Автореферат и диссертация по медицине (14.00.17) на тему:Влияние кордиалина на иммунитет, гемостаз и неспецифическую резистентность

На правах рукописи

БАДМАЕВА Эржена Элбековна

ВЛИЯНИЕ КОРДИАЛИНА НА ИММУНИТЕТ, ГЕМОСТАЗ И НЕСПЕЦИФИЧЕСКУЮ РЕЗИСТЕНТНОСТЬ

14.00.17 - Нормальная физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицииских наук

Чита-1997

Работа выполнента на кафедре нормальной физиологии Читинской Государственной медицинской академии.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ - доктор медицинских наук,

профессор Л. П. Мал ежи к

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ - кандидат химических наук,

доцент Б.Б.Шойбонов

ОФИЦИНАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Лауреат премии Совмина СССР, доктор медицинских наук, профессор Н.Н.Цыбиков доктор медицинских наук Ю.В.Пархоменко

Ведущая организация: Институт биорегуляции и геронтологии, г. Санкт-Петербург.

Защита состоится "_"_ 1997г. в___часов

на заседании специализированного совета Д 84.74.01 при Читинской медицинской академии по адресу: 672000, г.Чита, ул. Горького, 39 "а".

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Читинской медицинской академии по адресу: г.Чита, ул.Горького, 39 "а".

Автореферат разослан "_"_ 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, , старший научный сотрудник с'/ \ А.Н.Ложкина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

АКТУАЛЬНОСТЬ. В последние годы сформировано представление о нозом классе пептидных регуляторов - цитомедииа.ч ( Морозов В.Г.,Хазинсон В.Х. 1979-! 996). Авторы данной концепции предполагают, что цмтомедины осуществляют перенос биологической информации между клетками различных популяций, входящих в состав любого органа. Главная их функция заключается в регуляции генетического гомеостаза и- защитных механизмов, таких как иммунитет, неспецифпческая резистентность, гемостаз, репаративные, адаптационные процессы и другие (Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., 1979-1994; Кузник Б.И. и соавт.,1981-1996).

В отличии от известных регуляторных систем, пептидные регуляторы обладают тканевой специфичностью и нормализуют функцию тех органов, из которых они были получены. В связи с широкой распространенностью патологии кровообращения, особый интерес вызывают цитомедины, выделенные из органов сердечно-сосудистой системы.

В литературе существуют данные о коррегирующем влиянии кордиалина на отдельные функции сердечнососудистой системы (Слелушкин В.Д. 1988-1991; Андреева Л.И.,1988-1994). Однако до сих пор не изучено его действие на иммунитет, гемостаз и неспецифнческую резистентность. Подобные исследования являются актуальными, так как при атеро-" склеротическом поражении сердца и миокардитах различной этиологии угнетается иммунная система, падает неспецифическая резистентность, наступают глубокие изменения в системе гемостаза с развитием ДВС-синдрома (Климов А.К., Нагорнев В.А., 1986-1996; Балуда В.П., 1983-1992). В связи с этим изучение действия кордиалина на иммунитет, гемостаз и неспецифическую резистентность огранизма является необходимым и представляет интерес как в теоретическом, так и в практическом отношении.

Более ранними исследованиями, посвященными действию тканеспецифических пептидов на систему комплемента, выявлено ингибирующне влияние кордиалина на классический путь активации комплемента. (Кузник Б.И.,Ложкина А.Н., 1988). Из многих исследованных цитомединов пептидный препарат из сердца

обладает наиболее выраженным антикомплементгым действием. Эти данные открывают перспехтиву выделения чистого ингибитора системы комплемента из кордиалина.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Целью нашего исследования явилось изучение действия кордиалина на иммунитет, гемостаз и неспецифическуто резистентность организма с приоритетным исследованием молекулярных механизмов его влияния на систему комплемента. Поставленная цель определила следующие задачи:

1. Исследовать влияние кордиалина на иммунитет, гемостаз и неспецифическую резистентность организма у больных ише-мическсй болезнью сердца и здоровых людей in vitro.

2. Изучить молекулярные механизмы действия пептидного препарата сердца на систему комплемента.

3. Провести фракционирование кордиалина с целью выделения фрагментов, ингибирующих активность комплемента.

4. Исследовать влияние полученных очищенных.препаратов на гемостаз, иммунитет и неспецифическую резистентность.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

Установлено, что пептидный препарат из сердца практически не влияет на гемостаз здоровых доноров. В крови больных ИБС он снижает повышенную агрегационную активность тромбоцитов, уменьшает количесто адгезирующих кровяных пластинок, тормозит образование протромбиназы по внешнему и внутреннему путям и стимулирует фибринолитическую активность крови.

Пептидный препарат из сердца обладает иммуномодули-рующим действием. В опытах in vitro он не оказывает влияния на иммуннокомпетентные клетки здоровых доноров, но при иммунизации животных стимулирует антителообразование. У больных ИБС кордиалин уменьшает экспрессию рецепторов Т-хелперов и В-лимфоцитов и .повышает её на Т-супрессорах.

Кордиалин стимулирует кислородзависимые и кислород-независимые процессы в нейтрофилах периферической крови, повышает их фагоцитарную активность.

Кордиалин оказывает дозозависимое действие на систему комплемента, в дозе до 20 мкг/мл стимулирует активацию классического пути комплемента, более высокие концентрации препарата оказывают выраженный ингибирующий эффект. В сыворотке сольных ИБС кордиалин однонаправленно ингибн-рует активацию комплемента. Ингибирующий эффект проявляется в системе агрегированных IgG и связан с блокированием Сш доменаIgG.

Выделенная комплементрегулирующая фракция обладает иммунномодулирующей и коагуологической активностью кор-диалнна. В её состав входят стимулирующие и ингибирующие комплементарный гемолиз соединения.

Получен ингибитор системы комплемента, препятствующий связыванию Clq субкомпонента первого компонента комплемента с иммунным комплексом, предотвращая активацию комплемента по классическому пути. Подобный тип ингибиро-вания системы компемента полнпептидом, выделенным из эндогенного регулятора, описан впервые.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ.

Установлено, что в крови больных ИБС кордиалин удлиняет время свертывания крови, усиливает фибринолиз, оказывает антиагрегацнонный и антиадгезивный эффект, уменьшает количество B-лимфоцитов и Т-хелперов, активирует Т-супрессоры , стимулирует фагоцитарную активность in vitro. Сочетание имму-нокоррегирующего и антикомштементного действия препарата с улучшением микроциркуляции и нормализации гемостаза может найти широкое применение в кардиологической практике.

Разработан оригинальный метод выделения эффекторов Clq аффинной хроматографией на IgG-стскле.

Выделена фракция кордналина, обладающая комплемент-ной, иммуномодулирующей и коагулогической активностью. Этот компонент препарата может служить основой для синтеза соединений целенаправленного действия на иммунитет, гемостаз и систему комплемента.

Получен регулятор системы комплемента, ингибирующий связывание Clq субкомпонента с IgG в составе иммунного комплекс.

Данные диссертации внедрены в учгбный процесс кафедры нормальной физиологии Читинской медицинской академии.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Пептидный препарат сердца в опытах т уЛго не влияет на иммунитет и гемостаз здоровых людей. В крови больных ИБС кордиалин снижает агрегационную активность тромбоцитов, их адгезию, обладает гипокоагуляционным эффектом, усиливает фибрикслиз, уменьшает .экспрессию рецепторов Т-хелперов и В-лим-фоцитов, активирует Т-супрессоры, стимулирует фагоцитарную активность, кислородзависимые и кислороднезависимые процессы нейтрофилов, ингибирует классический путь активации комплемента. Введение препарата здоровым мышам на фоне сенсибилизации к чужеродному, агенту стимулирует антителооб-разование.

2. На классический путь активации комплемента кордиалин оказывает дозозависимый эффект: г. дозе до 20 мкг/мл усиливает активность комплемента, увеличение концентрации приводит к ингибирующему эффекту. Пептидный препарат из сердца ингибирует,связывание СЦ субкомпонента с Сш-доменом ^О в составе иммунного комплекса.(Ю= 2,84+0,3 мгк/мл). Подобный тип ингибирования системы комплемента препаратом эндогенной природы описан впервые.

,3. Методом аффинной хроматографии на ^О-стекле из кордиалина получена фракция, оказывающая противоположные эффекты на связывание и активацию СЦ с иммунным комплексом. Полученный фрагмент обладает иммуномодулирующумн свойствами кордиалина. \ ,

4.Выделен регулятор системы комплемента, препятствующий связыванию СЦ субкомпонента с агрегированным ^О. Данный полипептид ингибирует активацию системы комплемента в условиях образования иммунных комплексов.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

1 ■ ■ • •

Материалы исследований доложены на научной конференции молодых ученых и студентов ЧГМА (1995), Всероссийской научной конференции "Экологическая патология: вопросы биохимии, фармакологии, клиники" (Чита, 1995, 1996), 2

гъезде физиологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск. 1995), 1 региональной конференции "Сохранение биологического разнообразия в байкальском регионе: проблемы, подходы, практика" (Улан-Удэ, 1996), Международной конференции по иммун-нореабилитации (Турция, 1996), 1 Всероссийском конгрессе пато физиологов (Москва, 1996), Международном симпозиуме "Геронтологи ческие аспекты пептидной регуляции функций организма" (Санкт-Петербург, 1996). По материалам диссертации опубликовано 13 научных работ.

ОБЪЁМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ.

Работа изложена на 164 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы,трёх глав собственных результатов, обсуждения полученных данных, выводов и указателя литературы, включающего 125 отечественных и 129 зарубежных источников. Текст иллюстрирован 19 таблицами и 15 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Для работы использован петидный препарат из сердца -кордиалин пронзодства завода медицинских препаратов АО "Самсон" завода медицинских препаратов г.Санкт-Петербург. Исследована кровь 70 здоровых доноров, 40 больных с ише-мической болезнью сердца, стабильной стенокардией III-IV функциональных классов, недостаточностью кровообращения IIA - ИВ. Эксперименты in vivo проводились на 40 мышах, которых содержал» в обычных условиях вивария.

" Объектами исследования служили - плазма крови, сыворотка, форменные элементы крови, ткани экспериментальных животных (селезенка).

Действие кордиалина на сосудисто-тромбоцитарный гемостаз оценивали по агрегационной активности тромбоцитов с учётом индекса агрегации, времени агрегации и угла агрегационной'^ кривой на агрегатограмме (J.Born., 1962). Исследование адгезии, тромбоцитов проводилось по методу Т.А.Одесской и coaiü. (1971).

О влиянии кордиалина на коагуляционный гемостаз судили по времени рекальцификации плазмы (Bergenhof K.D.,Roka L., 1954), каолин-кефалиновом времени (Larrien M.J., Weilard С.,1957) в модификации Баркагана (1975), протромбиновом времени (Quick A.J. 1966), тромбиновом времени ( Балуда В.П. и соавт.,1980.). '

Фибринолитическую активность определяли по времени лизиса эуглобулинового сгустка (Kowarzyk M,.Buluk К., 1954) и площади лизиса фибриновых пластин (Astrup T.et all., 1952).

Исследование действия пептидного препарата сердца на им муннокомпетентные клетки осуществляли с помощью розет-кообразования (Bianko Е. et all 1970; Kerman В. et all 1976), опре деление субпопуляций лимфоцитов проводили методом непрямой поверхностной иммуннофлуоресценции (Фримель Х.,1987). Коли чество антителообразующих клеток в селезёнке животных оценивали по методу A.Cunningham (1965).

Исследование активации классического и альтернативного путей системы комплемента и приготовление реагентов для тестирования отдельных компонентов Clq, С1, С2, С4, СЗ проводили по методикам, описанным Л.В.Козловым и соавт.( 1982).

Выделенйе функционально активных субкомпонентов С1, первого компонента комплемента, осуществляли аффинной хроматографией на колонке с иммобилизированным IgG по методу Козлова Л.В.и соавт. (1989).

Для выделения эффекторов Clq субкомпонента первого компонента из кордиалина использовали аффинный сорбент -макропористое стекло с иммобилизованным IgG (9,5 х 2 см). Гель-фильтрацию проводили на калиброванной колонке с сефадексом G-50 Super Fine ( 3,5x50 см). Для определения молекулярной массы в качестве стандартов использовали химотрипсиноген, РНК-азу ("Serva", ФРГ), глутатион, триптофан ("Sigma",США).

Высокоэффективную жидкостную хроматографию под давлением (HPLC) полученного препарата проводили на колонке Ultrapore - RPMC С8 (4.6x7,5) в системе двух буферов А и В:

А: 0,1% трифторуксусная кислота в воде; В: 0,01% трифторуксусная кислота в ацетонитриле.

Использовали градиент от 0% до 60% буфера В за 30 мин. Детекция проводилась при длине волны 220 нм.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

В опьпах in vitro установлено,что у здоровых людей кор-ди- алии не влияет на адгезию и агрегацию тромбоцитов. При добавлении кордиалйна в плазму, полученную от больных ИБС, обладающих высоким агрегационным потенциалом, отмечается снижение волны АДФ-индуцированнои агрегации и уменьшение количества адгезирующих тромбоцитов. По нашему предположению, кордиалин модулирует реакции образования тромбо-цитарной пробки у больных с исходно-высокой агрегационнои активностью кровяных пластинок.

Добавление пептидного препарата сердца в концентрации мкг/мл в плазму здоровых людей не влияет на показатели коагуляционного гемостаза. При увеличении дозы до 100 мкг/мл кордиалин удлиняет время рекальцификации с 81,2+10 до 97+13 с. (p<0,Q5), каолин-кефалиновое время с 39,1 + 1,7 до 48,5+2,5 с. (р<0,05), протромбиновое время с 13,3+0,7 до 15,3+11,1 с. (р<0,05), тромбиновое время не изменяется. В плазме больных ИБС, на фоне активации свёртывающей системы кордиалин уже в минимальной дозе 2 мкг/мл оказывает выраженный гипокоагу-ляцнонный эффект: наблюдается удлиненне времени рекальцификации с 72,6+_6,2 до 94,7+9,1 с. (р<0,01), каолин-кефалинового времени с 35,2+2,1 с. до 45,2+ 2,3 с. (р<0,01) и протромбинового времени с 12,1+0,8с. до 15,5+!,1с.(р<0,05). При концентрации препарата 100 мкг/мл эффект увеличивается. Обнаруженные факты связаны- со способностью препарата тормозить образование протромбиназы кате по внутреннему, так и по внешнему пути (Баркаган З.С. 1988,Кузник Б.И. и др.,1989,1995).

Кордиалин дозозависимо сокращает время лизиса эугло-були нового сгустка с 208,4+10,0 мин. в контроле до 165,2+14,1 мин. при концентрации 2 мкг/мл и до 155,2+15,0 мин. при 100 мкг/мл внесенного препарата. Более активно препарат стимулирует фибринолиз у больных ИБС: при добавление 2 мкг/мл время лизиса составляет 188,2+14,1 мин., при концентрации препарата 100 мкг/мл - 160,2+15,0 мин. против 298,4+10,0 мин. в контроле.

Полученные данные нашли подтверждение при исследовании на фибриновых пластинах. Так,при добавлении кордиалина на -гретые пластины лизис фибрина не наступает, тогда как на негретых выявляется отчетливая зона лизиса. Это действие обусловлено наличием в пептидном препарате из сердца низкомоле-

кулярных неспецифических протеаз, обладающих свойствами проактиватора плазминогена.

Кордиалин в физиологической дозе не влияет на состояние лимфоцитов здоровых доноров. Лимфоциты больных ИБС более активно реагируют на присутствие препарата в инкубационной сре де. Добавление кордиалина в дозе 2 мкг/мл уменьшает экспрессию рецепторов на Т-активных лимфоцитах, Т-хелперах и В-лим фоцитах соответственно с 41,3+1,7, 41,7+01,8, 36,8+2,1% в контроле до 35,6+2,0; 25,6+1,7; 23,2+2,0% в опыте. Параллельно отмечается повышение активности Т-супрессоров с 20,6+2,5 % в контроле до 34,3+2,3% в опыте. Более интенсивно перечисленные эффекты проявляются при концентрации препарата 100 мкг/мл (р<0,01).

Кордиалин стимулирует процессы антителообразования: на фоне введения препарата увеличиваются количество антите-лообразующих клеток, титры гемализинов и гемагглютининов. Изучение влияния кордиалина на кислородзависимые процессы нейтрофилов периферической крови человека проведено в тесте восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест). Инкубация клеток в присутствии пептидного препарата сердца дозозависимо повышала количество НСТ-положительных нейтрофилов: при концентрации кордиалина 100 мкг/мл их число превышало контрольные показатели в 1;5 раза.

Кроме того, функциональное состояние фагоцитов характеризуют неферментные лизосомальные катионные белки, которые составляют кислороднезависимую микробицидную систему фагоцита. По снижению содержания катионных белков можно судить о степени активации фагоцита. ЛКТ-тест был использован для оценки влияния кордиалина на кислороднезависимые процессы нейтрофилов. Как показали исследования, при добавлении кордиалина в дозе 100 мкг/мл, наблюдается снижение среднего цитохимического коэффициента до 1,22+0,05, а в концентрации 2 мкг/мл до 1,36 + 0,02, против 1,63+ 0,05 в контроле (р<0,05). Таким образом, кордиалин активирует фагоцитарную функцию нейтрофилов, сопровождающуюся выходом из гранул неферментных катионных белков.

Исследование влияния пептидного препарата из сердца на фагоцитарную реакцию ■ нейтрофилов по отношению к микробной тест-культуре подтвердили результаты, полученные в ЛКТ и НСТ-тесте. Фагоцитарный показатель нейтрофилов при добавлении кордиалина в дозе 2 и 100 мкг/мл значительно превышабт

контрольные цифры (р<0,001). Одновременно с этим увеличивается фагоцитарный индекс, причём максимальные цифры отмечаются при минимальной концентрации препарата ( с 4,9 +0,6 до 8,8 ±0,2; р<0,001). Показатель завершенности фагоцитоза возрастает с 41,6+2,3% до 62,0 +.2,1% при концентрации 2мкг/мл и 68,0+1,2% при 100 мкг/мл кордиалина в инкубационной среде. Все тесты, характеризующие фагоцитарные функции, показывают, что пептидный препарат из сердца оказывают активирующее влияние на фагоциты.

Комплементарная активность крови здоровых доноров изменяется в зависимости от концентрации кордиалина. В дозе до 20 мкг/мл препарат стимулирует классический путь активации комп лемента , при более высоких дозах - ингибирует его (рис.1). При добавлении в сыворотку больных ИБС кордиалин оказывает однонаправленное ингибирующее действие.

О II 41 О 80 100 120 {кордиалин I,мкг/мл

Рис. 1. Влияние кордиалина на активность классического пути комплемента в зависимости от концентрации с 10 мин преинкуба-цией с сывороткой ( О ) и без преинкубации ( @ ).

Преинкубация сыворотки с препаратом сердца существенно не изменяет ингибирующий эффект (рис.1). Следовательно, кордиалин не действует прямо на компоненты комплемента, а вмешивается в- этапы активации системы. Для выясне-

ния места действия препарата ц комплементарном каскаде были смоделированы этапы активации комплемента по классическому пути: 1 - инициации; 2 - амплификации; 3 - формированиния мембранатакующего компекса..

Для исследования стадии инициации мы использовали модельную систему, включающую функционально чистый препарат С1я и иммунный комплекс, представляющий собой эритроциты барана, сенсибилизированные антителами кролика (ЕА).

Предварительная инкубация кордиалина с ЕА значительно усиливает ингибирующий эффект препарата, что показывает его связывание с ^О в составе иммунного комплекса. Разбавление и последующая отмывка комплекса ЕА-корди«лин. не отменяет антикомплементный эффект препарата, что свидетельствует о довольно прочной связи кордиалина с ^О в составе ЕА. После связывания С1 я на ЕА пептидный препарат из сердца эффекта на гемолиз клеток-мишеней не оказывает (рис.2).

Рис.2. Зависимость ингиби-рования связывания субкомпонента С на ЕА от концентрации кордиалина. • - с преинкубацией с сывороткой И) мин при 37°С, Л - без преинкубации с сы-пороткой , О - инкубация кордиалина с ЕА с последующим центрифугированием и отмывкой комплекса,

□ - влияние кордиалина после связывания СЦ на ЕА.

Степень лизиса клеток-мишеней (У) дает информацию о доле клеток, нагруженных СЦ (г). Для расчета пользовались формулой: 2 = -1п(1-у) или Ъ = 1п(Кл - КР)/(Кл - А), где Кл, Кр и А - величины А 405 надосадочной жидкости над эритроцитами пос ле проведения реакции комплементзависимого гемолиза,

«КТ.ГвНОь.-ГЪ

(«ордмапммЬ шПып

соот-ветственно, для контроля на полный лизис, контроля реагента КЛя и содержания СЦ в опыте. Величина Ъ линейно связана с концентрацией активных молекул В присутствии различных концентраций кордиалина [I], получали различные значения 7л - в отсутствии ингибитора). Константу ингибирования К! рассчитывали по линейному уравнению:

± = Ш.±+±

Zf Zo К> 2о и строили график зависимости 1/2 от концентрации кордиалина. При этом, точка пересечения графика с осью абсцисс соответствует значению-К1.

1(г

шг1кп

Рис. 3. Определение константы ингибирования кордиалином связывания субкомпонента СЦ на ЕА.

По графику (рис.3) величина Ю, ориентировочно, равна 2,84 ± 0,3 мкг/мл. Константа ингибирования определяет концентрацию кордиалина, при которой половина молекул связана в комплекс ^О-ингибитор.

Для исключения влияния кордиалина на последующие стадии комплементарного каскада, были проведены эксперименты по изучению влияния препарата на посадку С4Ь и формирование мембраносвязанной стабилизированной СЗ-конвертазы классического пути (ЕАС4Ь2а°*>). Пептидный препарат из сердца оказывает ингибирующее влияние на эти процессы, причём, данный эффект' при формировании СЗ-конвертазы был значительно меньше, чем ингибирование посадки С4Ь (рис.4).

% гемолиза

20

О _|_н__, (кордиапии),

Рис. 4. Влияние кордиалина на стадии комплементарного каскада: "

* - влияние кордиалина на связывание С4Ь с ЕА ,

• - влияние кордиалина на образование СЗ-конвертазы,

□ - влияние кордиалина после образования СЗ-конвертазы.

Влияние кордиалина на активацию С4Ь может быть обусловлено подавлением связывания С1ц и, следовательно, активации С Ингибнрованне формирования СЗ-конвертазы, видимо, обусловлено дополнительной посадкой СЦ из кЗ°х>' при образовании ЕАС1420Х>. Поэтому, ингпбирование посадки С4Ь больше, чем влияние на образование СЗ-конвертазы.

На образованную СЗ-конвертазу, cтaбилизиpoвaннvю пептидный препарат из сердца однозначно не влияет. Так же, как и на после дующие стадии реакции комплемента: образование СЗ-конвертазы, её функционирование и действие мембра-натакующего комплекса.

На альтернативный путь активации системы комплемента кордиалин действия не оказывает.

Таким образом, в препарате сердца обнаружена антиком-племёнтная активность, связанная с блокированием Сш-домена в составе иммунного комплекса. Данный тип ингибироаания системы комплемента препаратом эндогенной природы описан нами впервые.

Исходя из молекулярного механизма антикомплемеьт-ного действия кордиалина, был разработан .метод выделения эффекторов С1ц на аффинном сорбенте. В качестве аффинного сорбента нами использовано макропористое стекло снммобШш-зованным им- муноглобулином 6 (1§С-стекло)

Аффинная хроматография на- IgG-стекле проводилась следую щим образом. На колонку с аффинным сорбентом, уравновешенную 0,0! М трнс-НСЬ2+-буфером, содержащим 0,15 М NaCl, (рН 7.4,) наноснли препарат сердца, растворенный в 'ío.m же буфг.ре при и выдерживали на,колонке30 минут для пилно-го связывая кг, эффекторов Clq. Затем колонку промывали стартовым буфером, собирая фракции кесвязавйшхся пептидов -"проскок^. Апгикомллементной активности в этой фракции выявлено не было.

После выхода "прсскока' колонку продолжали промывать стартовым буфером до Ano =0 и проводили элюцшо буфером, содержащим ЭДТА в качестве хелатирующего агента. При этом с колонки элюировась -пепидная фракция, не обладающая антнкомплементной активностью - пик 1 (П-1).

Для „мюирования эффекторов Cl.q с аффинного сорбента ¡использовали буфер с более высокой ионной силой, при котором с колонки элюировалась фракция, оказывающая ингибирующее влияние на связывание Clq субкомпонента комплемента - пик 2. (П-2) (рис.5). Объём полученной фракции составил 16 мл (Л«5 = 0,05) Если считать, что при Aaso=l,0 в растворе содержится 1 мг/мл вещества, то выход полученного пептида равен 0,8 мг (1,6%).

j лроемк"

<1 1 4 6 9 1Ü И '■»• il

Рис. 5 . Выделение регуллторо. С1 ц из кордиалина аффинной хроматографией, на колонке с 1§0-стеклом (9,5 х 2,5 см), уравновешенной 0,01 М трис-НС12+-буфером,-содержащим 0,15 М' N«0, рН 7,4. 1 - промывание колонки 0,01 М ЭДТА в стартовом буфере, 2 -элюирование эффекторов СЦ 0,01 М трис-НС12+-буфером, содержащим 0,5 М КаС1 и 0,01 М ЭДТА, рН 7,4. 3 - А-во; 4 - влияние на связывание СЦ, %.

лина,

Поскольку, анализируя биологическое действие кордиа-мы изучали его коагулогические, иммунорегулирующие

свойства и способность влиять на неспецифическую резистентность, было решено посмотреть распределение изучаемых активностей среди полученных элюатов. С этой целью, мы исследовали влияние фракций кордиалина на активность Т- и В-лимфоцитов, антитело- образование, фагоцитарную актпзность нейтрофилов, коагуляционный гемостаз и фибринолиз.

П-1 не оказывает действия на иммунокомпетентные клетки . Инкубация тмфоцитов с П-2 уменьшает экспессию маркеров на В-лимфоцитов,Т-хесперов"-:з. активируя NK-клетки и Т-супрессоры (р<0,01).

П-2 ¡n vivo увеличивает число АОК (р<0,01), титр- ге-магглюгининоь и гемолизинов (р<0,05), причём более эффективно, чем цельный препарат сердца.

Из трёх полученных фракций кордиалина только фракция, влияющая на связывание Clq, действует на фагоцитарную функцию нейтрофилов периферической кроЬи. Данный фрагмент и цельный препарат сердца оказывают однонаправленное стимулирующее влияние на фагощпарньк процессы нейтрофилов.

Анализ коагулоп:ческп> свойсте полученных фракций кордиалина показывает, чгс П-! и ' лроскок" не влияют на, время свертывания крови. П-2 оказывает ингибирующее влияние на время рекальцификацич, нефелиновое и протромбино-вое вре%.я ^p<0,Dl) п не влияет на тромбиновое время. Подобный же эффект оазывает н цельный препарат сердца.

Исследование действия полученных фракций кордиалина на скорость лизиса фибрина показало, что только "проскок" оказывает достоверное влияние на фибрпнолитические процессы, ускоряя растворение фебринового сгустка с 264,4+ 10 мин. в контроле до 202,8+12,9 мин. в опыте (р<0,01). Видимо, компонент цельного препарата сердца, действующий на фибринолиз, находится во фракции, несвязавшейся на IgG-стекле. Таким образом, П-2, элюиру емый с аффинного сорбента при более высокой ионной силе буфера, обладает иммунорегулнрующим и коагуло-гическим действием цельного препарата.

Полученный полипептид ( П-2) был подвергнут гель-фильтрации на сефадексе G-50 SFine и получены дне фракции. Выделенные пептиды разнонаправленно действуют на связывание Clq • П-2 (1) стимулирует-связывание, а П-2 (2) ингибирует этот процесс (рис.6).

Рис. 6. Ггль- фильтрация на сс фадсксе С-50 БирегРше фракции П-2 из кордиалина, полученной аффинной хроматографией нп 1« в-стекле. 1 - Агло; 2 - влияние на связывание С1 ц, %.

Наличие двух пептидов было подтверждено обратно-фазовой хроматографией под высоким давлением (рнс.7 ).

% 70

зо

1, мин

Рис. 7. Хроматография высокого давления П-2 из кордиалина после аффинной хроматографии на колонке Штароге - 11РМС С8 (4,6 х 7,5) в системе 0,1 % трифторуксусной кислоты и ацето-нитрила. Детекция при 220 нм.

Наличие двух фракции, оказывающих разнонаправленное влияние на активацию системы комплемента, возможно, является одним из механизмов имуномодули рующего действия кордиади-на.

Анализ структуры Clq-ингибитора был осуществлю! в Институте Бпоорганической химии им.М.М.Шемяхина и Ю.А.Овчинникова. При качественном анализе на углеводы получен отрицательный результат. Методом тонкослойной хроматографии N-концевая аминокислота не обнаружена. По всей видимости, данный пептид имеет циклическую структуру.

Полученный нами ингибитор системы комплеиента связывается только с агрегированным или связанным антигеном IgG. Прямого инактивирующего действия на СI q или IgG ингибитор не оказывает. Такой тип "декомплементизации" является более рациональным для организма, т.к. выключается активация классического пути системы комплемента при состояниях иммунного конфликта.

Гомогенный ингибитор Clq является удобным инструментом для изучения роли регуляторов системы комплемента в иммунных процессах как in vitro, так и в -экспериментальных моделях патологических состояний, протекающих с участием системы комплемента. Возможно, j дальнейшем, этот препарат найдет применение в патогенетической терапии широкого круга заболеваний, сопровождающихся иммунным конфликтом.

ВЫВОДЫ

1. Кордиалнн в опытах in vitro оказывает коррегрующее дейс/Епе на гемостаз больных ИБС: сникает повышенную агрега-циоь.ную активность тромбоцитов, их адгезию, обладает гипокоа-гуляционным эффектом, стимулируе! фибринолиз.

2. В опытах in vitro кордиалин стимулирует фагоцитарную активность, уменьшает экспрессии рецепторов Т-хелперов и В-лимфоцитоа и активирует Т-супрессоры при ИБС. Препарат увеличивает антителообразование у сенсибилизирован ных животных.

3. Показано, что в физиологических концентрациях кор-дна лин стимулирует комплементарный гемолиз по классическому пути активации комплемента, увеличение дозы приводит к инги-бирую щему эффекту. Ингибирование обусловлено блокировапи-ем Cm-домена IgG в составе иммунного комплекса, что препятствует свя зыванию Clq субкомпонента первого компонента комплемента (Ki= 2,84+0,3 мкг/мл).

4.Разработан метод выделения эффекторов Clq субкомпонента первого компонента комплемента аффинной хроматографии на IgG-стекле.

5. Полученный методом аффинной хроматографии на IgG - стекле полипептид является одним из активных компонентов

хордиплина. обуславливающих его иммуномодулцрующие свой-стза.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Влияние щелочных полипеппщсз сердца на некоторые показатели иммунитета и гемостаза /А Экологическая патология: вопросы биохимии, фармакологии, клиники. - Тез. докл. Всео. конф. - Чита, 1995. - С.284. Совм. с Л.П.Малежик.

2. Особенности действия пептидов сердца на классический путь активации комплемента //Там же. - С.284. Соям, с Б.Б. Шойбоношш.

3. Коаг'улогнческие и иммунологические свойства пептидного регул-.п ора из сердца //Тез. 2 съезда ф:.зяологог Сибири и Дальнего Востока. - Новосибирск, 1995. - С.20. Совм. с Л.П.Малежик.

. 4. Выд( ление эффекторов СЦ из препарата сердца // Экологические интоксикации: биохимия, фармякология, клиника. -Тез.докл. Веер. конф. - Чита, 1996. СЛЬО. Созм. с Б.БЛНойбоио-Бым, Л.П.Малежик, В.Н.Ивановым.

5. Регуляция классического пути активации системы ком-п те мента препаратом из сердца // Сохранение биологического разнообразия в байкальском регионе: проблемы, подходы, практика. - Тез. до'сл. 1 регпон.конф. - Улан-Удэ, 1996. - С. 97-99. Совм. с Б.Б.Шойбоновым, Л.П.Малежик, В.Н.Ивановым. ■

6.Сравнительное исследование действия тканеспеци-фических полипетидов на систему комплемента // Там >хе. -С. 160-162. Совм. с Б.Б.Шойбоновым, В.Н.Ивановым, В.В.Каль-ченко.

7. Полипептидные регуляторы сердечно-сосудистой системы // Тез. международной конф. по иммунореаоилитации. -Турция, Анталия, 1996. - С.335. Совм. с Б.Б.Шойбоновым, -ГГП.Малежик, Я.В.Хамуевым, Т.Н.Степановой.

8. Иммуноиодулнрующие и антиаритмическое действие цитомединов сердца // Цитомедины. - Со. науч. трудов. - Чита,1996. -С.П-П.

9. Влияние цитомединов сердца на гемостаз и фибринолиз // Там же. - С.12-13. Совм. с В.В.Мельниковым, С.л.Мельниковой.

10. Исследование молекулярных механизмов воздействия препарата из сердца на систему комплемента // Там же. - С. 13-14. Совм. с Е.Б.Шоибоновым, Л.П.Малежик.

11.0 роли цитомединов влэегуляции иммунитета и гемостаза // С.20. Совм. с 0:Д.Аюшиевым, Л.П.Малежик, Р.А.Колдаеым, Т.Р.Юхно.

12. Ингибирования классического пути комплемента препаратом сердца // Там же. -С.20-21. Совм. с Л.П.Малежик, Б.Б. Шойбоновым, В.Н.Ивановым.