Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Влияние гипергомоцистеинемии и наследственных факторов риска тромбофилии на особенности клинического течения облитерирующего атеросклероза нижних конечностей

На правах рукописи 00505151а

ДМИТРИЕВА АЛИСА РАФАЭЛЕВНА

ВЛИЯНИЕ ГИПЕРГОМОЦИСТЕИНЕМИИ И НАСЛЕДСТВЕННЫХ ФАКТОРОВ РИСКА ТРОМБОФИЛИИ НА ОСОБЕННОСТИ КЛИНИЧЕСКОГО ТЕЧЕНИЯ ОБЛИТЕРИРУЮЩЕГО АТЕРОСКЛЕРОЗА АРТЕРИЙ

НИЖНИХ КОНЕЧНОСТЕЙ

14.01.21 - гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских паук

11 ДПР 2013

Санкг-Петербург 2013

005051519

Работа выполнена в ФГБУ «РОССИЙСКИЙ НИИ ГЕМАТОЛОГИИ И ТРАНСФУЗИОЛОГИИ» ФМБА России (директор - доктор медицинских наук, профессор А. В. Чечеткин)

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Людмила Петровна Папаян доктор биологических наук Сергей Игоревич Капустин

Официальные оппоненты:

член-коррсснондент РАМН, заслуженный деятель науки РФ

доктор медицинских наук профессор

ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский

Государственный медицинский

университет имени академика И.П. Павлова»

Минздравсоцразвития РФ,

декан лечебного факультета Петрищев Николай Николаевич

член-корреспондент Петровской академии наук и искусств, заслуженный врач России

доктор медицинских наук , профессор кафедры трансфузиологии Северо-Западного медицинского

университета имени И.И. Мечникова Дуткевич Игорь Георгиевич

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови"

191024, г. Санкт-Петербург, ул. 2-я Советская, д.16

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского НИИ гематологии и трансфузиологии

Автореферат разослан «_»_2013 года

Ученый секретарь специализированного совета

доктор медицинских наук Татьяна Валентиновна Глазанова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

В настоящее время показатели инвалидизации и смертности в России от сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) являются одними из самых высоких в мире (Национальные рекомендации по кардиоваскулярной профилактике, 2011). Данный факт объясняется большей распространенностью среди жителей нашей страны ряда общепризнанных факторов риска развития сердечно-сосудистой патологии, которые напрямую ассоциированы с достаточно низким социально-экономическим уровнем жизни россиян. К таким факторам, прежде всего, относятся несбалансированное питание, психосоциальный стресс и связанные с ним такие поведенческие факторы риска как курение, избыточное потребление алкоголя и т.д. Наряду с общепризнанными факторами риска выявлен и активно изучается целый ряд потенциальных индукторов развития сердечно-сосудистой патологии, которые в отдельности или при сочетании с классическими факторами риска способны ускорять и усугублять развитие ССЗ.

Среди потенциальных индукторов сердечно-сосудистой патологии важная роль отводится гипергомоцистеинемии (ГГЦ) — повышенному содержанию гомо-цистеина (ГЦ) в плазме крови. Экспериментальные исследования убедительно свидетельствует о патологическом воздействии на организм гомоцистеина в концентрациях выше физиологических (Roybai С. et al., 2004). Показано, что данное воздействие является комплексным и реализуется, прежде всего, путем прямого цитотоксического воздействия гомоцистеина на эндотелий сосудов, что, в конечном итоге, приводит к развитию атеросклеротического процесса и эндотелиальной дисфункции с угнетением антикоагулянтных и активацией прокоагулянтных свойств эндотелия (Durand P.et al., 2001; Eberhardt R. et al., 2000).

Облитерирующий атеросклероз артерий нижних конечностей (ОААНК) начинает развиваться задолго до появления первых клинических симптомов (асим-птомная форма), по риску развития критических осложнений сопоставим с атеросклерозом коронарных артерий (Grundy S. et al., 2004; Steg P. et al., 2007) и может рассматриваться как значимый предиктор системного атеросклероза. До настоящего времени данные об этиопатогенезе тромбоза и атеросклеротических процессов полностью не раскрыли механизма их взаимного влияния. Поскольку гомоци-стеин оказывает одновременно и атерогенное и тромбоваскулярное действие, изучение роли этого фактора представляется крайне важным с точки зрения прогноза клинического течения ОААНК.

Развитие ССЗ в существенной степени обусловлено генетическими особенностями организма. На сегодняшний момент выявлен целый ряд генов, аллельные варианты которых независимо или синергично могут модифицировать риск развития и характер течения сердечно-сосудистой патологии. Большинство из них кодирует компоненты плазменного и тромбоцитарного звеньев гемостаза или вовлечены в патогенез эндотелиальной дисфункции (Gehring N. et al., 2001; Lewis S. et al., 2005; Press R. et al., 2002). Вопрос об ассоциации между носительством дан-

VA

ных генетических вариантов и особенностями клинического течения ОААНК в настоящее время изучен недостаточно.

Существующие на сегодняшний момент методы лечения ОААНК не приводят к полному излечению пациентов, поэтому риск прогрессирования данного заболевания, а также развития тромботических эпизодов в других сосудистых бассейнах для пациентов с ОААНК остается высоким всю жизнь (Национальные рекомендации по ведению пациентов с сосудистой артериальной патологией. Часть 1. Периферические артерии, 2010). В связи с этим, изучение влияния гипергомо-цистеинемии и наследственных факторов риска тромбофилии на особенности клинического течения облитерирующего атеросклероза артерий нижних конечностей представляется крайне актуальным.

Все вышесказанное определило значимость данного исследования и явилось основанием для его проведения.

Цель исследования.

Установить степень влияния гипергомоцистеинемии и наследственных факторов риска тромбофилии на особенности клинического течения облитерирующего атеросклероза артерий нижних конечностей.

Задачи исследования.

1. Определить частоту встречаемости гипергомоцистеинемии у пациентов с облитерирующим атеросклерозом артерий нижних конечностей.

2. Изучить клинико-лабораторные особенности течения облитерирующего атеросклероза артерий нижних конечностей у больных с гипергомоцистеине-мией.

3. Провести оценку состояния системы гемостаза у больных облитерирующим атеросклерозом артерий нижних конечностей в зависимости от уровня го-моцистеина в плазме крови.

4. Оценить влияние ГГЦ на концентрацию циркулирующих эндотелиоцитов в плазме крови.

5. Изучить влияние полиморфизма С677Т в гене метилентетрагидрофолат ре-дуктазы на уровень гомоцистеина в плазме крови больных облитерирующим атеросклерозом артерий нижних конечностей.

6. Оценить наличие ассоциативных связей между генетическими маркерами тромбофилии и особенностями клинического течения облитерирующего атеросклероза артерий нижних конечностей.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Гипергомоцистеинемия является значимым самостоятельным фактором риска развития облитерирующего атеросклероза артерий нижних конечностей, оказывающим также существенное влияние на тяжесть течения заболевания.

2. Неблагоприятное влияние повышенного содержания гомоцистеина в плазме крови на характер клинического течения атеросклеротического процесса обусловливается сочетанием прямого атерогенного воздействия избытка

этого метаболита на эндотелий сосудов с тенденцией к большей выраженности прокоагулянтных нарушений и сопутствующим угнетением системы естественных антикоагулянтов. 3. Наличие в генотипе наследственных факторов риска, предрасполагающих к развитию гипергомоцистеинемии и гиперкоагуляционного синдрома, ассоциировано с неблагоприятным клиническим течением облитерирующего атеросклероза артерий нижних конечностей.

Научная новизна.

Впервые продемонстрировано, что тяжесть течения ОААНК и наличие клинически выраженной сопутствующей сосудистой патологии при этом заболевании ассоциированы с содержанием ГЦ в плазме крови.

Впервые установлено, что концентрация десквамированных циркулирующих эндотелиоцитов связана со степенью тяжести хронической артериальной недостаточности, что позволяет рассматривать данный показатель как неблагоприятный прогностический маркер клинического течения ОААНК.

Впервые показана ассоциация между носительством аллеля МТНРЯ 677Т, генотипа РА1-1 ЛаЛС и степенью хронической артериальной недостаточности у больных с ОААНК.

Практическая значимость.

Полученные результаты могут быть использованы в алгоритме обследования больных облитерирующим атеросклерозом артерий нижних конечностей, что позволит спрогнозировать особенности клинического течения заболевания и выбрать адекватные методы его лечения и профилактики тромботических осложнений.

Апробация материалов диссертации.

Положения диссертационной работы были представлены на третьей Международной конференции по гипергомоцистеинемии (Саарбрюкен, Германия, 2003г.), на Международном конгрессе "Тромбоз, гемостаз и патология сосудов" (Санкт-Петербург, Россия, 2004), а также на Международном Конгрессе по тромбозу и гемостазу (Сидней, Австралия, 2005).

Внедрение результатов исследования в практику.

Полученные результаты используются при обследовании больных с сердечно-сосудистой патологией, которым оказывается стационарная и амбулаторная помощь в Российском НИИ гематологии и трансфузиологии.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, описания объектов, материалов и методов исследования, изложения результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 12 таблицами 10 рисунками. Библиография включает 121 источник, из них 24 - отечественных и 97 - зарубежных.

Личный вклад автора.

Автором лично выцолнены исследования системы гемостаза. Проведен сбор анамнестических данных, регистрация, статистическая обработка, анализ полученных данных и обобщение результатов исследований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Обследовано 120 пациентов в возрасте от 36 до 75 лет (средний возраст 64,4 ± 7,2 года) с диагнозом "облитерирующий атеросклероз артерий нижних конечностей", находившихся на стационарном или амбулаторном лечении в Российском НИИ гематологии и трансфузиологии. Клинический диагноз ОААНК устанавливался на основании анамнестических данных и был подтвержден методами ультразвуковой допплерографии, ретроградной и антеградной ангиографии в рентгенологическом отделе РосНИИГТ. Критериями исключения из исследования являлись: перенесенный острый тромбоз любой локализации в течение трех месяцев до обследования; прием антикоагулянтных препаратов и лекарственных препаратов, влияющих на уровень гомоцистеина плазмы крови (на момент первичного лабораторного исследования); хроническая почечная и/или печеночная недостаточность; злокачественные новообразования любой локализации; возраст более 75 лет. У всех больных, включенных в исследование, учитывалось наличие классических факторов риска развития сердечно-сосудистой патологии (активное курение, артериальная гипертензия, показатели нарушения липидного статуса, ожирение и т.д.). У преобладающего числа пациентов (96%) был выявлен один или несколько классических факторов риска развития ССЗ. Подавляющее большинство обследованных составили лица мужского пола - 98 человек (81,7 %).

Материалом для исследования являлась венозная кровь, полученная путем пункции локтевой вены и стабилизированная 3,8% раствором цитрата натрия в соотношениях 9:1 и 4:1 для оценки коагуляционного и тромбоцитарного звеньев гемостаза соответственно. Для определения содержания ГЦ в плазме крови и проведения молекулярно-генетических исследований венозная кровь стабилизировалась 2,5% раствором ЭДТА в соотношении 9:1. Образцы геномной ДНК выделяли из лейкоцитарной фракции согласно Miller S. et al. (1998).

Коагулологические параметры определялись на автоматическом коагуло-метре ACL-200 производства "Instrumentation Laboratories", США. Исследование включало определение у больных активированного парциального тромбопласти-нового времени (АПТВ), протромбинового теста по Квику (ПТ), концентрации фибриногена. Концентрация фибриногена определялась хронометрическим методом (по Клауссу). Помимо этого проводилось определение ристомицин-кофакторной активности фактора Виллебранда (VWF R:Co) и содержания фактора Виллебранда (VWF Ag), активности фактора VIII и антитромбина (Петрищев Н.Н., Папаян Л.П., 1999). Для оценки VWF R:Co использовалась бестромбоцитар-ная плазма пациента (источник фактора Виллебранда) и стандартная взвесь фор-малинизированных тромбоцитов фирмы "Технология-Стандарт" (Россия, Барнаул). Определение содержания тканевого активатора плазминогена (t-PA) было выполнено иммунноферментным методом (ELISA). Измерение содержания гомоцистеина в плазме проводилось методом жидкостной хроматографии под высоким давлением с флуоресцентной детекцией (Fiskerstrand Y.et al.,1993). Определение

количества циркулирующих десквамированных эндотелиальных клеток (ДЭК) в крови выполнялось согласно методике Hladovec и Rossmann (HIadovec J. , Rossmann R, 1973).

Молекулярно-генетическое тестирование проводилось методом ПЦР в лаборатории биохимии РосНИИГТ (руководитель д.б.н. С.И. Капустин).

Статистический анализ полученных результатов, построение таблиц и диаграмм проводилось на персональном компьютере с использованием программ Microsoft Exel, GraphPad Prism (версия 4.0), Attestat (версия 12.2), Past (версия 1.82b) в среде Windows. Для характеристики разброса полученных значений использовался такой показатель, как стандартное отклонение (SD). Показатель "отношение шансов" OR (odds ratio) определялся при двустороннем доверительном интервале CI (confidence interval), равном 95%. Статистическая значимость различий устанавливалась при значениях р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

На первом этапе исследования был выполнен анализ содержания ГЦ в плазме крови больных ОААНК. Средний уровень данного метаболита у пациентов составил 15,0±10,6 мкмоль/л, что достоверно (р<0,0001) превысило соответствующий показатель в группе контроля - 9,3±3,9 мкмоль/л (значения для группы контроля получены в лаборатории свертывания крови РосНИИГТ (Шмелева В.М. и др., 2010)). Концентрация ГЦ у мужчин, страдающих ОААНК, оказалась достоверно выше, чем у женщин (15,9±11,2 против 11,2±6,0 соответственно, р=0,004).

Для изучения влияния концентрации ГЦ на тяжесть течения ОААНК, пациенты были разделены на группы в соответствии со степенью выраженности хронической артериальной недостаточности (ХАН) согласно классификации Фонтей-на-Покровского. Среди больных частота встречаемости ХАН I степени составила 10,8%, IIA -31,7%, II Б - 27,5%, III- 20,8%, IV- в 9,2%. На рис. 1 представлены данные о среднем уровне гомоцистеина в группах пациентов с различной степенью тяжести ХАН.

Из рисунка 1 следует, что средняя концентрация ГЦ в группах неуклонно увеличивается по мере повышения степени хронической артериальной недостаточности. Выполненный сравнительный анализ между группами пациентов показал, что значения уровня ГЦ в группах больных являются статистически неоднородными (р=0,02). Среди больных у 10% была произведена ампутация пальцев или нижней конечности, связанная с развитием критической ишемии (КИК). В данной группе пациентов средняя концентрация ГЦ оказалась самой высокой и составила 20,6±18,6 мкмоль/л. Таким образом, представленные данные убедительно свидетельствуют о выраженном неблагобриятном эффекте ГТЦ на течение ОААНК.

О -1-1-1-1-1-1

I IIA ИБ III IV КИК

Рис.1 Содержание ГЦ (M±SD) в плазме крови больных с различной степенью тяжести ХАН и у лиц с критической ишемией конечностей.

Частота встречаемости гипергомоцистеинемии (значения ГЦ в плазме крови выше 13,4 мкмоль/л, согласно данным Шмелевой В.М. (Шмелева В.М. и др., 2008)) в обследованной группе больных ОААНК оказалась в 5,5 раз выше, чем в группе контроля (46,7% против 8,5% , р<0,0001; OR=5,5; С1:3,2-9,4). Существенные различия и по уровню ГЦ, и по частоте встречаемости ГГЦ между пациентами с ОААНК и контрольной группой могут быть следствием ряда факторов. Во-первых, большую часть группы больных - 57,5 % составили пациенты с клинически тяжелым течением заболевания (ХАН - IIB, III, IV), которое, как было показано выше, ассоциировано с более высокими показателями уровня ГЦ. Кроме того, у 61,7% больных был отмечен такой важный фактор риска развития ГГЦ, как регулярное курение.

В 59,2 % случаев у пациентов с ОААНК в анамнезе имелись указания на наличие сопутствующей сосудистой патологии и/или перенесенных ранее тромбо-тических эпизодов иной локализации (коронарный и /или церебральный атеросклероз, ишемический инсульт, острый инфаркт миокарда, тромбоэмболия легочной артерии). При сравнении клинических проявлений в группе пациентов с ГГЦ и без таковой была выявлена следующая закономерность. Среди больных ОААНК с ГГЦ пациенты с инструментально верифицированными патологическими процессами в другом сосудистом бассейне встречались в 1,5 раза чаще, чем среди пациентов с нормальным содержанием ГЦ в плазме крови (71,4% против 48,4% , р=0,01; OR=2,7; CI: 1,3-5,7) (рис.2). Данный факт свидетельствует о том, что ГГЦ

является прогностически неблагоприятным фактором риска, способствующим

развитию клинически выраженного генерализованного атеросклероза.

%

100

ОбезСП О с СП

с ГГЦ без ГГЦ Больные ОААНК

Рис. 2 Частота проявления сопутствующей сосудистой патологии (СП) у больных ОААНК с наличием ГГЦ и без таковой.

Важным этапом исследования явилось изучение состояния системы гемостаза у больных ОААНК в зависимости от уровня ГЦ в плазме крови. Полученные результаты сравнивались с нормативными показателями, принятыми в лаборатории свертывания крови РосНИИГТ. Были определены скрининговые показатели коагулограммы (АПТВ, протромбиновый тест по Квику, уровень фибриногена), маркеры прокоагулянтных изменений (активность фактора VIII и фактора Вил-лебранда (VWF)), а также показатели содержания фактора Виллебранда (VWF:Ag) и тканевого активатора плазминогена (t-PA), являющиеся маркерами эндотелиаль-ной дисфункции (Smith F.B. et al., 1995; Reldy M.A. et al., 1989). Помимо этого были исследованы показатели активации тромбоцитов (сумма активных форм и процент тромбоцитов, вовлеченных в агрегаты); активность анитромбина (AT), характеризующая состояние системы естественных антикоагулянтов. Полученные результаты представлены в таблице 1.

Из таблицы 1 видно, что в обеих группах пациентов с ОААНК (т.е. вне зависимости от содержания ГЦ в плазме крови) по всем (кроме АПТВ) коагуляцион-ным показателям имеются статистически значимые отличия от нормы. Данный факт свидетельствует об усилении гемостатического потенциала крови и смещении баланса системы гемостаза у обследованных больных в сторону гиперкоагуляции. Значимое увеличение активности фактора VIII и фактора Виллебранда у больных ОААНК является реакцией на хроническое воспаление и прогрессирова-

ние атеросклеротического процесса. Выявленное в обеих группах пациентов повышение, по сравнению с нормой, уровня фибриногена приводит к еще большему усугублению патологических процессов, тем самым стимулируя развитие тромбо-тических осложнений.

Таблица 1

Показатели гемостаза у больных ОААНК в зависимости от содержания ГЦ в плазме крови (М±БО)

Показатель норма Больные ОААНК

Без ГГЦ (N=64) С ГГЦ (N=56)

АПТВ (индекс) 1,0±0,1 0,97±0,10 0,96±0,09

Протромбиновый тест,% 93,7±5,7 105,98±9,01* 102,73±8,59*

Активность Р VIII,% 119±30,5 147,88±45,57* 151,71±46,92*

Активность VWF,% 99,5±21,7 148,81±41,15* 168,64±50,46*

Содержание VWF:Ag, ед/мл 0,98±0,07 1,93±0,59* 1,83±0,66*

Концентрация фибриногена, г/л 2,8±0,7 3,63±0,89* 3,85±0,96*

Активность антитромбина,% 95,0±14,0 118,36±14,64* 114,46±22,04* **

Активные формы тромбоцитов, % 19,5±5,4 34,71±8,57* 34,78±11,12*

Кол-во тромбоцитов в агрегатах, % 6,7±2,1 8,73±2,93* 8,66 ±2,03*

Содержание тканевого активатора плазминогена, нг/мл 4,5±2,8 12,21±4,24* 13,93±4,83*

Ы- число пациентов; *- достоверное различие с нормой, р<0,05

** - достоверное различие между пациентами с ГГЦ и без таковой, р<0,05

О смещении баланса системы гемостаза в сторону гиперкоагуляции у больных ОААНК свидетельствуют также и повышенные, по сравнению с нормой, показатели внутрисосудистой активации тромбоцитов (сумма активных форм тромбоцитов и процент тромбоцитов, вовлеченных в агрегаты). Несмотря на то, что подавляющее число обследованных больных получали антиагрегантные препараты, показатели, характеризующие активацию тромбоцитарного звена гемостаза, статистически значимо отличаются от нормальных как у пациентов с наличием ГГЦ, так и без таковой.

Наряду с усилением процессов, приводящих к гиперкоагуляции, у пациентов с ООАНК наблюдалась активация системы фибринолиза. Так, и в группе пациентов с ГГЦ, и без таковой было статистически значимо повышено по сравнению с нормой содержание тканевого активатора плазминогена О-РА), который ограничивает рост уже сформировавшихся тромбов, вызывая их лизис посредством активации процессов превращения плазминогена в плазмин, что приводит к расщеплению фибрина.

Несмотря на общую для всех пациентов картину гемостазиологических изменений, между группами пациентов с наличием и без ГГЦ выявлен ряд отличий. Из таблицы 1 следует, что для пациентов с ГГЦ характерна большая активность фактора Виллебранда по сравнению с больными с нормальным уровнем ГЦ (р=0,12). Активность АТ повышена по сравнению с нормой у больных ОААНК в обеих группах, что свидетельствует об активации системы естественных антикоагулянтов. Однако у больных с ГГЦ активность АТ снижена по сравнению с лицами с нормальным содержанием данного метаболита, причем выявленная особенность является статистически значимой (р<0,05). Полученный результат может быть объяснен некоторым угнетением активации системы естественных антикоагулянтов под воздействием повышенных концентраций ГЦ. Таким образом, сравнительный анализ показателей системы гемостаза у пациентов с ГГЦ и без таковой позволяет сделать вывод о том, что под воздействием избытка ГЦ у больных ОААНК происходит повышение активности протромбогенной составляющей и снижение активности атромбогенной компоненты системы свертывания крови, что еще в большей степени усиливает смещение баланса системы гемостаза у пациентов с нарушенным обменом ГЦ в сторону гиперкоагуляции.

Проведенный сравнительный анализ концентрации циркулирующих эндоте-лиоцитов в группах пациентов с ГГЦ и без таковой показал, что избыток ГЦ оказывает выраженное негативное влияние на состояние эндотелия, тем самым также и опосредованно влияя на нарушения в тромбоцитарном звене гемостаза. Установлено, что средняя концентрация эндотелиоцитов у лиц с ГГЦ существенно превысила таковую у больных с нормальным уровнем ГЦ (27,0±10,9 кл/мл против 15,9±10,0 кл/мл) и в обеих группах пациентов данный показатель оказался выше среднего значения в группе контроля - 6,8±3,5 кл/мл (рис.3). Следует отметить, что все различия между группами являлись высоко статистически значимыми (р<0,001). Другой маркер эндотелиальной дисфункции - содержание фактора Виллебранда был повышен и статистически значимо отличался от нормы в обеих группах пациентов с ОААНК, хотя между собой группы больных с и без ГГЦ статистически значимых различий не имели (р=0,25) (см.таблицу 1).

О Ч-1-1-1

еГГЦ без ГГЦ КГ Больные ОААНК

Рис. 3 Концентрация эндотелиоцитов (М±5Э) у больных с ГГЦ и без таковой, и в группе контроля.

Показательным является изменение концентрации эндотелиоцитов в зависимости от степени тяжести артериальной недостаточности. Выполненный сравнительный анализ между группами пациентов продемонстрировал, что наблюдается неуклонное повышение концентрации эндотелиоцитов по мере нарастания степени тяжести артериальной недостаточности (рис.4). Следует подчеркнуть, что различия между средними концентрациями эндотелиоцитов в группах пациентов с различными степенями ХАН являются высоко статистически значимыми (р<0,0001). Максимальных значений средняя концентрация эндотелиоцитов достигла у пациентов с наиболее тяжелыми клиническими проявлениями (IV степень ХАН) - 28,3±16,8 кл/мл (против 6,8±3,5 кл/мл в группе контроля). Аналогичный анализ был выполнен и для У\УР:А§. Было выявлено, что по мере нарастания ХАН содержание в крови фактора Виллебранда увеличивалось (соответствующие показатели оказались равными 162,1±39,0; 169,7±66,2; 173,6±47,3; 185,9±70,3; 189,4±80,4 соответственно). Однако статистической значимости различий между группами больных достигнуто не было (р=0,14). Таким образом, представленные результаты свидетельствуют о том, что прогностическим маркером клинического ухудшения атеросклеротического процесса может служить именно нарастание концентрации циркулирующих эндотелиоцитов в плазме крови.

I'

О- ^

ас а. s

ZT

ОС

s

ко

OL (I

ai ■з

45 40 35 30 25 20 15 10 5 О

с

с > с ;

) с

) с

) с

—,—,—1—,—,—

I IIA МБ III IV КИК

Рис.4 Концентрация циркулирующих эндотелиоцитов (М±БО) в плазме крови больных с различной степенью тяжести ХАН и у лиц с критической ишемией конечностей (КИК).

Одной из задач данного исследования явилось изучение роли ряда генетических детерминант, которые могут предрасполагать к развитию ГГЦ, атеросклероза артерий нижних конечностей и/или влиять на особенности клинического течения данного заболевания. Был изучен полиморфизм генов, кодирующих компоненты плазменного и тромбоцитарного звеньев гемостаза - гена фактора V (мутация FV Leiden), гена фактора II (протромбина) - Prt G20210A, гена тканевого активатора плазминогена PAI-1 -675 4G/5G, гена фактора I (фибриногена) - Fg G-455A, гена гликопротеина GPIIIa Т1565С, а также гена метилентетрагидрофолат редуктазы - MTHFR С677Т, ассоциированного с уровнем ГЦ в плазме крови. Проведенный анализ показал, что только двое больных ОААНК (один с ГГЦ, другой - без таковой) не являлись носителями ни одного из потенциально неблагоприятных аллелей по рассматриваемым генам.

Фермент метилентетрагидрофолат редуктаза является одним из ключевых ферментов в метаболизме ГЦ, выступая катализатором реакции восстановления 5,10-метилентетрагидрофолата до 5-метилтетрагидрофолата - донора одноугле-родной группы в реакции реметилирования гомоцистеина в метионин. Полиморфизм С677Т гена MTHFR, кодирующего данный фермент, в настоящее время активно изучается в связи с риском развития ГГЦ.

Сравнительный анализ средних концентраций ГЦ в группах пациентов с генотипами МТНРЯ 677СС, 677СТ и 677ТТ показал, что между носителями этих генотипов наблюдались статистически значимые различия по уровню ГЦ (р=0,0002), что свидетельствует о существенном влиянии полиморфизма С677Т на содержание ГЦ (рис 5). Самая высокая концентрация ГЦ отмечалась в группе лиц с генотипом 677ТТ, а самая низкая - в группе пациентов с 677СС генотипом. Разница между средними значениями концентраций ГЦ для гомозиготных вариантов "ДГЦ" - МТНРЯ 677ТТ против МТНП1 677СС - составила 6,38 мкмоль/л (р=0,04).

а-го о.

X

ш ZS X

о

■31

35 30 25 ■20 ■■ 15 -10 --

■15 с > с

1 J

—1—1—

сс ст тг

Генотип по MTHFR С677Т

Рис.5 Ассоциация между генотипами по полиморфному варианту MTHFR С677Т и концентрацией гомоцистеина (M±SD) у больных ОААНК.

Имеющиеся в литературе данные об ассоциации между полиморфизом MTHFR С677Т и уровнем ГЦ носят противоречивый характер. Согласно представленным в мета-анализе Lewis S. et al. результатам (Lewis S. et al., 2005), показатель "ДГЦ" может изменяться в пределах от -0,8 мкмоль/л (т.е. концентрация незначительно повышена в группе носителей MTHFR-677CC по сравнению с MTHFR 677ТТ генотипом) до 8,8 мкмоль/л (сильно выраженное различие по уровню ГЦ между лицами с гомозиготными генотипами). Такой разброс, прежде всего, может быть объяснен особенностями диеты в различных популяционных группах (в частности, различием в употреблении в пищу витаминов группы В). Полученный для изученной группы больных ОААНК и показатель "ДГЦ" (6,38 мкмоль/л) превысил аналогичные усредненные показатели для Америки, и для большинства европейских стран (Lewis S. et al., 2005). Данный результат может быть объяснен, прежде всего, несбалансированным питанием, характерным для

жителей Северо-Западного региона России и высокой частотой встречаемости такого неблагоприятного фактора, как регулярное курение, отмечавшегося среди наших больных в 61,7% случаев.

Следует отметить, что среди больных с ГГЦ носители аллеля Т (генотипы 677СТ, 677ТТ) были выявлены в 67,9% случаев. У оставшихся 32,1% пациентов повышенный уровень ГЦ был детерминирован либо другими наследственными, либо внешними (приобретенными) факторами риска, что указывает на необходимость определения содержания ГЦ в плазме крови наряду с типированием полиморфизма MTHFR С677Т.

Сравнительный анализ средних концентраций фибриногена у лиц с различными генотипами по полиморфизму Fg G-456A не выявил статистически значимых отличий в исследуемых группах пациентов (р=0,85).

Сравнительный анализ частот встречаемости генотипов по генам фактора V, фактора II, PAI-1, фибриногена, гена тромбоцитарного рецептора GPIIIa, метилен-тетрагидрофолат редуктазы между больными ОААНК и группой контроля выявил ряд особенностей. Так, у больных ОААНК была существенно повышена частота встречаемости генотипа 4G/4G по полиморфизму PAI-1 -675 4G/5G (46,7% против 34,8% в контроле), причем выявленная особенность являлась статистически значимой (р=0,04; OR=l,6; С1:1,05-2,57). Полиморфизм 4G/5G гена PAI-1 является наиболее активно изучаемой генетической детерминантой активности системы фибринолиза. В ряде исследований показано, что носительство аллеля 4G ассоциировано с повышенной экспрессией гена и, следовательно, с повышенным содержанием ингибитора активатора плазминогена-1 (PAI-1) в плазме крови, что приводит к снижению активности системы фибринолиза, и, следовательно, предрасполагает к развитию тромботических эпизодов (Perez-Martinez P. et al., 2007). Выявленная нами повышенная частота встречаемости носителей "неблагоприятного" 4G/4G генотипа у больных с ОААНК полностью согласуется с данной концепцией.

Обратили на себя внимание и особенности распределения частот генотипов по полиморфизму С677Т гена MTHFR у больных ОААНК. Так, частота встречаемости гетерозиготных носителей аллеля 677Т гена MTHFR была несколько выше в группе пациентов с ОААНК по сравнению с группой контроля (53,3% против 40,9%, р=0,30; OR=l,27; С1:0,81-1,98). В то же время, лица с генотипом MTHFR 677ТТ были выявлены среди больных ОААНК в 2,4 раза реже, чем в здоровой популяции (р=0,06; OR=2,56; С1:0,95-6,90). Выше было показано, что носительство генотипа MTHFR 677ТТ у лиц, проживающих в Северо-Западном регионе России, особенно при сочетании с внешними неблагоприятными факторами (например, курение), ассоциировано с существенным повышением содержания ГЦ в плазме крови. При длительном воздействии повышенных концентраций ГЦ на организм, патологические эффекты, ассоциированные с ГГЦ (усиление гемостатического потенциала крови с вовлечением в патологический процесс сосудистой стенки, склонность к развитию генерализованного атеросклероза и ретромбозов и т.д.) может приводить к большей частоте летальных исходов среди больных с MTHFR

677ТТ генотипом. Возможно, что именно с этим может быть связана выявленная недопредставленность в группе больных лиц с генотипом МТНРЯ 677ТТ. Однако, данное предположение требует дальнейшего тщательного анализа.

Анализ влияния генетики пациента на особенности клинического течения облитерирующего атеросклероза артерий нижних конечностей позволил выявить ряд закономерностей. Так, было показано, что в группе больных ОААНК с сопутствующей сосудистой патологией и/или перенесенными ранее тромботическими эпизодами частота встречаемости протромботического варианта ЯУ 1691 ОА была повышена в 4,1 раза по сравнению с больными без ретромбозов (8,5% против 2,0%, р=0,24; 011=4,4; С1:0,5-38,0). Носители протромботического генотипа РИ 20210 ОА были выявлены в 5,6 % случаев среди больных с сопутствующей сосудистой патологией и отсутствовали среди пациентов без таковой (р=0,14; ОИ.=6,6; 0:0,4-125,5). Статистической значимости выявленные различия не достигли, вероятно, в связи с малым числом больных с данными генотипами. Кроме того, у больных ОААНК с тромбозами и/или атеросклеротическим поражением иной локализации была отмечена большая частота встречаемости "неблагоприятного" генотипа 40АЮ гена РА1-1 по сравнению с пациентами без сопутствующей патологии (49,30% против 42,86%, р=0,58; 011=1,30; 0:0,62-2,70). При сравнении с группой контроля результат оказался статистически значимым (49,3% против 34,8%, р=0,03; ОЯ=1,8; С1:1,1-3,1).

Анализ распределения частот генотипов по рассматриваемым нами генам у больных ОААНК с учетом степени тяжести артериальной недостаточности показал, что наиболее существенные различия между группами пациентов с тяжелым и легким течением атеросклероза отмечались для полиморфизма МТНРЯ (С677Т) и РА1-1 (-675 40/50). Было выявлено, что среди больных с тяжелым течением ОААНК носители аллеля МТНРЯ 677Т встречались в два раза чаще по сравнению с больными с легким течением атеросклероза (68,1% против 33,1%, р=0,009; 011=2,8; С1:1,3-6,0) и существенно чаще, чем в здоровой популяции (68,1% против 50,9%, р=0,01; 011=2,1; С1:1,2-3,6). В группе больных с тяжелым течением атеросклероза была выявлена и самая высокая частота встречаемости генотипа РА1-1 40/40 (53,6%), против 37,3% - у пациентов с легкой формой ОААНК (р=0,09; 0я=2,0; 0:0,9-4,1) и 34,8% - в здоровой популяции (р=0,007; ОЯ=2,2; С1:1,3-3,7) (рис.6).

Аналогичный анализ, выполненный в отношении возраста дебюта заболевания показал, что в группе пациентов с более поздним дебютом заболевания отмечалась повышенная частота встречаемости носителей аллеля МТНРЯ 677Т по сравнению с больными более молодого возраста (62,0% против 42,9%, р=0,08; ОИ.=2,2; 0:0,9-5,1). Напротив, неблагоприятный генотип -675 40/40 гена РАМ несколько чаще был отмечен у больных с более ранним дебютом заболевания (50,0% против 45,7% у лиц с поздним дебютом, р=0,83; 011=1,19; С1: 0,51-2,78).

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

%

1

□ 4С/56+5С/56

□ 46/4в

ЛФ ТФ Больные ОААНК

КГ

Рис.6 Распределение генотипов по гену РАМ у больных атеросклерозом артерий

нижних конечностей с учетом тяжести заболевания.

ЛФ — легкая форма; ТФ - тяжелая форма; КГ - группа контроля.

Облитерирующий атеросклероз артерий нижних конечностей является мультифакторным заболеванием. В связи с этим, наряду с рассмотрением единичных генов, важным также представлялся и анализ их сочетаний, поскольку синер-гично действующие неблагоприятные генетические детерминанты могут существенно ухудшать клиническую картину развития заболевания, повышая вероятность перехода протромботического состояния в острый тромбоз. Анализ "ген-генных взаимодействий" выявил неблагоприятное генотипическое сочетание "МТЫИ*. 677СТ/РА1-1 40ЛЮ", частота встречаемости которого оказалась в 1,6 раза выше в группе больных ОААНК по сравнению с контролем (26,7% против 17,0%; р=0,03; СЖ=1,8; С1: 1,1-3,0). Напротив, некоторые генетические варианты значительно реже обнаруживались в группе больных, чем в контроле. Среди них -генотипические сочетания "МТНИ1 677СС/СРП1а 1565ТС" (8,3% против 16,5%, р=0,03; 011=0,5; С1:0,2-0,9); "МТНт 677СС/РА1-1 40/5С' (15,0% против 27,0%, р=0,01; 011=0,5; С1:0,3-0,9). Примечательно, что в состав всех указанных сочетаний входят различные генотипы гена МТНП1. Это еще раз подчеркивает значимость полиморфизма МТНП1 С677Т для риска развития ГГЦ и ОААНК в популяции Северо-Западного региона России. Таким образом, ГГЦ и наследственные факторы риска оказывают существенное влияние на риск развития и характер клинического течения ОААНК.

выводы

1. Гипергомоцистеинемия является значимым самостоятельным фактором риска облитерирующего атеросклероза артерий нижних конечностей. В обследованной группе больных ОААНК гипергомоцистеинемия (уровень ГЦ >13,4 мкмоль/л) выявлена в 46,7% случаев, по сравнению с 8,5% в контрольной группе (р<0,0001; ОЯ=5,5; С1:3,22-9,45).

2. Наличие ГГЦ ассоциировано с неблагоприятным клиническим течением атеросклероза артерий нижних конечностей (различия по уровню гомоцистеина между пациентами с тяжелой и легкой степенью заболевания статистически значимы, р=0,003) и развитием клинически значимого атеросклероза сосудов других органов и систем - ишемической болезнью сердца, атеросклерозом брахиоце-фальных артерий, ишемией внутренних органов (р=0,02; 011=2,7; С1: 1,25-5,69).

3. У больных ОААНК на фоне гипергомоцистеинемии происходит повышение активности протромбогенной составляющей и снижение активности атромбоген-ной компоненты системы свертывания крови, что усиливает смещение баланса системы гемостаза у пациентов с нарушенным обменом гомоцистеина в сторону гиперкоагуляции.

4. Концентрация циркулирующих эндотелиоцитов существенно повышена у больных ОААНК с гипергомоцисгеинемией, по сравнению с пациентами без таковой (р<0,0001).Увеличение числа циркулирующих эндотелиоцитов можно рассматривать как неблагоприятный прогностический маркер заболевания.

5. Полиморфизм МТИП* С677Т является важной генетической детерминантой уровня гомоцистеина у больных ОААНК.

6. К тяжелой форме течения ОААНК предрасполагает наличие в генотипе ал-леля Мтет 677Т (р=0,009; ОИ=2,8; С1:1,3-6,0) и/или варианта 40/40 гена РАМ (р=0,09; 011=2,0; С1:0,9-4,1). Носительство Лейденской мутации, а также генотип РА1-1 40АЮ являются неблагоприятными генетическими детерминантами, которые могут обусловливать артериальные тромбозы различной локализации у больных ОААНК.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1.Исследование уровня гомоцистеина рекомендуется проводить всем больным, страдающим облитерирующим атеросклерозом артерий нижних конечностей, целью прогнозирования тяжести клинического течения заболевания.

2. У больных облитерирующим атеросклерозом артерий нижних конечностей целесообразно определять содержание циркулирующих эндотелиоцитов, увеличение количества которых является дополнительным отражением негативного влияния гипергомоцистеинемии на эндотелий и состояние тромбоцитарного звена гемостаза.

3. Для прогнозирования тяжести течения заболевания и развития возможных тромботических осложнений у больных облитерирующим атеросклерозом артерий нижних конечностей рекомендуется проведение молекулярно-генетического исследования на наличие мутаций в генах факторов II и V свертывания крови, а также протромботических вариантов генов MTHFR (С677Т) и PAI-1 (-675 4G/5G).

СПИСОК ТРУДОВ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Дмитриева А.Р. Гипергомоцистеинемия как маркер неблагоприятного прогноза при облитерирующем атеросклерозе нижних конечностей / Дмитриева А. Р. // Медицинский академический журнал. - 2004. - Т. 4. - № 3. - С. 139 - 140.

2. Шмелева В.М. Влияние полиморфизма С677Т гена фермента метилентетра-гидрофолатредуктазы на уровень гомоцистеина плазмы у больных с тромботиче-скими заболеваниями /Шмелева В.М., Капустин С.И., Дмитриева А.Р. // Медицинский академический журнал. - 2003. - Т. 3. - № 3. - прил. 4. - С. 105 - 106.

3. Shmeleva V. С677Т substitution in the MTHFR gene is significant predictor of hyperhomocysteinemia in patients with thrombotic disorders in North-Western Russia /Shmeleva V., Kapustin S., Dmitrieva A., Sobzynka-Malefora A. , Harrington D. , Savidge G. // Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. - 2003. - Vol. 41. -№ 3. -P. A3 4-A3 5.

4. Шмелева В.М. Повышение уровня гомоцистеина - фактор привычного невынашивания беременности /ШмелеваВ. М., ДмитриеваА. Р., Папаян Л. П. // Забайкальский медицинский вестник. - 2004. - № 4. - С. 111 — 114.

5. Шмелева В.М. Гипергомоцистеинемия как маркер неблагоприятного прогноза при облитерирующем атеросклерозе нижних конечностей / ШмелеваВ. М., ДмитриеваА. Р. // Материалы Международного конгресса «Тромбоз, гемостаз и патология сосудов». - СПб. - 2004. - С. 120.

6. Shmeleva V. Hyperhomocysteinemia is a Significant Risk Factor for Recurrent early Pregnancy Loss in Russia / Shmeleva V., Dmitrieva A., Papayan L. // J. Thromb. &Haemost. - 2005. - Vol. 3. - Suppl. 1. - P. 2272.

АПТВ

АТ

ВАТ

ГГЦ

ГЦ

ДНК

ДЭК КГ КИК ОААНК

ПТ

ССЗ ХАН

чв

ЭДТА

CI

Fg

GPIIIa М

MTHFR

OR

РАН

SD

t-PA

VWF

VWF Ag

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

активированное парциальное тромбопластиновое время антитромбин

внутриеосудистая активация тромбоцитов

гипергомоцистеинемия

гомоцистеин

дезоксирибонуклеиновая кислота

десквамированные эндотелиальные клетки контрольная группа критическая ишемия конечностей

облитерирующий атеросклероз артерий нижних конечностей

протромбиновый тест сердечно-сосудистые заболевания хроническая артериальная недостаточность частота встречаемости этилендиаминтетрауксусная кислота доверительный интервал фибриноген гликопротеин Illa

средняя арифметическая величина статистической совокупности

метилентетрагидрофолаг редуктаза отношение шансов

ингибитор активатора плазминогена 1-го типа стандартное отклонение тканевой активатор плазминогена фактор Виллебранда антиген фактора Виллебранда

Подписано в печать «20 » марта 2013 г. Формат 60x84/16 Бумага офсетная. Печать офсетная. Тираж 60 экз. Заказ № 469

Типография «Восстания -1» 191036, Санкт-Петербург, Восстания, 1. 22