Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Влияние ингибитора эндотелин-превращающего фермента на степень развития легочной гипертензии у животных, подвергавшихся воздействию гипоксии

□ □3488 156

на правах рукописи

СИМОНОВА АЛЕКСАНДРА ИГОРЕВНА

ВЛИЯНИЕ ИНГИБИТОРА ЭНДОТЕЛИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА НА СТЕПЕНЬ РАЗВИТИЯ ЛЕГОЧНОЙ ГИПЕРТЕНЗИИ У ЖИВОТНЫХ, ПОДВЕРГАВШИХСЯ ВОЗДЕЙСТВИЮ ГИПОКСИИ

14.00.16 - патологическая физиология 03.00.13 - физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 о ДЕК 2009

Москва-2009

003488156

Работа выполнена в лаборатории патофизиологии дыхания УРАМН Научно-исследовательского института общей патологии и патофизиологии РАМН

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор доктор биологических наук Официальные оппоненты: доктор биологических наук доктор биологических наук, профессор Ведущая организация: ГОУ Медицинский факультет Российского университета дружбы народов.

Защита диссертации состоится 24.12._ 2009 года в/У ¿'¿'часов на заседании

Диссертационного совета Д 001.003.001 при УРАМН Научно-исследовательского института общей патологии и патофизиологии РАМН по адресу: 125315, Москва, Балтийская ул., д.8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института.

Автореферат разослан "_"_2009 года.

Н.А.Медведева Н.В.Саноцкая

И.А.Тараканов О.С.Тарасова

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Л.Н.Скуратовская

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Длительное пребывание организма в состоянии гипоксии приводит к развитию патологических процессов, как в малом, так и большом круге кровообращения. В этом случае адаптивная констрикторная реакция легочных сосудов переходит в патологический процесс, проявляющийся в увеличении давления в малом круге кровообращения, и гипертрофии правого сердца - легочную гипертензию (ЛГ) [McCulloch КМ, 1998]. Одним из факторов патогенеза является изменение секреторной функции эндотелия, выражающееся в уменьшении эндотелийзависимого расширения легочных сосудов и увеличения эндогенного синтеза вазоконстрикторного пептида - эндотелина-1 (ЭТ-1) [Stewart DJ, 1991, Goerre S, 1995, Rubens С, 2001]. Литературные данные, касающиеся синтеза клетками эндотелия основного сосудорасширительного фактора - оксида азота (N0) при ЛГ, многочисленны и достаточно противоречивы [Teng GQ, 2001, Thijssen D.H., 2008], и вопрос о взаимодействии этих вазоактивных эндотелиальных факторов при формировании ЛГ остается открытым. Применение блокаторов эндотелиновых рецепторов приводит к уменьшению степени развития ЛГ и рекомендовано в качестве средства при лечении этого заболевания [Gregan В et al, 2004; Christian F. et al 2008]. Однако, вопрос о том, является ли увеличение уровня ЭТ-1 при ЛГ причиной заболевания или возникает в результате развития легочной формы гипертонии остается открытым.

В настоящем исследовании была предпринята попытка изучить возможный механизм участия ЭТ-1 в реакции хронического повышения давления в малом круге кровообращения при длительном действии гипоксии. Для этого было использовано хроническое применение ингибитора эндотелин-превращающего фермента (ЭПФ), катализирующего образование вазоактивного пептида эндотелина-1 (ЭТ-1) из его предшественника - биг эндотелина в тканях животных и человека. В качестве ингибитора ЭПФ было использовано новое оригинальное соединение - «РР36», разработанное в Институте Биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН [Позднев В.Ф. и др., 1998; Гомазков O.A., Позднев В.Ф. и др., 2000].

Цель исследования заключалась в том, чтобы в модельных экспериментах на крысах, используя ингибитор ЭПФ и уменьшение синтеза ЭТ-1, изучить участие этого пептида в механизме развития гипоксической формы легочной гипертензии и пути коррекции данной патологии.

Задачи исследования. Для достижения цели на стоящего исследования были поставлены следующие задачи:

1. Оценить эффективность ингибитора ЭПФ, вещества РР36, на синтез ЭТ-1.

2. Изучить влияние хронического применения соединения РР36 на основные показатели сердечно - сосудистой системы у нормотензивных крыс линии

3. Исследовать влияние хронического применения соединения РР36 на степень развития гипоксической легочной гипертензии в условиях экспериментальной модели,

4. Провести анализ изменений реактивности сосудов малого и большого кругов кровообращения в ответ на введение сосудосуживающих и сосудорасширительных агентов у животных всех экспериментальных групп.

5. Изучить влияние уменьшения синтеза ЭТ-1 на реактивность изолированных легочных сосудов нормотензивных и подвергавшихся воздействию гипоксии животных в ответ на перфузию сосудосуживающих и сосудорасширительных агентов.

6. Оценить влияние уменьшения синтеза ЭТ-1 на продукцию оксида азота по уровню экскреции его основных метаболитов с мочой, у экспериментальных животных.

Научная новизна работы. В работе были получены результаты, свидетельствующие о том, что торможение синтеза эндотелина-1 с помощью ингибитора ЭПФ, уменьшает степень развития гипоксической формы легочной артериальной гипертензии. У животных со сниженным синтезом ЭТ-1 в меньшей степени развивалась гипертрофия правого желудочка сердца, и увеличение артериального давления в малом круге кровообращения.

В ходе данного исследования были получены приоритетные данные об увеличении вклада оксида азота в формирование уровня АД на фоне снижения синтеза ЭТ-1. Результаты проведенных экспериментов указывают на существование зависимости между выраженностью гипоксической формы легочной гипертензии и индивидуальной чувствительностью организма к гипоксии и продукцией эндогенного N0.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты, полученные в настоящей работе, конкретизируют существующие представления об участии эндотелина-1 как фактора системной регуляции АД в норме и в патогенезе легочной гипертензии, вызываемой воздействием хронической гипоксии. Проведенное комплексное исследование, включающее в себя

эксперименты in vivo и in vitro, а также изучение механизмов реализации физиологических реакций, позволило получить новые данные о роли секреторной функции эндотелия в развитии JIT, возникающей при гипоксическом воздействии, и выявить значение взаимосвязи систем биосинтеза ЭТ-1 и N0 в этом процессе.

В настоящем исследовании показано, что использование соединений, ингибирующих активность ЭПФ, могут рассматриваться как потенциальные терапевтические средства медикаментозного воздействия на клинические аспекты данной патологии.

Положения, выносимые на защиту:

1. Снижение синтеза эндотелина-1 у нормотензивных крыс линии Wistar способствует увеличению реактивности сосудов малого круга кровообращения к вводимым экзогенно ЭТ-1 и N0.

2. Снижение синтеза ЭТ-1 уменьшает степень развития легочной гипертензии, возможно за счет потенцирования продукции эндогенного N0 и увеличения реактивности к нему сосудов гладкой мускулатуры.

3. Степень развития экспериментальной легочной гипертензии определяется индивидуальной чувствительностью животных к гипоксическому воздействию, которая в частности зависит от соотношения уровней ЭТ-1 и N0.

Апробация результатов исследования. Основные результаты работы были представлены на IV Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 80-летию Института физиологии им И.П. Павлова РАН (Санкт-Петербург, 2005); IV Российской конференции «Гипоксия; Механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2005); XX Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007); V Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 100-леппо со дня рождения академика ВН. Черниговского (Санкт-Петербург, 2007); X международной конференции, посвященной изучению эндотелина (Бергамо, 2007), на Ежегодной Встрече Скандинавского Физиологического Общества (Оулу, 2008), а также на 19 Европейской Встрече, посвященной изучению гипертензии (Милан, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 1 статья и 8 тезисов

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы (358

источников, в том числе 26 отечественных и 332 зарубежных). Объем диссертации 157 страниц машинописного текста, в том числе 38 рисунков и 18 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования выполнены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (1977) на самцах белых крыс линии Wistar весом 200-300г., полученных из вивария НИИ Общей патологии и патофизиологии (РАМН). Животных содержали в стандартных условиях, согласно требованиям европейской ассоциации FELASA/ICLAS [Guiade for use the laboratory animals, 1996]. С началом эксперимента животных рассаживали по отдельным клеткам для учета потребления раствора, содержащего РР36, или воды.

Группы животных, используемые в экспериментах. Все эксперименты проводились на четырех группах животных: первая группа представляла собой возрастной контроль (К-К); вторая группа ежедневно принимала с питьевой водой ингибитор эндотелин-превращающего фермента РР36 (К-РРЗб); третья группа подвергалась воздействию гипоксии (Тип); четвертая группа подвергалась воздействию гипоксии и ежедневно принимала с питьевой водой ингибитор эндотелин-превращающего фермента РР36 (Гип-РРЗб).

Ингибитор ЭПФ. В качестве ингибитора ЭПФ в данной работе использовался оригинальный отечественный препарат РР36 (пероральная форма - (RS)-N" - [1- карбокси - 2- (бензил-аминокарбонил) этил] - L - лейцил - L -триптофан) (рис.1.), синтезированный в НИИ биомедицинской химии им. В.Н.Ореховича (РАМН) Поздневым В.Ф. РР36 в течение 14 дней ежедневно добавляли в питьевую воду животных групп К-РР36 и Гип-РРЗб, учитывая индивидуальное суточное потребление воды каждым животным, так чтобы доза РР36 составляла 1,7 мг/кг/сут.

О

Рис.1. Формула ингибитора эндотелин-превращающего фермента РР 36.

Моделирование легочной гипертензии. Для моделирования гипоксической формы легочной гипертензии крыс помещали в барокамеру объемом 50л с разряжением воздуха, соответствующего 5000 м над уровнем моря, и вентиляцией воздуха 10-12 л/мин [Абдулла А., Шорникова М.В., и соавт., 1991] на 10 часов в светлое время суток 7 дней в неделю на протяжении 2-х недель [MacLean M., McCuIIoch К., 1998].

Моделирование острой гипобарической гипоксии (ОГГ). Животных по очереди помещали в барокамеру и в течение одной минуты «поднимали» на высоту 11 500 метров над уровнем моря. Замеряли время нахождения крыс на данной высоте до остановки дыхания и потери позы.

Эксперименты in vivo. Гемодинамические параметры: систолическое, диастолическое, среднее системное артериальное давление, систолическое, диастолическое, среднее правожелудочковое давление (СПЖД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС) регистрировали на 14-й день эксперимента у наркотизированных животных через имплантированные в бедренную артерию и правый желудочек сердца катетеры. Имплантация катетеров крысам проводилась под тиопенталовым наркозом (40мг/кг, в/б) ["Руководство по экспериментальной физиологии кровообращения", Мурашев А.Н. и др., 1992]. Через 1 час после вживления и присоединения к датчикам катетеров производили регистрацию гемодинамических параметров на компьютере с частотой оцифровки 512 Гц. Полученные данные обрабатывали с помощью модифицированной программы Bioshel [Кундузова O.P., Мурашев А. и соавт., 1997].

Протокол исследований in vivo. После получасового адаптационного периода наркотизированным животным внутривенно вводили ЭТ-1 (Sigma) в дозе 1,4 мкг/кг и регистрировали изменения параметров гемодинамики в течение часа. Следующим вводили гипотензивный агент, донор NO -нитропруссид натрия в дозе 3 мкг/кг (НП) (Sigma) и производили регистрацию параметров гемодинамики в течение 15 минут. Последним вводили неселективный блокатор NO-синтазы - Nco-nitro-1-arginine methyl ester (L-NAME) (Sigma) в дозе 1,4 мг/кг и производили регистрацию параметров гемодинамики в течение 1,5 часов.

Оценка гипертрофии правого желудочка сердца крыс. Степень развития легочной гипертензии оценивалась по величине гипертрофии правого желудочка сердца (гипертрофии сердца - ГС), по следующей формуле: ГС (o.e.)

= (М пр.жел. (г)/(М лев.жел (г) + М перег. (г)) • 100 % [Ito K.M. et al., 2000]; М пр. жел. (г) - вес правого желудочка сердца в г, М лев. жел. (г) - вес левого желудочка сердца в г, М перег.(г) - вес внутрисердечной перегородки в г. (o.e. -относительные единицы измерения).

Исследования in vitro. Исследования проводились на препарате сегмента легочной артерии второго порядка длиной 3-4 мм закрепленного на канюле из нержавеющей стали при проточной перфузии. Сосуды перфузировали с постоянным расходом 2 мл/мин в термостатируемой камере (37,5°С) объемом 10 мл. Для перфузии использовали модифицированный физиологический раствор Кребса-Хенсляйта (мМ концентрация веществ: NaCl-118, KCl-4,7, CaCl2-3,3, MgS04-2,4, глюкоза -5,05, KH2P04- 1,18, NaHC03-24,9; рН=7,4), раствор аэрировали 5% С02 и 95% Ог, поддерживая постоянную температуру, равную 37°С [Nesterova,1999]. О реакции сосуда судили по изменению перфузионного давления, измеренного посредством датчика давления (STATHAM, USA) и аналогово-цифрового преобразователя.

Протокол исследований in vitro. После получасового периода стабилизации изолированные сосуды последовательно перфузировали растворами серотонина в дозах от 10"8 до 10"5 М и эндотелина-1 в дозах от 10'12 до 10"9 М. Для изучения эндотелийзависимого и эндотелийнезависимого расслабления сосуды перфузировали растворами ацетилхолина в диапазоне концентрации от 10"8 до 10"5 М и нитропруссида натрия в диапазоне концентраций от 10'8 до 10'3 М, на фоне тонуса, создаваемого перфузией раствора серотонина в дозе Ю"6 М.

Определение продукции оксида азота. Для оценки уровня продукции NO определяли концентрацию нитратов и нитритов в моче. Животных помещали в специализированные метаболические камеры на 1 сутки и измеряли потребление НгО и объем выведенной мочи. Определение нитратов и нитритов в собранных пробах суточной мочи производили по модифицированному методу Грисса. Определение продукции NO производили у одних и тех же животных дважды: до и после гипоксического воздействия.

Количественное определение эндотелина-1. Определение уровня ЭТ-1 производили иммуноферментным методом с использованием набора реактивов Biomedica, согласно инструкции, предоставляемой производителем.

Количественное определение ангиотензина II. Определение уровня Анг-II производили иммуноферментным методом с использованием набора реактивов Peninsula, согласно инструкции, предоставляемой производителем.

Статистический анализ. Полученные в ходе исследования данные представлены в виде среднее ± ошибка среднего. Статистическую обработку результатов производили с помощью пакета статистической программы Statistica 6.0 (Statine., USA). Для статистической обработки данных, полученных в эксперименте по определению устойчивости животных к гипоксии, использовали критерий Фишера для малочисленных выборок. При изучении физиологических эффектов ингибитора РР36 использовали критерий Манна - Уитни. При анализе данных, полученных в нескольких сериях экспериментов, применяли способы обсчета ANOVA. При анализе данных экспериментов на изолированных сосудах использовали критерий Крускалла-Уолиса. Уровень доверительной вероятности р<0,05 рассматривали как статистически значимый.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Исследование эффективности ингибитора ЭПФ.

Об активности ЭПФ в физиологических экспериментах можно судить по изменению количества ЭТ-i в плазме крови животных [Wada А.,2002]. Используемый в нашей работе ингибитор ЭПФ - соединение РР36 - структурно схож с ингибитором ангиотензин-превращающего фермента. Однако ферментативная и физиологическая специфичность действия РР36 была подтверждена в предшествующих экспериментах, где было установлено, что применение РРЗб в течение 4 дней уменьшает содержание ЭТ-1 в плазме крови экспериментальных животных, за счет торможения синтеза ЭТ-1 из предшественника биг-ЭТ-1 [Петрухина В.А. и др. 2001].

Таблица 1.

Уровень ЭТ-1 и Анг-П в плазме животных.

К-К К-РР36 Гип Гип-РРЗб

ЭТ-1 (пкМ/мл) 0,54±0,02 0,48±0,01* 0,71±0,03* 0,47±0,03*#

Анг-П (пкМ/мл) 22,3±1,3 21 ¿±1,6 44,1±3,4* 42,4±3,2*

* - статистически значимые отличия от группы К-К (р<0,05),

# - значимые отличия от группы Гип (р<0,05)

В нашей работе были показано, что двухнедельное воздействие гипоксии (Ог 10%) приводит к увеличению на 31% ( р<0,05) уровня ЭТ-1 в плазме крови опытных животных (группа Гип) /Табл. 1/. Хроническое применение соединения РР-36 (Гип-РРЗб) приводило к снижению уровня ЭТ-1 в плазме

9

крови на 66%, относительно группы Гип. Хроническое применение РР36 достоверно уменьшает синтез ЭТ-1 у контрольных животных на 12% (группа К-РР36). В то же время применение РР-36, ингибитора ЭПФ, не влияло на уровень ангиотензина II в крови контрольных животных и животных, подвергавшихся гипоксическому воздействию, в то время как само гипоксическое воздействие значительно увеличивало уровень этого пептида в крови животных.

2. Влияние уровня циркулирующего ЭТ-1 на гемодинамические показатели при гипоксической легочной гипертензии.

Развитие гипоксической формы ЛГ характеризовалось достоверным уменьшением симптомов данной патологии на фоне хронического применения вещества РР36. А именно: наблюдалось значительное уменьшение прибавки относительного веса правого желудочка сердца в 1,5 раза (ГС) и уменьшение давления в правом желудочке сердца в 1,2 раза (СПЖД) (р<0,05), а также нормализация системного АД /Табл. 2/.

Таблица 2.

Основные параметры деятельности сердечно - сосудистой системы.

К-К К-РР36 Гип Гип-РРЗб |

п=10 п=10 п=10 п=10

ГС o.e. 29,6±1,0 29,7±2,0 58,2±б,0* 37,8±5,0*#

СПЖД мм рт.ст. 31,1±0,2 27,3±0,6 46,1±0,3 * 37,6±0,2 *#

ср.АД мм рт.ст. 112,0±2,3 116,5±5,7 136,6±2,4* 114,5±3,0#

| ЧСС уд/мин 293,1±0,37 293,2±0,8 306,1±0,9* 317,9±1,3*#

* - статистически значимые отличия от группы К-К (р<0,05),

# - значимые отличия от группы Гип (р<0,05)

Увеличение ЧСС наблюдаемое у животных Гип-РРЗб, согласуется с данными других исследователей [Петрухина и др., 2001]. Вероятное объяснение этому эффекту состоит в том, что при ЛГ одной из реакций, в ответ на угнетение синтеза ЭТ-1, может быть увеличение реактивности к N0, который в относительно низких концентрациях обладает положительных хронотропным эффектом [Balligand, 1997; Kojda,1997].

3. Влияние уровня циркулирующего ЭТ-1 на изменение реакции среднего артериального давления при действии гипер-и-гипотензивных агентов

Таблица 3.

Изменения ср.АД в ответ на внутривенное введение ЭТ-1, донора оксида азота и неселективного блокатора КО-синтазы Ь-ЫАМЕ.

К-К К-РР36 Гип Гип-РРЗб

п=15 п=15 п=15 п=15

ЭТ-11,4 мкг/кг Д % реакции 6,5±3,3 7,9±3,8 -1,9±5,5* 18,5±2,4*#

НП 3 мкг/кг Д % реакции 30,8±3,2 35,6±3,8 19,2±3,3* 30,6±2,1#

L-NAME 5 мг/кг А % реакции 47,8±3,2 44,7±1,7 15,8±2,2* 23,2±0,9*#

Д % реакции - отношение величины изменения ср.АД у наркотизированных животных после внутривенного введения ЭТ-1, НП, Ь-ЫАМЕ к величине ср.АД до введения соответствующих веществ в %.

* - статистически значимые отличия от группы К-К (р<0,05), # - значимые отличия от группы Гип (р<0,05).

Изучение изменений среднего артериального давления в ответ на системное введение ЭТ-1, НП и L-NAME не выявило достоверных различий ни в АД, ни в ЧСС у животных группы К-РР36 по сравнению с К-К. Можно было предположить, что уменьшение уровня циркулирующего ЭТ-1 на 12% не является существенным для поддержания нормального уровня системного АД у контрольных животных или комперсируется в ходе двухнедельного эксперимента.

Развитие гипоксической JIT приводит к значительному уменьшению реактивности сосудистой системы большого круга кровообращения на ЭТ-1 (в 3,4 раза) и N0 (в 1,6 раз) по сравнению с группой К-К. Из этого следует что JIT, являясь заболеванием не только малого, но и большого круга кровообращения, сопровождается снижением реакции системных сосудов как на сосудосуживающие, так и на сосудорасширяющие вазоактивные факторы. Хроническая блокада синтеза ЭТ-1 у группы Гип-РРЗб с помощью ингибитора ЭПФ РР36 увеличивала сосудосуживающую реакцию на внутривенное введение ЭТ-1 не только по сравнению с группой Гип (в 9,7 раз), но и по сравнению с соответствующей контрольной группой животных К-РР36 в 2,3 раза. Данный эффект, возможно, может объясняться изменением чувствительности или количества ЭТ-рецепторов на фоне уменьшения количества циркулирующего ЭТ-1. Кроме того, в группе Гип-РРЗб, наблюдалось восстановление реакции на НП до величины в контрольной группе К-К (30,8±3,2Д%), что косвенно может свидетельствовать об увеличении чувствительности к N0 системы гуанилатциклаза/цГЦ гладкой мышцы сосудов. Оценивая изменение

реактивности сосудов у животных с ЛГ на неселективный блокатор ЫО-синтазы Ь-ЫАМЕ, можно говорить о значительном уменьшении, в 3, раза реакции на его введение по сравнению с контролем. Применение ингибитора ЭПФ, соединения РР36, в 1,5 раза увеличивало максимальный ответ сосудов большого круга кровообращения на Ь-ЫАМЕ на фоне развития ЛГ. Можно предположить, что на фоне развития ЛГ снижается вклад оксида азота в формирование величины среднего АД, однако, блокада синтеза ЭТ-1 увеличивает вклад N0 в формирование среднего АД, на фоне ЛГ.

4. Влияние уровня циркулирующего ЭТ-1 на изменение величины систолического давления в правом желудочке сердца животных в ответ на введение гипо-и-гипертензивных агентов.

Таблица 4.

Величины изменения СПЖД в ответ на внутривенное введение ЭТ-1, донора оксида азота - НП и неселективного блокатора ЫО-синтазы Ь-1МАМЕ.

К-К К-РР36 Гип Гип-РРЗб

п=15 11=15 п=15 п=15

ЭТ-11,4 мкг/кг А % реакции 20,6±0,5 34,8±1,6* 14,1 ±2,4* 4,5±2,4*#

НП 3 мкг/кг Л % реакции 41,5±3,2 59,8±1,7* 10,7±0,9*# 20,9±3,2*

L-NAME 5 мг/кг Д % реакции 70,3±3,2 65,1 ±2,9* 31,3±2,7* 46,9±0,5*#

Д % реакции - отношение величины изменения СПЖД у наркотизированных животных после внутривенного введения ЭТ-1, НП, Ь-КАМЕ к величине СПЖД до введения соответствующих веществ в %.

* - статистически значимые отличия от группы К-К (р<0,05), # - значимые отличия от группы Гип (р<0,05).

Установлено, что у контрольных крыс, хронически принимавших ингибитор ЭПФ, гипертензивная реакция в малом круге кровообращения (увеличение систолического правожелудочкового давления = СПЖД) на введение ЭТ-1 было у животных группы К-РРЗб в 1,7 раз больше чем у К-К. При этом реакция СПЖД на донор оксида азота у этих животных увеличилась в 1,4 раза. Известно, что активация ЭТВ рецепторов, расположенных на эндотелиальных клетках, вызывает увеличение продукции простациклина или NO [Shichiri М et al, 1997; Christian F et al, 2008]. С другой стороны известно, что применение блокатора NO-синтаз в значительной мере потенцирует суживающий эффект ЭТ-1 при перфузии почки [J.l.Marshall, 1999]. В нашей работе было показано возрастание реакции на экзогенный NO-донор на фоне

уменьшения содержания ЭТ-1. Данную реакцию можно рассматривать как компенсаторный ответ, вызванный увеличением реактивности на гипертензивные факторы, который приводит к нормализации СПЖД. А возможно это проявление активно изучаемого в настоящее время взаимодействия между ЭТ-1, экзогенным и эндогенным оксидом азота и их участия в регуляции сосудистого тонуса. Таким образом, уменьшение циркулирующего ЭТ-1 имеет сигнальное значение для регуляции системы кровообращения в малом круге кровообращения, в отличие от большого круга кровообращения. Возможно, это связано с тем, что ЭТ-1 принимает участие в регуляции реактивности легочных сосудов при адаптивных реакциях.

При изучении реактивности сосудов малого круга кровообращения у животных с ЛГ были получены результаты, свидетельствующие о том, что реакция сосудов на внутривенное введение ЭТ-1 уменьшенная в 1,5 раз в группе Гип, по сравнению с К-К, еще в большей степени уменьшалась в группе Гип-РР36 - в 3 раза, относительно Гип. В то время как в сосудах большого круга кровообращения наблюдалось достоверное увеличение этой реакции - в 9,7 раз по сравнению с Гип. Данное различие, возможно, объясняется тем, что в сосудах легких на эндотелии располагаются ЭТВ подтип рецепторов к ЭТ-1, которые участвуют в интернализации циркулирующего ЭТ-1. Больше экзогенного ЭТ-1 удаляется из кровотока и меньше достигает рецепторов, расположенных на гладкой мышце сосудов, что и приводит к уменьшению гипертензивной реакции на экзогенный ЭТ-1. В большом круге кровообращения процесс интернализации отсутствует и наблюдается увеличение гипертензивного ответа на ЭТ-1.

Что касается реакций сосудов малого круга кровообращения на донор N0 и блокатор NO-синтаз, то они не отличались от реакций большого круга кровообращения. У животных группы Гип реакции на введение донора N0 - НП и на L-NAME были меньше по сравнению с К-К в 3,9 и 2,2 раза соответственно. Однако, наблюдалось достоверное увеличение, как гипотензивной реакции на нитропруссид натрия в 1,9 раз, так и гипертензивной реакции на блокатор NO-синтаз в 1,5 раза, относительно Гип. Возможно, это объясняется увеличением чувствительности гладких мышц сосудов к оксиду азота и возрастанием его вклада в формирование величины АД у животных с ЛГ, развивающейся на фоне снижения синтеза ЭТ-1.

Для более подробного изучения возможного механизма реализации данного эффекта в следующей серии экспериментов были проведены исследования

реактивности изолированных легочных сосудов животных в ответ на введение экзогенного ЭТ-1 и донора N0, а также ацетилхолина, опосредующего выделение эндогенного N0.

5. Влияние уровня эндогенного ЭТ-1 на изменение реактивности изолированных легочных сосудов животных.

Первым регистрируемым параметром в данной серии экспериментов было фоновое перфузионное давление сосудов (ПД). Фоновое перфузионное давление, регистрируемое при перфузии сосудов физиологическим раствором с постоянным расходом 2 мл/мин. В наших экспериментах было показано, что у животных с ЛГ наблюдалось увеличение на 70%, с 14,3±1,0 до 24,3±3,9 мм рт.ст. (р<0,05), фонового ПД в группе Гип, по сравнению с К-К. Хроническое применение ингибитора ЭПФ у животных с ЛГ (Гип-РРЗб) значимо уменьшало фоновое перфузионное давление изолированного легочного сосуда до 11,5±0,7мм рт.ст. что достоверно не отличалось от такового в группах контрольных животных - К-К и К-РР36 (14,3±1,0 и 12,0±0,3 мм рт.ст. соответственно). Можно предположить, что снижение синтеза ЭТ-1 предотвращает патологические изменения в стенке сосудов легких, о чем свидетельствует, сравнимое со значениями в контрольных группах, перфузионное давление в изолированных сегментах легочных сосудах у животных, принимавших ИЭПФ РР36 и подвергавшихся гипоксическому воздействию.

30 25

. 20

¡3

¿15

10 5 О

12

К-К

К-РР36

Гип

Гип-РРЗб

Рис.2. Величины фонового перфузионного давления легочных сосудов экспериментальных животных

*- статистически значимые отличия от группы К-К(р<0,05), # - значимые отличия от группы Гип (р<0,05)

В последующих экспериментах было изучено, как изменяется реактивность изолированных легочных сосудов животных с уменьшенным уровнем эндогенного ЭТ-1 в ответ на введение ЭТ-1 и донора N0, а также определялась эндотелийзависимая реакция на Ацх, опосредуемая выделением эндогенного N0. В этих экспериментах была подтверждена повышенная реактивность легочных сосудов животных, хронически принимавших РР-Зб, на экзогенный ЭТ-1. Констрикторный ответ легочных сосудов в группе К-РР36 (Емакс=231,6Д%) был значимо больше такового в группе К-К (Емакс=218,5Д%) при концентрациях ЭТ-1 2*10"10 - 10'9М. Дозазависимый сосудосуживающий эффект на ЭТ-1 в сосудах, изолированных из легких животных группы Гип-РР36 (Емакс=221,7Д%), был достоверно больше, чем в группе Гип (Емакс=169,2 Д%) при всех используемых концентрациях. Применение РРЗб также увеличивало реакцию изолированных сосудов животных группы К-РР36 к экзогенному N0 - нитропруссиду натрия на 7,2Д%. Расширение в ответ на НП в группе животных Гип-РРЗб было достоверно больше в 1,4 и 1,3 раза по сравнению с К-К и К-РР36 соответственно, и в 3,7 раз, по сравнению с группой Гип. В группе Гип-РРЗб наблюдалось также достоверное восстановление эндотелийзависимой реакции на Ацх до уровня контроля, уменьшенной в 3 раза у животных группы Гип. Эти данные подтверждают вывод, сделанный ранее, при сравнительном анализе реакций большого и малого круга кровообращения на исследованные гипотензивные факторы.

Рис.3. Дозозависимое изменение перфузионного давления изолированных легочных сосудов в ответ на ЭТ-1 в диапазоне концентраций 10'12 - 10'9 М; *- статистически значимые отличия от группы К-К(р<0,05), # - значимые отличия от группы Гип (р<0,05)

Таблица 5.

ЕД50 и Етах развиваемые легочными сосудами при перфузии растворами ацетилхолина (Адх) и нитропруссида натрия (НП).

1 Ацх ЕД50 НП ЕД50

А% реакции [С]М А% реакции [С1М

к-к 66,95 7,9* 10'"8 52,4 8,7*10"8

К-РР36 78,45* КГ7 59,6* 7,6*10"'

Гип 11,9* 2,4* Ю'"6 20,3* 3,2* Ю-7

Гип-РРЗб 67,8# 1,3*10'"7 74,35*# 7,1*10*8

Емакс Емакс

А% реакции ГС1М А% реакции [С1М

К-К 91,1 10г5 79,3 КГ4

К-РР36 94,2 Ю'-5 88,2* 10'"5

Гип 19,9* 10'"5 26* КГ9

Гип-РРЗб 100*# 10'"3 91,54 10'"'

*- статистически значимые отличия от группы К-К(р<0,05),

# - значимые отличия от группы Гип (р<0,05)

Можно предположить, что уровень эндогенного синтеза ЭТ-1 и/или его количество, достигающее гладкую мышцу сосудов, определяет ее чувствительность к оксиду азота, а, следовательно, существенно влияет на расширительный потенциал сосудов. Возможно, уменьшение синтеза ЭТ-1 способствует увеличению синтеза эндогенного N0 и его вклада в формирование величины АД.

Для подтверждения этого предположения была проведена серия экспериментов по изучению продукции основных метаболитов N0 для всех экспериментальных групп животных. В ходе проведения исследований с определением продукции нитратов и нитритов с мочой, были получены противоречивые данные: у половины животных, подвергавшихся воздействию гипоксии, наблюдалось увеличение продукции метаболитов N0, а у других, наоборот, снижение. В связи с этим, было принято решение разделить животных, подвергавшихся двухнедельному воздействию гипоксии, по результатам теста на острую гипобарическую гипоксию, на более и менее устойчивых к такому воздействию. Были сформированы группы Гип и Гип-РР36, которые включали равных по весу и количеству «более или менее» устойчивых к гипоксии животных.

В ходе изучения зависимости между устойчивостью животных к гипоксии и гипертрофией правого желудочка сердца, как показателя степени развития ЛГ, были получены результаты, свидетельствующие, что ЛГ в большей степени (на 19%; р<0,05) развивается у животных группы Гип-м/уст, нежели у Гип-б/уст. У животных, хронически потреблявших ингибитор ЭПФ, вещество РР36 (Гип-РРЗб-м/уст и Гип-РР36-б/уст), гипертрофия сердца развивалась, в значимо (р<0,05), меньшей степени - на 32,6% и 26,5%, относительно групп Гип-м/уст и Гип-б/уст соответственно, и не зависела от устойчивости животных к гипоксии (р<0,05).

75

Гип м/уст

Гип б/уст Гип-РР36 м/уст Гип-РРЗв 6/уст

Рис.4. Относительные вес правого желудочка сердца (ГС) животных, подвергавшихся двухнедельному гипоксическому воздействию.

@ - статистически значимые отличия от группы Гип м/уст (р<0,05),

$ - значимые отличия от группы Гип б/уст( р<0,05).

Из полученных данных, следует что, развитие гипоксической формы ЛГ находится в прямой зависимости от устойчивости животных к гипоксии. При этом хроническое ингибирование эндогенного синтеза ЭТ-1, на фоне воздействия гипоксии, значимо, уменьшает степень развития данной патологии вне зависимости от устойчивости животных к гипоксии.

6. Влияние уровня эндогенного ЭТ-1 на продукцию оксида азота.

Для сбора суточной мочи и дальнейшего определения продукции нитратов и нитритов животных помещали в специализированные метаболические камеры. Значимых отличий в потреблении воды (мл/сут) во всех исследуемых группах как до, так и после гипоксического воздействия выявлено не было (в среднем 23,7 мл). Также не было выявлено значимых отличий в объеме выводимой мочи (мл/сут) ни до, ни после гипоксической экспозиции (в среднем 22,8 мл).

При изучении зависимости между степенью устойчивости животных к гипоксии и продукцией оксида азота, которую оценивали по количеству выведения нитратов и нитритов с мочой, было установлено отсутствие значимых различий в продукции N0 у всех исследуемых животных до гипоксического воздействия (Гип-м/уст., Гип-б/уст., Гип-РР36-м/уст., Гип-РРЗб-б/уст).

150 ■

□ До гипокической экспозиции

Гип м/уст Гип б/уст Гип-РРЗб м/уст Гип-РРЗб б/уст

Рис.5. Скорость выведения нитратов и нитритов с мочой (мкМ/м-д/сут) у экспериментальных животных до и после двухнедельного гипоксического воздействия.

@ - статистически значимые отличия от группы Гип м/уст (р<0,05), $ - значимые отличия от группы Гип б/уст( р<0,05),

+ - значимые отличия от показателей в той же группе до гипоксического воздействия ( р<0,05).

Измерение суточной продукции N0 у животных с легочной гипертензией показало, что развитие Ж сопровождается снижением в 1,9 раз (р<0,05) уровня Ж)х, выводимых с мочой у менее устойчивых к гипоксии животных (Гип м/уст) и, напротив, увеличением в 2,3 раза (р<0,05) у более устойчивых к гипоксии крыс (Гип б/уст). Эти показатели коррелируют со степенью развития легочной гипертензии. Таким образом, у менее устойчивых к гипоксии животных ЛГ развивается в большей степени, и продукция N0 у них понижена по сравнению с более устойчивыми к гипоксии животными. Хроническая блокада ЭПФ, на фоне развития ЛГ, способствовало еще большему увеличению суточной продукции N0 (в 3,7 раз (р<0,05)) у более устойчивых к гипоксии животных -Гип-РРЗб б/уст, не влияя при этом на выведение метаболитов N0 у менее устойчивых к гипоксии крыс - Гип-РЗб м/уст. По-видимому, один из существенных механизмов приспособления организма к хроническому

воздействию гипоксии связан с уровнем эндогенной продукции оксида азота, что соответствует физиологической индивидуальности организма.

7. Изменение уровня циркулирующего ЭТ-1 и Анг-П у животных с разной индивидуальной устойчивостью к гипоксии, подвергавшихся двухнедельному гипоксическому воздействию.

Изучение соотношения между уровнем ЭТ-1 в плазме крови и устойчивостью животных к гипоксии показало, что у менее устойчивых к гипоксии животных - Гип м/уст, уровень ЭТ-1 в крови был на 52% выше после гипоксической экспозиции, нежели в контроле. В группе Гип-б/уст. содержание ЭТ-1 превышало контрольный уровень лишь на 17%. На фоне воздействия гипоксии хроническое применение ингибитора ЭПФ-РР36 статистически значимо снижало уровень ЭТ-1 в крови как у менее (Гип-РРЗб м/уст), так и у более устойчивых к гипоксии животных (Гип-РРЗб б/уст), в равной степени (36-39%)/Рис. 6/.

Рис.6. Уровень ЭТ-1 в плазме (пкМ/мл) у всех экспериментальных групп

животных на 14-й день эксперимента.

* - статистически значимые отличия от группы К-К,

@ - значимые отличия от группы Гип м/уст (р<0,05),

$ - значимые отличия от группы Гип б/уст( р<0,05),

«-значимые отличия от группы Гип-РРЗб м/уст.

Изучение зависимости между уровнем Анг-П в крови и степенью устойчивости животных к гипоксии показало наличие обратной зависимости между устойчивостью животных к гипоксии и изменением уровня Анг-II в

крови, сопутствующему развитию JIT. Хроническое применение ингибитора ЭПФ не влияло на это соотношение. У менее устойчивых к гипоксии (Тип м/уст. и Гип-РРЗб м/уст.) крыс уровень Анг-П был весьма существенно - на 137% и 120% (52,4±4,0 и 49,6±3,7 пкМ/мл соответственно) выше (р<0,05) такового в контрольных группах: К-К и К-РР36 (22,3±1,3 и 21,2±1,6 пкМ/мл, соответственно). В то же время у более устойчивых к гипоксии животных: Гип б/уст. и Гип-РРЗб б/уст. уровень Анг-П в плазме был на 61% и 60% (35,4+2,0 и 35,1±2,7 пкМ/мл соответственно) выше (р<0,05) такового в контрольных

Рис.7, Уровень Анг-П в плазме (пкМ/мл) у всех экспериментальных групп животных на 14 день эксперимента. * - статистически значимые отличия от группы К-К, @ - значимые отличия от группы Гип м/уст (р<0,05), «-значимые отличия от группы Гип-РРЗб м/уст.

Исходя из полученных нами данных, следует, что развитие гипоксической формы легочной артериальной гипертензии сопровождалось увеличением уровня Анг-П в крови в большей степени у менее устойчивых к гипоксии животных. Хроническая блокада ЭПФ не оказывала влияния на данный показатель.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Заключая изложенное выше можно сказать, что степень развития гипоксической формы легочной гипертензии зависит от индивидуальной устойчивости организма животного к гипоксии. Чем выше устойчивость, тем в меньшей степени под воздействием гипоксии стимулируется образование ЭТ-1 и Анг-П, тем в больше степени синтезируется N0. В результате сдвига

равновесия между сосудосуживающими и сосудорасширительными факторами, в сторону последних, уменьшается степень гипертрофии сосудистой стенки, правого желудочка сердца и давления в нем, нормализуется системное артериальное давление, а, следовательно, и уменьшается выраженность гипертонии. Хроническое применение ингибитора ЭПФ РР36 в значительной степени уменьшает степень развития ЛГ, снижая количество ЭТ-1 в плазме и увеличивая продукцию N0.

ВЫВОДЫ:

1. Снижение уровня циркулирующего эндотелина-1 на 12%, обусловленное применением ингибитора эндотелии - превращающего фермента РР36, изменяет реактивность сосудов МКК у нормотензивных животных, но не влияет на величину артериального давления в малом круге кровообращения.

2. Ингибитор эндотелин-превращающего фермента, вещество РР36, при хроническом применении достоверно снижает степень развития гипоксической легочной гипертензии, о чем свидетельствует понижение системного и правожелудочкового артериального давления, перфузионного давления в изолированных легочных сосудах, а также уменьшение относительного веса правого желудочка сердца у крыс.

3. Уменьшение уровня циркулирующего эндотелина-1 при гипоксической форме легочной гипертензии приводит к увеличению вклада N0 в регуляцию АД, возможно за счет увеличения чувствительности гладкой мышцы сосудов к N0 и/или возрастанию его продукции.

4. Степень развития легочной артериальной гипертензии зависит от соотношения уровня эндотелина-1 и N0, и индивидуальной чувствительности животных к гипоксии.

Автор выражает благодарность д.х.м., главному научному сотруднику Института биомедицинской химии им В.Н.Ореховича РАМН Поздневу Владимиру Федоровичу; д.б.н., профессору, главному научному сотруднику Института биомедицинской химии им В.Н.Ореховича РАМН Гомазкову Олегу Александровичу. Научным руководителям: профессору, д.б.н., Медведевой Наталье Александровне, д.б.н. Саноцкой Наталье Владимировне. А также благодарность сотрудникам кафедры Физиологии человека и животных биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова за помощь и ценные советы в подготовке данной диссертационной работы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Симонова А.И., Позднев В.Ф., Гомазков O.A., Медведева H.A. Хроничекое применение ингибитора эндотелии - превращающего фермента снижает степень развития гипоксической формы легочной гипертензии у крыс // Российский физиологический журнал имени И.М.Сеченова.- 2008.-Т.94(7).-С.777-784.

2. Симонова А.И., Позднев В.Ф., Гомазков O.A., Медведева H.A. Участие эндогенного пептида эндотелина в регуляции сосудистого тонуса в норме и патологии // Механизмы функционирования висцеральных систем. Тез. докл. IV Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 80-летию Института физиологии им И.П. Павлова РАН.- СПб.,2005.-С.29-30.

3. Симонова А.И., Позднев В.Ф., Гомазков O.A., Медведева H.A. Эндотелии как фактор патогенеза легочной гипертензии, вызванной адаптацией к гипоксии // Гипоксия; Механизмы, адаптация, коррекция. Тез. докл. IV Российской конференции. - М., 2005. - С.56-58.

4. А.И. Симонова, H.A. Медведева, В.Ф. Позднев, О.А.Гомазков. Влияние блокатора эндотелии - превращающего фермента на развитие легочной гипертензии у крыс, вызванной адаптацией к жесткой гипоксии // Тез. докл. XX Съезда Физиологического общества им. И.П.Павлова. - М., 2007. - С. 416.

5. НА. Медведева, А.И. Симонова, В.Ф. Позднев, O.A. Гомазков. Роль эндотелиальных факторов в регуляции сосудистого тонуса в малом круге кровообращения в норме и при легочной гипертензии // Механизмы функционирования висцеральных систем. Тез. докл. V Международной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения академика В.Н. Черниговского.- СПб, 2007. - С. 199.

6. Симонова А.И., Позднев В.Ф., Гомазков O.A. Хроническое применение ингибитора эндотелии - превращающего фермента уменьшает степень развития легочной артериальной гипертензии у крыс, вызванной адаптацией к жесткой гипоксии // Механизмы функционирования висцеральных систем. Тез. докл. V Международной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения академика В.Н. Черниговского.- СПб, 2007. - С. 293.

7. Simonova A., Pozdnev V., Gomazkov О., Medvedeva N.. Endothelin converting enzyme inhibitor decreases right ventricular pressure, right ventricular hypertrophy and increases the reaction on L-NAME and NO production in rats with hypoxia induced pulmonary hypertension // 10th International Conference on Endothelin - ET-10, Italy, Bergamo, 16-19 july, 2007, abstract nr.: 055.

8. Simonova A., Pozdnev V., Gomazkov O., Medvedeva N.. Endothelin converting enzyme inhibitor decreases endothelin-1 plazma level and increases NO production with urine in rats with hypoxia induced pulmonary arterial hypertension // Scandinavian Physiological Society Annual Meeting SPS2008, Finland, Oulu, August 15-17,2008, abstract nr.: 06.

9. Medvedeva NA., Simonova AT, Poznev VF, Gomazkov OA. Interaction of endothelin-1 and nitric oxide in the pathogenesis of hypoxic forms of pulmonary hypertension // 19-th European Meeting on Hypertension, Milan, June 12-16, 2009,

abstract nr.: 385.

■

Список используемых в работе сокращений: 5-НТ - серотонин

L-NAME - Nco-nitro-l-arginine methyl ester

NO - оксид азота

NOS - синтаза оксида азота

NOx - метаболиты оксида азота (нитраты/нитриты)

АнгП - ангиотензин II

Ацх - ацетилхолин

БКК - большой круг кровообращения ГС - гипертрофия сердца

ИЭПФ - ингибитор эндотелии - превращающего фермента

ЛГ - легочная гипертензия

МКК - малый круг кровообращения

НП - нитропруссид натрия

ОГГ - острая гипобарическая гипоксия

СПЖД - систолическое правожелудочковое давление

ЭПФ - эндотелии превращающий фермент

ЭТ-1 - эндотелии 1 (1-21)

ЭТА - эндотелиновые рецепторы типа А

ЭТВ - эндотелиновые рецепторы типа В

SIMONOVA ALEXANDRA IGOREVNA

ENDOTHELIN CONVERTING ENZYME INHIBITOR EFFECT ON SEVERITY OF HYPOXIA INDUCED PULMONARY HYPERTENSION IN

ANIMALS

Pulmonary arterial hypertension (PAH) - disease, characterized by the elevated right ventricular systolic pressure, pulmonary vessels remodeling and right heart ventricle hypertrophy.. The pathogenesis of PAH is not completely understood, but its accepted mechanisms include vasoconstriction, endothelial dysfunction and smooth muscle cell proliferation. Two of the most important factors produced by the vascular endothelium are the endothelium-derived relaxing factor nitric oxide (NO) and the endothelium-derived vasoconstrictor peptide endothelin-1 (ET-l).Its role in pulmonary hypertension is supported by increased levels of circulating ET-1, as well as increased local production. There is a correlates between ET plasma levels and the severity of PAH in patients. The aim of our study was to investigate the effects of original endothelin converting enzyme inhibitor (ECEI) (Orekhovich Institute of Biomedical Chemistry, Russian) - PP36 (Pozdnev et al.1998) on development of right ventricular overload, systolic right ventricular pressure (RVSP) and reactivity of the pulmonary vessels in, Wistar rats with hypoxia induced pulmonary hypertension (hPAH). This data shows that blocking functional endothelin-converting enzyme (ECE) activity may offer a new approach to inhibit the development of hypoxia induced pulmonary arterial hypertension in rat by preventing transformation of big Endothelin-1 (big ET-1) to vasoactive Endothelin-1 (ET-1) with ECE inhibitor - PP36.

Treatment with ECE blocker PP36 significantly reduced pathological changes due to hypoxia induced pulmonaiy hypertension. One of the reasons may be the increased production and role of NO in pulmonary artery tone.

Change of ET-1 concentration correlates with animal tolerance to hypoxia. As well changes due to hypoxia in NOx production correlates with animal tolerance to hypoxia and blockade of ECE with PP-36 significantly increases this effect

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД № 1-00007 от 25.09.2000 г. Подписано в печать 04.08.2009 Тираж 80 экз. Усл. п.л. 1,5 Печать авторефератов: 730-47-74,778-45-60

Актуальность проблемы. Длительное гипоксическое состояние организма приводит к развитию патологических процессов, как в малом, так и большом круге кровообращения. Дыхательная система в первую очередь реагирует на хроническое снижение напряжения кислорода в циркулирующей крови. В этом случае адаптивная констрикторная реакция легочных сосудов переходит в патологический процесс, проявляющийся в увеличении давления в малом круге кровообращения, и гипертрофии правого сердца - легочную гипертензию (ЛГ) [McCulloch K.M., 1998]. Легочная гипертензия - заболевание, которое характеризуется увеличением давления в малом круге кровообращения, структурной перестройкой легочных сосудов и гипертрофией правых отделов сердца. Параллельно развивается изменение системного артериального давления, которое может либо увеличиваться, либо уменьшаться в зависимости от формы ЛГ. Одним из факторов патогенеза этого заболевания является изменение секреторной функции эндотелия, выражающееся в уменьшении эндотелийзависимого расширения и увеличения синтеза вазоконстрикторных факторов и в частности эндогенного пептида -эндотелина-1 (ЭТ-1) [Stewart D.J., 1991, Goerre S., 1995, Rubens С., 2001]. Известно, что количество циркулирующего ЭТ-1 при ЛГ возрастает в 2-3 раза [Goerre S., 1995], а также показано его участие в активации пролиферации и миграции гладкомышечных клеток сосудов. Литературные данные, касающиеся синтеза клетками эндотелия основного сосудорасширительного фактора оксида азота (N0) при ЛГ, многочисленны и достаточно противоречивы [Teng G.Q., 2001, Thijssen D.H., 2008]. Вопрос о взаимодействии вазоактивных эндотелиальных факторов при формировании этой патологии остается открытым. Синтез эндогенного эндотелина происходит из его предшественника биг -эндотелина (Биг-ЭТ), при участии специфического фермента - эндотелин-превращающего фермента (ЭПФ). [Opgenorthet al., 1992; Turner and Murphy, 1996]. Эндотелия реализует свои эффекты путем связывания со специфическими рецепторами - ЭТА и ЭТВ. Через оба типа рецепторов эндотелии вызывает пролиферацию гладкомышечных клеток сосудов и сужение сосудов, если они расположены на гладкой мышце, а через ЭТВ, если он расположен на эндотелии, продукцию сосуд орасширительных (NO, PGI2) и сосудосуживающих агентов (тромбоксан), а также обратный захват эндотелина. В медицинской и экспериментальной практике в качестве одного из способов уменьшения воздействия эндотелина на гладкую мышцу сосудов широко применяются антагонисты рецепторов эндотелина, специфически блокирующие ЭТА рецепторы или одновременно оба типа рецепторов - ЭТА и ЭТВ. [Rubin LJ, et al, 2002; Giannick RN, et al, 2001]. Однако, согласно существующей гипотезе - 'cross-talk1, селективная блокада одного из ЭТ рецепторов может компенсироваться за счет другого типа рецептора. [Clozel М et al, 1995; Sauvageau S et al, 2007; Christian F et al, 2008]. Функционально это означает, что ЭТВ рецепторы, экспрессируемые на гладкомышечных клетках сосудов, сливаются с ЭТА и принимают на себя вазоконстрикторные функции последнего [Gregan В. et al, 2004; Christian F. et al 2008]. В настоящем исследовании была предпринята попытка изучить возможный механизм участия ЭТ-1 в реакции хронического повышения давления в малом круге кровообращения при длительном действии гипоксии. Для этого было использовано хроническое применение ингибитора ондотелин-превращающего фермента (ЭПФ), катализирующего образование вазоактивного пептида эндотелина-1 (ЭТ-1) из его предшественника - биг эндотелина в тканях животных и человека. В качестве ингибитора ЭПФ было использовано новое оригинальное соединение - «РР36», разработанное в Институте Биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН [Позднев В.Ф. и др., 1998; Гомазков О.А., Позднев В.Ф. и др., 2000].

Цель исследования заключалась в том, чтобы в модельных экспериментах на крысах, используя ингибитор ЭПФ и уменьшение синтеза ЭТ-1, изучить механизмы развития гипоксической формы легочной гипертензии и пути коррекции данной патологии.

Задачи исследования. Для достижения цели настоящего исследования были поставлены следующие задачи:

1. Оценить эффективность ингибитора ЭПФ, вещества РР36, на синтез ЭТ-1.

2. Изучить влияние хронического применения соединения РРЗб на основные показатели сердечно - сосудистой системы у нормотензивных крыс линии Wistar.

3. Исследовать влияние хронического применения соединения РРЗб на степень развития гипоксической легочной гипертензии в условиях экспериментальной модели.

4. Провести анализ изменений реактивности сосудов малого и большого кругов кровообращения в ответ на введение сосудосуживающих и сосудорасширительных агентов у животных всех экспериментальных групп.

5. Изучить влияние уменьшения синтеза ЭТ-1 на реактивность изолированных легочных сосудов нормотензивных и подвергавшихся воздействию гипоксии животных в ответ на перфузию сосудосуживающих и сосудорасширительных агентов.

6. Оценить влияние уменьшения синтеза ЭТ-1 на продукцию оксида азота по уровню экскреции его основных метаболитов с мочой, у экспериментальных животных. Научная новизна работы:

В работе были получены результаты, свидетельствующие о том, что блокада синтеза эндотелина-1, с помощью ингибитора эндотелии - превращающего фермента, уменьшает степень развития гипоксической формы легочной артериальной гипертензии. У этих животных в значительно меньшей степени развивалась гипертрофия сердца и увеличение давления в малом кругу кровообращения, т.е. уменьшалась степень ЛГ.

В ходе данного исследования были получены приоритетные данные, свидетельствующие о том, что на фоне блокады синтеза ЭТ-1 увеличивается вклад оксида азота в формирование АД. Результаты проведенных экспериментов указывают на существование прямой зависимости между степенью выраженности гипоксической формы легочной гипертензии и индивидуальной чувствительностью организма к гипоксии.

Индивидуальная устойчивость к гипоксии зависит от соотношения синтеза ЭТ-1 и N0 в организме. Было показано, что после гипоксического воздействия продукция N0 у животных с низкой устойчивостью к гипоксии снижалась, а у животных с высокой устойчивостью, наоборот, увеличивалась. Уменьшение синтеза ЭТ-1 у высоко устойчивых к гипоксии животных приводила к увеличению продукции N0 еще в большей степени.

Теоретическая н практическая значимость работы.

Полученные данные конкретизируют существующие представления об участии эндотелина-1 в регуляции АД не только в ходе развития легочной гипертензии, но и в норме. Проведенное комплексное исследование, включающее в себя эксперименты in vivo, in vitro, а также изучение биохимических механизмов реализации физиологических реакций позволило получить новые данные о роли секреторной функции эндотелия в развитии ЛГ при гипоксическом воздействии и выявить участие и важность взаимосвязи систем синтеза ЭТ-1 и N0 в этом процессе,

Снижение синтеза эндотелина-1 значительно уменьшает степень развития ЛГ, уменьшая количество циркулирующего ЭТ-1 и увеличивая продукцию N0, а также, препятствуя патологическому увеличению давления и гипертрофии в МКК. Было показано, что уменьшение циркулирующего ЭТ-1 у нормотензивных животных на 12% имеет сигнальное значение для регуляции системы кровообращения в малом, но не в большом круге кровообращения. Уменьшение циркулирующего ЭТ-1 на 12% значимо увеличивает реактивность гладкой мышцы легочных сосудов как к ЭТ-1, так и к экзогенному N0, что, вероятно, свидетельствует о ведущей роли гладкой мышцы сосуда в реализации проявления взаимодействия между ЭТ-1 и N0.

Настоящее исследование позволяет рассматривать ингибиторы эндотелин-превращающего фермента, как класс соединений, потенциально обладающего медикаментозным действием, что важно не только для понимания патогенеза ЛГ, но и разработки лечебной терапии этого сложного заболевания. Положения, выносимые на защиту:

1. Снижение синтеза эндотелина-1 у нормотензивных крыс линии Wistar способствует увеличению реактивности сосудов малого круга кровообращения к вводимым экзогенно ЭТ-1 и N0.

2. Снижение синтеза ЭТ-1 уменьшает степень развития легочной гипертензии за счет потенцирования продукции эндогенного N0 и увеличения реактивности к нему сосудов гладкой мускулатуры.

3. Степень развития экспериментальной легочной гипертензии определяется индивидуальной чувствительностью животных к гипоксическому воздействию, которая зависит от соотношения уровней ЭТ-1 и N0.

Апробация результатов исследования. Основные результаты работы были представлены на IV Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 80-летию Института физиологии им И.П. Павлова РАН (Санкт-Петербург, 2005); IV Российской конференции: Гипоксия; Механизмы, адаптация, коррекция (Москва, 2005); на XX Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007); V Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 100-летию со дня рождения академика В.Н. Черниговского (Санкт-Петербург, 2007); на XX международной конференции, посвященной изучению эндотелина (Бергамо, 2007), на Ежегодной Встрече Скандинавского Физиологического Общества (Оулу, 2008), а также на 19 Европейской Встрече, посвященной изучению гипертензии (Милан, 2009).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, экспериментальной части, обсуждения

1. Снижение синтеза эндотелна-1 на 12%, с помощью ингибитора эндотелии -

превращающего фермента РР36, изменяет реактивность МКК, не влияя на величину давления в малом круге кровообращения.2. Блокада синтеза эндотелина-1 значимо уменьшает степень развития гипоксической формы легочной гипертензии у крыс.3. Блокада синтеза эндотелина-1 при гипоксической форме легочной гипертензии приводит к увеличению вклада NO в регуляцию АД, возможно за счет увеличения чувствительности гладкой мышцы сосудов к N0 и возрастанию его продукции.4. Соотношение уровня эндотелина-1 и N0 определяет индивидуальную чувствительность крыс к гипоксии, а также степень развития легочной гипертензии.