Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Вирусные вакцины и их онколизаты в терапии экспериментальных опухолей

На правах рукописи

Видяева Инна Геннадьевна

ВИРУСНЫЕ ВАКЦИНЫ И ИХ ОНКОЛИЗАТЫ В ТЕРАПИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ОПУХОЛЕЙ

14.00.14 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Томск - 2005

Работа выполнена в ГУ НИИ онкологии Томского научного центра СО РАМН

Научный руководитель: доктор биологических наук

Официальные оппоненты: доктор мед. наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ доктор мед. наук, профессор

Уразова Людмила Николаевна

Пашинский Виталий Глебович Ильинских Николай Николаевич

Ведущая организация: Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Минздрава РФ

Защита состоится "_

_2005 года, в_

часов

на заседании диссертационного совета Д 001.032.01 при ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН (634009, г. Томск, пер. Кооперативный, 5)

Автореферат разослан «_»_

2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Евтушенко В.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Вирусы являются естественными природными иммуномодуляторами, имеющими рецепторные структуры для взаимодействия как с иммуннокомпетентными, так и с другими, в частности, опухолевыми клетками, проявляя повышенную тропность к ним (Фердат А.К., Муцениеце А.Я.,1988). Поскольку формирование и рост опухоли представляют собой сложнейший процесс, который затрагивает все существующие в организме системы, подход к лечению рака должен включать в себя не только традиционные, но и дополнительные воздействия. На сегодняшний день в онкологическую практику прочно входит биотерапия -метод, предусматривающий использование в комплексной терапии рака различных иммуномодуляторов (Коростелев С. А., 2003), При этом онколитическим вирусам, как адъювантным агентам, уделяется повышенное внимание. В настоящее время проводится исследование онколитических свойств различных семейств вирусов, таких как аденовирусы, реовирусы, вирусы вакцинных штаммов, болезни Ньюкастла и других (Parmiani G, Pilla L. et. al., 2003., Christopher J., Ring A., 2002). Противоопухолевое действие онколитических вирусов реализуется за счет нескольких потенциальных механизмов: прямого литического воздействия, возникающего в результате репликации вирусов в малигнизированных клетках (Kirn D., 1996), индукции синтеза белков, которые являются цитотоксическими к опухолевым клеткам (Tollefson A., Ryerse J., Scaria A. et al., 1996; Shtrichman R, Kleinberger Т., 1998) и, наконец, разрушения опухолевых клеток посредством индукции противоопухолевого иммунитета (Toda M., Rabkin S., Kojima H et. al., 1999). Вирусы, также, могут изменять антигенные характеристики опухолевых клеток, встраивая свои антигены в их мембраны, что делает клетку более доступной для действия эффекторов иммунной системы (Gooding L., 1994). Недавно в литературе появились сообщения о способности вирусов, в частности, на примере онколитического аденовируса, индуцировать апоптоз в опухолевых клетках (Mullen J., Tanabe К., 2002). Проводится клиническое изучение лизатов опухолевых клеток, инфицированных вирусами, предпринимаются попытки генетически модифицировать онколитические вирусы с целью повышения их противоопухолевого потенциала и специфичности (Christopher J., Ring A., 2002). Онколитические вирусы обладают способностью увеличивать чувствительность опухолевых клеток к химио- и лучевой терапии (Mullen J., Tanabe К., 2002). Тем не менее, в литературе не освещен вопрос использования вакцинных штаммов вирусов, имеющих огромное преимущество перед «дикими» аналогами - эпидемиологическую безопасность, в качестве терапевтических агентов в лечении, рака. Наряду с генетически закрепленной утратой патогенных свойств, вакцинные штаммы в полной мере сохраняют способность к репликации и формированию активного иммунного ответа (Медуницин Н. В.,

1999). При этом, вирусы обладают высокой тропностью по отношению к клеткам опухолей различных локализаций. Экспериментальными исследованиями доказано, что концентрация вирусных частиц в опухолевой ткани, при прочих равных условиях, многократно превышает аналогичный показатель в нормальной (Andreansky S., 1997; Chung R.Y., 1999; Stojdl D. F.,2000; Li Y., 2001; Nakamura H. et. al., 2002). Универсальность действия вирусных вакцин заключается в том, что оказывая прямое цитопатическое действие на опухолевые клетки в процессе вирусной репликации, они также способны индуцировать противоопухолевое звено иммунитета. Руководствуясь вышеизложенным, мы сочли целесообразным исследовать в качестве онколитических агентов вакцинные штаммы вирусов, изучить механизмы их антибластомного действия в отношении перевиваемых экспериментальных опухолей, а также особенности противоопухолевой активности лизатов опухолевых клеток, инфицированных изученными вирусами.

Цель исследования. Оценка цитопатического и апоптоз-индуцирующего действия вакцинных штаммов вирусов и онколизатов оспы, паротита, гриппа и венесуэльского энцефаломиелита, исследование их способности индуцировать противоопухолевую активность эффекторов системы иммунитета.

Задачи:

1. Исследовать индуцируемую вакцинными штаммами вирусов и их онколизатами патологию ядра и цитоплазмы опухолевых клеток в системах in vivo и in vitro.

2. Изучить особенности индуцируемой вирусами апоптотической гибели опухолевых клеток.

3. Оценить противоопухолевую активность вакцинных штаммов вирусов на фоне терапии цитостатиками.

4. Изучить влияние вирусных вакцин и онколизатов на функциональную активность иммунокомпетентных клеток (спленоцитов, тимоцитов) животных-опухоленосителей при экспериментальном онкогенезе.

Основные положения выносимые на защиту.

- Вакцинные штаммы вирусов и их онколизаты активно подавляют метастазирование и рост экспериментальных опухолей.

- Противоопухолевая и антиметастатическая активность вирусных вакцин и их онколизатов базируется как на прямом литическом воздействии на опухолевые клетки, так и на модуляции противоопухолевой активности клеток иммунной системы.

- Вакцинные штаммы вирусов проявляют апоптоз-индуцирующие свойства по отношению к опухолевым клеткам in vitro.

Цитостатическая терапия существенно повышает противоопухолевую и антиметастатическую активность вакцинных штаммов вирусов.

Научная новизна.

Впервые проведено развернутое исследование по изучению влияния вакцинных штаммов вирусов оспы, паротита, гриппа, венесуэльского энцефаломиелита на уровень цитологических нарушений в опухолевых клетках в системах in vivo и in vitro. Впервые оценена апоптоз -индуцирующая активность вакцинных штаммов вирусов при экспериментальном онкогенезе. На экспериментальных моделях опухолевого роста выявлена степень изменения функциональной активности иммунокомпетентных клеток (спленоцитов, тимоцитов) при терапии вирусными вакцинами и их онколизатами. Впервые показано, что комплексное применение вакцинных штаммов вирусов с цитостатиками приводит к более выраженному угнетению роста и метастазирования злокачественных опухолей. Впервые оценена цитодеструктивная, противоопухолевая и антиметастатическая активность онколизатов вирусных вакцин оспы, паротита, венесуэльского энцефаломиелита.

Теоретическая и практическая значимость.

На основании полученных результатов определена значимость различных звеньев системы иммунитета в реализации противоопухолевого действия вирусных вакцин. Скрининг цитодеструктивной, иммуномодулируюшей и противоопухолевой активности вакцинных штаммов вирусов позволяет скорректировать подходы к их практическому применению. Результаты проведенных экспериментальных исследований свидетельствуют о возможности применения вирусных вакцин в качестве биотерапевтических агентов в комплексной терапии онкологических заболеваний.

Апробация работы.

Основные положения работы доложены и обсуждены на 1-й международной юбилейной конференции, посвященной 110-летию проф. К. Н. Виноградова (Томск, Россия 2-S апреля, 2001); на 9-й, 10-й международных конференциях «СПИД, рак и родственные проблемы» (Санкт -Петербург, 2001, 2002); 4-й конференции молодых ученых (Новосибирск, 2002); конкурсах молодых ученых (НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН, 2000-2003 гг); 5-й конференции молодых ученых СО РАМН "Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины" (Новосибирск 2004); Российской научно-практической конференции "Отечественные противоопухолевые препараты" (Москва, 2004). Результаты исследования опубликованы в 20 печатных работах, отражающих основные положения диссертации.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 141 страницах и иллюстрирована 25 таблицами и 10 рисунками. Библиография включает 153 литературных источника (43 отечественных и 110 зарубежных).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Работа выполнена на 690 мышах линий BALB/c, C57B1/6 и DBA/2 массой 20-22 г разведения питомника научно-исследовательской лаборатории экспериментальных биомоделей ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН. В качестве опухолевых моделей использовали штаммы перевиваемых солидных, метастазирующих в легкие опухолей (пигментный вариант меланома В16 и карцинома легких Льюис), полученные из банка опухолевых штаммов РОНЦ (Москва). Доза перевивки опухолей составила 1-2х106 клеток/мышь подкожно или внутримышечно. Клетки мастоцитомы Р-815 и эритромиелолейкоза К-562 использовали в качестве мишеней для постановки цитотоксического и мембранотоксического тестов in vitro, аденокарциномы Эрлиха (асцитный вариант) и эритромиелолейкоза K-562 - для постановки цитологических тестов и количественной оценки апоптоза, индуцируемого вирусами.

В работе использовали вакцинные штаммы вирусов: паротита - вакцина паротитная культуральная, живая, сухая, производства ФГУП «НПО Макроген», Московское подразделение по производству бактерийных препаратов; осповакцины - вакцина живая, сухая, производства НПО «Вирион», Томск.; венесуэльского энцефаломиелита - аттенуированный штамм 2621 вируса венесуэльского энцефаломиелита (ВЭЛ), получен в Томском НИИВС, прошел контроль как вакцинный препарат в ГИСК им. А. Тарасевича (Москва). Нативная вируссодержащая суспензия, содержащая 1 п.д. (104-105ЕД вируса) в объеме 0,5 мл вводилась мышам однократно, подкожно на 3 сутки после имплантации опухолей.

Онколизаты получали по методу F.Austin (1979): опухолевые клетки инфицировали вирусом в концентрации 104-105 ЕДзо/Ю6 клеток и инкубировали 24 часа при 37°С. Затем клетки облучали дозой 20 Гр (у-облучатель "Рокус", Россия). Инактивацию пролиферативной активности онколизата оценивали по отсутствию включения ЗН-уридина. Полученные онколизаты вводили мышам подкожно, однократно, из расчета 1x106 клеток исходной опухолевой суспензии. В качестве контроля использовали суспензии, содержащие адекватное количество облученных нативных опухолевых клеток.

В качестве цитостатиков применяли: циклофосфан, который вводился животным внугрибрюшинно 3-кратно (суммарная доза 180 - 200 мг/кг) и винбластин, который, вводился по аналогичной схеме в дозе 0,007 мг/ мышь 3-кратно (суммарная доза 0,021 мг/ мышь).

Приготовление мазков и подсчет цитологических показателей в системе in vivo. На 7-21 сутки эксперимента опухоль извлекали (аденокарциному Эрлиха - на 7, 14, 21 сутки; карциному Льюиса - на 10, 20сутки), измельчали, клетки ресуспендировали и готовили мазки по стандартной методике (Гольдберг Е.Д. с соавт., 1992). Проведены следующие цитологические исследования: митотической активности - подсчет на 100 клеток количества делящихся;

патологий ядра в интерфазе - подсчет на 100 клеток количества многоядерных, двуядерных и содержащих микроядра клеток; вакуолизации - подсчет на 100 клеток количества вакуолизированных.

Приготовление мазков и подсчет цитологических показателей в системе in vitro. На 10-14 сутки после перевивки опухоли животных умерщвляли методом цервикальной дислокации, опухоль извлекали, ресуспендировали. Клетки в концентрации 3 X 10s/ мл помещали в пробирки с питательной средой. Опытные образцы инфицировали вирусами ВЭЛ, гриппа, паротита, оспы в количестве 10* E/VIO6 клеток. В качестве контроля использовали суспензию исходных клеток. Инкубацию проводили в течении 24 - 48 часов при 37°С. Мазки готовили по стандартной методике Исследовали патологию ядра, цитоплазмы и клеточного цикла. Количественное определение апоптоза в опухолевых клетках. Индукцию апоптоза в

опухолевых клетках регистрировали методом С. Н. Орлова (1996) по анализу фрагментации ДНК. Клеточную взвесь из расчета 106 клеток / мл ростовой среды помещали в планшеты, пробирки или флаконы. Каждую пробу метили ЗН-тимидином (1 мкК в 50 мкл). Через 48 часов инкубации снимали первый контроль (2-3 пробы без добавления индукторов апоптоза). В оставшиеся пробы добавляли индукторы апоптоза (вакцины: по 1 п. д), Инкубировали опытные пробы 3, б, или 24 часа. Измерение радиактивности проводили на жидкостном сцинтилляционном счетчике "Mark 3". Анализ фрагментации хроматина проводили по формуле: 1,5 х( Alt — А10У (А2 + Alt — - число импульсов в надосадке, А2 - число импульсов в осадке, А10 -контроль до индукции апоптоза.

Определение индекса ингибирования метастазирования. Метастазирование в легкие

учитывали на 10-20 сутки после перевивки опухолей по стандартной методике, подсчетом под световым микроскопом количества метастатических колоний. Степень метастазирования характеризовал индекс ингибирования метастазирования, вычисляемый по формуле: НИМ =

где: и А - частота метастазирования в легкие у мышей контрольной и опытной групп, и В - среднее число метастазов легких в легких мышей контрольной и опытной групп.

Определение коэффициента торможения роста опухоли. Динамику роста опухоли оценивали по изменению объема, который вычисляли по формуле Шрека: Vcp=Jl/6 » (а * в * с), где а, в, с -три взаимно перпендикулярных замера, процент торможения роста опухоли по формуле: Кр = VK-Vo/Vk * 100%, где: Кр - коэффициент торможения роста опухоли, VK - средний объем опухоли у животных контрольной группы, Vo - средний объем опухоли у животных опытной группы.

Мембранотоксическую активность клеток-эффекторов (тимоциты, спленоциты) определяли по методу Рыковой М. П. (1981) по выходу радиоактивной метки из клеток-мишеней, которые предварительно обрабатывали ЗН-уридином в концентрации 3-5 мкКю/2х106 клеток. В качестве

эффекторов использовали неприлипающие фракции клеток тимуса, селезенки. Тест ставили в 96-луночных плейтах. Измерение радиоактивности проводили на счетчике Магск-3. Индекс мембранотоксичности вычисляли по формуле: ИМТ = (I - О/К) х 100%, где О - число импульсов в опытных лунках, К - число импульсов в лунках только с клетками - мишенями

Цитостатическую активность иммунокомпетентных клеток определяли по методике Gadiot et al. (1982) в модификации И. В. Богдашина (1986). В качестве мишеней использовали клетки мастоцитомы Р-815; в качестве эффекторов - неприлипающие фракции клеток тимуса, селезенки. Свежевыделенные клетки-мишени инкубировали совместно с клетками-

эффекторами в 96-луночных плейтах в течение 4 часов при 37 °С в атмосфере 5% СОг- Затем в каждую лунку добавляли по 1 мкКи ЗН-тимидина и клетки инкубировали дополнительно 18 часов, после чего проводили измерение радиоактивности на счетчике Marck-З. Индекс цитостатической активности вычислялся по формуле: где О - число

импульсов в опытных лунках, К - число импульсов в лунках только с клетками - мишенями.

Статистическую обработку результатов проводили на персональном компьютере с использованием пакета прикладных программ STATISTICA 5.0. Проверку статистической значимости различий между группами проводили с помощью непараметрического критерия Вилкоксона - Манна Уитни. Для каждого анализируемого показателя вычисляли среднее (X), ошибку среднего (m). Статистически значимыми считались различия при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Цитоморфологические нарушения, индуцированные вакцинными штаммами вирусов и их онколизатами в опухолевых клетках in vivo.

В результате проведенных исследований было показано увеличение количества клеток карциномы легких Льюис с патологией ядра и цитоплазмы, индуцируемое вирусными вакцинами во все сроки эксперимента. При этом, на ранних стадиях опухолевого процесса изменения имели более выраженный характер. Так, на 10 сутки после введения вируса происходит достоверное увеличение количества многоядерных клеток в опухолях мышей всех опытных групп. Максимально этот эффект выражен при терапии опухолей вакцинными штаммами вирусов оспы и венесуэльского энцефаломиелита (0,73 % клеток - контроль, 2,4 % - опыт). Все использованные в эксперименте вирусы вызывали значительное увеличение количества двуядерных клеток (9,3 % - LLC; 21,3 % - вирус ВЭЛ; 17,3 % - вирус оспы; 15,1 % - вирус паротита), высокую степень вакуолизации клеток (12,4 % - LLC; 29,1 % - вирус паротита; 27,6% - вирус венесуэльского энцефаломиелита; 21,3 % - вирус оспы). В результате наших исследований отмечено увеличение количества клеток с микроядрами в опухолях животных, получивших вакцину вируса паротита (1,76 % - контроль, 3,7 % - опыт). Снижение митотической активности

опухолевых клеток вызывали все изученные вакцинные штаммы (22,3 % - контроль; 1,5 % вирус оспы; 1,3 % - вирус паротита; 1% - вирус венесуэльского энцефаломиелита), что свидетельствует о влиянии на клеточный цикл. Показано, что вирусы паротита и осповакцины вызывали увеличение числа гигантских клеток (с 1,16 % до 2,3 %). В более поздние сроки эксперимента, (20 сутки), когда происходит генерализация опухолевого процесса, достоверное увеличение показателей патологии клетки наблюдается реже.

Таблица 1

Цитоморфологические изменения клеток карциномы легких Льюис, индуцированные онколизатом вируса паротита in vivo (X ± m)

Цитологические показатели, клетки % Группы наблюдений

LLC LLC+ вирус паротита Опухолевый контроль LLC+ онколизат вируса паротита

10 сутки

Двуядерные 2Д±0,14 15,3± 0,7* ** *** 9,99±0,54* 6,7±0,94

Многоядерные 0,3±0,014 5,3± 0,02* 3,3±0,47 5,2±0,68*

Микроядра-содержащие 0,33±0,01 13,3* 0,08* ** *** 3,7 ±0,31* 2,23±0,27

С вакуолизацией цитоплазмы 3,3±0,013 29,6± U3*** 24,2±1,78* 15,7±1,36*

С вакуолизацией ядра 0,73±0,03 11±0,7* 8,5±1Д5* 10Д±0,95*

С вакуолизацией ядра и цитоплазмы 0,3±0,01 9,24±0,45* 7,3±0,83* 7,03±1,34*

Митозы 14±1,57 1,3±0,09 * 4,4±0,16* 1,9±0,02*

Примечания: различия достоверны с группой: * - «LLC»; ** - «LLC + онколизат вируса паротита»; *** - «опухолевого контроля» (р<0,05).

Аналогичные цитоморфологические нарушения вызываемые вирусными вакцинами наблюдались и в клетках асцитной карциномы Эрлиха. Так, было показано увеличение количества многоядерных и двуядерных клеток, увеличение количества клеток с микроядрами, с вакуольной деградацией цитоплазмы, а также снижение митотической активности опухолевых клеток Наиболее достоверные изменения данных показателей вызывали вирусы венесуэльского энцефаломиелита и паротита.

При исследовании цитодеструктивной способности вируса паротита и его онколизата, нами было показано увеличение количества многоядерных, двуядерных клеток, а также клеток с вакуолизацией цитоплазмы и ядра, снижение митотической активности опухолевых клеток (табл. 1). Однако, вирус паротита оказывает более выраженное цитодеструктивное действие, нежели его

онколизат или лизат нативных клеток. Объясняется этот феномен, мы полагаем, тем, что онколизаты, в отличие от вирусов, видимо, вызывают особую форму деструкции клеток -иммунный цитолиз, который приводит к очень быстрой их элиминации, поэтому процент клеток с цитодеструктивными нарушениями ниже в группах животных, леченных онколизатами, чем в группах, получивших вирус.

Нами было проведено исследование влияния вирусных вакцин и циклофосфана на индукцию патологических изменений клеток карциномы легких Льюис. Показано, что при монотерапии животных цитостатиком не наблюдается выраженной цитодеструкции, что может свидетельствовать о гибели опухолевых клеток посредством некроза, который является конечным этапом действия циклофосфана, как алкилирующего агента. Цитопатический эффект от применения схемы "вирус + цитостатик" аналогичен соответствующему при монотерапии животных вирусными вакцинами, поэтому можно полагать, что этот эффект в данном случае обеспечивается именно вирусом. Под действием всех изученных препаратов наблюдается, в равной степени, увеличение количества гибнущих клеток, а также, одновременно, снижается количество делящихся. При исследовании в динамике влияния вируса венесуэльского энцефаломиелита и винбластина на индукцию патологических изменений опухолевых клеток наблюдается картина, аналогичная полученной при использовании схемы «вирус+ циклофосфан».

Влияние вирусных вакцин на уровень апоптоза опухолевых клеток in vitro.

При изучении апоптозиндуцирующего действия вирусных вакцин (табл.2) на модели клеток эритромиелолейкоза человека (К-562) показано, что вирус паротита увеличивает количество апоптотически гибнущих клеток в ранние сроки инкубации (3-6 часов) на 14-15%, а вирус венесуэльского энцефаломиелита - в более поздние сроки (24 часа) - на 20 %. При воздействии вируса оспы, мы наблюдали лишь тенденцию к увеличению данного показателя.

Таблица 2

Влияние вакцинных штаммов вирусов на апоптотическую гибель клеток зритромиелолейкоза человека (К - 562) в системе in vitro

Время Группы наблюдения

инкубации (час) К-562 К-562 +вирус К-562 + вирус К-562 + вирус

ВЭЛ оспы паротита

% апоптотических клеток

3 15,77 ±3,26 17,165 ±6,16 21,28 ±3,5 30,85 ±4,15*

6 17,1 ±6,5 16,2 ±1,8 20,05 ±2,75 31,1 ±3,18*

24 10,5 ±2,4 30,3 ± 5,8* - 12,4 ±2,9

Примечание: * - различия достоверны с группой «К-562» (р<0,05)

Однако, при изучении апоптозиндуцирующего действия вирусов на клетки аденокарциномы Эрлиха (табл.3) показано, что вирус оспы увеличивает данный показатель на 17 -19 %, а вирус венесуэльского энцефаломиелита, наоборот, вызывает достоверное снижение (приблизительно, в 2,5 раза) количества апоптотических клеток. Возможно, противоопухолевые свойства вируса ВЭЛ обусловлены в большей степени литическим, чем апоптозиндуцирующим действием, что подтверждается нашими цитоморфологическими исследованиями, показавшими, что вирус ВЭЛ обладает более высоким цитодеструктивным потенциалом, в сравнении с другими изученными агентами. Возможно, также, что отсутствие эффекта объясняется типом и индивидуальной чувствительностью данной опухоли к применяемым терапевтическим агентам, поскольку на модели клеток К-562 наблюдалась индукция апоптоза под действием этого вируса.

Таблица 3

Влияние вакцинных штаммов вирусов на индукцию апоптоза в клетках асцитной карциномы

Эрлиха в системе in vitro

Время инкубации (час) Группы наблюдения

АКЭ АКЭ + вирус ВЭЛ АКЭ + вирус оспы АКЭ + вирус паротита

% апоптотических клеток

3 18,78 ± 4,4 6,51± 1,5* 36,1 ±7,6* Н.д.

6 26,73 ± 4,9 19,6 ±7,3 45,7 ±7,3* Н.д

24 35,22 ± 7,73 13,25 ± 1,25* 46,7 ± 2,6 Н.д.

Примечания: АКЭ - асцитная карцинома Эрлиха; * - различия достоверны с группой «АКЭ» (р<0,05).

Действие вакцинных штаммов вирусов на рост экспериментальных опухолей.

Исследование динамики роста экспериментальных опухолей показало значительное торможение роста карциномы легких Льюис под действием вирусных вакцин и их онколизатов. При этом, онколизаты вирусов ингибируют рост первичных опухолей более интенсивно, чем исходные вирусы, причем, индекс торможения роста опухоли составляет для них 60-63% (на 1014 сутки эксперимента), оставаясь достаточно высоким (42-49%) и на более поздних сроках онкогенеза. При применении вирусных вакцин изученный показатель достигает максимальных значений на ранних стадиях опухолевого процесса (36-47%), а в более поздние снижается до 21 -26 %.

При исследовании динамики опухолевого роста на модели меланомы В16 выявлены аналогичные закономерности - ингибирование первичного опухолевого узла под действием вакцин и их онколизатов. Онколизаты вирусов более активно, чем вакцины, ингибируют рост меланомы В16 и эта тенденция сохраняется на протяжении всего срока наблюдения, в то время, как в группах животных, получивших вирусные вакцины, отмечается прогрессия опухолевого

роста. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о способности онколизатов вирусных вакцин более интенсивно, чем сами вакцины, подавлять рост первичных опухолей, что связано, по-видимому, с их более высокими иммуногенными потенциями.

При терапии карциномы легких Льюис вирусными вакцинами на фоне введения цитостатика, индекс торможения роста опухоли максимален и составляет до 73 % на ранних сроках онкогенеза (10 -14 сутки), снижаясь к 20 суткам до 40 %. В группах животных, получивших монотерапию вакцинами или ЦФ, изученный показатель значительно ниже: на ранних сроках опухолевого процесса он не превышает 60% в группах животных, получивших ЦФ, и 47% - в группах, леченных вирусами. На более поздних стадиях онкогенеза этот показатель снижается до 22 - 26%.

Изучение антиметастатических свойств вакцинных штаммов вирусов .

При исследовании антиметастатической активности исследуемых вирусных вакцин показано, что они подавляют метастазированис карциномы легких Льюис интенсивней, чем их онколизаты, причем, на всех стадиях опухолевого процесса (табл.4).

Таблица 4

Влияние вирусных вакцин и их онколизатов на метастазирование карциномы лёгких Льюис

Группы наблюдений Сутки Частота метастази-рования % Среднее число метастазов Индекс ингибирования метастазирования (ИИМ %)

LLC 10 100(16/16) 11,3 ± 2,6 -

20 100(50/50) 29,5 ± 3,4 -

LLC + вирус паротита 10 73(11/8) 3,6 ± 0,34* 70,16 ±6,7

20 96(29/28) 11,4 ±2,7* 66,9 ±3,3

LLC + вирус оспы 10 100 (4/4) 7,33 ± 1,2* 57,7 ± 3,9

20 100(21/21) 16,9 ±4,4* 59,5 ± 5,5

LLC + вирус ВЭЛ 10 70(10/7) 3,5 ±0,58* 72,9 ±7,08

20 79(14/11) 13,9 ±3,9* 78,3 ± 4

Опухолевый контроль 10 63 (8/5) 5,12 ±2,3* 70,5 ± 8,5

20 100(10/10) 37,5 ±4,6 17 ±4,1

LLC + онколизат оспы 10 75(4/3) 11,3 ±2,9* 46 ±6,2

20 100 (5/5) 32 ± 3,5 26 ±2,8

LLC +онколизат паротита 10 25(4/1) 0,25 ±0,08* 89 ±3,12

20 100 (8/8) 15 ± 1,9 34,7 ± 1,5

LLC + онколизат ВЭЛ 20 75 (4/3) 3,25 ± 1,1* 77,6 ±5,4

Примечания: *- различия достоверны с группой «LLC» (р<0,05); в скобках: числитель - общее количество животных в группе; знаменатель - количество животных с метастазами в легких.

Так, индекс ингибирования метастазирования карциномы легких Льюис при применении вирусных вакцин составляет 58-72% на ранних этапах развития опухоли, оставаясь в тех же пределах и в более поздние сроки эксперимента. Антиметастатическая активность онколизатов вирусов высока лишь на 10 сутки онкогенеза (ИИМ составляет до 89%, снижаясь к 20 суткам наблюдения до 17-34%). Исключение составляет группа мышей, получивших онколизат вируса ВЭЛ (ИИМ и на поздних стадиях онкогенеза достаточно высок - 77%).

При терапии меланомы В16 также отмечен более высокий антиметастатический потенциал вакцинных штаммов вирусов, в сравнении с онколизатами. Так, при применении вакцин индекс ингибирования метастазирования достигает 79%. У онколизатов вирусов эти показатели варьируют от 33 до 58 %. При этом, как и на модели карциномы Льюис, исключение составляет онколизат вируса ВЭЛ (ИИМ 97%).

Показано, что при сочетанном применении вирусов оспы, паротита с циклофосфаном происходит более активное подавление метастазирования, чем при монотерапии животных данными агентами Так при комплексной терапии карциномы легких Льюис вирусами оспы, паротита и цитостатиком ИИМ составил 83,5 % (табл,4). При монотерапии вакцинными штаммами вирусов максимальный антиметастатический эффект вызвал вирус ВЭЛ (78,3 %). В других подопытных группах ИИМ, в зависимости от исследуемого штамма, варьировал в пределах 57,7- 75,6%. Высокий антиметастатический потенциал схем «вирус + цитостатик» сопровождается способностью активно подавлять рост первичных опухолей.

Изучение иммуномодулирующей активности вирусных вакцин и их онколизатов на моделях экспериментальных опухолей.

Цитостатическая и мембранотоксическая активность иммунокомпетентных клеток (тимуса и селезенки) мышей оценивались нами на 10 и 20 сутки после перевивки опухолей.

Показано, что максимальное увеличение цитостатической активности спленоцитов мышей, леченых вирусными вакцинами и их онколизатами, происходит в ранние сроки (10 сутки) опухолевого процесса (рис.1). При этом, ИЦС в группах мышей, получивших вирусные вакцины, выше, чем у животных, получивших онколизаты и составляет от 73,2% до 82,5 %, в то время, как в группах, леченных онколизатами, ИЦС варьирует от 46% до 63%. Полученные данные согласуются с динамикой роста и метастазирования первичных опухолей (в указанные сроки мы наблюдали выраженное угнетение этих показателей), что может быть связано с высоким цитостатическим потенциалом спленоцитов в период формирования метастазов. К 20 суткам, вследствие прогрессирования первичной опухоли, ИЦС снижается у мышей во всех подопытных группах.

Установлено, что супернатанты спленоцитов проявляют более высокую, чем сами клетки, цитостатическую активность в отношении клеток-мишеней Причем, антипролиферативная активность супернатантов остается высокой и на поздних стадиях опухолевого роста (20 сутки) Так ИЦС для спленоцитов варьирует (в зависимости от применяемого агента) от 38 % до 48 %, для их супернатантов от 51% до 80 %

Рис 1 Влияние вакцинных штаммов вирусов и их онколизатов на цитостатическую активность спленоцитов мышей с карциномой легких Льюис

Нами была исследована роль тимоцитов в реализации антибластомного действия вирусных вакцин Аналогично спленоцитам, наблюдалась тенденция к увеличению цитостатической активности клеток тимуса в группах животных, инфицированных вирусами, в сравнении с интактными и опухоленосителями. При этом ИЦС супернатантов тимоцитов выше, чем соответствующий показатель, полученный при прямом контакте их с клетками-мишенями. Что касается индуцирующего влияния вирусных онколизатов на активность тимоцитов, отмечено, что оно менее значительно, чем при действии вирусных вакцин.

Показано увеличение мембранотоксической активности супернатантов спленоцитов, индуцированное вирусными вакцинами и их онколизатами во всех группах подопытных животных, причем, на 20 сутки онкогенеза эти изменения были более значительны, чем на ранних стадиях опухолевого процесса Так, на 10 сутки после перевивки опухолей ИМТ лимфоцитов селезенки составил от 29,5 % при применении вируса паротита, до 37,5 % при воздействии онколизата вируса оспы. На 20 сугки изученный показатель варьирует в группах подопытных животных от 28,7% до 43,3%

Исследование мембранотоксической активности тимоцитов мышей с карциномой легких Льюис, леченных вирусными вакцинами и их онколизатами (20 сутки), показало значительное увеличение ИМТ (до 47,6 %) в группе "LLC+ вирус оспы". При изучении влияния вирусных вакцин и их онколизатов на мембранотоксическую активность супернатантов тимоцитов показано, что на 20 сутки наблюдения в опытных группах, инфицированных вирусными вакцинами, ИМТ составил при действии вирусов: паротита - 29,5%, оспы- 39,4%, ВЭЛ - 47,3%. При этом, мембранотоксическую активность супернатантов тимоцитов онколизаты вирусных вакцин индуцируют значительно слабее, за исключением онколизата вируса паротита (ИМТ достаточно высок - 37,5 %).

Влияние вакцинных штаммов вирусов и цитостатика на функциональную активность иммунокомпетентных клеток мышей с карциномой легких Льюис,

При сочетанном применении вирусов и циклофосфана наблюдалось угнетение цитостатической активности лимфоцитов селезенки, как на 10, так и на 20 сутки эксперимента. Видимо, эффект усиления пролиферации опухолевых клеток может вызываться ростовыми факторами, продуцируемыми иммунокомпетентными клетками. Однако, супернатанты спленоцитов на 20 сутки наблюдения проявляют достаточно высокую цитостатическую активность по отношению к клеткам-мишеням, как в группах мышей, получивших монотерапию вирусными вакцинами, так и в группах, инфицированных вирусом на фоне введения циклофосфана. При этом, индекс цитостатической активности спленоцитов варьирует в обследованных группах от 50,8% до 68,1%. Поскольку, показатели цитостатической активности во всех опытных группах приблизительно равны, за исключением группы мышей, получивших монотерапию циклофосфаном, где изменения ИЦС не происходит, можно предположить, что увеличение исследуемого параметра обусловлено иммуномодулирующей активностью вирусов, но не цитостатика.

Исследование способности вирусных вакцин и ЦФ индуцировать мембранотоксическую активность лимфоцитов селезенки показало, что при применении схем «вирус + цитостатик» увеличения ИМТ как клеток- эффекторов, так и их супернатантов не наблюдается. Индукция мембранотоксической активности спленоцитов происходит лишь в опытных группах, получивших монотерапию вирусными вакцинами (ИМТ в этих группах составил 36-40,3%, в группе контроля -до 27%). Исходя из вышеизложенного, можно предположить, что циклофосфан, обладающий иммунодепрессивными свойствами влияют на мембранотоксическую активность спленоцитов.

Влияние вакцинных штаммов вирусов и их онколизатов на функциональную активность иммунокомпетентных клеток мышей с меланомой В16.

Показано, что значительное увеличение цитостатической активности спленоцитов наблюдается в группах подопытных мышей, получивших вирус оспы. Отмечено, что как и в опытах на модели

карциномы легких Льюис, супернатанты спленоцитов проявили более высокую цитостатическую активность, чем исходные клетки, причем, как на ранних, так и на поздних стадиях онкогенеза. Так, показатели ИЦС на 10 сутки наблюдения составили в группах: интактных животных - 44,4%; опухоленосителей - 58,4%; «В 16 + опухолевый контроль» - 69%, «В 16 + онколизат вируса паротита» - 78,3% (табл. 5).

Таблица 5

Влияние вирусных вакцин и их онколизатов на цитостатическую активность клеток тимуса и

селезенки (X ± m)

Подопытные группы животных

Клетки Интактны меланома В 16 В16 + паротит В16 + оспа В16 + О.К. В16 + О.П.

ИЦС%

Тимоциты (20 супси) 26,6±5,5 13,4±3,4* 61±7,4* ** 57,7±3,5* ** Н.д. Н.д.

Супернатант тимоцигов (10 сутки) 53,3±3,1 56,3±4,1 55,2±5,9 Н-д. 73,3* 8Д* ** 74,3±8Д* **

Супернатант тимоцигов (20 супси) 5б,3±2,8 43,5±2,5 73,7±9,9* ** 60,7±4,7* * 61±4,7** 66,3±7,1* **

Спленоциты (20 супси) 41,3±5,8 28,7±3,7* 32,3±4Д 47,8±б,5* * Н.д. Н.д.

Супернатант спленоцитов (10 сутки) 44,4*5,5 58,4±1,9* 7б,4±4,4* ** Н.д. 69±6,7* ** 78,3±5,3» **

Супернатант спленоцитов (20 сутки) 45,6±2,9 57,9±3,6* 78,8±3,3* *» 67,7±5,3* ** 72,4± 6,5* ** 63,7±6,9*

Примечания: различия достоверны с группой: * - «интактные»,** - «В 16» (р<0,05)

Исследование воздействия вирусных вакцин и их онколизатов на цитостатическую активность тимоцитов животных показало значительное увеличение цитостатического индекса клеток-эффекторов под действием вирусов паротита и оспы (61% и 57,7%, соответственно). Цитостатическая активность супернатантов тимоцитов леченных животных достаточно высока, в сравнении с аналогичным показателем в группах интактных животных и опухоленосителей, во все сроки опухолевого процесса, и превышает действие исходных клеток.

Показано значительное увеличение мембранотоксической активности (на 20 сутки эксперимента) спленоцитов в группах мышей, леченных вирусными вакцинами оспы - 37,6%, венесуэльского энцефаломиелита - 37,4%. Супернатанты спленоцитов, индуцированных вирусными вакцинами и их онколизатами, проявляют еще более высокую мембранотоксическую активность в отношении клеток - мишеней как на 10, так и на 20 сутки онкогенеза.

Изучение мембранотоксической активности тимоцитов показало, что на ранних сроках развития опухолей (10 сутки) только супернатант онколизата вируса паротита проявил достаточно высокую иммуномодулируюоую активность в отношении изученных клеток (ИМТ составил 39,3%). В более поздние сроки наблюдения (20 сутки) установлено увеличение показателей ИМТ клеток-эффекторов в группах животных, леченных вирусами оспы и паротита (47% и 39,7%, соответственно). Достаточно высокую функциональную активность в отношении клеток-мишеней проявляют, одновременно, и супернатанты тимоцитов. При этом, наиболее значительно изменяют ИМТ тимоцитов вирусы паротита (22,2%) и оспы (29,3%), а также онколизат вируса паротита (34%).

Анализируя иммуномоделирующую активность вирусных вакцин и их онколизатов в сравнении, мы выяснили, что онколизаты по своей способности активировать клетки-эффекторы иммунной системы несколько уступают вирусам, проявляя, при этом, более выраженную способность подавлять рост первичных опухолей. Установлено, также, что супернатанты иммуннокомпетентных клеток более активны в отношении клеток-мишеней, чем исходные клетки.

Проведенные исследования позволили нам продемонстрировать широкий спектр иммунобиологической активности вакцинных штаммов вирусов, включая их цитодеструктивное и апоптоз-индуцирующее действие на опухолевые клетки, способность стимулировать противоопухолевую активность эффекторов иммунной системы организма-опухоленосителя, высокий противоопухолевый и антиметастатический потенциал, что позволяет рассматривать вирусные вакцины как перспективное адъювантное средство в комплексной терапии злокачественных опухолей.

ВЫВОДЫ

1. Антибластомный эффект вакцинных штаммов вирусов на ранних стадиях опухолевого процесса реализуется посредством прямого литического действия на клетки перевиваемых опухолей, индуцируя в них увеличение количества многоядерных, двуядерных, с микроядрами и вакуолизированной цитоплазмой (2,4%; 15,1-21,3%; 3,7%; 21,3-29,1%, соответственно). При этом, вакцинные штаммы вирусов оспы, паротита, ВЭЛ вызывали снижение митотической активности опухолевых клеток (до 1,5%, 1,3% и 1,0%, соответственно, против 23% контроля).

2. Вакцинный штамм вируса паротита в ранние сроки инкубации на 14-15% увеличивает количество апоптотических клеток эритромиелолейкоза человека К-562, вирус венесуэльского энцефаломиелита - на 20% в более поздние. Апоптоз-индуцирующие потенции вируса осповакцины показаны на модели клеток асцитного варианта аденокарциномы Эрлиха (увеличение количества апоптотических клеток на 17-19%).

3. Вакцинные штаммы вирусов подавляют развитие метастазов более активно (ИИМ составляет до 75%), чем их онколизаты (ИИМ - до 21-26%) замедляющие, преимущественно, рост первичных опухолей (ТРО на 10 сутки - 60- 63%, 20 сутки - 42 - 49%; ТРО вирусами - 36 -47%, 21 -26% в соответствующие сроки).

4. Применение вирусов оспы и паротита на фоне терапии циклофосфаном вызывает более эффективное торможение роста (73%) и метастазирования (83,5%) экспериментальных опухолей, чем монотерапия вирусными вакцинами (до 47%, 58%-76%, соответственно).

5. Вакцинные штаммы вирусов оспы и паротита в большей степени, чем их онколизаты, модулируют функциональную активность (цитостатическую и мембранотоксическую) лимфоцитов селезенки и тимуса.

6. Супернатанты тимоцитов и спленоцитов, содержащие цитокины и биологически активные вещества, проявляют более выраженную, чем исходные лимфоциты, функциональную активность в отношении клеток экспериментальных опухолей.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Видяева И.Г. Влияние вакцинных штаммов вирусов на цитогенетические характеристики аденокарциномы Эрлиха / И.Г Видяева., Л.Н. Уразова // 4-я ежегодная Российская онкологическая конференция: 21 - 23 ноября, 2000 г. - Сб. науч. работ. - М., 2000. - С.81.

2. Видяева И.Г. Влияние вирусных вакцин на цитоморфологию клеток перевиваемых опухолей в эксперименте in vivo/ И.Г. Видяева., Л.Н. Уразова. // Акт. вопросы онкологии. -Кызыл, 2001. -С. 58 -60.

3. Уразова Л.Н. Механизмы противоопухолевого действия вирусных вакцин / Л.Н. Уразова., Т.И. Кузнецова., И.Г. Видяева // Акт. вопросы онкологии. - Кызыл, 2001. - С. 58 - 60.

4. Видяева И.Г. Влияние вирусных вакцин на цитоморфологию клеток карциномы Льюиса/ И.Г. Видяева., Л.Н. Уразова //Акт. проблемы инфектологии и паразитологии. Мат-лы 1-ой межд. юбилейной конф. посвященной 110-летию проф. К.Н. Виноградова: 2-5 апреля, -Томск 2001. - С. 77.

5. Уразова Л.Н. К вопросу о механизмах противоопухолевого действия вирусных вакцин / Л.Н. Уразова., Т.М. Кузнецова., И.Г. Видяева // Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы, материалы 9-ой международной конференции «СПИД, рак и родственные проблемы» 24 мая - 1 июня, 2001 г., Санкт-Петербург. - С. - 32.

6. Свистунова Ю.В. Влияние вирусных вакцин на цитоморфологию клеток перевиваемых опухолей в эксперименте / Ю.В. Свистунова., И.Г. Видяева // Сб. статей по результатам 60-ой юбилейной студенческой научной конференции им. Н. И. Пирогова 23 - 25 апреля 2001 г., Томск. - С. 39.

7. Уразова. Л. Н. Вирусные вакцины в терапии злокачественных опухолей / Л.Н. Уразова., И.Г. Видяева., Т.И. Кузнецова //Актуальные вопросы клинической медицины (к 50-летию ЦМСЧ №81) Материалы научно-практической конференции 13-14 ноября 2001 г. ЗАТО Северск,-2001,-С. 144-145.

8. Уразова Л. Н. Цитогенетические изменения, индуцированные вирусными вакцинами в опухолевых клетках in vitro / Л.Н. Уразова., Е.Н. Рогозин., И.Г. Видяева., Т.И. Кузнецова //Сибирский онкологический журнал. - Томск. - 2002. - 1. - с. 62 - 64.

9. Уразова Л.Н. Влияние вирусных вакцин на цитоморфологию клеток перевиваемых опухолей в эксперименте / Л. Н. Уразова., И. Г. Видяева., Т.И. Кузнецова. //10-я Межд. конференция " СПИД, рак и родственные проблемы", 26 - 31 мая, 2002 г., Санкт - Петербург. //Русс, журнал ВИЧ / СПИД и родственные проблемы. - 2002. - Т. 6 , № 1. - С. 106 - 107.

10. Рогозин Е.А. Биотерапия экспериментальных опухолей вирусными вакцинами венесуэльского энцефаломиелита, паротита, гриппа и оценка эффективности с использованием цитологических показателей / Е.А. Рогозин., Л.Н. Уразова., И.Г. Видяева // Вопросы онкологии.- 2002. - Т.48, № 6. - С. 710-713.

11. Уразова Л.Н. Опыт применения вирусных вакцин в терапии экспериментальных опухолей / Л.Н. Уразова., И. Г. Видяева., Т. И. Кузнецова / / 6 - я ежегодная росс, онкологическая конфер.: 26 - 28 ноября, 2002 г. - Сб. науч. работ. - М., 2002. - С.

12. Уразова Л.Н. Противоопухолевое действие вирусных вакцин в эксперименте / Л.Н. Уразова., ИГ. Видяева., Т. И. Кузнецова // Бюлл. СО РАМН.- 2002.- N 4.- С. 107-110.

13. Видяева И.Г. / Изучение противоопухолевой активности онколизатов вирусных вакцин в эксперименте / И.Г. Видяева., Л.Н. Уразова., Т.И. Кузнецова // Новые диагностические и лечебные технологии в онкологии. Мат-лы Росс, научно - практической конференции НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН (11-12 сентября 2003г.). Томск - 2003. - С. 60 - 61.

14. Кузнецова Т.И. Роль макрофагов в реализации противоопухолевого действия вакцинных штаммов вирусов / Т.И. Кузнецова., Л.Н. Уразова., И.Г. Видяева // Новые диагностические и лечебные технологии в онкологии. Материалы Российской научно - практической конференции НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН (11-12 сентября 2003г.). Томск - 2003. - с. 127 -128.

15. Видяева И.Г. Противоопухолевая и апоптоз- индуцирующая активность вирусных вакцин в эксперименте / И.Г. Видяева., Л.Н. Уразова. // Акт. вопросы клин, и эксперим. онкологии. Мат-лы 4 -й Всероссийской конференции молодых ученых (10 - 12 сентября 2003 г.). Москва - 2003. - С. 33 - 34.

16. Уразова Л.Н. Влияние вакцинных штаммов вирусов на послеоперационное метастазирование опухолей в эксперименте / Л. Н. Уразова., А.Ю. Громова., Т.И. Кузнецова., И.Г. Видяева //7-я ежегодная российская онкологическая конференция: 25 - 27 ноября, 2003 г. - Сб. науч. работ. - М., 2003. - С. 253 - 254.

17. Уразова Л.Н. Опыт применения вирусных вакцин в терапии экспериментальных злокачественных опухолей / Л.Н. Уразова., Т.И. Кузнецова., И.Г. Видяева // Росс. Биотер. журнал. Мат-лы Всероссийской научно-практической конф.: Москва, 17-19 марта2004г. -2. - С.9-10.

18. Уразова Л.Н. Влияние вирусных вакцин на развитие послеоперационного метастазирования экспериментальных опухолей / Л. Н. Уразова., Т. И. Кузнецова., И. Г. Видяева // Бюлл. СО РАМН.- 2004.- N 1.- С. 56 - 60.

19. Видяева И.Г. Экспериментальное изучение противоопухолевой активности онколизатов вирусных вакцин / И.Г. Видяева // Материалы 5 молодежной научной конференции СО РАМН: Новосибирск, 28 - 29 июня 2004 г., С. 44.

20. Кузнецова Т.И. Антибластомное действие вирусных вакцин на фоне цитостатической терапии в эксперименте / Т.И. Кузнецова., Л. Н. Уразова., И. Г Видяева // Совр. состояние и перспективы развития экспер. и клин, онкологии. Мат - лы Росс, научно - практической конференции, посвященной 25-летию НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН (24-25 июня 2004 г). -Томск.,-2004.- Часть И. - С. 74-75.

Типография «Иван Фёдоров» 634009 г.Томск, Октябрьский взвоз, 1, т.: (382-2) 51-24-20 Тираж 100 экз. Заказ № 136.

¡I

' г п

L

{

< 1815

12 КАР 2C05J ' ;

Актуальность. Сегодня прогресс в лечении онкологических заболеваний связан с существенным прорывом в молекулярной биологии, иммунологии, понимании причин возникновения опухолевой клетки и закономерностей опухолевого процесса. Как известно, в организме существует целый ряд механизмов, позволяющих противостоять появлению и развитию опухоли. Это антиоксидантная и репаративная системы, блокирующие появление опухолевых клеток, а также иммунная система, работа которой направлена, в том числе, и на элиминацию клеток, несущих признаки отличия от нормальных тканей человека (Кузнецов В. П., 2000; Коростелев С. А.,2003).

Достигнут, также, колоссальный прогресс в клинической онкологии. Хирургическое лечение больных злокачественными опухолями изменилось, коренным образом, с появлением новых подходов (комбинированного и комплексного лечения), которые позволили выполнять менее травматичные органосохраняющие операции. Значительный прогресс достигнут в лекарственной терапии злокачественных опухолей. Химио-, гормоно- и лазерная терапия стали за это время неотъемлемыми компонентами комплексного лечения многих злокачественных новообразований (Хансон К. П., Афанасьев Б. В и др., 1996). Тем не менее, высокая резистентность опухолей к стандартным методам терапии вдохновляет исследователей на поиск новых, оригинальных стратегий лечения рака, одной из которых является биотерапия. Под этим термином понимается группа высокотехнологичных методов лечения опухолей, основой которых служит воздействие на естественные защитные реакции больного, или введение в организм естественных полимерных молекул (факторов роста, антител, генов, цнтокинов и так далее). Вакцинотерапия, как один из методов биотерапии, основана на использовании антигена или их комплекса в сочетании с адъювантами, или без них, для модуляции иммунного ответа. Это активная специфическая иммунотерапия, в основе которой лежит стимуляция иммунного ответа пациента на собственную опухоль. Большинство подходов к созданию противоопухолевых вакцин направлено на достижение таких лечебных эффектов, как: предотвращение рецидивирования и метастазирования новообразований после их хирургического удаления или химиолучевого "воздействия, восстановление функций иммунокомпетентных клеток, снятие явления депрессии кроветворения, улучшение качества и продолжительности жизни больного ( Кузнецов В. П., 2000). Частным случаем вакцинотерапии является вирусный онколиз. Вирусы являются естественными природными иммуномодуляторами, имеющими рецепторные структуры для взаимодействия как с иммунными, так и с другими, в частности, опухолевыми, клетками, и обладающие, при этом, повышенной чувствительностью к последним (Фердат А.К., Муцениеце А. Я., 1988). Существует несколько потенциальных механизмов разрушения опухолевых клеток онколитическими вирусами (Kirn D., 1996). В первую очередь -непосредственное прямое литическое действие, возникающее в результате репликации вирусов в малигнизированных клетках. Следующий механизм -онколитический, то есть, в течение репликационного цикла вирусы индуцируют синтез белков, которые обладают цитотоксическими свойствами в отношении опухолевых клеток (Tollefson A., Ryerse J., Scaria A.et al., 1996; Shtrichman R, Kleinberger Т., 1998). Третий механизм разрушения опухолевых клеток онколитическими вирусами - посреднический, через индукцию неспецифического и специфического противоопухолевого иммунитета.

В настоящее время проводятся исследования онколитических свойств адено- и реовирусов, вирусов вакцинных штаммов, болезни Ныокасла и других. Проводится исследование антибластомных свойств лизатов опухолевых клеток, инфицированных вирусами, которые, в качестве активной специфической иммунотерапии, используются сейчас для лечения пациентов с меланомой и раком яичников. Лизаты вирусинфицированных опухолевых клеток человека вызывают гуморальный иммунный ответ против опухоле- и вирус - ассоциированных антигенов (Savage Н., Rossen R., Hersh Е. et al., 1986), что, за счет усиления иммунных реакций, улучшает результаты хирургического лечения пациентов с меланомой (Wallack М., Sivanandham М, Balch С. et al., 1998). Онколитические вирусы могут увеличивать чувствительность опухолевых клеток к химио- и лучевой терапии (John Т. Mullen, Kenneth К. Tanabe., 2002). С другой стороны, вирусы могут размножаться в опухолевых клетках, сохранивших функцию р53, индуцируя их апоптотическую гибель. В настоящее время проводятся исследования, направленные на понимание механизмов этого явления и создание вирусных штаммов с максимально выраженной способностью индуцировать апоптоз в опухолевых клетках (John Т. Mullen, Kenneth К. Tanabe., 2002). Созданы препараты на основе мутантных вариантов аденовируса человека, способных избирательно размножаться на р53-дефицитных раковых клетках, вызывая их разрушение (Сергеев А.Н. с соавт., 2003; Шишкина JI. Н. с соавт., 2002). Тем не менее, в литературе не освещен вопрос использования вакцинных штаммов вирусов в качестве терапевтических агентов в лечении рака. Между тем, вирусные вакцины имеют огромное преимущество перед «дикими» вариантами эпидемиологическую безопасность, поскольку в процессе их получения происходит инактивация гена, ответственного за образование фактора вирулентности. Наряду с генетически закрепленной утратой патогенных свойств, вакцинные штаммы в полной мере сохраняют присущие исходным способность к репликации и формированию активного иммунного ответа (Медушщин Н. В., 1999). При этом, вирусы обладают высокой тропностыо по отношению к клеткам опухолей разных локализаций. Этот феномен -достаточно давно установленный факт. В экспериментальных исследованиях доказано, что концентрация вирусных частиц в опухолевой ткани превышает тот же показатель в нормальных, и различия могут достигать до 104 ЕД/мл (Stojdl D., 2000; Chung R., 1999; Nakamura H. et. al., 2002; Li Y., 2001; Andreansky S., 1997). Кроме того, вирусы, являясь высокоиммуногенными агентами, способны индуцировать клеточное и гуморальное звенья иммунитета. Универсальность механизмов действия вирусных вакцин заключается в том, что с одной стороны они оказывают прямое цитопатическое действие на опухолевые клетки в процессе вирусной репликации, с другой - индуцируют противоопухолевое звено иммунитета. Руководствуясь выше изложенными фактами, мы сочли целесообразным исследовать вакцинные штаммы вирусов оспы, паротита, гриппа и ВЭЛ в качестве онколитических агентов и изучить особенности механизмов их противоопухолевого действия на моделях экспериментальных опухолей, а также особенности действия лизатов опухолевых клеток, инфицированных данными вакцинными вирусами.

Цель исследования. Оценка цитопатического и апоптоз-индуцирующего действия вакцинных штаммов вирусов и онколизатов оспы, паротита, гриппа и венесуэльского энцефаломиелита, исследование их способности индуцировать противоопухолевую активность эффекторов системы иммунитета.

Задачи:

1. Исследовать индуцируемую вакцинными штаммами вирусов и их онколизатами патологию ядра и цитоплазмы опухолевых клеток в системах in vivo и in vitro.

2. Изучить особенности индуцируемой вирусами апоптотической гибели опухолевых клеток.

3. Оценить противоопухолевую активность вакцинных штаммов вирусов на фоне терапии цитостатиками.

4. Изучить влияние вирусных вакцин и онколизатов на функциональную активность иммунокомпетентных клеток (спленоцитов, тимоцитов) животных-опухоленосителей при экспериментальном онкогенезе.

Положения, выносимые на защиту:

- Вакцинные штаммы вирусов и их онколизаты активно подавляют метастазирование и рост экспериментальных опухолей.

- Противоопухолевая и антиметастатическая активность вирусных вакцин и их онколизатов базируется как на прямом литическом воздействии на опухолевые клетки, так и на модуляции противоопухолевой активности клеток иммунной системы.

- Вакцинные штаммы вирусов проявляют апоптоз-индуцирующие свойства по отношению к опухолевым клеткам in vitro.

Цитостатическая терапия существенно повышает противоопухолевую и антиметастатическую активность вакцинных штаммов вирусов.

Научная новизна.

Впервые проведено развернутое исследование по изучению влияния вакцинных штаммов вирусов оспы, паротита, гриппа, венесуэльского энцефаломиелита на уровень цитологических нарушений в опухолевых клетках животных в системах in vivo и in vitro.

Впервые оценена апоптозиндуцирующая активность вакцинных штаммов вирусов при экспериментальном онкогенезе.

На экспериментальных моделях опухолевого роста выявлена степень изменения функциональной активности иммунокомпетентных клеток (спленоцитов, тимоцитов) при терапии вирусными вакцинами и их онколизатами.

Впервые показано, что комплексное применение вакцинных штаммов вирусов с цитостатиками приводит к более выраженному угнетению роста и метастазирования злокачественных опухолей.

Впервые оценена цнтодеструктивная, противоопухолевая и антиметастатическая активность онколизатов вирусных вакцин оспы, паротита, венесуэльского энцефаломиелита.

Теоретическая и практическая значимость.

На основании полученных результатов определена значимость различных звеньев системы иммунитета в реализации противоопухолевого действия вирусных вакцин. Скрининг цитодеструктивной, иммуномодулирующей и противоопухолевой активности вакцинных штаммов вирусов позволяет скорректировать подходы к их практическому применению. Результаты проведенных экспериментальных исследований свидетельствуют о возможности применения вирусных вакцин в качестве биотерапевтических агентов в комплексной терапии онкологических заболеваний.

Апробация работы.

Основные положения работы доложены и обсуждены на 1-й международной юбилейной конференции, посвященной 110-летию проф. К. Н. Виноградова (Томск, Россия 2-5 апреля, 2001); на 9-й, 10-й международных конференциях «СПИД, рак и родственные проблемы» (Санкт - Петербург, 2001, 2002); 4-й конференции молодых ученых (Новосибирск, 2002); конкурсах молодых ученых (НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН, 2000-2003 гг); 5-й конференции молодых ученых СО РАМН "Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины" (Новосибирск 2004); Российской научно-практической конференции "Отечественные противоопухолевые препараты" (Москва, 2004). Результаты исследования опубликованы в 20 печатных работах, отражающих основные положения диссертации.

ВЫВОДЫ

1. Антибластомный эффект вакцинных штаммов вирусов на ранних стадиях опухолевого процесса реализуется посредством прямого литического действия на клетки перевиваемых опухолей, индуцируя в них увеличение количества многоядерных, двуядерных, клеток с микроядрами и вакуолизированной цитоплазмой (2,4%; 15,1-21,3%; 3,7%; 21,3-29,1%, соответственно). При этом, вакцинные штаммы вирусов оспы, паротита, ВЭЛ вызывали снижение митотической активности опухолевых клеток (до 1,5%, 1,3% и 1,0%, соответственно, против 23% контроля).

2. Вакцинный штамм вируса паротита в ранние сроки инкубации на 1415% увеличивает количество апоптотических клеток эритромиелолейкоза человека К-562, вирус венесуэльского энцефаломиелита - на 20% в более поздние. Апоптоз-индуцирующие потенции вируса осповакцины показаны на модели клеток асцитного варианта аденокарциномы Эрлиха (увеличение количества апоптотических клеток на 17-19%).

3. Вакцинные штаммы вирусов подавляют развитие метастазов более активно (НИМ составляет до 75%), чем их онколизаты (НИМ - до 21-26%) замедляющие, преимущественно, рост первичных опухолей (ТРО на 10 сутки - 60- 63%, 20 сутки - 42 - 49%; ТРО вирусами - 36 -47%, 21 -26% в соответствующие сроки).

4. Применение вирусов оспы и паротита на фоне терапии циклофосфаном вызывает более эффективное торможение роста (73%) и метастазирования (83,5%>) экспериментальных опухолей, чем монотерапия вирусными вакцинами (до 47%, 58%-76%, соответственно).

5. Вакцинные штаммы вирусов оспы и паротита в большей степени, чем их онколизаты, модулируют функциональную активность (цитостатическую и мембранотоксическую) лимфоцитов селезенки и тимуса.

6. Супернатанты тимоцитов и спленоцитов, содержащие цитокины и биологически активные вещества, проявляют более выраженную, чем исходные лимфоциты, функциональную активность в отношении клеток экспериментальных опухолей.

129

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Истоками возникновения проблемы противоопухолевого действия вирусов послужили эмпирические наблюдения случаев стабилизации и обратного развития опухолевого процесса, как при естественных вирусных инфекциях, так и вакцинации живыми вирусными вакцинами (Муцениеце А. Я., 1972; Sinkovics G., 1986), а также обнаружение в экспериментальных опухолях различного генеза онкотропных и онколитических свойств у многих вирусов животных и человека (Муцениеце А. Я., 1972; Lindenmann J., 1970). Поскольку формирование и рост опухоли представляют собой сложнейший процесс, который затрагивает все существующие в организме системы, подход к лечению рака должен быть комплексным и включать в себя не только традиционные методы — хирургическое вмешательство, химио- и лучевую терапию, но и дополнительные воздействия. На сегодняшний день, в онкологическую практику прочно входит биотерапия — метод, использующий в своем вооружении целый арсенал различных иммуномодуляторов, используемых в качестве адыовантов в комплексной терапии, рака. Этот подход действительно необходим, поскольку традиционные методы лечения рака чрезвычайно токсичны и наносят большой ущерб организму, и без того ослабленному опухолью. В настоящее время уделяется большое внимание применению онколитических вирусов в качестве адьювантов.

В чем же преимущество онколитических вирусов, как иммуномодуляторов, перед другими адыовантами ? Во - первых, высокая тропность вирусов, в большей степени, к опухолевым клеткам, чем к нормальным. Этот феномен - уже достаточно давно установленный факт. Доказано в экспериментальных исследованиях, что концентрация вирусных частиц в опухолевой ткани превышает тот же показатель в нормальных, и различия в титрах могут достигать до 104 (Andreansky S., 1998; Chung R.Y.,

1999; Li Y., 2001; Nakamura H. et. al., 2002). Механизмы вирусного онкотропизма расшифрованы недостаточно. Некоторые авторы (Муцениеце А. Я., 1979) считают, что онкотропизм вирусов не определяется малигнизацией клеток и опухоль, в определенной мере, сохраняет ту чувствительность к вирусу, которая имелась у исходной нормальной ткани. Поэтому каждый вирус имеет свой опухолевый спектр и каждый вид опухоли - свой вирусный спектр, аналогично тропизму вирусов к нормальной ткани. Но есть и другая сторона проблемы: возможно, вирусный онкотропизм связан с тем, что опухолевая ткань является быстрорастущей, с усиленными процессами метаболизма, что создает благоприятные условия для репликации вируса, поскольку обеспечивает быстрое формирование и массовый выход вирусных частиц.

Во — вторых, универсальность механизмов действия вакцин: с одной стороны, это прямое цитопатическое действие на опухолевые клетки в процессе вирусной репликации, с другой - индукция противоопухолевого звена иммунитета. По характеру протекания вирусная инфекция в малигнизированных клетках практически не отличается от таковой в нормальных (Муцениеце А. Я. 1979; 1982). Репликация вируса в опухолевой клетке сопровождается цитоморфологическими изменениями (патологией ядра и цитоплазмы), которые, чаще всего, не совместимы с дальнейшим существованием этой клетки и, в конечном итоге, сопровождаются ее гибелью. Помимо этого, инфицирование опухоли вирусом может сопровождаться апоптотической гибелью популяции опухолевых клеток, которые сохранили дикий тип гена р53, по механизму, запускающему апоптоз в нормальных клетках, инфицированных вирусом. Известно, что в нормальных клетках белки некоторых вирусов блокируют активность р53, что препятствует апоптозу инфицированной клетки и позволяет вирусу реплицироваться (Yew Р. & Berk А., 1992). С другой стороны, инфицирование вирусом нормальных клеток автоматически запускает в них процесс апоптоза (по крайней мере, в клетках, которые получили необратимые повреждения), а это препятствует процессу репликации и распространения вируса в ткани. Естественно, напрашивается вывод о том, что вирусы отдадут предпочтение размножению в клетках, дефектных по данному механизму. Действительно, в некоторых лабораториях было показано, что онколитические вирусы эффективно реплицируются в опухолевых клетках, которые несут мутации (Bischoff J. et al. 1996) или другие дефекты р53 (Ries S. et al., 2000), активно лизируя их. Следовательно, можно предположить, что этот механизм также может лежать в основе тропизма вирусов к опухолевой ткани.

Иммуномодулирующее действие вирусов заключается в их способности стимулировать Т-клеточное звено иммунитета, неспецифически индуцировать естественные защитные силы организма, изменять антигенные и иммуногенные характеристики опухолевых клеток, вызывать образование интерферона (Мерфи Б., 1989; Пемен Ш., 1989). Опухоли, в основном, слабоиммуногенны. Проще ситуация с вирус - инфицированными опухолями, в которых обнаруживаются вирусные антигены. Они относятся к группе сильно иммуногенных опухолей (Кузнецов В. П., 2000). Вирусные антигены представлены на поверхности клетки в соединении с белками МНС 1 класса, а этот комплекс может распознаваться цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTLS), которые привлечены инфицированной вирусом опухолью. После инфицирования опухолевой клетки происходит индукция выброса цитокинов лимфоцитами и антигенпрезентирующими клетками (Toda M., Rabkin S., Kojima H. et al., 1999).

В-третьих, живые вирусные вакцины практически не имеют противопоказаний и побочных эффектов. Аттенуированные штаммы вирусов получают путем инактивации гена, ответственного за образование фактора вирулентности, или за счет мутаций в генах, неспецифически снижающих этот показатель (Медуницин Н. В., 1999). Наряду с генетически закрепленной утратой патогенных свойств и потерей способности вызывать у человека острое инфекционное заболевание, вакцинные штаммы индуцируют формирование иммунитета при отсутствии клинической картины заболевания. Лишь в единичных случаях могут возникать вакцино-ассоциированные заболевания, связанные с остаточной вирулентностью вакцинного штамма, реверсией его вирулентных свойств или наличием у привитого иммунодефицитного состояния. Чаще всего, на введение вакцин возникают аллергические реакции 1 типа, которые можно купировать симптоматическим лечением (Медуницин Н. В., 1999).

Проведенное исследование убедительно показало, что использованные нами терапевтические агенты (вирусные вакцины и онколизаты) проявляют выраженную противоопухолевую и антиметастатическую активность при моно- и комплексной терапии перевиваемых экспериментальных опухолей, таких, как карцинома легких Льюис, меланома В 16, аденокарцинома Эрлиха.

В наших исследованиях мы попытались осветить самые важные аспекты противоопухолевого действия вирусов. Нами было показано, что цитодеструктивные нарушения в опухолевых клетках развиваются in vitro уже через 24 часа после заражения вирусами свежевыделенных опухолевых клеток, т.е. практически на стадии инфицирования, и к 48 часам инкубации эти изменения продолжали нарастать. По мере развития цитодеструктивных нарушений, увеличивается в 3 - 4 раза и процент гибнущих клеток в зараженных культурах, , что говорит о хорошем литическом потенциале исследованных вакцинных штаммов. При этом, следует отметить, что в культуре опухолевых клеток, инфицированных вирусом венесуэльского энцефаломиелита, наблюдается наиболее высокий процент клеточных повреждений.

При лечении животных вирусными вакцинами, также наблюдается, преимущественно на ранних стадиях онкогенеза, увеличение количества опухолевых клеток с патологиями. Позднее, при генерализации опухолевого процесса, деструктивные нарушения становятся менее выраженными. Конечно, трудно ожидать на поздних стадиях онкогенеза высокие показатели клеточной деструкции, поскольку следует учитывать то, что в эти сроки период вирусемии заканчивается. И хотя показатели патологии клетки на 20 сутки менее выражены, чем на 10, они остаются достаточно высокими, что свидетельствует об опосредованном, через иммунную систему, воздействии вирусов на опухолевые клетки.

Стимуляция противоопухолевого Т- клеточного иммунитета является одним из основных механизмов, с помощью которого вирусы уничтожают опухолевые клетки или подавляют их рост. В ранний период опухолевого процесса (7-14 сутки), когда наблюдается увеличение количества опухолевых клеток в состоянии деструкции, нами зарегистрировано значительное торможение опухолевого роста, являющееся результатом размножения вируса в опухолевых клетках, а также высокий антиметастатический эффект: Кроме того, в эти сроки отмечается максимальное увеличение функциональной активности иммунокомпетентных клеток, стимулированных вирусными вакцинами. Суммируя вышеизложенное, мы можем утверждать, что на данном этапе опухолевого процесса проявляется комплексное действие вирусов - цитодеструктивное и иммуномодулирующее, что и обеспечивает положительный эффект от проведенного лечения. На более поздних стадиях онкогенеза, когда опухолевый процесс начинает прогрессировать, наблюдаем снижение показателей иммунологической активности лимфоцитов. Известно, что при клинически развитой форме онкологической патологии возможности иммунной системы, как правило, исчерпаны и попытки ее активации методами иммунотерапии не могут вызвать кардинальных изменений, хотя, безусловно, влияют на динамику заболевания (Кузнецов В.П., 2000). Таким образом, применять иммуномодуляторы более целесообразно, безусловно, на ранних стадиях онкогенеза, когда масса опухоли еще невелика, а иммунная система находится в достаточно активном состоянии для стимуляции ее противоопухолевого звена с целью получения клинически выраженного эффекта. Однако, применение иммуномодуляторов на более поздних стадиях онкогенеза также необходимо для: а) снятия депрессии кроветворения и восстановления нарушенных опухолью и/или цитотоксическим лечением функций иммунных эффекторов; б) восстановления противоопухолевого иммунного надзора, снижения риска развития рецидивов и метастазов; в) улучшения качества жизни пациентов (Кузнецов В.П., 2000).

Мы попытались, также, оценить цитодеструктивный и противоопухолевый потенциал лизатов опухолевых клеток, инфицированных вирусами (онколизатов). Преимуществом этих препаратов является то, что они содержат двойной набор антигенов (опухолевых и вирусных), следовательно, теоретически, должны индуцировать более высокий уровень специфического противоопухолевого иммунитета (Фердат А. К., Муцениеце А. Я., 1988). Однако, несмотря на более высокую иммуногепность онколизатов, иногда исходные вирусы (в наших исследованиях - вирус паротита) оказывают более выраженное цитодеструктивное действие, что сопровождается появлением большего количества опухолевых клеток с патологией ядра и цитоплазмы. Таким образом, онколизаты не вызывают выраженного прямого цитодеструктивного эффекта, так как их действие на опухолевые клетки связано, в основном, с индукцией противоопухолевого иммунного ответа. Нами не было показано существенных различий в показателях функциональной активности иммунокомпетентных клеток (лимфоцитов тимуса и селезенки) при терапии подопытных животных вирусами, либо их онколизатами. Интересно и то, что онколизаты более активно, чем вакцинные штаммы вирусов, подавляют рост первичных опухолей (карциномы Лыоис и меланомы В16), причем, процент торможения этого показателя не только существенно превышает аналогичный при монотерапии вирусами, но и эффект этот сохраняется в течение более длительного периода. Антиметастатический потенциал вирусных онколизатов высок, преимущественно, на ранних стадиях онкогенеза (10 сутки), в более поздние сроки (20 сутки) наблюдается его снижение, в то время, как вирусы подавляют развитие метастазов на протяжении всего периода развития опухоли. Чем можно объяснить подобный эффект?

Видимо, мы имеем дело с некоторыми особенностями механизмов противоопухолевого действия данных терапевтических агентов. Вирусы являются, прежде всего, индукторами Т- клеточного звена иммунитета, кроме того, они стимулируют выработку эндогенного интерферона, увеличивают чувствительность опухолевых клеток к фактору некроза опухолей, а также могут изменять их антигенные и иммуногенные характеристики (Кузнецов В. П., 2000.; Gooding L., 1994). Опухолевые клетки, инфицированные вирусом, становятся более доступными для распознавания и уничтожения Т-лимфоцитами, так как содержат в составе своей мембраны вирусные антигены и, таким образом, привлекают к себе внимание представителей специфического и неспецифического иммунного ответа - макрофагов, цитотоксических Т-лимфоцитов, естественных киллеров и др. (Toda М., Rabkin S., Kojima Н., 1999). Помимо стимуляции вирусами системного иммунитета (увеличение цитостатического и мембранотоксического потенциала ИКК), Т-клетки, привлеченные опухолью, инфицированной вирусом, накапливаются в опухолевой массе и могут специфически лизировать неопластические клетки. Кроме того, эти лимфоциты обладают способностью секретировать ИЛ-2, ИНФу, ГМ-КСФ, а также пролиферировать в ответ на стимуляцию аутологичными опухолевыми клетками (Барышников А. Ю., 2003). Согласно полученным нами результатам, аттенуированные штаммы вирусов оспы, паротита, ВЭЛ эффективны в отношении первичных узлов метастазирующих опухолей мышей, но более активно исследуемые вирусы ингибируют развитие небольших опухолевых очагов - метастазов. При помощи рассмотренного механизма действия вирусы способны не только подавлять рост первичной опухоли, но и препятствовать на начальных этапах развития опухолевого процесса распространению опухолевых клеток от основного очага, когда метастазы только закладываются в организме, что, видимо, лежит в основе высокого антиметастатического потенциала вирусных вакцин.

Обращает на себя внимание, что супернатанты изученных нами иммунокомпетентных клеток (тимоцитов и спленоцитов) животных, получивших терапию вирусными вакцинами и их онколизатами, проявляют более высокую функциональную активность в отношении опухолевых клеток, чем исходные лимфоциты. Супернатанты представляют собой комплекс растворимых медиаторов иммунной системы (ИФН, ИЛ-1, -2, -4, -6, -8, ФНО-а и др.) и биологически активных веществ (лизосомальных ферментов, активных форм кислорода, продуктов окисления арахидоновой кислоты и др.), продуцируемых иммунными клетками в процессе инкубации in vitro. Поскольку мы не выявили ярко выраженного повышения специфической активности клеток-эффекторов, мы предполагаем, что противоопухолевый эффект их связан, в большей степени, с продукцией вышеупомянутых растворимых факторов - цитокинов и биологически активных веществ, и в меньшей - с прямым цитотоксическим контактом с клетками-мишенями. Согласно литературным данным, селезенка, например, содержит все субпопуляции"ИКК, цитостатическое действие которых связано с секрецией комплекса цитокинов и биологически активных веществ (Кетлинский С. А. и соавт., 1995; Маянский Д. Н. и соавт., 1990). Не исключено, что противоопухолевый эффект обеспечивается, также, инфильтрирующими опухоль лимфоцитами, макрофагами и, возможно, другими клетками специфического и неспецифического иммунитета.

Онколизаты, в отличие от вирусов, вызывают, в большей степени, гуморальный иммунный ответ против опухоле- и вирус - ассоциированных антигенов, что приводит к образованию вирус- и опухоль- нейтрализующих антител (Savage Н., Rossen R., Hersh Е. et al., 1986). Индукция гуморального звена иммунитета может сопровождаться активацией цитотоксических лимфоцитов и натуральных киллеров, поскольку в функционировании иммунной системы существует кооперация лимфоцитов - взаимодействие Тс B-лимфоцитами и предшественниками Т-киллеров и т.д. (Ярилин А. А., 1999). Мы полагаем, что эффективное торможение роста первичного опухолевого узла онколизатами связано с их более выраженными иммуногенными свойствами, поскольку, содержание большого количества различных антигенов должно способствовать индукции более высокого уровня специфического противоопухолевого иммунитета, с привлечением разных звеньев иммунитета, в том числе, антител, антиген- презентирующих клеток, Т- лимфоцитов. Рассмотренные нами конкретные звенья иммунитета (цитостатическая и мембранотоксическая активность клеток тимуса и селезенки) не единственные показатели, обеспечивающие противоопухолевую эффективность онколизатов, поэтому необходимо более углубленное исследование иммунологических механизмов действия изученных терапевтических агентов.

Некоторыми исследователями проведено изучение лизатов инфицированных вирусом опухолевых клеток, которые используются в клинике в качестве агентов активной специфической иммунотерапии меланомы и рака яичников (Коростелев С.А., 2003). Клинические испытания показали, например, повышение выживаемости больных меланомой при использовании онколизата клеток меланомы, инфицированных вирусом болезни Ныокастла (Batliwalla F., Bateman В., Serrano D., 1998); корреляционную зависимость между повышением уровня иммунного ответа и выживаемостью больных при использовании, в качестве терапевтического средства, онколизата клеток меланомы, инфицированных вирусом коровьей оспы (Wallack М., Sivanandham М.,1998).

Одним из традиционных методов лечения опухолей на сегодняшний день является химиотерапия. Различные препараты, которые используются для этой цели, несмотря на хороший цитостатический потенциал, не могут полностью справиться с растущей опухолью, поэтому предпринимаются попытки усилить терапевтическое действие этих агентов и снизить побочные эффекты от их применения с помощью различных адыовантов.

Проведенные нами исследования позволили оценить противоопухолевый потенциал вакцинных штаммов вирусов на фоне цитостатической терапии карциномы легких Льюис. Комбинация этих терапевтических агентов вызвала значительное торможение опухолевого роста у животных-опухоленосителей, причем, объемы опухолей у подопытных мышей в этих группах были на 20 -30 % ниже, чем у животных, получивших монотерапию вирусами, либо циклофосфаном. Индекс торможения роста опухоли в группах, получивших комбинированную терапию, был достаточно высок и на поздних стадиях опухолевого процесса (20 сутки), когда у подопытных мышей других групп был отмечен рецидив первичного опухолевого узла. Антиметастатический эффект схемы лечения "вирус + ЦФ" превышает аналогичный, полученный при использовании вирусных вакцин и циклофосфана в монотерпии. (Подавление развития метастазов, как и торможение роста опухоли, отмечалось до 20-х суток наблюдения, а индекс ингибирования метастазирования при использовании вышеупомянутых схем был, приблизительно, на 20 % выше, чем в группах, получивших только вирус, или цитостатик. Однако, исследованные противоопухолевые эффекты не были связаны с активностью соответствующих звеньев системы иммунитета (мы не выявили увеличения функциональной активности тимоцитов и спленоцитов под действием данных агентов), что может быть связано с супрессивным действием циклофосфана на иммунокомпетентные клетки (Агеенко А. И., 1982; Гершанович М. Л., 1982). Более значимое торможение роста и метастазирования карциномы легких Льюис, при сочетанной терапии вирусом и цитостатиком, может происходить вследствие суммирования соответствующих эффектов каждого из применяемых агентов. Циклофосфан, благодаря своему иммунодепрессивному действию, может блокировать противовирусный иммунный ответ (Ikeda К., 1999) и, тем самым, облегчать распространение вируса в опухолевой ткани и его успешную репликацию (Chase М., Chung R. Y., 1998). Кроме того, при регрессии опухоли опухолевые и вирусные антигены высвобождаются в циркуляторное русло и могут быть презентированы антиген - представляющими клетками, которые, в свою очередь, активируют CD4+n CD8+ Т- клетки (Т-хелперы, Т-киллеры), что приводит к иммунной деструкции остатков опухоли (Todo Т. et. al., 1999).

В представленной работе мы предприняли попытку оценить апоптоз-индуцирующее действие вирусных вакцин на клетки экспериментальных опухолей. Недавно в литературе появились сообщения по исследованию апоптоз-индуцирующего действия онколитического аденовируса ONIX-15, которое продемонстрировало эффективное размножение данного вируса во многих типах опухолевых клеток с утраченной функцией апоптоза (Goodrum F., Ornelles DA., 1998; Rothmann Т., Hengstermann А., 1998). Поскольку, популяция опухолевых клеток гетерогенна по своему составу (часть из них сохраняет полную или частичную способность к апоптозу, а другая -утрачивает это свойство), то цитоморфологическое действие онколитнческих вирусов может складываться из двух компонентов: цитодеструктивного и апоптоз - индуцирующего, что мы и наблюдали в наших исследованиях. Но если цитодеструктивное действие в отношении опухолевых клеток у всех исследованных вирусных вакцнн было четко выражено, то апоптоз-индуцирующее проявлялось у каждого вируса индивидуально. Так, например, вирус паротита активно индуцировал этот показатель в клетках эритромиелолейкоза человека К-562 на ранних сроках инкубации (3-6 часов), а вирус ВЭЛ - на более поздних (24 часа). Вирус осповакцины проявил слабую апоптоз-индуцирующую активность по отношению к клеткам К—562, но довольно активно стимулировал апоптоз в клетках карциномы Эрлиха. Таким образом, проведенные нами исследования не противоречат литературным данным, свидетельствующим о том, что интенсивность индуцированного апоптоза в опухолевых клетках может зависеть от многих причин, например, от типа опухоли, ее происхождения, гистологического варианта, прогрессии, стадии, а также природы индуктора апоптоза, его индивидуальных свойств (Погорелов В.М., 1995; Циплакова В. Г., 1999; Bowen J., 1998; Candiz - Boduroglu Е., 1999; Demoura S., 1999; Galazka К., 1999; 1999; Torre F., 1999). Использование индукторов апоптоза вирусной природы весьма заманчиво, в перспективе, для лечения злокачественных опухолей и требует, безусловно, дальнейшего изучения. С одной стороны, потеря опухолевыми клетками функций р53 может являться причиной опухоле -селективной репликации вирусов (Goodrum F., Ornelles D., 1998; Rothmann T, Hengstermann A, Whitaker N. et al., 1998). С другой стороны, вирусы могут размножаться в опухолевых клетках с сохраненной функция р53 и индуцировать их апоптотическую гибель с участием иммунных клеток, ответственных за этот процесс, который протекает по тем же законам, что и апоптоз в нормальных клетках, инфицированных вирусом. В настоящее время проводятся исследования, направленные на понимание механизмов этого явления и создание вирусных штаммов с максимально выраженной способностью индуцировать апоптоз в опухолевых клетках ( Mullen J., Tanabe К., 2002).

Широкий спектр иммунобиологической активности вирусных вакцин, их цитодеструктивное и апоптоз-индуцирующее действие, способность стимулировать противоопухолевый иммунный ответ организма-опухоленосителя, высокий антиметастатический потенциал, отсутствие выраженных побочных эффектов и осложнений, высокая избирательность по отношению к опухолевым клеткам позволяют рассматривать вирусные вакцины как перспективное адъювантное средство в комплексной терапии злокачественных опухолей.