Автореферат и диссертация по медицине (14.00.19) на тему:Влияние комбинированной химио-лучевой терапии на состояние кроветворения у больных лимфогранулематозом

На правах рукописи

Гч

ст

«=т £ О

£ ¿Г ДАНИЛОВА

си I

Марина Александровна

ВЛИЯНИЕ КОМБИНИРОВАННОЙ ХИМИО-ЛУЧЕВОЙ ТЕРАПИИ НА СОСТОЯНИЕ КРОВЕТВОРЕНИЯ У БОЛЬНЫХ ЛИМФОГРАНУЛЕМАТОЗОМ

14.00.19 — лучевая диагностика, лучевая терапия

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Обнинск — 1997

Работа выполнена в Медицинском радиологическом научном центре РАМН.

Научные руководители:

кандидат медицинских наук В. В. ПАВЛОВ;

доктор медицинских наук А. И. КОЛЕСНИКОВА.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Г. А. ПАНЬШИН;

кандидат медицинских наук Е. В. ДОМРАЧЕВА.

Ведущая организация: Онкологический научный центр РАМН, Москва.

Защита диссертации состоится » ¿¿¿¿'/¿«¿С . 1997 г. в /У. часов на заседании диссертационного совета Д.001.11.01 в Медицинском научном центре РАМН (249020, Калужская область, г. Обнинск, ул. Королева, 4).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Медицинского радиологического научного центра РАМН.

Автореферат разослан « » . . 1997 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук В.А.КУЛИКОВ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В связи с широким применением ионизирующего излучения в медицинской практике, актуальной проблемой является изучение механизмов его биологического действия на клеточном уровне, особенно при облучении клеток в условиях целостного организма. Особое место среда них занимают стволовые клетки самообновляющихся систем, в первую очередь костного мозга и эпителия тонкой кишки, радиационные изменения которых во многом определяют картину и исход острого лучевого поражения. Такие клетки-предшественницы являются единственным источником восстановления соответствующих систем после радиационного воздействия.

Успехи современной гематологии во многом обусловлены прогрессом в изучении кроветворных стволовых клеток и механизмов регуляции гемопоэза. Предложенный в 1961 году J.E. Till и Е.А. Мс Culloch метод для выявления клоногенных гемопоэтических клеток позволил доказать существование в кроветворной ткани класса полипотентных, активно пролиферирующих клеток, дающих начало всем росткам кроветворения. С использованием методов клонирования клеток стволового типа был получен целый ряд новых данных, принципиально изменивших существовавшие представления о клеточных основах кроветворения (J.E. Till, Е.А. Мс Culloch, 1961; И.Л. Чертков, А.И. Воробьев, 1973; А.Я. Фриденштейн, Е.А. Лурия, 1980; И.Л. Чертков и соавт., 1984, 1991; А.И. Воробьев и соавт., 1985, 1995; Д А. Натан и К.А. Зифф, 1994; М. Ogawa, 1993).

Методы клонирования гемопоэтических клеток человека в культуре позволяют оценить кроветворение на уровне клеток стволового типа как в норме, так и при различных заболеваниях органов кроветворения, изучать реакцию клеток-предшествекников и гемопоэтических ростовых факторов на проводимую терапию, в том числе на различные препараты, вводящиеся в схемы противоопухолевого лечения.

Методом выбора в лечении больных злокачественными лимфомами является комбинированная химио-лучевая терапия. Несмотря на успехи, достигнутые к настоящему времени в лечении больных лимфогранулематозом, настороженность вызывает значительное количество острых осложнений и отдаленных последствий, связанных с комбинированной терапией (Г.Д. Байсоголов и соавт., 1971; 1975; 1983; 1987; В.В. Павлов и соавт., 1971; 1975; И.П. Шишкин, 1976; М.Р. Sykes et al., 1964; P. Rubin et al., 1973; J. Slanina et al., 1977; C. Par-mentier et al.,1983). Повреждение кроветворной системы является основным фактором, ограничивающим использование эффективного цитостатического лечения (А. Dritchilo, D.S. Sherman, 1981; P. Rubin, 1984; D. Peiffert et al, 1989).

К настоящему времени появился ряд работ, посвященных изучению основ пострадиационного восстановления кроветворного микроокружения у экспериментальных животных (А.Г. Коноплянников, 1984; А.И. Колесникова, 1988; С.Ш. Кальсина, 1992; А.1 Kolesnikova et al., 1995), однако механизмы восстановления костного мозга человека после применения комбинированного лечения остаются недостаточно изученными.

В связи с изложенным, есть основания полагать, что использование кло-нальных методов культивирования гемопоэтических клеток стволового типа человека позволит получить новую информацию о состоянии кроветворения на уровне клоногенных клеток-предшественников у больных злокачественными лимфомами, а также оценить ближайшие и отдаленные гематологические эффекты различных схем противоопухолевого лечения.

Цель работы. Целью настоящей работы явилось изучение кроветворения у больных лимфограну лематозом на уровне клеток стволового типа в процессе комбинированного лечения, исследование механизмов восстановления гемопоэза после различных цитостатических (лекарственного и лучевого) во ¡действий, а также оценка отдаленных гематологических последствий противоопухолевой терапии у пациентов, излеченных oi лимфогранулематоза.

В задачи исследования входило:

1. Изучение исходного содержания костномозговых и циркулирующих гемопо-этических клоногенных клеток-предшественников у больных лимфогранулематозом и оценка их клинической значимости.

2. Изучение динамики показателей гемопоэза на различных этапах стандартной комбинированной терапии, проводимой больным лимфогранулематозом.

3. Оценка влияния глюкокортикоидов, применяемых в гематологической клинике, на кроветворные клетки стволового типа.

4. Исследование механизма пострадиационного восстановления костного мозга нй уровне клоногенных гемолоэтических предшественников.

5.0ценка отдаленных последствий терапевтического гамма облучения в системе кроветворения у пациентов, излеченных от лимфогранулематоза.

Научная новизна. В результате проведенных исследований получены сведения о клетках стволового типа в системе гемопоэза больных лимфогранулематозом и проведен сравнительный анализ их содержания и качественного состава в зависимости от клинических проявлений заболевания. Изучена динамика содержания циркулирующих в крови гранулоцитарно-макрофагальных предшественников в сравнении с изменениями концентрации зрелых лейкоцитов в процессе проведения комбинированного химио-лучевого лечения.

Исследовано влияние глюкокортикоидов, относящихся к наиболее часто используемым в гематологической клинике лекарственным препаратам, на показатели кроветворения, оцененное по содержанию костномозговых и циркулирующих в крови клоногенных предшественников.

Изучены процессы восстановления костного мозга после локального терапевтического облучения на уровне стромальных и гемопоэтических клеток стволового типа, впервые продемонстрировано нарушение нормального соотношения двух субпопуляций клеток-предшественников фибробластов, обладающих, по экспериментальным данным, различной радиочувствительностью.

Состояние облученного и интактного костного мозга пациентов, находящихся в длительной (18-23 - летней) полной ремиссии после проведения им лучевой терапии по радикальной программе, впервые исследовано с использованием методов клонирования кроветворных клеток в культуре.

Практическая ценность работы. Достижения теоретической и экспериментальной гематологии в области изучения стволовых клеток непосредственно отражаются на клинической гематологии. Данные проведенного исследования имеют большое практическое значение и могут быть использованы для решения целого ряда клинических вопросов: ранней диагностики и дифференциального диагноза заболеваний системы крови, а также контроля за проводимой терапией и ее результатами. Оценка состояния кроветворения по уровню клоногенных гемопотических клеток в процессе химио-лучевой терапии лимфогранулематоза предоставляет возможность более рационально комбинировать методы лечения и устанавливать оптимальные сроки проведения того или иного вида цитостатической терапии.

Актуальной как для практической онкологии, так и для теоретической медицины является проблема отдаленных последствий интенсивного противоопухолевого лечения для системы кроветворения, состояние которой во многом определяет качество жизни пациентов, излеченных от опухоли. Полученные нами результаты, отражающие наличие значительных отклонений в системе гемопоэза лиц, находящихся в длительной ремиссии, ставят перед врачами сложную задачу выбора и сочетания методов лечения, позволяющих добиться полной эрадикации опухоли, не превышая при этом установленных пределов гематологической толерантности и не ухудшая качества жизни излеченных пациентов.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на 1У Всероссийском съезде онкологов (Ростов-на-Дону, 1995); конференции "Актуальные вопросы гематологии" (Санкт-Петербург, 19^5); на I съезде онкологов

стран СНГ (Москва, 1996); заседании гематологического общества (Москва, 1997). Диссертационная работа апробирована 3 марта 1997 г. на научной конференции клинического сектора МРЬЩ РАМН.

. Публикации. Основные результаты исследований, представленных в диссертационной работе, изложены в 7 публикациях.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа включает введение, 6 глав и выводы. Работа содержит 118 страниц машинописного текста, включающего 19 таблиц, 4 рисунка, 2 графика и 5 диаграмм. Список цитированной литературы насчитывает 165 источников, из них 60 отечественных и 105 зарубежных.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Состояние кроветворения у больных лимфогранулематозом отражает характер воздействия опухоли на организм человека, в частности, на систему гемопоэза.

2. Система кроветворения больных лимфогранулематозом может быть использована в качестве модели для изучения гематологических эффектов терапевтического облучения.

3. Изменения, выявляемые в компартменте гемопоэтических и стромальных клеток стволового типа, предшествуют сдвигам в морфологически дифференцируемом пуле костного мозга и периферической крови. При этом раньше обнаруживаются изменения в субпопуляции предшественников, обладающих большим пролиферативным потенциалом.

4. В участках, облученных в суммарных дозах порядка 20-25 Гр, происходит регенерация костного мозга. В пострадиационном восстановлении гемопоэти-ческой стромы принимает участие преимущественно субпопуляция КОЕ-Ф,

• формирующая в культуре колонии рыхлого типа.

5. Облучение в суммарных дозах более 35 Гр вызывает стойкую необратимую аплазию костного мозга.

6. В необлученных участках костного мозга в отдаленные сроки после проведения лучевой терапии по радикальной программе нарастает тенденция к гипоплазии кроветворной ткани. Содержание циркулирующих предшественников грануломоноцитопоэза и зрелых лейкоцитов сохраняются на близком к контролю уровне.

ОБЪЕМ и МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Нами были изучены показатели кроветворения 118 больных лимфогранулематозом, 42 из них обследованы до начала лечения, 23 пациента - в отдаленные сроки (18-23 лет) после проведения им курса лучевой терапии, 53 больных - в процессе выполнения комбинированного лечения, включающего цикловую ПХТ и лучевую терапию.

Облучение осуществляли по принятой в институте методике (Г.Д. Байсо-голов и З.И. Хмелевская) на гамма-терапевтических установках "Рокус" и "Агат" со встречных полей при расстоянии источник - кожа 75 или 84 см, в разовой очаговой дозе 1,9-2,1 Гр, недельной - порядка 10-11 Гр. Суммарную дозу на очаги поражения доводили до 40-45 Гр, на области субклинического метастазировання - до 35-40 Гр. Оценку поглощенной дозы проводили расчетным методом. Облучению подвергали лимфатические коллекторы выше диафрагмы и селезенку, лучевая терапия осуществлялась в два этапа. Большинству больных на первом этапе проводили дистанционную гамма-терапию на шейно-надключичную область и средостение, вторым этапом облучали лимфатические коллекторы подмышечных областей и селезенку. При выполнении радикальной программы лучевого лечения прямому воздействию высоких доз ионизирующего излучения порядка 40 Гр подвергалось примерно 25% кроветворного костного мозга.

Материалом для исследования служили аспираты костного мозга, полученные при пункции тела грудины !;/или передней ости крыла подвздошной кости в количестве 0,5-1,0 мл., и венозная кровь в количестве 7,0-8,0 мл.

В костном мозге оценивали следующие показатели:

1) количество миелокариоцитов и клеток, способных к делению, а также показатели миелограммы;

2) относительное и абсолютное содержание клеток-предшественниц гранулоци-тарно-макрофагального ряда (КОЕ-ГМ), их качественный состав;

3) относительную и абсолютную концентрацию клеток-предшественниц фибро-бластов (КОЕ-Ф), процентное соотношение КОЕ-Ф, формирующих в культуре плотные и рыхлые колонии-клоны.

В венозной крови определяли:

1) относительное и абсолютное содержание циркулирующих КОЕ-ГМ;

2) колониестимулирующую активность (КСА) плазмы.

Клонирование костномозговых и циркулирующих КОЕ-ГМ in vitro проводили в двухслойной системе агара по модифицированному методу В. Pike и W. Robinson (1970). Количественная оценка концентрации клеток-предшественниц гемопоэтической стромы в костном мозге проводилась по методу А.Я. Фри-денштейна и соавт. (1970) в условиях монослойных культур, при этом подсчитывали процентное соотношение двух субпопуляций КОЕ-Ф, формирующих в культуре плотные (содержащие 200 и более фибробластов) и рыхлые (содержащие от 50 до 200 клеток) колонии-клоны фибробластов. Колонии в агаровых и монослойных культурах подсчитывали на 8-10 сутки, при этом учитывали скопления в 50 и более клеток. Всего в работе поставлено и проанализировано более 2000 культур.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Клоногениые клетки стволового типа у первичных больных лимфогранулематозом. Исследование гематологических показателей 42 больных ЛГМ, не получавших ранее цитостатического лечения, показало (таблица 1), что у пациентов с конституциональными симптомами относительная и абсолютная концентрация костномозговых клеток-предшесгвенниц грануломоноиитопоэза и

абсолютное содержание в костном мозге стромальных клеток стволового типа была значительно выше, чем у больных с бессимптомным течением заболевания.

Таблица 1

Относительные и абсолютные показатели КОЕ-ГМ и КОЕ-Ф в костном мозге

Изучаемые показатели Подгруппа А п=2б чел. Подгруппа Б п=14 чел. Р

КОЕ-ГМ на 100 тыс. эксплант кл. к.м. 59,1±3,6 77,3+7,5 <0,05

КОЕ-ГМ в 1 мкл к.м. 93,1±10,4 154,8±26,2 <0,05

КОЕ-Ф на 1 млн эксплант. кл. к. м. 87,6±8,2 105,9±24,9 >0,1

КОЕ-Ф в 1 мкл. к.м. 11,7 ±2,0 27,3±7,5 <0,05

КОЕ-Ф, формирующие плотные колонии (%) 44,0±3,3 47,5±6,8 >0,1

Показатели относительного и абсолютного содержания циркулирующих КОЕ-ГМ у больных подгруппы Б также были существенно выше, чем у пациентов без общих проявлений ЛГМ (таблица 2).

Таблица 2

Содержание циркулирующих КОЕ-ГМ в венозной крови и КСА плазмы больных

Изучаемые показатели Подгруппа А п=26 чел. Подфуппа Б п=14 чел. Р

КОЕ-ГМ на 1млн. эксплант кл. венозной крови 9,9±0,8 14,5±1,8 <0,05

КОЕ-ГМ в 1 мл венозной крови 89,6±12,0 193,0±38,0 <0,05

КСА плазмы (% к контр.) 97,7+11,7 102,8+4,2 >0,1

Нами не было выявлено зависимости исследованных показателей кроветворения от распространенности лимфогранулематозного процесса, а также от морфологического варианта заболевания.

Таким образом, состояние кроветворения у больных ЛГМ, оцененное с использованием методов клонирования кроветворных клеток в культуре, отражает гематологическую направленность системных проявлений опухолевого процесса. У больных с симптомами интоксикации содержание костномозговых гемопоэтических и стромальных клоногенных клеток, а также циркулирующих в крови КОЕ-ГМ значительно превышает соответствующие показатели пациентов с бессимптомным течением ЛГМ.

2. Кроветворные клетки-предшественники у больных лимфогранулематозом в процессе комбинированной терапии. Целью следующего раздела работы явилась количественная оценка показателей гемопоэза первичных больных лимфогранулематозом в ответ на применение преднизолона в терапевтическом диапазоне доз.

В настоящее исследование включены 18 первичных больных. Больные I подгруппы (10 человек) получали преднизолон в дозе 0,5 мг на 1 кг веса внутрь в течение 1 дней и были обследованы до и после недельного приема препарата. Пациентам II подгруппы (8 человек) преднизолон вводился однократно внутривенно в дозе I мг на килограмм веса, показатели гемопоэза у этих больных изучали исходно, через б и 24 часа после введения препарата.

Нами не выявлено существенных изменений в изученных показателях коспюго мозга (содержание миелокариоиитов, количество клеток, способных к готическому делению, абсолютное и относительное содержание КОЕ-ГМ и КОН-Ф, а также их качественный состав) под действием преднизолона ни у I, ии у II группы больных. Однако, было обнаружено значительное увеличение от постельного и абсолютно! о содержания в крови циркулирующих КОЕ-ГМ независимо 01 схемы назначения гормонального препарата (таблица 3).

Таблица 3

Влияние преднизолона на относительное и абсолютное содержание КОЕ-ГМ в

Показатели Исходно После преднизолона Р

Подгруппа I, п=10

КОЕ-ГМ на 1 млн. экспл. кл. крови 11,3+1,2 48,8±14,6 <0,05

КОЕ-ГМ в 1 мл. венозной крови 109,7±36,8 495,0±115,7 <0,01

Подгруппа II, п=8

КОЕ-ГМ на 1 млн. экспл. кл. крови 15,6±2,5 ч/зб час 19,1±4,5 ч/з 24 час 61,9±21,6 >0,1 <0,05

КОЕ-ГМ в 1 мл. венозной крови 104,4±19,2 ч/збчас 154,2+27,0 ч/з 24час 278,7+28,2 >0,1 <0,01

Отмечалось выраженное повышение данного показателя у больных после недельного приема преднизолона внутрь и у пациентов II подгруппы через сутки после внутривенного введения препарата.

Была также проанализирована динамика показателей периферической крови (содержание лейкоцитов и циркулирующих КОЕ-ГМ) при'однократном внутривенном введении преднизолона. Отмечено значительное повышение содержания зрелых лейкоцитов в крови через 6 часов после инъекции преднизолона, что совпадает с литературными данными, концентрация же циркулирующих КОЕ-ГМ имела тенденцию к повышению, но достоверно не отличалась от исходных показателей. Через сутки после введения препарата количество лейкоцитов возвращалось к исходным величинам, а содержание предшественников трануломоноцитопоэза в крови значительно возрастало.

Таким образом, назначение терапевтических доз преднизолона, независимо от способа и длительности его применения в изученных условиях вызы-

вало мобилизацию клеток-предшественниц грануломоноцитопоэза вслед за реакцией зрелоклеточного пула из костного мозга в периферическую циркуляцию без явных признаков повышения активности костномозгового гемопоэза.

Исследование кроветворения у больных в процессе комбинированного проведено у 18 пациентов. Стандартная схема комбинированного лечения включала в себя два цикла полихимиотерапии по схеме ЦОПП и многопольный вариант дистанционной гамма - терапии по радикальной программе. Лучевая терапия начиналась непосредственно после окончания второго цикла ПХТ и длилась в среднем 8-10 недель.

Исследование показателей периферической крови проводили в сроки: до лечения; после окончания второго цикла ПХТ (на момент начала лучевой терапии) - 0 сутки; далее - еженедельно или 1 раз в две недели до окончания курса дистанционной гамма - терапии.

У больных лимфогранулематозом до лечения средние показатели циркулирующих КОЕ-ГМ были выше, чем у здоровых людей (р< 0,001). Учитывая исходную разницу в количестве циркулирующих гранулоцитарно-макро-фагальных предшественников у больных подгрупп А и Б, мы проанализировали показатели крови после двух циклов ПХТ отдельно для указанных групп больных. Полученные данные (таблица 4) свидетельствуют о том, что у больных ЛГМ с общими симптомами содержание КОЕ-ГМ в периферической крови после двух циклов ПХТ не отличается, от соответствующих показателей пациентов с бессимптомным течением заболевания (р> 0,1). Если же оценивать процентное отношение уровня исследуемого показателя после ПХТ к его исходной величине, то у больных с симптомами интоксикации падение относительного и абсолютного содержания КОЕ-ГМ будет достоверно глубже, чем у пациентов подгруппы А (р<0,05). Анализируя полученные результаты, можно сделать вывод о том, что гиперплазия гранулоцитарного ростка, характерная для кроветворения больных ЛГМ с конституциональными

симптомами, нивелируется после двух циклов полихимиотерапии и не увеличивает толерантности гемопоэтической ткани больных подгруппы Б к проводимой цитостатической терапии.

Таблица 4

Концентрация циркулирующих КОЕ-ГМ до и после ПХТ у больных ЛГМ в

Показатели Исходно После 2 циклов ПХТ %

Подгруппа А

КОЕ-ГМ на 1 млн клеток крови 9,9±0,8 4,7±1,6 47,5

КОЕ-ГМ в 1 мл крови 89,6± 12,0 21,5±11,0 23,9

Подгруппа Б

КОЕ-ГМ на 1 млн клеток крови 14,5±1,8 3,2+1,3 22,1

КОЕ-ГМ в 1 мл крови 193,0±38,0 10,4±7,5 5,4

В процессе комбинированной терапии содержание КОЕ-ГМ в крови было подвержено значительным колебаниям. Динамику концентрации циркулирующих КОЕ-ГМ в процессе проведения лучевой терапии сравнивали с колебаниями содержания зрелых лейкоцитов и нейтрофилов в периферической крови.

Нами были отмечены значительные различия в сроках развития изменений содержания циркулирующих КОЕ-ГМ и зрелых лейкоцитов. Так, выраженное увеличение концентрации КОЕ-ГМ после второго цикла ЦОПП приходилось на конец первой недели после окончания ПХТ, возвращение же количества лейкоцитов и нейтрофилов к уровню 0 суток происходило только к концу второй недели наблюдения. В период проведения лучевой терапии до 5 недели наблюдения количество лейкоцитов, нейтрофилов и циркулирующих КОЕ-ГМ

было стабильным. Через 5-7 недель от начала лучевого лечения (срок зависел от индивидуальных особенностей кроветворения пациентов) отмечался второй пик концентрации гранулоцитарно-макрофагальных предшественников, при этом содержание лейкоцитов и нейтрофилов не отличалось от уровня предыдущих сроков наблюдения. К времени завершения лучевой терапии, то есть через 2-3 недели после значительного увеличения концентрации КОЕ-ГМ, отмечалось возрастание количества зрелых лейкоцитов и нейтрофилов в периферической крови. Таким образом, последовательность изменений в системе гемопоэза после лекарственного (ПХТ) и лучевого лечения в изученных условиях была сходной. Процесс восстановления кроветворения после цитостатического воздействия выражался в более раннем увеличении содержания в периферической крови клеток стволового типа (КОЕ-ГМ) и отсроченным на 1 - 3 недели восстановлением количества лейкоцитов и нейтрофилов.

В следующем разделе представлены результаты исследования состояния кроветворения в участках костного мозга, облученных в дозе 20-25 Гр, в сочетании с шестью циклами полихимиотерапии. Исследование стернального пунктата осуществляли у 14 пациентов через 4-12 месяцев (медиана 5,5 месяцев) после облучения и не менее, чем через две недели после заключительного цикла ПХТ. Полученные данные сравнивали с 'Исходными показателями кроветворения 26 больных ЛГМ без симптомов интоксикациии.

Нами не было отмечено существенной разницы в процентном составе пунктатов из облученного костного мозга по сравнению с контролем. Клеточ-ность костного мозга, а также концентрация клоногенных гранулоцитарно-макрофагальных и стромальных предшественников в аспиратах из облученного участка к.м. не достигали нормальных значений (таблица 5). Однако показатель концентрации КОЕ-ГМ на 100 тысяч клеток костного мозга, способных к делению (суммарное количество бластов, промиелоцитов и миелоцитов), отражающий функциональную "полноценность" клеток стволового типа,

коммитированных в направлении грануломоноцитопоэза, не отличался от исходного уровня. Изменения со стороны клеток-предшественниц гемопоэти-ческого микроокружения характеризовались нарушением нормального соотношения субпопуляций КОЕ-Ф в сторону значительного увеличения фракции, формирующей в культуре рыхлые колонии-клоны.

Таблица 5

Концентрация гранулоцитарно - макрофагальных (КОЕ-ГМ) и стромальных (КОЕ-Ф) клеток-предшественниц в интактном и облученном до 20-25 Гр

Показатели К.м. до лечения, п=26 К.м. после облучения, п=14 Р

КОЕ-ГМ на 100 тыс. эксплант. клеток к.м. 59,1+3,6 17,8+5,0 <0,01

КОЕ-ГМ на 100 тыс. делящихся кл. к.м. 327,6±33,1 306,7± 102,7 >0,1

КОЕ-Ф на 1 млн. эксплант. кл. к.м. 87,6±8,2 9,3+2,9 <0,001

% КОЕ-Ф, формирующих рыхлые клоны 56,0+3,3 92,8±3,2 <0,001

Результаты проведенных нами исследований показали, что в участках, облученных в СОД порядка 20-25 Гр, происходит регенерация костного мозга. Впервые в клинике получены данные, свидетельствующие о том, что в пострадиационном восстановлении гемопоэтической стромы принимает участие преимущественно субпопуляция КОЕ-Ф, формирующая в культуре рыхлые колонии-клоны.

Использование современных программ комбинированного лечения позволило добиться значительных успехов в лечении онкологических заболеваний. Поскольку частота и длительность безрецндивною выживания больных лимфогранулематозом является одной из самых значительных н с учетом шири-

кого применения лучевого компонента в их лечении, показатели кроветворения этих пациентов могут быть использованы в качестве модели для изучения отдаленных последствий радиотерапии.

Состояние кроветворения изучали у 23 пациентов в отдаленные сроки после проведения лучевой терапии по поводу лимфогранулематоза 1-11 стадии. Облучению подвергали лимфатические коллекторы, расположенные выше диафрагмы в суммарных очаговых дозах порядка 40 Гр в сочетании с облучением селезенки (17 больных) или спленэктомией (СЭ, 6 пациентов). При выполнении этой программы прямому воздействию ионизирующего излучения подвергалось 20-25% кроветворного костного мозга. На момент обследования все пациенты были в полной клинико - гематологической ремиссии продолжительностью 18 -23 года. Исследовали пунктаты из облученной в СОД от 35 до 41 Гр грудины (13 чел.) и необлученных участков гемопоэтической ткани (23 чел). ' Результаты исследования аспиратов костного мозга из грудины, облученной в суммарных дозах, превышающих 35 Гр, свидетельствовали о глубоком угнетении кроветворения, что выражалось в низких показателях клеточности костного мозга (21,3±7,5 тыс. в 1 мкл); содержания КОЕ-ГМ (5,6±2,7 на 100 тыс. клеток к.м.) и КОЕ-Ф (3,6±1,6 на 1 млн. клеток к.м.).

В аспиратах из необлученных участков костного мозга (таблица 6) отмечалось выраженное снижение содержания миелокариоцитов по сравнению с нормой (р<0,001). Морфологическое исследование костномозговых пунктатов свидетельствовало о значительном снижении относительного и абсолютного содержания незрелых гранулоцитов и клеток эритроидного ряда, причем эти показатели выходили за нижнюю границу нормы. Абсолютное количество лимфоидных клеток в миелограмме обследованных лиц существенно не отличалось от нормы при значительном увеличении относительной их концентрации. Не было выявлено различий в изученных показателях кроветворения у пациентов с удаленной и облученной селезенкой.

Таблица 6

Клеточный состав интактного костного мозга у больных ЛГМ в различные сроки после гамма - терапевтического облучения с захватом 20-25%

Исследуемые показатели Пациенты после СЭ, п=6 Неопериро ванные., п= 17 Норма

Клеточность, тыс/мкл 42,5±9,3 37,7±5,5 91,0±2,0

Лимфоидные клетки, % содержание абс. кол-во, тыс/мкл 25,0±3,7 10,2±2,0 23,7±1,8 8,2±0,9 6,8-17,2

Гранулоциты незрелые, % содержание абс. кол-во, тыс/мкл 14,4±2,1 6,4+1,5 14,2±1,4 6,2+1,3 18,6-34,3

Эритроидный росток, %содержание абс. кол-во, тыс/мкл 14,3±1,7 6,4±1,9 12,2±1,4 5,5±1,5 14,5-26,5

Данные по колониеобразующей способности костного мозга в обследованной группе больных представлены в таблице 7.

Таблица 7

Содержание КОЕ-ГМ и КОЕ-Ф в интактном костном мозге больных ЛГМ через 18-23 года после гамма-терапевтического облучения с воздействием на 20-25%

Исследованные показатели Пациенты после СЭ, п=6 Неоперирован-ные, п=14 Норма

КОЕ-ГМ на 100 тыс. экспл. кл.к.м. 9,9±3,3 14,1^2,5 20,0-150,0

КОЕ-Ф на 1 млн. экспл.клеток к.м 20,7±6,3 19,1 ±7,0 44,0±10,0

Отмечалось выраженное снижение концентрации костномозговых КОЕ-ГМ по сравнению с соответствующими показателями первичных больных ЛГМ без симптомов интоксикации (59,1+3,6), р<0,001. Этот показатель также не достигал нижней границы нормы, причем не было выявлено различий у больных с удаленной и облученной селезенкой.

Количество костномозговых КОЕ-Ф у пациентов, обследованных в отдаленные сроки после лучевой терапии, оказалось значительно меньшим, чем у больных ЛГМ до лечения (87,6±8,2), р<0,001, и у здоровых людей (р< 0,01). Еще более выраженное (примерно в 4 раза) различие отмечается при сравнении абсолютного содержания КОЕ-Ф у данной группы пациентов с показателями первичных больных и нормой.

При подсчете процентного соотношения КОЕ-Ф, формирующих в культуре плотные и рыхлые колонии-клоны фибробластов, получены результаты (таблица 8), свидетельствующие о нарушении нормального соотношения субпопуляций стромальных предшественников как в облученных, так и в необлу-ченных участках костного мозга, причем КОЕ-Ф в облученном костном мозге почти полностью (96,4%) были представлены фракцией, формирующей в культуре рыхлые колонии.

Таблица 8

Соотношение субпопуляций КОЕ-Ф в облученных и необлученных участках

Показатели Облученный к.м. (СОД 40 Гр), п=13 Необлученный к.м., п=23 Норма

КОЕ-Ф, формирующие плотные колонии (%) 3,6±3,8 15,1 ±2,8 55,0±5,0

КОЕ-Ф, формирующие рыхлые колонии (%) 96,4+3,9 84,9+2,8 45,0+5,0

Показатели циркулирующих предшественников гранулоцитарно-макро-фагального ряда и зрелых лейкоцитов у данной группы пациентов сохранялись на близком к контролю уровне.

Таким образом, исследование гемопоэза на уровне клеток стволового типа позволяет не только оценить особенности кроветворения у различных групп больных, но и изучить реакцию системы крови на применяемые цитостатичес-кие воздействия. Использование методов клонирования гемопоэтических клеток в культуре предоставляет возможность более раннего выявления признаков повреждения кроветворения, и, следовательно, расширяет диапазон профилактических и лечебных мероприятий, направленных на предотвращение или уменьшение клинически значимых гематологических последствий противоопухолевой терапии.

ВЫВОДЫ

1 .Состояние кроветворения у больных лимфогранулематозом, оцененное с использованием методов клонирования кроветворных клеток в культуре, отражает гематологическую направленность системных проявлений опухолевого процесса. При этом содержание гемопоэтических и стромальных клоно-генных предшественников у пациентов с конституциональными симптомами значительно превышает соответствующие показатели больных с бессимптомным течением ЛГМ.

2. Гематологические показатели пациентов без общих проявлений заболевания не выходят за пределы нормы, а исходные различия в состоянии кроветворения больных ЛГМ с наличием или отсутствием симптомов интоксикации исчезают после одного-двух циклов ПХТ, что позволяет использовать систему гемопоэза указанной категории больных в качестве модели для изучения гематологических эффектов терапевтического облучения.

3. В участках костного мозга, облученных в суммарных дозах 20-25 Гр, в среднем через полгода происходит восстановление функциональной активно-

сти гемопоэза. Регенерация стромы костного мозга после облучения осуществляется преимущественно за счет субпопуляции КОЕ-Ф, обладающей меньшей радиочувствительностью и формирующей в культуре рыхлые колонии.

4. Облучение костного мозга в суммарных дозах, превышающих 35 Гр, вызывает стойкую необратимую аплазию, прослеженную в сроки до 18-23 лет после проведения локального терапевтического облучения.

5. В необлученном костном мозге спустя 18-23 года после завершения лучевой терапии нарастает тенденция к гипоплазии кроветворной ткани, выражающаяся в снижении общей клеточности и значительном уменьшении содержания костномозговых КОЕ-ГМ и КОЕ-Ф. Изменения, выявляемые в ком-партменте клеток стволового типа, предшествуют сдвигам в морфологически дифференцируемом пуле костного мозга, при этом содержание циркулирующих предшественников грануломоноцитопоэза и зрелых лейкоцитов в периферической крови сохраняется на нормальном уровне.

6. Больные лимфогранулематозом до лечения имеют характерное для здоровых лиц соотношение субпопуляций КОЕ-Ф. В отдаленные сроки после проведения лучевой терапии как в облученных, так и в необлученных участках костного мозга отмечается значительное уменьшение содержания стромаль-ных предшественников, обладающих большим пролиферативным потенциалом и формирующих в культуре плотные колонии-клоны.

7. В изученных условиях терапевтические дозы преднизолона вызывают мобилизацию клеток-предшественниц гранулоцитарно-макрофагального ряда из костного мозга в периферическую циркуляцию без явных признаков повышения активности костномозгового гемопоэза.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Данилова М.А., Колесникова А.И., Павлов В.В. и соавт. Кроветворные клетки-предшественники и гемопоэтические ростовые факторы у больных

лимфогранулематозом в процессе комбинированного лечения // В кн. "Проблемы современной онкологии". Тез. докл. IY Всероссийского съезда онкологов, т.1, МЗМП РФ, Ростов-на-Дону, 1995, 315-317.

2. Колесникова А.И., Карпов Д.А., Данилова М.А. и соавт. Эффекты общей электромагнитной гипертермии на циркулирующие КОЕ-ГМ и колоние-стимулирующую активность плазмы у больных лимфогранулематозом // Там же, 503-504.

3. Данилова М.А., Колесникова А.И., Павлов В.В. и соавт. Показатели колоние-стимулирующей активности плазмы и циркулирующих гранулоцитарно-мак-рофагальных предшественников у больных лимфогранулематозом на этапах комбинированной терапии // "Актуальные вопросы гематологии". Матер, конференции, Санкт-Петербург, 1995,11-12.

4. Колесникова А.И., Карпов Д.А., Данилова М.А. и соавт. Эффекты общей электромагнитной гипертермии на циркулирующие КОЕ-ГМ у больных лимфогранулематозом // Вопросы онкологии, 1995, т. 41, N2, с. 98.

5. Данилова А.И., Колесникова А.И., Павлов В.В. и соавт. Характеристика клоногенных клеток в облученном костном мозге больных лимфогранулематозом после комбинированного лечения // Матер. I съезда онкологов стран СНГ, Москва, 1996, т. II, crpSií?

6. Данилова М.А., Колесникова А.И., Павлов В.В. и соавт. Новое в понимании компенсаторных гематологических реакций и их исходов при локальном фракционированном гамма - облучении // Тер. архив, 1997, N 7 ( в печати).

7. Kolesnikova АЛ., Karpov D.A., Danilova М.А. et al. Effects of whole-body-hyper-thermia (WBH) combined with chemotherapy on the circulating CFU-GM and plasma CSA-GM in patients with Hodgkin's disease // The 18th Intern. Symp. On Clinical Hypotermia, Abstract Book, 1995, p. 65.

Заказ 633 Объём 1,25 п. л. Формаг 60x841/16 Тираж 100

Отпечатано в Обнинской городской типографии 249U20, г. Обнинск, ул. Комарова, 6