Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Цитотоксическая и иммуномодулирующая активность высокоэффективных ингибиторов белкового синтеза

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ИМ Н.Н.

БЛОХИНА РАМН

БУГХЛАЛА САМИРА

ЦИТОТОКСИЧЕСКАЯ И ИММУНОМОДУЛИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНЫХ ИНГИБИТОРОВ

БЕЛКОВОГО СИНТЕЗА

(ОНКОЛОГИЯ 14.00.14)

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологичесютх наук

Научные руководители: д.м.н. МВ.Киселевский Академик РАМН, д.м.н. Профессор АА Воробьев

Москва- 1999

Оглавление

Введение

1. Обзор литературы

1.1 .Молекулярные механизмы активации лимфоцитов

1.1.1. Мембранные изменения при активации лимфоцитов

1.1.2. Роль кальция в активации лимфоцитов

1.1.3. Система внутриклеточных посредников в активации лимфоцитов

1.2. Цитотоксичвское противоопухолевое действие лимфоцитов

1.3. Общая характеристика и механизмы активация тромбоцитов 1.3.1. Противоопухолевая цитогоксичность тромбоцитов

1.4. Токсические растительные токсины

1.4.1. Токсически лекгины псшш-сотгштз

1.4.2. Структура и специфичность углеводсвязывающих центров В-субьеданицы

токсических лектинов 24

1.4.3. Ферментативная активность каталитических субьединиц 27

1.4.4. Связывание с клеточной поверхностью 28

1.4.5. Интернализация токсических лектинов 29

1.4.6. Внутриклеточный путь токсинов 30

1.5. Иммунноконьюгаты 31

1.5.1. Переносчики и цитотоксические агенты для элиминации

опухолевых клеток 31

1.5.2. Использование МАТ в составе конъюгатов с различными соедининиями 33

1.5.3. Иммунотоксины 34

1.5.4. Способы повышение эффективность иммунотоксинов 35

1.6. Физиологическая гибель клеток 36 2. Материалы и методы исследования 41

2.1 Выделение мононуклеарных клетск 42

2.2 Выделение тромбоцитов 42

5 10 10 10 12 13 15 18 19 19 20

2.3 Активация мононуктюарных клеток 42

24. Функциональные исследование тромбоцитов 43

2.5 Определение цитотоксической активности кггеток 43

2.6 Использование иммуноферметживнсго анализа для определения уровня цитокинов в супернатантах, стимулированных мононуклеарных клеток 44

2.7 Выделение белков из с^тггернатантов МНК 45

2.7.1 Фракционирование белков по молекулярным массам с помощью центрифугирования с использованием мембран 4^

2.7.2 Высокоэффективная жидкостная хроматография белков 46

2.7.3 ДСН - электрофорез белков и электроблоттинг 46

2.7.4 Сканирование бе.лков 47

2.7.5 Определение Ы-коицевой аминокислотной последовательности белков 47

2.8. Определение нуклеосомальной фрагментации клеток мишеней 4 8

2.9. Исследование пролиферации клеток по включению [ЗН]ткми дина 48 3. Результаты и обсуждение 50

3.1. Повышение эффективности иммунотоксида КТА'ВЗР? 50

3.2. Прямая противоопухолевая дихотоксичность разных токсинов на К562 53

3.3. Определение иитотоксичности моншукпеарнььх клеток после их активации разными токсинами и конъюгатами в концентрациях не вызывающих шбелъ опухолевых клеток линии К562 59

3.4. Тестирование цитокинов в супернатантах стимулированных рицином

мононуклеаров 65

3.5. Сравнение щтгогоксичностъ мононуклеаров стимушфованных разными

факторами (ФГА, К ОН-А, Са-ионофор-А23187 и рицин) 69

3.6. Цитотоксическая активность тромбоцитов человека, стзадулированных различными экзогенными агентами. 72

3.7. Функциональные исследования тромбоцитов, спт^улированных различными

экзогенными агентами 75

3.8. Сравнение циготоксичности мононуклеаров и тромбоцитов, стимулировшнььх

рицином и Са-ионофором 81

3.9. Исследование супернатантов мононуклеаров, активированных разными факторами 82

3.10, Исследование биологической активности р!4 86 3.11 Тестирование нуклеосомальной фрагментация ДНК мононуклеарньтх

Клеток 89

Заключение 92

Выводы 96

Список литературы 97

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АК - аминокислоты

AT -антитела

ИТ - иммуннотоксины

ЕК - естественные киллеры

К562 - эритролейкомическая линия клеток

Кон-А - конканавалин-А

ЛПС - липополисахариды

мАТ - моноклональные антитела

МНК - мононуклеарные клетки

РТА - А-цепь рицина

РТВ - В-цепь рицина

TAX - транбоксан

ФАТ - фактор активации тромбоцитов

ФГА - фитогемагглютинин

ФЛС - фосфолипазы - С

ФЛА - фосфолипазы - А

ФСБ - фосфатно солевой буфер

ВВЕДЕНИЕ

Элиминация опухолевых клеток из организма является одной из важнейших проблем в современной биологии и медецине. Для решения этой проблемы многие исследователей удоляли большое внимание иммуной системе. Среди разных видов взаимодействия организма и опухоли одним из основных является взаимодействие, осуществляюмое с помощью иммунологических механизмов. Клетки иммунокомпетентной системы обусловливают выявление трансформированной опухолевой клетки. Они первыми вступают в непосредственный контакт с опухолевыми клетками и вызывают их повреждение или удаление из организма. Иммунная система обладает автономностью в распознавании и элиминации из организма генетически чужеродных клеток и субстанций. При этом распознаются ' гетерогенные вещества, находящиеся на плазматической мембране трансформированных клеток. Все остальные системы (нервная и эндокринная) организма, осуществляющие интеграцию его деятельности, оказывают регулирующее воздействие на функции иммунной системы. Они изменяют интенсивность ее реакции на опухолевую клетку [2].

В настоящее время показано, что центральными элементами иммунной системы являются лимфоциты- клетки, которые принимают участие в основных иммунных, в том числе противоопухолевых, реакциях. Распознавание опухолевых клеток и первичный ответ на них связаны с активацей Т-лимфоцитов. В составе Т-субпопуляций лимфоцитов входят антиген-реактивные клетки, которые участвуют в распознавании ассоцированного с опухолью антигена и определяют начало иммунной реакции. Важную роль в механизме распознавания играет комплекс гистосовместимости. При дальнейшем развитии иммунного ответа стимулируются эффекторные Т-клетки, что приводит к образованию цитотоксических клеток. Воздействие цитотоксических Т-клеток (Т-киллер) на опухолевую клетку -мишень связано с ее чувствительностью к серологически определенным антигенам комплекса гистосовместимости, хотя не исключена возможность действия на

другие структуры. После кратковременного контакта цитотоксичес ких Т-киллеров с чужеродной клеткой в последней могут возникнуть необратимые изменения, приводящие ее к гибели. При этом Т-киллер не синтезирует ДНК и существенно не изменяется , что позволяет одному Т-киллеру разрушить несколько клеток мишеней [3].

Кроме специфической цитотоксичности, в организме есть еще один вид киллерной реакции по отношению к опухолевым клеткам с помощью Е К. Они отличают от макрофагов, не имеют маркеров Т- и В- лимфоцитов, их действие на опухолевые клетки не зависит от антитела, комплемента и макрофагов. Т-лимфоциты могут значительно увеличивать активность естественных киллеров, помогая им установить контакт с опухолевой клеткой [93].

В цитотоксическом эффекте, осуществляемом антителами, большое значение имеют К- клетки, относящиеся к одной из субпопуляций В-лимфоцитов.

V

Фиксированные на В-лимфоцитах антитела, направленные против клеток опухоли, превращают В-лимфоцит в цитотоксическую эффекторную клетку, на поверхности которой обнаруживаются иммуноглобулиновые молекулы и рецепторы для Рс-фрагмента ^ в.

Активность К-клеток проявляется в начале роста опухоли или в период ее регрессии и отсутствует при быстром росте новообразования.

Макрофаги также являются главными киллерами опухолевых клеток. Изолированные от влияния лимфоцитов, макрофаги оказывают более выраженное киллерное действие на опухолевые клетки, чем в присутствии этих клеток. Лимфоциты при отсутствии макрофагов значительно теряют их киллер ные свойства. Способность макрофагов разрушать опухолевые клетки связана с фагоцитозом.

Кроме этого, в литературе есть данны свидетельствующие о способности тромбоцитов периферической крови осуществлят противоопухолевое цитотоксическое действие [4]. Ранее было известно только то, что тромбоциты способствуют метастазированию и эндоваскулярной инвазии злокачественных клеток [5].

Однако последние исследования показали, что тромбоциты могут подавлять рост опухолевых клеток, обработанных антителами. В других исследованиях было показано, что тромбоциты способны лизировать эритроциты ципленка и опухолевые клетки in vitro. Но механизм этой лизирующей реакции авторы объяснить не смогли. О способности тромбоцитов лизировать опухолевые клетки было сообщено в работе Grethen 1985 [6].

Авторы изучали цитотоксичность тромбоцитов периферической крови против клеток перевиваемых опухолевых линий и предположили, что механизм литического действия тромбоцитов связан с выделением цитотоксического медиатора.

Стимуляция цитотоксической активности лимфоцитов, макрофагов и тромбоцитов связана с их активацей. Так, к стимулятаром лимфоцитов и макрофагов относятся различные агенты, способствующие повышению иммунного ответа при антигенной стимуляции. Такими свойствами обладают химически агенты (латекс, алюминий, берилий), витамины (ретинол), нуклеиновые кислоты, синтетические полинуклеотиды, микроорганизмы (бактерии, вирусы, паразиты), вещества выделенные из растений. Иммунокомпетентные клетки вырабатывают много биологически активных факторов, имеющих значение для процессов пролиферации, дифференцировки и запуска эффекторных механизмов, среди них спектр интерлейкинов. Так, главную роль в развитии клеточного иммунного ответа играет ИЛ-2. Он активирует цйтотоксические Т- клетки (усиливая синтез эстераза) и обеспечивает пролиферация любых Т-клеток при условии экспресс на их поверхности рецептора к ИЛ-2 [7]. В пользу этого положения свидетельствуют тот факт, что при ингибировании синтеза ИЛ-2 глюкокортикоидами или связывании ганглиозидов с рецептором к ИЛ-2, пролиферация Т-клеток останавливалась [8]. Взаимодействие ИЛ-2 с рецепторами служит механизмом запуска последующих событий, приводящих к пролиферации Т-клетки, которые уже не требуют присутствия митогена или антигена.

При стимуляции лимфоцитов специфическими или неспецифическими факторами наблюдаются морфологические и цитохимические изменения. Так,

исследование ультраструктуры стимулированных лимфоциотов показала, что наиболее ранним признаком активации являются поляризация ядра и цитоплазмы и агглюцинация рибосом, после этого в ядрах активированных лимфоцитов увеличивается количество эухроматины и размеры ядрышка и потом увеличивается объем ядра и цитоплазмы, митохондрий и аппарата Гольда-и. Похожие изменения были обнаружении также при стимуляции цитотоксической активности тромбоцитов тромбином или ФАТ. Тромбоциты экспрессируют Рс фрагмента и 1^также они экспрессируют антигены комплекса

гистосовместимости, по характеру экспрессии которых эти клетки близки к лимфоцитам и моноцитам.

Исследование способность новых веществ к активацию лимфоцитов и тромбоцитов является одной из вожных путей не только для расшерения спектра иммуномодулирующих факторов но и для понимания данного сложного механизма активации, который в настоящее время, имеет большое научное и практическое значение и представляет интерес для многих исследователей. Цель работы.

Целью настоящей работы явилось изучение способности ряда высокотоксичных веществ к активации, им му некомпетентных клеток и тромбоцитов, а также получение из клеточного материала медиаторов, способных активировать пролиферации мононуклеарных клеток.

Основные задачи исследования: для реализации цели исследования были поставлены следующие задачи:

1. изучить прямую цитотоксическую активность токсинов и их конъюгатов (рицина, абрина, микотоксинТ2 и его конъюгат Т2-БСА) на опухолевые клетки линий К562.

2. Исследование влияния цитотоксических концентраций токсинов (рицин, абрин, Т2 и Т2-БСА) на киллерные свойства МНК.

3. Сравнение свойства активированых МНК рицином и классическими факторами (ФГА, Кон-А и Саионофор А23187).

4. Изучение цитотоксической активности тромбоцитов против К562 после их активация разными факторами (ФГА, ФАТ, Кон-А Саионофор А23187 и рицином).

5. Получение и исследование супернатантов активированных МНК рицином и другими факторами (определение уровень цитокинов (ИЛ 1а, ИЛ 10, ИЛ2), определение фактора некроза опухоли.

6. Определение механизма гибели клеток- мишеней и выделение цитотоксического фактора МНК.

Научная новизна работы:

В настоящей работе впервые показано, что высокотоксичные вещества (рицин, абрин, Т2 и Т2-БСА) способны не только разрушать клетки но и стимулировать мононуклеарные клетки, если использовать их в низких концентрациях. При этом цитотоксичность мононуклеаров против опухолевых клеток значительно увеличивается.. Вследствие активации мононуклеаров супернизкими дозами рицина выделяется ряд медиаторов, таких как ИЛ 1а, ИЛ2, фактор некроза опухоли, а также продемонстрировано, что при действии МНК стимулированных рицином на опухолевые клетки происходит фрагментация ДНК данных клеток. Кроме этого, рицин как и другие факторы (ФГА, КонА, Саионофор А23187) стимулирует не только мононуклеарных клеток, но и тромбоциты, повышая их цитотоксичность против опухолевых клеток.

Впервые было показано, что при стимуляции мононуклеарных клеток рицином и другими факторами в межклеточное пространство секретируются специфический белковый медиатор Р14, оказывающий пролиферативный эффект на мононуклеарные клетки. Данный фактор был получен также при активации тромбоцитов рицином и другими факторами (ФГА, Саионофор-А 23187 и ФАТ).

1. Обзор литературы

Одним из мощных факторов, регулирующие постоянство внутренней среды организма, является иммунная система. Нарушение функционирования иммунной системы приводит к резкому повишению чувствительности к инфекциям, увеличению вероятности возникновения опухолей, аутоиммунным процессам, нарушению кроветворения, регенерации и др. [2].

Иммунный ответ смысл которого заключается в защите организма от генетически чужеродной информации (инфекционные агенты, трансплантированные, генетически чужеродные органы и ткани, опухолевые клетки, собственные клетки с измененной под влянием тех или иных факторов антигенной структурой и др.). представляет собой сложный многокомпонентный процесс, где лимфоциты играют важную роль. Лимфоциты - одна из групп лейкоцитов, которые содержатся в больших количествах в крови, в лимфе и в специализированных лимфоидных органах, таких как тимус, лимфатических узлы, селезенка и аппендикс [2]. 1.1 Молекулярные механизмы активация лимфоцитов. 1.1.1. Мембранные изменения при активации лимфоцитов. Мембрана лимфоцита по своей структуре является типичной плазматической мембраной, характерной для многих клеток организма. В соответствии с наиболее разработанной и общепринятой в настоящее время теорией, мембрана лимфоцита является липидно-белковым образованием, имеющим характеристики скорее жидкости, чем твердого тела, и способным выраженно изменять свое агрегатное состояние при различных воздействиях на нее. Основная часть мембраны прдставлена липидами, из которых свыше 50% составляют глицерофосфолипиды, главным образом лецицин. Около 1/3 липидов мембраны представлено холестерином. Обнаружены в составе лимфоцитарных мембран также фосфатидиловая кислота, инозитол-фосфаты,лизолецитин, другие липиды, содержащие как ненасыщенные, так и насыщенные жирные кислоты.

В ходе активации лимфоцитов митогенами отмечено выраженное изменение в физико-химическом состоянии и в составе липидов мембраны [36]. Отмечено выраженное, в десятки раз, увеличение обмена фосфатидилинозитола уже через

минуты после действия на лимфоцит митогена. Увеличивается также включение фосфата в фосфатидиловую кислоту и инозитол- фосфатиды мембраны, повышается включение длиноцепьевых полиненасыщенных жирных кислот в фосфолипиды плазматической мембраны, за счет ацилирования эндогенного лизолецитина. Последний процесс катализируется мембранновстроенным ферментом- ацил-коА-лизилецитинацилтрансферразой, которая найдена лишь во фракции мембран поверхности лимфоцита. Интересно, что фрагменты, содержащие этот фермент, обладают выраженным средством к Кон-А. Ингибирование эффекта данного фермента наблюдается при действии цАМФ, который активирует фермент противоположного действия - липазу - и обладает свойством тормозить пролиферацию лимфоцитов. В целом все изменения мембраны в ходе ее активации приводят к увеличению подвижности мембранновстроенных белков и снижению вязкости мембраны. Такой процесс приводит к увеличению миграции белков в плоскости мембраны, от чего зависит возможность ассоциации рецепторной единицы с аденилциклазой [28].

В мембране клетки идентифицировано около 50 различных ферментов, многие из которых могут активироваться в ходе действия различных мембранотропных веществ. Химическим процессам в мембране принадлежит �