента Тип ТГСК, источник ГСК

донор рецип донор рецип

муж муж 40 7 лейкодистрофия Краббе-Бенеке неродственная, км

жен муж 20 10 ХМЛ неродственная, км

муж муж 23 9 анемия Фанкони неродственная, км

муж муж 14 4 ОЛЛ родственная, км

муж муж 9 4 ОМЛ родственная, скк

жен жен 36 6 ОбифЛ неродственная, км

муж муж 7 9 мес МПС родственная, км

муж муж 23 16 МДС неродственная, км

муж муж 20 15 ХМЛ родственная, км

Клинико-анамнестический метод. При сборе анамнеза внимание уделялось дате манифестации заболевания и прошедшему между ней и трансплантацией промежутку времени. Клинический осмотр детей проводился в соответствии с общепринятыми методами. Оценка стадии острой реакции «трансплантат против хозяина» проводилась согласно международной классификации (таблицы 4 и 5).

Таблица 4. Клиническое определение степени острой РТПХ.

Степень Кожа Функция печени Кишечник

+ (1) Макуло-папулезная сыпь < 25% поверхности тела Билирубин, 2-3 мг/дл (34-50 мкмоль/л) Диарея, 500-1000 мл/сутки (300-580 мл/м2 в сутки). * Диарея > 10-15 мл/кг/24 ч либо постоянная тошнота и «+» биопсия

+ + (П) Макуло-папулезная сыпь 25-50% поверхности тела Билирубин, 3-6 мг/дл (51-102 мкмоль/л) Диарея, 1000-1500 мл/сутки (580-880 мл/м3 в сутки). »Диарея > 16-20 мл/кг/24 ч

+ + + (III) Генерализованная эритродерма Билирубин,6-15 мг/дл (102255 мкмоль/л) Диарея, >1500 мл/сутки (>880 мл/м2 в сутки)/ * Диарея >21-25 мл/кг/24 ч

+ + + + (IV) Десквамация и образование булл Билирубин, >15 мг/дл (>255 мкмоль/л) Сильная боль или илеус *Диарея > 26 мл/кг/24 ч * по классификации St Jude

Таблица 5. Клиническое стадирование острой РТПХ.

Стадия Степень Нарушение

Кожа Печень Кишечник функции

0(отсутствует) 0 0 0 0

I(легкая) + до 0 0 0

+ +

II (умеренная) + до + + +

+ + +

III (выраженная) ++ до + +до + +до + +

+ + + + + + + + +

IV (жизнеугрожающая) ++ до + + до + + до + + +

+ + + + + + + + + + + +

В основе метола проточном цитометпии лежит измерение параметров каждой отдельно взятой клетки. Суспензию предварительно окрашенных флуоресцирующими красителями (в роли красителей выступают моноклональпые антитела, коныогированпые с флуоресцентной меткой) клеток под давлением прогоняют через капилляр. Клетки, подхваченные потоком жидкости, выстраиваются друг за другом, образуя "цепочку" - принцип гидродинамического фокусирования, благодаря которому создаются условия ламинарного потока без перемешивания суспензии клеток с обтекающей жидкостью.

Когда такую струю пересекает сфокусированный лазерный луч, в точке пересечения потока и луча одновременно оказывается, как правило, только одна клетка, что позволяет избежать артефактов, связанных с разной удаленностью клеток от точки пересечения лазерного луча с потоком.

Высокочувствительные датчики, расположенные вблизи проточной ячейки, фиксируют рассеивание света мод углом от 2 до 19°, которое называется прямым или малоугловым светорассеиванием (FSC) и под углом 90° - боковое светорассемванме (SSC). Одновременно с этим регистрируется излучение флюорисцентных меток (FL1, FL2, и т.д.), имеющее строго определенную для каждого флюорохрома длину волны.

Иммуноцитофлюориметрический анализ клеток производится по следующим основным параметрам:

FSC (forward side scatter) - показатель прямого светорассеяния, который характеризует размеры клеток;

SSC (side scatter) - показатель бокового светорассеяния, который отражает оптическую неоднородность цитоплазмы клеток, характер клеточных включений и гранулярность клетки. Термин "гранулярность" имеет специфическую цитофлюориметрическую нагрузку и не является отражением морфологического понятия "гранулярность", которую отражает параметр SSC, следует понимать всю совокупность образований, формирующих клетку, включая любые клеточные органеллы и ядро. Использование этого параметра позволяет судить о соотношении размеров ядра и цитоплазмы;

FL1, FL2 - каналы детекции специфического флуоресцентного сигнала красителя на разной длине волны.

Анализ информации, получаемый по каналам светорассеяния, дает возможность разделить лейкоциты периферической крови на три популяции - лимфоциты, моноциты и гранулоциты. Лимфоциты характеризуются наименьшими размерами, наиболее крупные клетки - гранулоциты, моноциты занимают промежуточное положение по параметрам FSC.

Наиболее низкие характеристики SSC имеют лимфоциты, промежуточные - моноциты и высокие показатели SSC - у гранулоцитов.

Использование нескольких флюоресцентных меток позволяет проводить одновременный двух-, трехцветный и более анализ, так как каждый флюорохром при прохождении через луч лазера испускает свет различной длины волны. В качестве красящей метки применялся флюоресцеинизотиоционат (FITC), который улавливается FL-1-детектором (первый канал флюоресценции) (зеленый спектр), фикоэритрин (РЕ) - FL-2-детектором (желтый спектр), и, менее часто - тандем цианин - 5/фикоэритрин и пиридин хлорофилл (РегСр, Су5/РЕ) - FL-3-детектором.

Мононуклеары периферической крови выделялись путем центрифугирования в градиенте плотности (Lympho Separation Medium, MP Biomedicals, Inc, США). Суспензия клеток метилась следующими моноклональными антителами: анти CD3-FITC, анти CD16+CD56-PE, анти CD8-PE, анти CD4-FITC, анти CD25-PE, анти CD19-PC5, анти CD3-PC5 анти HLA-DR-PC5, анти CD86-PE, анти CD83-F1TC (Immunotech, Франция), анти CDla-FITC, анти CD14-PE (Pharmingen, США) а также соответствующими изотипическими контролями. Для исследования внутриклеточных маркеров клетки, предварительно окрашенные антителами к мембранным антигенам, были пермеабилизованы с применением IntraPrep™ Permeabilization Reagent (Immunotech, Франция),

а затем окрашены изотипическим контролем или моноклональными антителами к Foxp3-PC5, (eBioscience, США), Granzyme В (Serotec, Великобритания) в соответствии с методиками производителя. Анализ

образцов проводился на проточном цитометре FACSCalibur (Becton Dickinson, США) с использованием программного обеспечения CELL Quest Pro. Результаты представлены в виде процента позитивных клеток (Mean ± SD)

Статистический анализ и обработка результатов проводилась с помощью пакета статистических программ Statsoft Statistica version 6.0. Различие между показателями признавалось существенным при 5% уровне во всех проведенных сравнениях при использовании U-теста Манна-Уитни.

Результаты исследования и их обсуждение

Анализ частоты и тяжести оРТПХу детей после аплогениой ТГСК.

Знание частоты манифестации и тяжести острой РТПХ у разных групп пациентов важно для понимания серьёзности данного осложнения, а также для прогнозирования клинического состояния пациента и лучшей подготовки отделения к лечению.

Исследование позволило установить, что острая РТПХ была диагностирована у большинства пациентов. 61% детей страдали от острой РТПХ, тогда как 39% избежало этого осложнения. Таким образом, ещё раз подтверждается опасность острой РТПХ в постгрансплантационный период.

Расчеты показали, что реципиенты родственных ГСК страдали в 43,8% случаев, неродственных в 72,6% случаев, а опасные для жизни стадии (III и IV) были в 8% и 23% случаев соответственно (таблица 6). Эти цифры подтверждают худший прогноз для реципиентов неродственных ГСК в сравнении с реципиентами родственных как в плане острой РТПХ в целом, так и в опасности развития тяжёлых стадий осложнения в частности. В таблице 7 показано, что при наличии РТПХ у детей после неродственных ТГСК гораздо чаще страдают кожные покровы - 68,5% против 37,5% при родственной ТКМ, тогда как различия в показателях поражения ЖКТ и печени не так значительны - 19,6% против 26% и 5,4% против 9,6% соответственно.

Таблица 6. Частота встречаемости разных стадий острой РТПХ у детей после 277 родственных и неродственных аллогенных ТГСК.

Стадия острой РТПХ Родственная ТГСК Неродственная ТГСК

% %

0 56,2 27,4*

I 13,4 23,3*

II 22,3 26,1

III 5,4 16,4*

IV 2,7 6,8

* Достоверные (р <0.05) различия показателей

Таблица 7. Частота поражения кожи, ЖКТ и печени.

Родственная ТГСК Неродственная ТГСК

% %

Кожа 37,5 68,5*

ЖКТ 19,6 26*

Печень 5,4 9,6

* Достоверные (р <0.05) различия показателей

Таблица 8. Сравнительная таблица посттрансплантационного периода и исходов у детей после трансплантации гемопоэтических клеток костного мозга и периферической крови.

КМ (%) СКК (%)

Смертность 20,9 22,3

Острая РТПХ 0 37,2 37,9

I 19,6 12,6

II 28,4 31,1

III 8,8 9,7

IV 6,1 8,7

Кожа 58,1 55,3

ЖКТ 25 35

Печень 8,8 18,4

При этом, источник ГСК никак не влияет на исход трансплантации. Сравнительный анализ детей трансплантированных ГСК костного мозга и ГСК периферической крови не показал ни одного статистически значимого различия между этими двумя группами пациентов. Результаты показаны в таблице 8.

Следующим этапом исследования стало изучение субпопуляционного состава трансплантата и периферической крови реципиента и их корреляция с клиническим состоянием детей. В этом проспективном исследовании приняло участие 19 детей, находившихся в отделении трансплантации костного мозга ГУ РДКБ Росздрава в 2007-2009 гг.

Корреляция субпопуляционного состава трансплантата и последующей острой РТПХ.

В некоторых опубликованных ранее исследованиях авторы выявили обратную зависимость между абсолютным количеством Трег в трансплантате и появлением острой РТПХ у взрослых реципиентов. Авторы исследовали фенотип клеток костного мозга и клеток мобилизованной крови донора, оценивая клетки СБ4+РохрЗ+ в соответствии с появлением РТПХ у взрослых реципиентов. Было показано, что у пациентов, которым трансплантировали

стволовые клетки с низким абсолютным количеством С04+С025+РохрЗ+, отмечен более высокий риск развития РТПХ (Кегуаш К, е! а1,2006).

Первоочередной задачей исследования было изучение влияния количества регуляторных Т клеток в донорском трансплантате на последующий посттрансплантационный период реципиента ГСК и оценка роли этих клеток в развитии и течении острой РТПХ.

Эта часть исследования состояла из двух этапов. На первом этапе брался образец трансплантата и методом проточной цитометрии изучалось количество регуляторных и прочих Т клеток в нём. На втором проводился ежедневный клинико-лабораторный мониторинг состояния ребёнка вплоть до сотого дня с момента трансплантации, либо выписки.

В этой части исследования приняло участие 9 больных детей в возрасте от 9 месяцев до 16 лет и 9 здоровых доноров. 4 ТГСК были проведены от родственных доноров и 5 от неродственных. Обработка результатов лабораторного исследования и их сопоставление с клиническими данными показали чёткую взаимосвязь концентрации регуляторных Т лимфоцитов С04+С025+Р0ХРЗ+ в трансплантате и течения посттрансплантационного периода реципиента-ребёнка. Из рисунка 1 видно, что получившие трансплантат с более высоким, в сравнении с другими исследуемыми, содержанием регуляторных Т лимфоцитов пациенты либо не страдали острой РТПХ, либо имели её лимитированную стадию, тогда как у трансплантированных ГСК с низким содержанием Т клеток исследуемой популяции острая РТПХ манифестировала в 100% и почти всегда приобретала жизнеугрожаемую форму.

4.0

Г! э о

О.

1

2

Л 1.0

о.о

0.0 0.4 1.0 1.5 3 0 24 30 4

Сод*ржл#м1« Тр«г ■ 1раиспплитлтл

Рисунок 1. Содержание регуляторных Т клеток СБ4+ С025+ РохрЗ+ в трансплантате отрицательно коррелирует с максимальной стадией острой РТПХ в посттрансплантационный период.

V*»! I - 3.0444 0.4410-Х

10 15 3 0 2 4 3 0

Сод*ржл#м1« Гмг ■ 1раиспплитлтл

В качестве иллюстрации этих данных предлагаю сравнить данные двух пациентов:

Таблица 9. Сравнительная таблица данных двух реципиентов ГСК с разной концентрацией регуляторных Т клеток в трансплантате.

Пациент С Пациент Р

Возраст, пол 15 лет, мужской 9 лет, мужской

Диагноз ХМЛ ХМЛ

Тип ТГСК Родственная (брат) Неродственная

Кондиционирование Бусульфан 8мг\кг+ Бусульфан 16мг/кг

Флударабин 150мг\м2+ Флюдарабин 150мг/м2

АТГ (АТГАМ) 90мг/кг Мельфалан 140мг/м2 Тимоглобулин 10мг/кг

Количество Т per в 0,7% 4,2%

трансплантате

Максимальная стадия IV 0

острой РТПХ

Как видно из таблицы 9, пациент С изначально имел лучший прогноз, чем пациент Р, так как ему была проведена ТГСК от родного брата, тогда как пациент Р был трансплантирован неродственными ГСК. Более того, донором ребёнка Р была женщина, что согласно действующему протоколу профилактики и лечения РТПХ является ещё одним ухудшающим прогноз фактором. Однако именно пациент Р избежал острой РТПХ, а пациент С до сих пор страдает IV стадией РТПХ и находится в специализированном отделении российской детской клинической больницы, хотя ТГСК была проведена больше года назад.

На наш взгляд, именно превосходство в концентрации регуляторных Т клеток обусловило гораздо более лёгкий посггрансплантационный период в плане острой РТПХ у пациента Р.

Приживление трансплантата.

Исследование периферической крови пациентов в момент приживления транплантата показало, что

• Количество цитотоксических Т лимфоцитов СБЗ+С08+ выше у тех детей, кто в будущем заболеет острой РТПХ (рисунок 2).

• Низкая концентрация регуляторных Тклеток СР4+СО25+Р0ХРЗ+ в момент приживления непосредственно связана с максимальной стадией последующей РТПХ у ребёнка после ТГСК (рисунок 3);

ао 70

со

50

зо го ю о

0-1 II -IV

Максимальная стадия РТПХ

Рисунок 2. Высокая концентрация цитотоксических Т клеток напрямую связана с тяжестью острой РТПХ.

4.0

З.э

3.0

5 2Л

1

Я г.о

о и

§ 1.5 1.0 0.3 0.0

о . I II . IV

МАХ ст»АИЯ РТПХ

Рисунок 3. Низкая концентрация регуляторных Т клеток в момент приживления трансплантата связана с тяжестью острой РТПХ в посттрансплантационный период.

Таким образом, видна взаимосвязь между количеством регуляторных и цитотоксических клеток. Чем больше в периферической крови пациента регуляторных Т клеток, тем меньше цитотоксических и тем лучше прогноз для него.

Посттрапсплантационный период. Некоторыми исследователями, например, в Китае, уже проводилась оценка корреляции между содержанием С04+СВ25Ь1 Т-клеток у больных и появлением РТПХ. Анализ показал, что у взрослых реципиентов с нормальным или высоким количеством клеток С04+С025ы РТПХ не развивалась или была умеренной (I стадия) и все больные выжили. Напротив, у реципиентов с низким содержанием Трег, или тех, у кого клетки СВ4+С025Ь| не выявлялись, развивалась тяжёлая стадия заболевания (выше чем II) Ъ. е1 а1, 2007). В этом исследовании мы проводили ежедневный мониторинг состояния больных и регулярный анализ субпопуляционного состава их крови. Исследование показало, что и у детей на этом этапе лечения большое значение имеет количество регуляторных Т клеток. Также была показана большая роль цитотоксических и активированных Т лимфоцитов в манифестации и тяжести острой РТПХ. Как видно из рисунка 4, количество клеток С04+С025+Р0ХРЗ+ у детей с РТПХ ПТУ стадий ниже, чем у остальных.

1,4

1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 О

+

го о.

X

О

и. +

1Л гч

а

и

+

ГТ

а и

а?

1,15

0,74

РТПХ 0-1 РТПХИ-П/

Рисунок 4. У детей с острой РТПХ П-1У концентрация регуляторных Т клеток ниже, чем у детей с 0-1 стадиями.

На рисунке 5 показано количество СШ+СС8+ и СГО+НЬА-1Ж+ клеток и их корреляция с тяжестью острой РТПХ у детей.

ю

*

Г

Рисунок 5. Высокая концентрация цнтотоксических и активированных Т клеток коррелирует с тяжёлыми стадиями острой РТПХ.

Как и на этапе приживления, концентрация регуляторных и цнтотоксических клеток очень важна. Они связаны друг с другом и с тяжестью острой РТПХ у ребёнка. Чем больше регуляторных Т клеток, тем сильнее они подавляют цитотоксические клетки и, тем самым, снижают тяжесть острой РТПХ.

По нашим данным, регуляторные Т клетки можно успешно индуцировать ex vivo. Полученные клетки полностью идентичны нативным Т per по фенотипическим и функциональным характеристикам: в тестах in vitro они ингибируют пролиферацию эффекторных клеток в той же степени, что и Т per, выделенные из крови больных или доноров (Masteller E.L. et al, 2006). Таким образом, следующим шагом в изучении влияния субпопуляционного состава донорского трансплантата и периферической крови реципиента на тяжесть острой реакции «трансплантат против хозяина» должна стать попытка профилактики и лечения острой РТПХ путём выращивания ex vivo и введения пациенту регуляторных Т лимфоцитов CD4+CD25+FOXP3+.

Введение выращенных ex vivo регуляторных Т клеток. Пациент: мальчик, 16 лет;

Диагноз: хронический миелобластный лейкоз, 1я хроническая фаза, цитогенетическая ремиссия

Кондиционирование: немиелоаблативное (бусульфан,флударабин); ТГСК: аллогенная, от родного брата ;

Субпопуляционный состав трансплантата:

CD3+ 80,1%; CD3+CD8+ 41,4%; CD3+CD4+ 34,8%; CD4+/CD8+ 0,84%; CD4+CD25+FOXP3+ 0,7%; CD 19+ 10,4%; CD16+CD56+ 7,8%; CD3+HLA-DR+ 16,6%

К 70-му дню после ТГСК состояние пациента было стабильно тяжелым: отмечена клиническая картина IV стадии стероид-резистентной РТПХ, массивный гемоколит, что послужило основанием для принятия решения о целесообразности введения ему выращенных ex vivo регуляторных Т клеток CD4+CD25+FOXP3+.

Первое введение 178 миллионов выращенных ex vivo регуляторных Т клеток было сделано на 83й день от ТГСК. Через 8 дней кишечное кровотечение прекратилось. А после второго введения (350 миллионов клеток) РТПХ перешла в III стадию. Состояние ребёнка было стабильным. Никаких побочных эффектов выявлено не было. На рисунке 6 показано, что уже через неделю после инъекции суспензии клеток их концентрация выросла почти в два раза, а через две недели ещё раз удвоилась и в результате, после Зго введения, достигла 5%, что на порядок выше, чем до начала терапии.

* 3

V) гч

Í2

'S 1 * А

дней поел« ТГСК

83

89

Ваедеиие1/8,ЬхИУ CD4«CD2S«fOXP3»

96

103

110

117

ВеедениеЗЬ0х10° CD4»CD2S«fOXP3»

124

Л-

131

Введение 4 ЬО*Ю" СР4»СР25«ГОХРЗ»

139

Рисунок 6. Количество регуляторных Т клеток в периферической крови пациента возрастает.

На рисунке 7 можно увидеть, как изменяется количество активированных Т клеток CD3+HLA-DR+ после инъекций выращенных ex vivo регуляторных Т клеток.

Рисунок 7. Уменьшение количества активированных Т клеток и увеличение коэффициента CD4+/CD8+ в связи с введением выращенных ex vivo регуляторных Т клеток.

Выводы.

1. Неродственная трансплантация даёт ребенку худший прогноз по сравнению с родственной в плане развития острой «реакции трансплантат против хозяина»;

2. Источник гемопоэтических стволовых клеток не влияет на манифестацию и тяжесть острой «реакции трансплантат против хозяина» в посттрансплантационном периоде;

3. Количество регуляторных Т-клеток CD4+CD25+FOXP3+ в трансплантате отрицательно коррелирует с частотой манифестации и тяжестью последующей острой «реакции трансплантат против хозяина» у пациента;

4. Содержание цитотоксических (CD3+CD8+) и активированных (CD3+HLA-DR+) Т клеток и в периферической крови ребёнка положительно коррелирует со стадией «реакции трансплантата против хозяина» на момент приживления;

5. Концентрация регуляторных Т клеток CD4+CD25+FOXP3+ в периферической крови пациента отрицательно коррелирует со степенью острой «реакции трансплантат против хозяина»;

6. Оценка еубпопуляционного состава трансплантата и периферической крови является быстрым и точным тестом для прогнозирования и диагностики острой «реакции трансплантат против хозяина»;

7. Введение ex vivo культивированных регуляторных Т клеток может стать одним из методов профилактики и лечения острой «реакции трансплантат против хозяина».

Практические рекомендации.

1. Иммунофенотипирование трансплантата рекомендуется проводить перед всеми ТГСК вне зависимости от типа трансплантации для прогнозирования вероятности развития острой РТПХ и её тяжести.

2. Рекомендуется проводить иммунофенотипирование периферической крови (Трег, Такт, коэф 4/8) пациентов с острой РТПХ для оценки эффективности терапии и возможности клинического применения Т per.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Корсунский И.А., Румянцев А.Г., Быковская С.Н. «Роль регуляторных Т-клеток CD4+CD25+FOXP3+ и мезенхимальных стволовых клеток костного мозга в подавлении реакции «трансплантат против хозяина»». Онкогематология, 3, 45, 2008 год.

2. Корсунский И.А., Быковская С.Н., Скоробогатова Е.В. «Влияние количества регуляторных CD4+CD25+FOXP3+ Т-клеток в трансплантате на тяжесть реакции «трансплантат-против-хозяина» у реципиента». VI симпозиум «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний», 50, Москва, 2009 год.

3. Корсунский И.А. «Реакция «транплантат против хозяина» - роль регуляторных CD4+CD25+FOXP3+ Т-клеток». VI симпозиум «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний», 50, Москва, 2009 год.

4. Корсунский И.А., Карандашов E.H., Скоробогатова Е.В. «Значение регуляторных Т клеток в реакции «трансплантат против хозяина» у детей». Сборник материалов XVI съезда педиатров России «актуальные проблемы педиатрии», 198. Москва 2009 год.

5. Корсунский И.А. Скоробогатова Е.В., Карандашов E.H. «Корреляция уровня регуляторных Т клеток в транплантате и тяжести реакции «трансплантат против хозяина» у реципиента-ребёнка». Сборник материалов XVI съезда педиатров России «актуальные проблемы педиатрии», 198. Москва 2009 год.

6. Bykovskaia S.N., Korsunsky I.A., Rumjantsev A.G."Severity of GVHD in leukemia patients correlates with the number of regulatory CD4+CD25+Foxp3+ T cells". First International Conference "Cancer Immunotherapy and Immunomonitoring", 20, Kiev, 2009.

Список сокращений:

ТГСК - трансплантация гемопоэтических стволовых клеток

ГСК - гемопоэтические стволовые клетки

РТПХ - реакция «трансплантат против хозяина»

КМ - костный мозг

СКК - стволовые клетки крови

Трег - регуляторные Т клетки

ТКМ - трасплантация костного мозга

РДКБ - российская детская клиническая больница

АА - апластическая анемия

ОМЛ - острый миелобластный лейкоз

АФ - анемия Фанкони

ОЛЛ - острый лимфобластный лейкоз

ТКИН - тяжёлый комбинированный иммунодефицит

ХМЛ - хронический миелобластный лейкоз

ГФЛГЦ - гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз

МДС - миелодиспластический синдром

ХММЛ - хронический миело-моноцитарный лейкоз

СВО - синдром Вискотта-Олдрича

ОбифЛ - острый бифенотипический лейкоз

МПС - мукополисахаридоз

ЮММЛ - ювенильный миеломоноцитарный лейкоз

ПИД - первичный иммунодефицит

ЛНЛ - лимфобластная неходжкинская лимфома

ПНГ - пароксизмальная ночная гемоглобинурия

АЛД - адренолейкодистрофия

СКА - серповидно-клеточная анемия