Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Влияние L-глутаминовой кислоты на активность иммунокомпетентных и опухолевых клеток

Актуальность проблемы. Многочисленные исследования последних лет свидетельствуют о тесной структурной и функциональной взаимосвязи молекулярных элементов нервной, эндокринной и иммунной систем. С одной стороны, получены доказательства участия иммуноглобулинов, интерферонов, цитокинов и их фрагментов в процессах нейроэндокринной регуляции. С другой стороны, накоплен богатый экспериментальный материал, демонстрирующий вовлеченность гормонов и нейромедиаторов в реакции клеточного и гуморального иммунитета. Несмотря на то, что L-Glu присутствует во всех органах и тканях человека и животных, в настоящее время хорошо изучены только нейромедиаторные и нейрорегуляторные свойства этой аминокислоты. В последнее время получены первые прямые доказательства участия L-Glu и ее рецепторов в процессах эндокринной регуляции. Поэтому, изучение механизмов иммуномодулирующего и антиростового действия L-Glu является актуальным исследованием, результаты которого важны для формирования современных представлений о молекулярных механизмах, обеспечивающих функционирование и взаимосвязь нервной, эндокринной и иммунной систем.

Научная новизна. Представленные в настоящей работе результаты являются первым экспериментальным доказательством универсальности действия L-Glu в организме: она является регулятором важнейших функций не только нервной и эндокринной, но и иммунной систем.

Обнаружены и охарактеризованы специфические GluRs на Т-лимоцитах человека, выделенных из донорской крови.

Показано, что L-Glu подавляет активность иммунокомпетентных клеток человека и мыши in vitro.

Обнаружено неизвестное ранее свойство L-Glu накапливаться в культуральной среде клеток острого промиелоцитарного лейкоза человека HL-60, обработанных ATRA, и при концентрации 10"7 М вызывать дифференцировку этой клеточной линии по гранулоцитарному пути.

Установлено, что L-Glu ингибирует связывание IL-1J3, IL-6 с их высокоаффинными рецепторами на клетках HL-60 и, одновременно, усиливает чувствительность этих клеток к действию TNF-a.

Показано, что дифференцировка клеток HL-60 ATRA приводит к появлению на их поверхности стереоспецифичных, квискалат-чувствительных глутаматных рецепторов.

Практическая ценность результатов работы. В настоящее время во многих странах мира L-Glu используется в качестве пищевой добавки и является составной частью ряда лекарственных препаратов. Поэтому, информация об ингибирующем действии L-Glu на активность иммунокомпетентных клеток важна для практической медицины. Она ставит под сомнение господствующее в настоящее время убеждение в безопасности этой аминокислоты для человека.

Данные о способности L-Glu ингибировать рост клеток ряда лейкемических линий человека (промиелоцитарной HL-60, эритробластной К-562, Т-лимфобластной Jurkat) и вызывать дифференцировку клеток линии HL-60 открывают широкие перспективы для ее использования в терапии различных форм лейкоза. Вполне вероятно, что применение L-Glu в сочетании с уже известными антираковыми препаратами позволит значительно снизить терапевтические дозы, а значит и токсичность последних.

Цели и задачи исследования

Цель настоящего исследования - изучение влияния L-Glu на активность иммунокомпетентных и лейкемических клеток человека и мыши.

Основные задачи исследования:

1. Изучение влияния L-Glu на активность иммунокомпетентных клеток человека и мыши in vitro. Выявление и характеристика GluRs этих клеток.

2. Изучение влияния L-Glu на рост и дифференцировку лейкемических клеточных линий человека in vitro,

3. Исследование влияния L-Glu на рецепцию и экспрессию клетками HL-60 цитокинов и интерферонов, вовлеченных в процессы пролиферации и дифференцировки этих клеток.

4. Характеристика связывания L-Glu с недифференцированными и дифференцированными ATRA клетками HL-60.

Положения, выносимые на защиту

1. Т-лимфоциты периферической крови человека экспрессируют специфические рецепторы к L-Glu, чувствительные к агонисту GluRs мозга квискалату. L-Glu ингибирует активность иммунокомпетентных клеток человека и мыши in vitro.

2. L-Glu подавляет рост клеток ряда лейкемических линий человека (промиелоцитарной HL-60, эритробластной К-562, Т-лимфобластной Jurkat) и вызывает дифференцировку по гранулоцитарному пути клеток линии HL-60.

3. Не обладая способностью специфически связываться с клетками HL-60,

L-Glu ингибирует связывание IL-1(3 и IL-6 с их высокоаффинными рецепторами на этих клетках. Одновременно, в присутствии L-Glu снижается экспрессия клетками HL-60 мРНК IL-lp и IL-6. Напротив, 9 снижается экспрессия клетками HL-60 мРНК IL-1 (3 и IL-6. Напротив, после обработки L-Glu клеток HL-60 увеличивается экспрессия высокоаффинных рецепторов к TNF-a и уровень экспрессии мРНК TNF-a.

4. Обработка клеток HL-60 ATRA приводит к появлению на их поверхности стереоспецифичных, квискалат-чувствительных GluRs.

Часть I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Роль цитокинов в регуляции активности лейкемических клеток

При изучении дифференцировки иммунокомпетентных клеток и механизмов межклеточного взаимодействия, формирующих клеточный и гуморальный иммунный ответ, была открыта большая группа медиаторов белковой природы, названных в последующем цитокинами. Являясь коммуникационными молекулами, они обеспечивают межклеточные взаимодействия, как внутри самой иммунной системы, так и между различными системами: иммунной, нервной, эндокринной, гемопоэтической и др. Цитокины взаимосвязаны и образуют единую систему, имеющую свойственные ей определенные закономерности: локальность, короткодистантность и быстротечность действия; каскадность эффектов; плейотропность влияния с дублированием и перекрыванием эффектов друг друга; способность к ауто- и паракринной регуляции; многоуровневость взаимосвязей [2].

В здоровом организме наиболее существенным и закономерным является участие цитокинов в реализации процессов кроветворения и иммунного ответа, а при развитии патологических состояний - в поражении этих процессов, а также в инициации воспалительных реакций и формировании ответа организма на развивающийся опухолевый рост. Роль цитокинов в развитии опухолевых процессов разнообразна и сложна. С одной стороны, цитокины могут служить ростовыми факторами для клеток некоторых опухолей, а, с другой стороны, - важными противоопухолевыми агентами, что активно используется в настоящее время при лечении злокачественных новообразований [2].

В настоящем обзоре основное внимание будет уделено IL-1, IL-6, IFN, TNF, GM-CSF, IL-2, цитокину Р48 и их роли в регуляции активности лейкемических клеток.

1. IL-1

IL-1 (IL-1 а и IL-1P) является одним из наиболее активных цитокинов, участвующих в реализации иммунного ответа и воспалительной реакции. IL-1 предпочтительно синтезируется активированными моноцитами и макрофагами [71].

В состав семейства IL-1 входят IL-la, IL-1 J3 и антагонист рецептора IL-1 (IL-IRa) [71]. IL-la и IL-ip - агонисты, а IL-IRa - специфический антагонист рецептора IL-1. Изучение структуры IL-la и IL-ip выявило отсутствие у их цитоплазматических предшественников лидерной последовательности, необходимой для прохождения через мембрану. Молекулярная масса каждого предшественника 31 кДа. Для процессинга IL-la и IL-lp необходимы специфические клеточные протеазы: кальций-зависимая, ассоциированная с мембраной цистеиновая протеаза (калпаин) для IL-la [147]; внутриклеточная цистеиновая протеаза (IL-ip преобразующий фермент (ICE)) для IL-ip [32, 49].

Известны два типа рецепторов IL-1: рецептор типа I (IL-1RI) [267], связываясь с которым, в присутствии, так называемого, вспомогательного белка (IL-lR-AcP) [101], IL-la,P запускает каскад реакций, приводящих к биологическому ответу клетки-мишени, и рецептор типа II (IL-1RSII), функционально неактивный рецептор или рецептор-"ловушка" [64, 268], прочно связывающий IL-la,P, но не способный передавать сигнал внутрь клетки. Внеклеточная или "растворимая" часть IL-1RI (IL-lsRI) и IL-1RII (IL-lsRII) выступает в качестве "буфера" для связывания IL-la, IL-1 Р и IL-IRa [17, 218, 268, 283,284].

Многочисленные исследования показали спонтанную экспрессию и синтез IL-1 в ряде лейкемических клеточных линий, относящихся к острому миелобластному лейкозу (OMJI) [36, 65, 82, 102, 156, 201, 219,

232, 236, 270, 314], хроническому миелогенному лейкозу (XMJI) [24, 65, 83, 256, 276, 329], Т-лимфолейкозу взрослых [148, 176, 265, 326], острому лимфоцитному лейкозу (ОЛЛ) [47, 148, 197] и хроническому лимфоцитному лейкозу (ХЛЛ) [156].

Имеются данные о том, что автономный рост бластов от более 70% пациентов с ОМЛ in vitro [248] связан со спонтанной экспрессией гена IL-1 (3 [156, 236]. Следует отметить, что при использовании чувствительного метода PCR экспрессии гена IL-1J3 в периферических мононуклеарных клетках здоровых доноров установлено не было [187], а для ОМЛ бластов экспрессия IL-1P была обнаружена при использовании менее чувствительного метода гибридизации полиаденилированной РНК. В дополнение к спонтанной продукции, почти все исследования показали, что экзогенный IL-1, добавленный в культуру лейкемических клеток, индуцирует или усиливает их пролиферацию. Добавление IL-1 к клеткам ОМЛ приводит к повышению продукции GM-CSF. IL-1 также усиливает экспрессию фактора стволовых клеток и его рецептора, онкогена c-kit, который связан с ростом этих клеток [87].

Для того, чтобы уменьшить пролиферацию ОМЛ бластов необходимо специфически блокировать IL-1. Это стало возможным при использовании нейтрализующих антител к IL-ip [59, 65, 270], IL-IRa [82, 236] или растворимого IL-1R1 [82]. Добавление анти-IL-1 р антител препятствует росту ОМЛ клеток in vitro. Несмотря на способность экзогенного IL-la стимулировать пролиферацию ОМЛ бластов in vitro, ОМЛ клетки спонтанно не экспрессируют ген IL-la [87] и нейтрализующие антитела к IL-la не снижают их спонтанную пролиферацию [65]. Антисмысловые олигонуклеотиды к ICE приводят к значительному подавлению пролиферации периферических и находящихся в костном мозге ОМЛ клеток, а так же к снижению уровня GM-CSF [279].

При использовании конкурентного ингибитора ICE наблюдалось значительное снижение пролиферации бластов костного мозга у 19 пациентов с OMJI [81]. Другие цитокины, такие как трансформирующий ростовой фактор-(3 (TGF-J3) [171, 304], макрофагальный воспалительный белок-1а [86], TNF-a [48, 59], IFN-а, IFN-y [47, 48, 59, 270] ингибируют спонтанную пролиферацию OMJI клеток in vitro.

IL-1 так же спонтанно продуцируется клетками ХМЛ и бластами ювенильного типа ХМЛ in vitro [156, 256, 276]. Экспрессия гена IL-ip обнаружена в клетках у 5 из 5 пациентов с ювенильным типом ХМЛ в течение бластного криза [276] и у 5 из 6 с ХМЛ [329]. В большинстве этих клеток был обнаружен белок IL-1(3. Клетки пациентов в хроническую фазу этого заболевания или у пациентов с лимфоидным бластным кризом не экспрессировали IL-1|3 [329]. Специфическая блокада IL-1 при использовании IL-IRa или IL-lsRI снижала спонтанную пролиферацию этих клеток in vitro [83]. Роль TNF-a в клетках ювенильного типа ХМЛ изучается [90] и, возможно, что TNF-a осуществляет ростовой сигнал, индуцированный IL-1.

Спонтанная продукция IL-1 была обнаружена в миелоидных антиген-положительных клетках ОЛЛ, а не в антиген-отрицательных бластах [148]. Спонтанная пролиферация ОЛЛ бластов in vitro ингибировалась антителами к IL-la. Показано, что в этих клетках происходит спонтанная экспрессия IL-la [197]. В отличие от ОМЛ, ОЛЛ клетки не экспрессируют ген IL-1(3 [156]. IL-1, добавленный к культуре ОЛЛ клеток, стимулировал пролиферацию, которая не ингибировалась нейтрализующими антителами к GM-CSF, TNF-a, IL-3 или IL-6 [47]; IL-lsRI наоборот предотвращал рост ОЛЛ клеток, индуцированный IL-1.

IL-la в основном продуцируется клетками Т-лимфолейкоза взрослых и также клеточной линией, трансформированной лимфотропным

Т клеточным вирусом-I человека (HTLV-I) [197, 265, 326]. Предполагали, что HTLV-1 инфекция индуцирует экспрессию гена IL-la. Для изучения данного механизма две плазмиды, содержащие промоторный участок гена IL-la человека (от -1437 до +19) и (от -1437 до +725), были трансформированы с репортерным геном в клетки Jurkat. Когда эти клетки были котрансформированы с геном Tax HTLV-1, наблюдалось почти 10-кратное увеличение количества IL-la по сравнению с контролем, где отсутствовала экспрессия гена Tax [198]. Данные результаты показали, что аутокринная экспрессия и ростовой сигнал IL-la при Т-клеточном лейкозе находится под влиянием HTLV-1. IL-1 усиливает пролиферацию Т-клеток, полученных от пациента с Т4 хроническим лимфоцитным лейкозом, и экспрессию (3-цепи рецептора IL-2 [176]. При добавлении нейтрализующих антител к IL-1 наблюдалось подавление экспрессии (3-цепи рецептора IL-2. При волосовидноклеточной лейкемии высокий уровень IL-lp и растворимого рецептора IL-2 коррелирует с тяжестью заболевания [25].

Человеческие миеломные клетки костного мозга спонтанно продуцируют IL-1 [65, 164, 203, 335], который в свою очередь, стимулирует продукцию IL-6, который, по-видимому, является действительным фактором роста для этих клеток [137, 144]. Приблизительно у 50% пациентов с множественной миеломой была обнаружена делеция гена ретинобластомы (Rb-1), подавляющего опухоль [68]. Миеломные клетки человека спонтанно экспрессируют гены IL-1J3, IL-6 и G-CSF, и у 36 пациентов с миеломой была выявлена коэкспрессия этих генов [229]. Экспрессия IL-la составляет 32% от всей экспрессии IL-1 (3 [229]. Нейтрализующие антитела к IL-1(3, а не к IL-la частично ингибируют спонтанную пролиферацию миеломных клеток in vitro [203].

Суммируя все данные о спонтанной продукции любой формы IL-1 в различных лейкемических клетках, можно сделать единый вывод, что IL-1 усиливает рост лейкемических клеток. Этот вывод подтвержден исследованиями in vitro, в которых блокирование активности IL-1 с помощью нейтрализующих антител, растворимых рецепторов, IL-IRa или ингибирования ICE приводило к снижению роста лейкемических клеток.

2. IL-6

IL-6 является мультифункциональным цитокином [13]. Он продуцируется стимулированными Т- и В-лимфоцитами, гранулоцитами, моноцитами, фибробластами [10, 142] и обладает рядом биологических функций: 1) вызывает терминальную дифференцировку (секреция иммуноглобулинов) В-клеток; 2) стимулирует рост различных В клеток (миеломы/плазмацитомы/ гибридомы); 3) стимулирует гепатоциты к синтезу различных белков плазмы; 4) вызывает дифференцировку и/или активацию Т-клеток и макрофагов; 5) вызывает нейрональную дифференцировку. В ранних работах при характеристике этой молекуле давались различные названия: стимулирующий фактор В клеток 2 (BSF-2), интерферон-132 (IFN-(32) и гепатоцит-стимулирующий фактор (HSF). Позднее ей было предложено название IL-6, так как нуклеотидные последовательности этих белков оказались идентичными.

Рецептор IL-6 состоит из лиганд-связывающий цепи а, ассоциированной с сигнал-передающим белком gpl30, с которым взаимодействуют JAK-киназы. gpl30 ассоциирует при взаимодействии IL-6 с IL-6R и активирует JAK1, JAK2 и TYK2 [19, 103, 209,277].

Известно, что IL-6 вовлечен в патологию многих болезней [13], таких как множественная миелома, гломерулонефрит, ревматоидный артрит, приобретенный синдром иммунодефицита (AIDS). Избирательное ингибирование синтеза или действия IL-6 может быть использовано при терапии болезней, связанных с IL-6. С другой стороны, IL-6 обладает мощной антиопухолевой активностью против основных типов опухолей. Применение IL-6 является таким же перспективным при терапии рака, как и миелосупрессия, индуцированная радиацией или химиотерапией.

IL-6 стимулирует рост и является аутокринным фактором роста для некоторых плазмацитом и миелом [136, 305], отдельных Т и В лимфом [264, 338].

Множественная миелома относится к злокачественным опухолям системы В-лимфоцитов. Это заболевание характеризуется накоплением в костном мозге плазматических клеток, секретирующих иммуноглобулины, и многочисленными повреждениями костного мозга. IL-6 необходим для роста in vivo мышиных плазмацитом и человеческих миелом [136, 312]. Термином плазмацитома обозначены опухоли из плазматических клеток. У мышей линии BALB/c она может возникать под влиянием минерального масла пристана, который является важным индуктором хронического воспаления и продукции IL-6 [230]. Индометацин ингибирует плазмацитогенезис [231] и снижает уровень IL-6 у мышей, обработанных пристаном [263].

Kawano с соавт. [136] сообщили о том, что IL-6 является возможным аутокринным фактором роста для миеломных клеток человека, в частности для миеломной клеточной линии U266. Они установили: 1) IL-6 индуцирует in vitro рост миеломных клеток, взятых у пациентов с множественной миеломой; 2) миеломные клетки спонтанно продуцируют IL-6 и экспрессируют рецепторы к IL-6; 3) in vitro рост миеломных клеток специфически ингибировался анти-1Ь-6 антителами. В поддержку этих данных о существовании опосредованного IL-6 аутокринного роста Schwab с соавт. [259] показали, что добавление нейтрализующих анти-1Ь-6 моноклональных антител или антисмысловых олигонуклеотидов к IL-6 может ингибировать пролиферацию человеческой миеломной клеточной линии. Эти эффекты исчезают при добавлении IL-6. Также было показано, что IL-1 и TNF-a стимулируют рост миеломных клеток человека, индуцируя аутокринную продукцию IL-6 в этих клетках [132, 137]; однако, Klein с соавт. [145] не смогли подтвердить аутокринную гипотезу роста человеческих миелом и предложили взамен паракринную гипотезу. Они продемонстрировали значительную экспрессию мРНК IL-6 в стромальных клетках костного мозга у большинства пациентов с миеломой in vivo (у 13 из 19 пациентов). Стромальные клетки костного мозга от пациентов с множественной миеломой активно продуцируют IL-6, в отличие от нормальных стромальных клеток костного мозга [212]. Активированные стромальные клетки множественной миеломы поддерживают рост злокачественных В-клеток и, кроме того, содействуют увеличению предшественников остеокластов и росту остеокластов, что приводит к разрушению костной ткани [42]. Все эти данные указывают на то, что IL-6 функционирует и как аутокринный, и как паракринный фактор в миеломных клетках.

Уровень IL-6 в сыворотке крови отражает тяжесть болезни пациентов с множественной миеломой. У пациентов с прогрессирующей формой заболевания в сыворотке был отмечен повышенный уровень IL-6, тогда как на ранней стадии уровень IL-6 обычно не увеличивается [26]. Возможно, что высокий уровень IL-6 в сыворотке отражает переход от паракринного к аутокринному росту миелоидных клеток [129].

Klein и его коллеги [143] для терапии множественной миеломы использовали aHTH-IL-б антитела. При введении aHTH-IL-б антител пациентам с множественной миеломой полностью блокируется пролиферация миеломных клеток in vivo и ингибируется активность IL-6 и уровень С-реактивного белка в сыворотке. Кортикостероиды и эстрогены являются ингибиторами продукции IL-6 миеломными клетками. Ингибирующий эффект кортикостероидов на рост миеломы, по-видимому, опосредован через стероид-индуцированное снижение экспрессии IL-6

13]. ATRA снижает число рецепторов к IL-6 (IL-6R) на миеломной клеточной линии AF 10 и соответственно ингибирует клеточную пролиферацию [266]. Антипролиферативное действие ATRA на AF 10 клетки связано с уменьшением экспрессии IL-6R и с последующим ингибированием аутокринного роста, опосредованного IL-6.

Имеются данные о том, что активация генов IL-6 и IL-6R осуществляется при включении в них вирусной ДНК. Так, мышиная клеточная линия плазмацитомы МРС11 в основном продуцирует IL-6 благодаря включению ретротранспозона длиной 18 пар оснований в область инициации транскрипции гена IL-6 [33]. Ген IL-6, но не IL-6R перестраивается у пациентов с множественной миеломой [88]. Повышенная экспрессия IL-6R наблюдалась в мышиной плазмацитомной клеточной линии P3U1, в которой участок гена IL-6R, кодирующий внутрицитоплазматическую область рецептора IL-6, был замещен участком длинного терминирующего повтора IAP гена [281]. Недавно было показано, что трансфекция с кДНК IL-6 усиливает рост опухоли мышиной плазмацитомы [302, 318]. Снижение опухолеобразования достигалось при введении животным моноклональных антител, которые блокируют связывание IL-6 с их рецепторами. IL-4 препятствует росту клеток плазмацитомы, блокируя синтез эндогенного IL-6 [115, 298].

Так же существуют данные о возможной аутокринной роли IL-6 для злокачественных неходкинских лимфом, хронической лимфоцитной лейкемии и острой миелоидной лейкемии [31, 91, 219, 338]. Лимфомные клеточные линии OCI-LY3 и OCI-LY12 экспрессируют и секретируют IL-6. Добавление рекомбинантного IL-6 (rIL6) стимулирует рост этих линий, а поликлональных анти-г1Ь-6 антител заметно ингибирует их пролиферацию. Эти результаты говорят о аутокринной роли IL-6 в росте клеток лимфомы. Экспрессия IL-6 рассматривалась в случае хронической лимфоцитной лейкемии и острой лимфобластной лейкемии человека. В результате 1,3 kb транскрипт IL-6 был обнаружен только у 7 из 11 пациентов с В-хронической лимфоцитной лейкемией. При хронической лимфоцитной лейкемии такая существенная экспрессия IL-6 связана с продукцией биологически активного белка. IFN-a блокирует пролиферацию клеток В-хронической лимфоцитной лейкемии и волосовидноклеточной лейкемии, индуцированную IL-6. При острой миелоидной лейкемии IL-6 выступает в роли костимулятора, усиливая индуцированную колониестимулирующим фактором пролиферацию AMJI бластов.

Несмотря на то, что IL-6 стимулирует рост плазмацитом, миелом и некоторых В лимфом, он также может ингибировать рост определенных клеток хронической В-лейкемии и В лимфом [53]. Таким образом, IL-6 выполняет роль как позитивного, так и негативного регулятора роста В лимфоцитов. Рост клеток мышиной В лимфомы М12, у которых отсутствует рецептор IL-6, но имеется gpl30, ингибируется IL-6 при трансфекции в эти клетки гена рецептора IL-6 [285]. IL-6 ингибирует рост определенных клеток миелоидной лейкемии и индуцирует дифференцировку этих клеток в зрелые макрофаг-подобные клетки [192, 168, 261]. Человеческие и мышиные миелоидные лейкемические клеточные линии могут быть индуцированы к дифференцировке in vitro следующими факторами: G-CSF, макрофаг-гранулоцит-индуцирующим фактором 2 (MGI-2) и лейкемия-ингибирующим фактором (LIF). IL-6 функционально идентичен MGI-2, который индуцирует дифференцировку мышиной миелоидной лейкемической клеточной линии Ml [55, 168, 192, 261]. IL-6 ингибирует рост человеческой миелоидной линии U937 и мышиной миелоидных лейкемических клеточных линий и индуцирует дифференцировку этих клеток в зрелые макрофаг-подобные клетки. В то же время IL-6 усиливает фагоцитоз и экспрессию макрофагальных антигенов дифференцировки Мас-1, Мас-3 и рецепторов yFc, неспецифических эстераз, лизоцима, 2',5'-А-синтетазы, с-fms (рецептора M-CSF), что говорит о функциональной дифференцировке в зрелые макрофаги. Для человеческой миелоидной клеточной линии U937 возможно усиление действия IL-6 при добавлении его вместе с другими цитокинами, такими как IFN-y, IL-1, LIF, G-CSF, GM-CSF. Подавление роста человеческой промиелоцитарной клеточной линии HL-60 происходит только при совместном действии IL-6 и GM-CSF, а дифференцировка наблюдается в присутствии TNF и IFN-y. Shabo с соавт. [262] выдвинули гипотезу, что IL-6 и GM-CSF являются аутокринными факторами дифференцировки, которые синтезируются в миелоидных клетках как вторичные мессенжеры других факторов роста. Их гипотеза основывается на том, что все колониестимулирующие факторы, включая IL-3, индуцируют продукцию IL-6 и GM-CSF в нормальных миелоидных предшественниках.

При терапии злокачественных заболеваний применение IL-6 в качестве индуктора дифференцировки отдельных миелоидных лейкемических клеточных линий может иметь преимущество по сравнению с использованием антираковых препаратов, которые убивают как раковые, так и нормальные клетки [96]. Введение IL-6 SJL/J мышам с острой миелоцитной лейкемией ослабляет развитие лейкемии и повышает выживаемость животных. In vitro IL-6 ингибирует рост суспензионных культур; однако, предполагалось, что IL-6 действует как ростовой фактор определенных лейкемических клеток, полученных от пациентов с острой миелогенной лейкемией. Для того, чтобы решить вопрос о возможном использовании IL-6 при лечении острой миелогенной лейкемии, необходимо изучить in vitro действие IL-6 на рост и дифференцировку лейкемических клеток, находящихся как в суспензионных, так и в полутвердых культурах.

3. IFN

IFN - семейство секреторных гликопротеинов, обладающих противовирусными, противомикробными, антипролиферативными и иммуномодулирующими свойствами [226]. Интерфероны делятся на два основных типа: первый - IFN-1 включает IFN-a (лейкоцитарный) и IFN-J3 (фибробластный). Их продукция индуцируется непосредственно вирусами и опухолевыми клетками. Второй тип - IFN-2 - представлен IFN-y (иммунный), который образуется при стимуляции различными антигенами и митогенами Т лимфоцитов. По ряду своих свойств IFN-y похож на IFN первого типа, однако, существенным отличием является его способность влиять на процессы иммунорегуляции [85, 226].

Рецепторы для IFN-a/p и IFN-y состоят из двух цепей, которые необходимы для передачи сигнала [85, 214, 310]. Рецептор IFN-a/(3 представлен двумя субъединицами: IFNAR-1, взаимодействующей с тирозинкиназой Тук2, и IFNAR-2, взаимодействующей с тирозинкиназой JAK1 [175, 310]. Рецептор IFN-y содержит IFNyARl цепь, которая ассоциирована с JAK1, и IFNyAR2 цепь, которая связана с JAK2 [20]. Передача сигналов рецепторами цитокинов в подавляющем большинстве случаев осуществляется с помощью ассоциированных с ними тирозинкиназ. Взаимодействие IFN-a/p с субъединицами рецептора IFNAR-1 и IFNAR-2 в соотношении 1:1:1 приводит к образованию гетеротримерного сигнального комплекса [330]. При этом JAK1 и Тук2 активируются и фосфорилируются и по очереди фосфорилируют внутриклеточные факторы транскрипции STAT1 и STAT2. Активированные STAT1 и STAT2 с ДНК-связывающим белком р48 формируют комплекс, названный интерферон-стимулированным генным фактором 3 (ISGF3), который перемещается в ядро и связывается с элементом, расположенным в пределах промоторной области IFN-a/p индуцибельных генов (ISRE). IRF-1 (регуляторный фактор) также связывается с ISRE и активирует вместе с ISGF комплексом экспрессию IFN-индуцибельных генов. Активация рецептора IFN-y приводит к формированию стабильного гомодимера STAT1, способного к перемещению в ядро и связыванию с IFN-у-активируемыми последовательностями (GAS), локализованными в регуляторных областях IFN-у-индуцибельных генов.

Многочисленные данные, полученные in vitro, указывают на то, что интерфероны оказывают антиростовое и дифференцирующее действие на лейкемические клетки. Для клеток миелоидного происхождения, в частности для человеческой моноцитарной лейкемической клеточной линии U937, показано, что человеческий IFN-a (природный и рекомбинантный) и IFN-0 индуцируют дифференцировку этих клеток по моноцитарному пути [108]. Позднее Testa с соавт. [299] сообщили о том, что человеческий IFN-a и IFN-J3 подавляют клеточный рост, вызывая дифференцировку клеток U937, но только IFN-y индуцирует экспрессию специфических моноцитарных маркеров (HLA-антигены, Fc, С5а, СЗа и C3bi рецепторы), вовлеченных в клеточную иммунорегуляцию. Следует отметить, что из всех интерферонов только IFN-y вызывает дифференцировку клеток промиелоцитарного лейкоза HL-60 по моноцитарному пути, а IFN-a и способны лишь усиливать дифференцировку, вызванную другими химическими индукторами. В ходе дифференцировки клеток HL-60 IFN-y индуцирует экспрессию рецепторов анафилотоксических пептидов СЗа (C3aR) и С5а (C5aR), C3bi рецепторов, антигенов II класса главного комплекса гистосовместимости (HLA-DR) и значительно усиливает экспрессию Fc рецептора для IgG (FcyR). IFN-y также индуцирует экспрессию рецепторов TNF-a в клетках HL-60.

Иммунохимический анализ с использованием специфических антител к каждому типу рецептора IFN показал, что рецепторы к TNF в равной степени индуцируются как IFN-a, так и IFN -р и -у [220].

Интерфероны не вызывают дифференцировку мышиных миелоидных лейкемических клеток Ml в гранулоциты и макрофаги в отличие от человеческих миелоидных клеточных линий HL-60 и U937 [303].

Действие мышиных интерферонов на лейкемические клетки эритроидного происхождения было изучено Rossi с соавт [177]. Клетки эритролейкоза Френда (FLC) являются предшественниками эритроцитов, дифференцировка которых блокируется на стадии промиелобластов. Добавление DMSO к культуре этих клеток вызывает значительные изменения по направлению к нормобластной стадии эритропоэза [241]. Низкие дозы мышиного IFN-a/p (mu IFN-a/P) способны усиливать эритроидную дифференцировку клеток, индуцированную DMSO или другими индукторами [74, 174]. Этот эффект нейтрализовался при использовании моноклональных антител к этому типу IFN, что подтверждает важную роль mu IFN-a/p в регуляции процесса дифференцировки FLC клеток. Природный или рекомбинантный IFN-y в диапазоне концентраций 0,1 -100 МЕ/мл не влияет на этот процесс [9].

Человеческая эритробластная линия К562 сходна с клетками FLC. Гемин или масляная кислота индуцируют экспрессию эмбриональных генов глобина в обеих линиях клеток. Обработка К562 клеток человеческими интерферонами приводит к изменению продукции гемоглобина, индуцированной масляной кислотой или гемином [57].

Kimchi с соавт. обнаружили, что при дифференцировке химическими агентами клетки мышиного эритролейкоза Френда и клетки U937 продуцируют эндогенный IFN, иммунологически подобный IFN-P [92, 239,

337]. Эндогенный интерферон, по-видимому, выступает в роли аутокринного ингибитора клеточного роста на поздней стадии дифференцировки. Спонтанная продукция эндогенного IFN сопровождается увеличением уровня фермента 2'-5'-олигоаденилат (2-5А) синтетазы в этих клеточных линиях [92, 141]. 2-5А синтетаза вызывает полимеризацию АТФ с образованием 2'-5'-связанных олигомеров. 2-5А олигомеры активируют эндогенную рибонуклеазу, что приводит к деградации как вирусной, так клеточной РНК, таким образом, принимая участие в антивирусном и антипролиферативном действиях. Введение в культуру этих клеток анти-IFN-P антител препятствует увеличению уровня 2-5А синтетазы [337]. Для того, чтобы определить какой тип рецептора IFN вовлечен в данный ответ, к дифференцированным клеткам U937 были добавлены моноклональные антитела к рецепторам IFN первого типа. В результате было обнаружено, что эти антитела блокируют антиростовое действие и синтетазную активность, индуцированную IFN-a и -(3, а не IFN-y.

Основное антиростовое действие IFN-a и -|3 на лейкемические клетки связано с ингибированием экспрессии с-тус онкогена. Jonak, Knight и Einat с соавт. [79, 131] впервые сообщили о том, что экзогенный IFN-a и -(3 снижают уровень с-тус мРНК в клетках лимфомы Дауди Беркитта. Более того, Einal с соавт. показали, что это изменение происходит в результате снижения скорости транскрипции с-тус гена, и установили тесную связь между понижением с-тус мРНК, индуцированным IFN, и последующей IFN-опосредованной остановкой клеточного цикла клеток Дауди на стадии G0/G1. IFN-индуцированное ингибирование экспрессии с-тус наблюдалось и в других клеточных линиях (Molt-4 клетках, P3HR-1 клетках лимфомы Беркитта и мышиных миелоидных клетках Ml). В случае других лейкемических клеток (HL-60, U937, эритролейкемии

Фрейда) a-IFN не способен снижать экспрессию с-тус мРНК и ингибировать переход клеток из G0/G1 в S фазу клеточного цикла.

Поскольку, при терминальной дифференцировке происходит остановка клеточного цикла клеток в фазе G0/G1, интересно проверить продуцируют ли эти клетки IFN в период снижения их пролиферативного потенциала. Для решения этой задачи Resnitzky с соавт. [239] в качестве объекта выбрал мышиную миелоидную клеточную линию Ml. Клетки этой линии были индуцированы к дифференцировке слабо-кондиционированной средой, обогащенной G-CSF. В результате было отмечено увеличение уровня 2-5А синтетазы, которое блокировалось антителами к IFN первого типа. Это указывает на то, что в этой системе продуцируется эндогенный IFN. К тому же они сообщили, что эндогенный IFN является лишь частью механизма контроля за снижением уровня с-тус мРНК, и добавление антител против IFN частично поднимает уровень с-тус мРНК. Важно отметить и то, что добавление только эндогенного IFN или интерферонов первого типа недостаточно для индукции дифференцировки, даже если использовать клетки, которые отвечают на IFN остановкой клеточного цикла на стадии G0/G1.

IFN-a наиболее эффективен при лечении пациентов с волосовидноклеточной лейкемией. Лечение этих пациентов IFN-a приводит к исчезновению волосатовидных клеток из костного мозга, периферической крови и восстанавливает нормальный уровень тромбоцитов, моноцитов, гранулоцитов и гемоглобина. Этот эффект также приписывается способности IFN-a- и -(3 стимулировать развитие лимфомиелоидных стволовых клеток этих пациентов в миеломоноцитарном направлении, при котором понижено формирование частично зрелых В-клеток с фенотипом волосатовидных клеток. Человеческий IFN-y, который не оказывает терапевтического действия на волосатовидноклеточную лейкемию, не стимулирует и лимфомиелоидные стволовые клетки [52, 186, 235, 237].

IFN-a и -у индуцируют экспрессию IRF-1, играющего существенную роль в апоптозе лейкемических клеток. Недавно было показано, что IRF-1 регулирует экспрессию отдельных генов, генные продукты которых непосредственно вовлечены в программируемую клеточную гибель или регуляцию клеточного цикла. Так, например, индукция транскрипции caspas-1 гена (IL-1 (3-преобразующий фермент, ICE) является IRF-1 зависимой [290]. Известно, что активированный caspas-1 инициирует апоптоз [204]. Недавно было обнаружено, что ATRA также индуцирует экспрессию гена caspas-1 в клетках миелоидной лейкемической клеточной линии NB4, но более медленно по сравнению с IRF-1. В дополнение к caspas-1 индукция транскрипции гена ингибитора циклин-зависимой киназы (р21) при у-радиации зависит от IRF-1 [291]. Tanaka с соавт. [291] также показал, что эмбриональные фибробласты мышей при отсутствии IRF-1 не подвержены повреждению ДНК, обусловленному остановкой клеточного цикла. Другим геном-мишенью для IRF-1 регуляции является ген индуцибельной синтазы окиси азота (iNOS) [133]. Белковый продукт гена iNOS вовлечен в синтез окиси азота. Эти компоненты продуцируются активированными макрофагами при усилении их фагоцитарной активности [133]. Так же, окись азота ингибирует пролиферацию Т-лимфоцитов [14, 194].

Основным биологическим свойством IRF-1 является подавление клеточного роста [292]. Уровень IRF-1 понижен при стимуляции роста и возрастает при остановке клеточного роста. Willman с соавт. [332] обнаружили, что ген IRF-1 делетирован в клетках пациентов больных лейкемией. Потеря функционального IRF-1 белка, по-видимому, приводит к развитию некоторых лейкозов.

Для некоторых форм рака экспрессия генов IRF-1 или факторов транскрипции STAT очень низка, или функции соответствующих белков изменяются до такой степени, что контроль клеточной пролиферации нарушается. Недавно было показано, что комбинация ATRA с интерферонами очень эффективна при терапии некоторых форм рака. Это связано с тем, что ATRA усиливает экспрессию белков (IRF-1, STAT1, STAT2, р48), которые вовлечены в передачу IFN-опосредованного сигнала.

ATRA индуцирует экспрессию гена IRF-1 в NB4 клетках [179]. Похожий эффект наблюдался и в других миелоидных лейкемических клеточных линиях (HL-60, ТНР-1, U-937). Следует отметить, что повышенный уровень мРНК IRF-1 был зарегистрирован сразу после ATRA-индукции. Индукция экспрессии гена IRF-1 наблюдается и в присутствии ингибитора белкового синтеза. Все эти данные указывают на то, что ответ лейкемических клеток на ATRA напрямую связан с активацией анти-онкогенного гена IRF-1 [179]. Индукция IRF-1 коррелирует с ингибированием роста и апоптозом этих клеток, что также указывает на то, что IRF-1 вовлечен в антипролиферативное действие ATRA.

Детальный анализ промотора IRF-1 показал, что он содержит функциональный GAS элемент, с которым активированный STAT1 связывается в ответ на стимуляцию IFN-a и IFN-y [228, 269]. В NB4 клетках, также как и в человеческих макрофагах, как IFN-a, так и IFN-y способны индуцировать экспрессию гена IRF-1 и связывание STAT1 с промотором IRF-1 [162, 179]. В дополнение к этому, в промоторном участке гена IRF-1 был обнаружен NF-kB (ядерный фактор транскрипции-кВ) элемент [269]; предполагается, что этот сайт связан с индуцированной IL-1/TNF-a экспрессией гена IRF-1 [215]. Недавно было показано, что IFN-у и TNF-a синергично усиливают экспрессию IRF-1 гена через активацию факторов транскрипции STAT1 и NF-kB [215]. Тогда как индуцированная ATRA экспрессия этого гена осуществляется непосредственно через рецептор ретиноевой кислоты, который связан с промотором IRF-1.

В NB4 клетках уровень р48 очень мал, и комплекс ISGF3 не формируется в ответ на действие IFN-a. При обработке клеток NB4 ATRA значительно возрастает уровень как мРНК р48, так и белковой продукции, и полностью восстанавливается их способность отвечать на действие IFN-a [180]. В дополнение к р48 экспрессия факторов транскрипции STAT1 и STAT2 значительно возрастает в клетках NB4 и U937, обработанных ATRA. Некоторые клеточные линии XMJI также имеют низкий уровень IFN-зависимых сигнальных молекул [334]. Таким образом, недостаток этих сигнальных молекул внутри опухолевых клеток и объясняет их резистентность к антипролиферативному эффекту IFN-a.

Немалый интерес представляет комбинация IFN и химиотерапевтических препаратов в связи со способностью интерферонов изменять активность противоопухолевых препаратов, усиливая чувствительность опухолевых клеток к их цитолитическому и цитотоксическому действию. Так Hassan с соавт. [107] изучили цитотоксическое и цитолитическое действие IFN-a в комбинации с химиотерапевтическими препаратами (сарбоплатин, даунорубицин, цитарабин), обладающими значительной антилейкемической активностью, для трех человеческих миелоидных клеточных линий: МНН225 (CD34-позитивная мультилиния), HL-60 (промиелоцитная), U937 (монобластная), находящихся на разных стадиях дифференцировки. В результате они показали, что IFN-a в концентрации 300 и 3000 МЕ/мл значительно усиливает цитотоксическое и цитолитическое действие сарбоплатина, в меньшей степени даунорубина и совсем не изменяет активность цитарабина для всех трех клеточных линий. Ранее сходные результаты были получены и для клеток хронического эритробластного лейкоза К562. Следует отметить, что ни один из трех химиотерапевтических препаратов не индуцирует дифференцировку ни одной из тестируемых лейкемических линий. Механизм действия этих препаратов остается невыясненным. Но все же полученные результаты указывают на возможность клинического использования комбинации IFN-a и сарбоплатина при лечении пациентов с миелоидным лейкозом.

4.TNF

При изучении различных продуктов секретируемых активированными макрофагами, был получен фактор, который лизировал большой набор опухолевых клеток in vivo и in vitro. По основному биологическому эффекту он получил название - TNF [46, 112]. В параллельных исследованиях из культуры активированных Т-клеток выделили другой фактор, также обладающий литической активностью по отношению к чужеродным клеткам. По типу клеток, продуцирующих этот фактор, его стали обозначать как лимфотоксин [247, 331]. Детальное изучение этих факторов показало существенное структурное и функциональное сходство между ними. Настоящее их название - TNF-a и TNF-P [11, 12, 99, 225,324].

TNF-a в зависимости от типа опухолевых клеток вызывает их пролиферацию, дифференцировку или апоптоз [306, 313]. Помимо способности вызывать некроз некоторых опухолей этот цитокин обладает рядом свойств. Основными биологическими свойствами TNF является стимуляция роста и дифференцировки Т- и В-лимфоцитов и фибробластов, активация и регулирование функций нейтрофилов, стимуляция продукции самого TNF и других цитокинов.

Существует два типа рецепторов к TNF: TNF-R1 с молекулярной массой 55 кДа и TNF-R2 - 75 кДа [38, 116]. Различные типы клеток, включая макрофаги, лимфоциты, эндотелиальные и лейкемические клетки, содержат рецепторы к TNF. В TNF-опосредованном сигнале участвуют белковые молекулы, которые взаимодействуют с рецептором TNF после его лиганд-индуцированной тримеризации [123, 242, 243]. Активация TNF-R1 приводит к присоединению TNF-R1 -ассоциированного белка, содержащего домен смерти (TRADD) [122, 123]. С TRADD непосредственно взаимодействуют два белка, содержащие домен смерти: серин-треониновая киназа RIP [121] и Fas-ассоциированный белок (FADD), а также TNF-R1-ассоциированный белок 2 (TRAF2) [122]. TNF-индуцированный апоптоз опосредуется через N-терминальный домен FADD белка, который взаимодействует с ICE-подобными протеазами МАСН или FLICE и активирует апоптотический протеазный каскад [34, 202]. Существует альтернативный ответ клетки на TNF-опосредованный сигнал, при котором присоединение TRAF2 и RIP к TRADD белку активирует фактор транскрипции NF-kB, что защищает клетку от апоптоза.

С активированным TNFR2 взаимодействуют TRAF1 и TRAF2 белки, которые вызывают активацию NF-kB [166]. Таким образом, активация этого рецептора не приводит к апоптозу.

Следует отметить, что фактор некроза опухолей ингибирует рост и вызывет дифференцировку только отдельных лейкемических клеточных линий. Показано, что он ингибирует рост бластов от пациентов с острой миелогенной лейкемией (OMJ1) или с хронической миелогенной лейкемией в стадии бластного криза (XMJI), и не влияет на рост клеток от больных с острой лимфобластной лейкемией и с хронической миелогенной лейкемией в хронической фазе [80, 94, 233].

Tamatani с соавт. [289] изучили влияние TNF-a на рост миелоидных лейкемических клеточных линий. Ими показано, что TNF-a дозозависимо ингибирует рост клеток U937 (50 % ингибирование наблюдалось при концентрации TNF-a 100 МЕ/мл), но не вызывает их дифференцировки. При этом эффект TNF-a был скорее цитолитическим, чем цитостатическим. В отличие от U937, TNF-a слабо ингибирует рост клеток ТНР-1 (30 % ингибирование наблюдалось при концентрации TNF-a 1000 МЕ/мл), но при этом он дозозависимо индуцирует дифференцировку этих клеток. TNF-a также вызывает дифференцировку клеток Ml по макрофагальному пути, но только в присутствии IL-1. Ранее две группы исследователей сообщили о том, что TNF-a и лимфотоксин при концентрации -Ю-11 М вызывают дифференцировку человеческой промиелоцитарной клеточной линии HL-60 по моноцитарному пути [287, 307]. Культивирование клеточной линии HL-60 в течение 5 дней в присутствии этих цитотоксинов (TNF-a и лимфотоксина) приводит к накоплению клеток, находящихся в G1 фазе клеточного цикла, которые экспрессируют специфические моноцитные антигены В52.1 и миеломоноцитные антигены ОКМ1 (рецептор C3bi). TNF-a и лимфотоксин в концентрации 20 МЕ/мл не способны к индукции высокоаффинных рецепторов FcR и антигенов гистосовместимости II класса. Тем не менее, TNF-a усиливает этот эффект, вызванный IFN-y. Все интерфероны способны усиливать экспрессию рецепторов TNF-R1 и TNF-R2 на миелоидных клетках без изменения их аффинности [220]. Увеличение экспрессии TNF и его рецепторов приводит к усилению TNF-опосредованного сигнала. Вместе с IFN-y TNF-a и лимфотоксин индуцируют миелоидные клетки к терминальной дифференцировке в клетки с фенотипическими, функциональными и пролиферативными характеристиками дифференцированных миеломоноцитных клеток.

Greenblatt и Elias [100] сообщили, что в лейкемических клеточных линиях HL-60 и U937 под воздействием TNF-a наблюдается фрагментация

ДНК. Для клеток ДОЗ 7 цитотоксическое действие TNF-a связано с апотозом этих клеток: происходит разрушение ДНК с образованием нуклеосомных фрагментов. Однако, в случае HL-60 TNF-индуцированная фрагментация ДНК вызывает дифференцировку клеток по моноцитарному пути. Таким образом, TNF-индуцированная фрагментация ДНК клеток HL-60 приводит к регуляции генной экспрессии и дифференцировке.

Для изучения роли рецепторов TNF в TNF-опосредованной фрагментации ДНК клеток HL-60 и U937 и моноцитарной дифференцировке HL-60 клеток Greenblatt и Elias [100] использовали моноклональные антитела. Ранее Brockhaus с соавт. [38] с помощью моноклональных антител к TNF-R1 (htr-9) и TNF-R2 (utr-1) удалось идентифицировать оба рецептора на поверхности клеток HL-60 и U937. Они показали, что в комбинации htr-1 и utr-1 антитела полностью ингибируют связывание TNF-a с клетками HL-60 и U937. Htr-9, действуя в качестве агониста TNF-R1, вызывает лизис клеток U937 и активирует фактор транскрипции NF-kB клеток HL-60. Utr-1 ингибирует TNF-индуцированную активацию NF-kB в клетках HL-60. Эти результаты подтверждают важную роль TNF-R1 в регуляции апоптоза U937 и моноцитарной дифференцировке клеток HL-60.

Следует отметить, что TNF обладает как антиростовой и дифференцирующей, так и пролиферативной активностью. TNF-a стимулирует пролиферацию клеток, полученных от пациентов с В формой хронической лимфобластной лейкемии (B-XJIJI) [311]. Пролиферативный ответ возникает только при комбинации TNF-a и форбол миристат ацетата (РМА). Добавление интерлейкина-4 (IL-4) к суспензии TNF-индуцированных клеток приводит к полному ингибированию их пролиферации. Максимальное ингибирование достигается при концентрации IL-4 40 пг/мл. Независимо от присутствия TNF-a IL-2 вместе с РМА способен индуцировать пролиферацию клеток B-XJIJL Синтез и секреция TNF-a индуцируется при стимуляции IL-2 B-XJIJI клеток, активированных 12-о-тетрадеканоил форбол-13-ацетатом (TPА) [158]. При стимуляции клеток B-XJIJI отдельно ТРА или IL-2 наблюдалось лишь небольшое усиление секреции TNF-a. Интересно, что IL-4 подавляет IL-2- стимулированную продукцию TNF-a в активированных B-XJIJI клетках и IL-2-стимулированную пролиферацию этих клеток. Экспрессия рецепторов TNF-a была активирована после ТРА стимуляции клеток В-XJIJI, тогда как TNF-a, TNF-(3, IL-2 и В-клеточный ростовой фактор не способны изменить уровень экспрессии рецепторов TNF-a. Таким образом, усиление эндогенной продукции TNF-a, индукция экспрессии TNF-R и митогенный эффект TNF-a на активированные B-XJIJI клетки говорят о том, что TNF-a способен функционировать как аутокринный костимулятор роста B-XJIJI клеток. Существуют данные о том, что помимо IL-4 блокировать пролиферацию клеток B-XJIJI может верапамил [28]. Он контролирует рост этих клеток посредством ингибирования секреции TNF.

TNF-a эффективно стимулирует рост клеток от пациентов с волосовидноклеточной лейкемией (BKJI) [40]. TNF-индуцированную пролиферацию можно подавить рекомбинантным IFN-a. Trentin с соавт. показали, что на поверхности клеток BKJI и B-XJIJI экспрессируются только высокоаффинные (75 кДа) TNF-R2. TNF-индуцированная пролиферация этих клеток ингибируется при предынкубации их с utr-1, а не с htr-9 антителами. Более того, только анти-75 кДа антитела запускают процесс пролиферации этих клеток. Эти результаты говорят о том, что лейкемические клетки от больных с BKJI и B-XJIJI содержат только функциональные высокоаффинные рецепторы TNF-R2.

Суммируя все данные о роли TNF-a в регуляции активности лейкемических клеток, можно сделать вывод, что TNF-a выполняет роль как негативного, так и позитивного регулятора роста определенных лейкемических клеточных линий.

5. GM-CSF

Исследования последних лет показали, что ряд цитокинов способен стимулировать рост и дифференцировку предшественников клеток костного мозга. Вся эта группа получила название колониестимулирующих факторов (CSF) [58, 185], так как они, в основном, характеризуются способностью формировать клеточные колонии в культуре клеток костного мозга. CSF действуют на клетки костного мозга на различных стадиях созревания, что приводит к образованию колоний разного происхождения. В настоящее время в эту группу цитокинов включают: G-CSF, GM-CSF, M-CSF, мультиколониестимулирующий (IL-3) факторы и эритропоэтин (Еро) [44, 138, 165,275, 336].

При использованиии рекомбинантной ДНК и систем экспрессии бактерий, дожжей и млекопитающих было получено 3 различных rHuGM-CSF: молграмостим, реграмостин и сарграмостин [41, 44, 333]. Эти вещества не идентичны и отличаются по своим специфическим аминокислотным последовательностям и степени гликозилирования.

Биологическое действие GM-CSF опосредовано через связывание с рецепторами на поверхности клеток-мишеней. Рецептор GM-CSF присутствует на поверхности гранулоцитов, эритроцитов, мегакариоцитов, нейтрофилов, моноцитов, макрофагов, дендритных клеток, определенных групп Т-лимфоцитов, эндотелиальных клеток сосудов, миелоидных лейкемических клеток [63, 73, 130, 157, 221, 252, 300]. Работы по молекулярному клонированию показали, что рецептор GM-CSF состоит из двух субъединиц: а и общей (3 фс) [109]. а-субъединица связывает GM

CSF с низкой аффинностью. рс образует гетеродимер с а-субъединицей, который обладает высокой аффинностью для GM-CSF. рс субъединица является общей для рецепторов интерлейкина-3 (IL-3) и IL-5, тогда как а-субъединица относится только к рецептору GM-CSF [190]. Растворимая изоформа а субъединицы рецептора GM-CSF имеется в клеточных линиях, где экспрессируется мембрано-связанный рецептор. Экспрессия растворимого рецептора GM-CSF снижается более чем в три раза во время дифференцировки клеток HL-60, индуцированной DMSO, тогда как экспрессия мембранно-связанной изоформы возрастает более чем в 20 раз [110].

Существуют два отличных пути передачи GM-CSF-опосредованного сигнала внутрь клетки, в которые вовлечены разные участки рс субъединицы [253]. Первый путь приводит к активации Janus киназы (JAK2), которая физически ассоциирована с рс [234]. JAK2 активирует транскрипцию белков STAT1, STAT2 и STAT5 [200, 325]. Второй путь передачи сигнала при рецепции GM-CSF связан с активацией ras-киназы [254] и киназ митоген-активируемого белка [216] и последующей индукцией генов c-fos и c-jun, которые вовлечены в регуляцию гемопоэтической дифференцировки [234].

Известно, что факторы, стимулирующие рост нормальных гемопоэтических предшественников, оказывают подобное действие на лейкемические предшественники. GM-CSF может стимулировать пролиферацию клеток от пациентов с острой миелоидной лейкемией (ОМЛ) [45, 70, 127, 139, 223, 224, 227, 316]. Как правило, для максимальной пролиферации этих клеток необходима комбинация различных колониестимулирующих факторов: IL-3, G-CSF и GM-CSF [45, 139, 163,224,315].

GM-CSF индуцирует дифференцировку in vitro некоторых лейкемических клеточных линий (К-562, HL-60) [163, 297]. При обработке этих клеток GM-CSF наблюдаются изменения в экспрессии поверхностных клеточных антигенов [93, 119, 222, 223]. Несмотря на это, имеются клинические данные, что ни GM-CSF, ни G-CSF не могут индуцировать окончательную дифференцировку лейкемических бластных клеток от пациентов с ОМЛ [93, 199, 224, 316].

Лейкемические клетки в S фазе клеточного цикла более чувствительны к цитолитическим агентам. Поскольку GM-CSF переводит лейкемические клетки из G1 в S фазу клеточного цикла, то он может вызвать усиление антилейкемического эффекта химиотерапии. Cannistra с соавт. сообщили, что rHuGM-CSF-индуцированное увеличение числа лейкемических клеток в S фазе клеточного цикла приводит к усилению клеточной гибели, вызванной цитарабином [43]. Lotem и Sachs [169] отметили, что в отличии от цитарабина rHuGM-CSF и rHuG-CSF предотвращают апоптоз в мышиных лейкемических клеточных линиях. Поскольку существуют противоречивые данные, то невозможно предсказать клиническую картину применения этого цитокина при лечении пациентов с ОМЛ.

В своей работе Buchner [39] сравнил использование химиотерапии при лечении пациентов с ОМЛ с применением химиотерапии совместно с сарграмостимом. При ежедневном введении сарграмостима в концентрации 5 мкг/кг/день за 24 часа до химиотерапии наблюдалось восстановление пула нейтрофилов. В результате проведенного лечения ремиссия наблюдалась у 79% пациентов, которым вводился сарграмостим, и у 84% - в контроле; рецедив болезни был зарегестрирован соответственно у 4 % и 18 % пациентов. У пациентов моложе 60 лет полная ремиссия возникала у 79% пациентов, которым вводился сарграмостим, и у 84% - в контроле. Сходные результаты были получены и при применении молграмостима [105, 111, 172, 340].

Новым направлением в лечение OMJI может стать иммунотерапия, в основе которой лежит действие rHuGM-CSF на цитотоксические функции Т-лимфоцитов и на экспрессию мембранных адгезионных белков OMJI клетками. Было проведено несколько предварительных экспериментов с использованием молграмостима для пациентов с OMJI. Действие молграмостима в концентрации 5 мг/кг/день на цитотоксические функции Т-киллеров изучено у 20 пациентов OMJI, перенесших трансплантацию костного мозга [240]. Цитотоксические свойства Т-киллеров были исследованы до трансплантации костного мозга, во время rHuGM-CSF терапии и после нее. В качестве контроля была взята группа пациентов, у которых проведена только трансплантация костного мозга. В результате было установлено, что rHuGM-CSF существенно усиливает цитотоксические функции Т-киллеров; во время rHuGM-CSF терапии эта функция активированных Т-киллеров возрастала от 1,8% (до трансплантации костного мозга) до 35% и оставалась повышенной после терапии (в среднем 20%). Спустя 24 месяца риск повторного заболевания у пациентов, прошедших rHuGM-CSF терапию, по сравнению с контролем (49,5%) составлял 37,4%.

Обработка клеток OMJI rHuGM-CSF вызывает повышение экспрессии мембранных адгезионных белков: ICAM-1 (CD54) и ассоциированной с лимфоцитарной функцией молекулы-3 (LFA-3; CD58), но не приводит к усилению их чувствительности к лизису IL-2-активированными натуральными киллерами [27]. rHuGM-CSF усиливает экспрессию ICAM-1, в большей степени, на лейкемических CD34+ клетках по сравнению с их CD34" аналогами. Если клетки ОМ Л перед инкубацией с Т-киллерами обработать rHuGM-CSF, то их клоногенная активность значительно уменьшается. Эти данные указывают на то, что применение клеточного активатора IL-2 и модулятора rHuGM-CSF будет иметь терапевтическую пользу для пациентов с минимальной остаточной миелоидной лейкемией.

6. IL-2

IL-2, называемый также фактором роста Т-клеток, является физиологическим митогеном для предшественников цитотоксических Т лимфоцитов и индуцирует пролиферацию Т-клеток из G1 в S фазу клеточного цикла. Основными продуцентами IL-2 являются хелперные Т-клетки, которые начинают активную продукцию цитокина под влиянием антигенов, митогенов или других цитокинов. Мишенями регуляторного действия IL-2 являются различные субпопуляции Т-клеток, В-клетки, натуральные киллеры, макрофаги [272, 293]. Все эти клетки имеют соответствующий рецептор для восприятия сигнала от IL-2. Рецепторный комплекс IL-2 состоит из 3 субъединиц, представляющих собой полипептиды разного размера и обозначаемых как а- (р55, антиген Тас), Р~ (р75), у- (р64) цепи, каждая из которых кодируется собственным геном [188, 294]. Отдельные субъединицы рецепторного комплекса IL-2 являются общими для IL-2 и некоторых других цитокинов. Так (3-цепь является одновременно компонентом рецептора для IL-15, а у-цепь служит общей субъединицей рецепторов для IL-2, 4, 7 и 15 [95, 150, 213, 250, 280]. Различные комбинации а, Р, и у цепей приводят к формированию трех различных классов рецепторов к IL-2: низкоаффинные рецепторы представляют собой индивидуальные а цепи и не содержат Р и у цепей; среднеаффинные рецепторы состоят из р и у цепей и не содержат а цепей; высокоаффинные же рецепторы являются аРу гетеротримерами. Средне- и высокоаффинные рецепторы способны передавать IL-2-опосредованный сигнал в клетку.

В настоящее время не вызывает сомнений тот факт, что индукция пролиферативного сигнала в Т-лимфоцитах происходит за счет гетеродимеризации цитоплазматических доменов (3 и у цепей IL-2R, которые ассоциированы с Janus киназами Jakl и Jak3 соответственно [134, 205, 210, 211, 249]. Установлено, что ус субъединица физически и функционально ассоциирована с тирозинкиназой JAK3, принадлежащей к семейству Janus киназ. [193, 249]. Полагают, что эта уникальная молекулярная пара инициирует сигнальный каскад реакций, включающий гетеродимеризацию с цитокин-специфическим рецепторным компонентом, активацию Янус киназы JAK1 или другой тирозинкиназы (Lck, Syk, PI-3, MAP), фосфорилирование рецептора, приводящее к связыванию сигнальных белков, в основном факторов транскрипции STAT, регулирующих экспрессию специфических генов. Возможно существование по крайней мере 3 различных внутриклеточных путей передачи сигнала от рецепторного комплекса IL-2 [238]: 1) путь, опосредуемый Lck/Jak, ведущий к активации Ras киназы и затем к индукции экспрессии онкогенов c-jun и c-fos; 2) путь, связанный с активацией Syk/Jak, ведущий к индукции экспрессии онкогена с-тус; 3) не до конца охарактеризованный путь, ведущий к изменению цитоскелета клеток, уровня экспрессии гена bcl-2 и активации ядерного фактора транскрипции NF-kB.

Основным результатом действия IL-2 на покоящиеся или стимулированные антигеном или митогеном клетки является обеспечение их пролиферации. Именно эта биологическая активность IL-2 определяет его как типичный ростовой фактор клеток лимфо-миелоидного комплекса. IL-2 является ростовым фактором и для клеток некоторых опухолей.

Известно, что IL-2 стимулирует пролиферацию клеток Т-лимфолейкоза взрослых, волосовидноклеточной лейкемии [18, 97, 257].

Известно, что рецепторный полипептид с массой 75 кДа (IL-2R а) в покоящихся Т-, В-клетках и моноцитах либо отсутствует на клеточной поверхности, либо его крайне мало. Его полноценная экспрессия начинается после активации покоящихся клеток специфическими антигенами. В отличие от покоящихся клеток, клетки некоторых опухолей экспрессируют а-цепь IL-2R. Фактически у всех пациентов с HTLV-I-ассоциированным Т-лимфолейкозом взрослых и волосатовидноклеточной лейкемией отмечен высокий уровень экспрессии IL-2R а [152, 308, 323]. Так же у ряда пациентов с кожной Т клеточной лимфомой, с хронической и острой миелогенной лейкемией наблюдается экспрессия Тас пептида (IL-2R а) [260, 323]. Кроме того, в плазме крови этих больных замечено увеличение концентрации растворимой формы рецептора IL-2 (IL-2R а) [245, 320]. Увеличение уровня растворимой формы рецептора IL-2 отмечено при ряде заболеваний, включая многие формы рака, аутоиммунные и инфекционные заболевания, кризы отторжения при пересадках органов. Во всех случаях определение его содержания в сыворотке крови может быть диагностическим и прогностическим критерием [246].

Следует отметить, что с помощью моноклональных анти-Тас антител было установлено, что клетки Т-лимфолейкоза взрослых экспрессируют а-цепи IL-2R. Этот факт послужил основой для возникновения IL-2R-направленной иммунотерапии при помощи моноклональных антител. Предполагалось, что агенты для IL-2R-нaпpaвлeннoй иммунотерапии смогут уничтожить лейкемические клетки, экспрессирующие IL-2Ra. Для этого пациентам с Т-лимфолейкозом взрослых вводили ^модифицированные мышиные анти-Тас антитела [319, 321]. Ремиссия наблюдалась только у тех пациентов, у которых продуцировались антитела на моноклональные антитела. В результате только у 7 из 20 пациентов наблюдалась смешанная (1), частичная (4) или полная (2) ремиссия с продолжительность от 1 до 30 месяцев после анти-Тас терапии. Таким образом, использование моноклональных антител, которые препятствуют взаимодействию IL-2 с его ростовым рецептором на клетках Т-лимфолейкоза взрослых является рациональным подходом при лечении этого заболевания. При активной форме Т-лимфолейкоза взрослых лейкемические клетки не продуцируют IL-2 и не нуждаютя в нем для своего роста. При такой форме заболевания пациенты могут быть нечувствительны к немодифицированной анти-Тас терапии. Тем не менее, такие клетки содержат на своей поверхности Тас белок. Таким образом, наличие Тас белка все же является различием между нормальными и опухолевыми клетками.

Для повышения эффективности 1Ь-2К-направленной химиотерапии рядом исследователей предложены разные подходы по модификации антител. Так, например, экзотоксин Pseudomonas (РЕ) присоединяли к анти-Тас для того, чтобы цитотоксичское вещество достигало клетки-мишени без потери токсичности. Предполагалось, что адресное действие таких препаратов обеспечит уничтожение опухолевых клеток, не затрагивая здоровые клетки того же тканевого происхождения. Первый полученный химерный белок РЕ-анти-Тас был гепатотоксичен для 2 из 5 пациентов с Т-лимфолейкозом взрослых. Принимая во внимание полученные результаты, Hwang с соавт. [124] провели функциональный анализ делеционных мутантов РЕ, для того, чтобы определить, какой домен необходим для клеточной гибели, какой отвечает за неспецифическое связывание и его гепатотоксичность. В результате было установлено, что третий домен, ответствененный за ADP-рибозилирование, и второй домен, вовлеченный в перенос экзотоксина, должны быть сохранены. 26 кДа фрагмент из 66 кДа пептида из первого домена, участвующий в неспецифическом связывании, может быть удален. После удаления этого фрагмента остается 40 кДа пептид (РЕ40), который и осуществляет уничтожение опухолевых клеток. Но для осуществления клеточной гибели ему необходима система доставки к поверхности Тас-экспрессирующих клеток. В результате был создан химерный белок IL-2рЕ40 [167].

Также был создан и другой химерный белок anti-TacFv-PE40, содержащий вариабельные домены тяжелых и легких цепей мышиных моноклональных анти-Тас антител [51]. Эта одноцепочечная молекула сходна с анти-ТасРЕ40, но в ней отсутствует константный домен. Белок anti-TacFv-PE40 проявляет высокоаффинное связывание с Тас-экспрессирующими клетками в отличие от исходной молекулы анти-ТасРЕ40. Более того, данный белок эффективнее при уничтожении Тас-экспрессирующих клеток [155]. Таким образом, с использованием слитных белков, включающих в себя токсины, ассоциированные с лимфокинами или антителами, стало возможным повышение эффективности IL-2R-направленной химиотерапии.

Особый интерес вызывает сообщение ряда исследователей об использовании меченых изотопов в качестве альтернативных цитотоксических агентов [322]. Предполагалось, что изотопы, конъюгированные с анти-Тас будут более эффективны в уничтожении Тас-экспрессирующих клеток. Для исследований был использован иттрий-90 (90Y) и висмут-212 (212 Bi). Исследование эффективности и токсичности этих препаратов показало, что у 10 из 15 пациентов с Т лимфолейкозом взрослых при концентрации препарата (5, 10 и 15 mCi) наблюдалась частичная (8) или полная (2) ремиссия. Таким образом, анти-Тас с радиоизотопами могут использоваться для лечения таких форм лейкемии, которые ранее были неизлечимы.

7. Цитокин р48

Из культуральной среды человеческой пре-В лейкемической клеточной линии Reh, был выделен и охарактеризован новый цитокин, обладающий дифференцирующей и антиростовой активностью [160, 161]. Новый фактор дифференцировки - одноцепочечный полипептид с молекулярной массой 48 кДа был назван р48.

Letfwich и Hall установили, что р48 индуцирует моноцитарную дифференцировку и цитолитическую активность в клетках промиелоцитарного лейкоза HL-60 и является антипролиферативным агентом для ряда лейкемических клеточных линий (U937, К-562, YAK, Daudi).

Известно, что клеточная линия HL-60 in vitro индуцируется к дифференцировке рядом химических агентов (форболовыми эфирами, DMSO, ATRA и т.д.) и цитокинами, такими как IFN-y, TNF-a, CSF [23, 37, 61, 69, 244, 278]. В зависимости от используемого индуктора эти клетки могут дифференцироваться либо по гранулоцитарному, либо по моноцит-макрофагальному пути. Клетки HL-60, культивированные в течение трех дней в присутствии р48, продуцируют супероксид анион (Ог") и экспрессируют поверхностные клеточные рецепторы, которые присутствуют на зрелых мононуклеарных фагоцитах.

Из работы Kostyal и соавт. [154] следует, что подобно другим цитокинам (TNF-a, IL-1), р48 имеет две формы: ассоциированную с мембраной и секретируемую, причем обе активны. В отличие от TNF-a и IL-la, обе формы р48 имеют одинаковую молекулярную массу. Мембрано-ассоциированные формы р48 и большинство (но не все) секретируемых форм гидрофобны. Роль мембранной фракции р48 и ее связь с секретируемой полностью не известна. Возможно, что мембранная форма выступает в качестве клеточного резерва р48. Предполагается, что мембранная форма р48 может представлять собой рецептор для другого лиганда или рецептор при межклеточном взаимодействии.

Описанный ранее фактор, индуцирующий дифференцировку, (DIF) по структуре и функциональным свойствам схож с TNF-a или TNF-f3, которые индуцируют дифференцировку клеток HL-60 [113, 287, 307]. Хотя TNF-a, TNF-(3 и р48 являются антипролиферативными агентами ряда мышиных и человеческих лейкемических клеточных линий, р48 ингибирует пролиферацию клеточных линий (мышиная YAK лимфома), которые не чувствительны к TNF-a и TNF-(3. Изучение температурной и рН стабильности показало, что р48 имеет отличную от TNF-a и TNF-|3 природу. Кроме того, было показано, что антитела к TNF-a и TNF-P не блокируют дифференцировку клеток HL-60, вызванную р48 [161]. Суммируя полученные данные, можно заключить, что р48 отличается от TNF-a и TNF-p. В своей работе Leftwich и Hall [160, 161]также представили доказательство того, что р48 не является CSF, IFN-a или -у, IL-6. Таким образом, проведенные исследования показали, что р48 является новым цитокином с дифференцирующей активностью, который может играть важную роль в контроле нормального и аномального (лейкемического) гемопоэза.

Kestler и Hall [140] установили, что р48 регулирует экспрессию мРНК IL-la, IL-1 Р и TNF-a в моноцитах человека и клеточных линиях HL-60 и U937, а мРНК IL-6 - только в моноцитах. Так как HL-60 и U937 находятся в премоноцитарной стадии дифференцировки, то, вероятно, что для воздействия р48 на экспрессию IL-6 мРНК необходимы клетки, находящиеся на более поздней стадии дифференцировки.

В настоящее время, секвенирован N-конец этого белка, кодирующий его ген был клонирован [104]. кДНК р48 была проклонирована из РНК Reh клеток, используя З'-ревертазную амплификацию к ДНК. Саузерн-блот кДНК р48 показал гибридизацию с ДНК из Reh и Molt-4 клеток, но не с ДНК мононуклеарных клеток периферической крови. Используя PCR и Саузерн-гибридизацию, была обнаружена гомологичная последовательность в ДНК, выделенной из Mycoplasma fermentans. Используя кДНК р48, была выделена геномная ДНК из М. fermentans, которая на 98.5 % совпадает с кДНК р48 из Reh клеток. Выведенная из геномной ДНК М. fermentans, аминокислотная последовательность совпадает с N-концевой последовательность белка р48 из Reh клеток. 5' конец гена М. fermentans содержит ряд консенсусных последовательностей характерных для прокариотических генов, и полученная аминокислотная последовательность показывает, что р48 является липопротеином. кДНК р48 была экспрессирована в pMAL в Escherichia coli, и было обнаружено, что экспрессированный гибридный белок с молекулярной массой 60 кДа взаимодействует с антителами к р48. Это согласуется с тем, что гибридные белки pMAL состоят из двух частей, а именно из мальтозосвязывающего белка 42 кДа и рекомбинантного белка р48 18кДа. Полученные результаты говорят о том, что нативный р48 подвергается существенной посттрансляционной модификации. Рекомбинантный гибридный белок обладает антипролиферативной активностью по отношению к клеткам HL-60, антитела к рекомбинантному р48 блокируют биологическую активность нативного р48, выделенного из культуральной среды Reh клеток. Эти данные говорят о том, что р48 - молекула с иммуномодулирующей и гемопоэтической дифференцирующей активностями происходит из М. fermentans.

Таким образом, цитокины вовлечены в самые разнообразные клеточные процессы, такие, как пролиферация, дифференцировка, хемотаксис, формирование очага воспаления, переключение синтеза иммуноглобулинов, изменение экспрессии антигенов и т.д. Данные,

46 приведенные в обзоре, показывают, что в зависимости от типа лейкемических клеток один и тот же цитокин может как усиливать, так и подавлять их пролиферацию. Все вышесказанное ограничивает клинические перспективы применения цитокинов в качестве противоопухолевых препаратов. Однако, это обстоятельство не умоляет ценность научных исследований, направленных на установление молекулярных механизмов действия цитокинов на лейкемические клетки. Несомненно, что результаты таких исследований способствуют более глубокому пониманию биохимических процессов, обеспечивающих опухолевый рост.

Часть II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Глава I. Материалы и методы

1. Реактивы

В работе использовали: L-Glu, D-Glu, L-Asp, L-Gln, фетальную сыворотку теленка, Quis, трипсин, ЭДТА, агарозу (Sigma, США); HEPES (Fluka, США); азид натрия (NaN3) (Serva, Германия); Кон А, фиколл, декстран 500, Isopaque (Pharmacia, Швеция); бензил-пенициллин, гентамицин (Gibco, США); L-[6- H]Glu с удельной активностью 56 Ки/ммоль, Na125I без носителя в NaOH (100 мКи/мл) (Amersham Corp., Англия); 1,3,4,6-тетрахлоро-За,6а-дифенилгликолюрил (Иодоген) (Pierce, США).

Все остальные реактивы соответствовали квалификации ч.д.а. и х.ч. Дистиллированную воду дополнительно очищали с помощью системы Mono-Q (Millipore, США).

Жидкий сцинтиллятор Ready Gel (Beckman, США).

Среды для культивирования клеток: среда 199 (Fluka, США) и RPMI-1640 (Fluka, США).

ATRA была любезно предоставлена А.Н. Ходоновым (Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова). rHuIL-lp, rHuIFN-y, rHuIFN-a2, rHuIL-2 были любезно предоставлены В.М. Абрамовым (Институт иммунологии, Любучаны). rHuTNF-a, rHuIL-6 (Sigma, США).

ВЫВОДЫ

1. На Т-лимфоцитах периферической крови человека обнаружены специфические рецепторы к L-Glu, чувствительные к агонисту глутаматных рецепторов мозга квискалату.

2. Показано, что L-Glu ингибирует активность иммунокомпетентных клеток человека и мыши in vitro.

3. Обнаружена способность L-Glu подавлять рост клеток ряда лейкемических линий человека (промиелоцитарной HL-60, эритробластной К-562, Т-лимфобластной Jurkat) и вызывать дифференцировку по гранулоцитарному пути клеток линии HL-60.

4. Установлено, что L-Glu ингибирует связывание IL-ip и IL-6 с их высокоаффинными рецепторами на клетках линии HL-60. Одновременно, в присутствии L-Glu снижается экспрессия этими клетками мРНК IL-ip и IL-6. Напротив, после обработки L-Glu клеток HL-60 увеличивается экспрессия высокоаффинных рецепторов к TNF-a и уровень экспрессии мРНК TNF-a.

5. Показано, что дифференцировка клеток HL-60 all-^ram-ретиноевой кислотой приводит к появлению на их поверхности стереоспецифичных, квискалат-чувствительных глутаматных рецепторов.