Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Влияние гепатопротекторов на течение хронического поражения печени тетрахлорметаном

РГ6 од

- 1 ЯНВ 1В96

На правах рукописи

БАТУРИНА НАТАЛИЯ ОЛЕГОВНА

ВЛИЯНИЕ ГЕПАТОПРОТЕКТОРОВ НА ТЕЧЕНИЕ ХРОНИЧЕСКОГО ПОРАЖЕНИЯ ПЕЧЕНИ ТЕТРАХЛОРМЕТАНОМ

14.00.25 - фармакология // 14.00.16 - патологическая физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Томск - 1995

Работа выполнена на кафедрах фармакологии и технологии лекарств Сибирского государственного медицинского университета

Научные руководители: заслуженный деятель науки РФ, акаде-

мик МАИ А.С.Саратиков

доктор медицинских наук, профессор А.И.Венгеровский

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

В.Г.Пашинский

доктор медицинских наук, профессор И.В.Суходоло

Ведущая организация: Кемеровский государственный медицинский институт

Защита диссертации состоится ^/^Уус?-^ 1996 года в /¿Р^чъй. на заседании диссертационного совета К 001. 33.01. при НИИ фармакологии ТНЦ РАМН (634028, г.Томск, пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ фармакологии ТНЦ РАМН

Автореферат разослан 1995г.

Ученый секретарь диссертационного совета, . "=—

ст. науч. сотрудник, кандидат биологических наук Горшкова В.К.

ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Заболевания печени и билиарной системы занимают значительное место в структуре заболеваемости населения, составляя более 40% в группах нозологических форм, относящихся к патологии пищеварительной системы. Термин "хронический гепатит" объединяет обширный круг воспалительных заболеваний печени различной этиологии. Наиболее частым этиологическим фактором является длительное воздействие на печень токсических агентов. В настоящее время в окружающей среде присутствуют около 80000 гепа-тотоксических ксенобиотиков, более 200 лекарственных соединений могут вызвать гепатотоксические эффекты [Логинов A.C., Блок Ю.Е., 1987; Арчаков А.И., Карузина И.И., 1988].

Арсенал эффективных средств для лечения хронических заболеваний гепатобилиарной системы весьма отграничен. В плане его расширения интерес представляют гепатопротекторы, действие которых направлено на нормализацию метаболизма, функции и структуры паренхимы печени. Гепатозащитный эффект присущ большому количеству лекарственных веществ, однако в клинической практике используют лишь легалон, катергсн, лив.52 и эссенциале. На кафедрах фармакологии и технологии лекарств Сибирского государственного медицинского университета выявлена высокая терапевтическая активность гепато-защитных средств: эплира (комплекс фосфолипидов, сульфолипидов, тиолов и каротиноидов илового осадка), салсоколлина (сухой экстракт травы интродуцированного сибирского растения солянка холмовая, содержащий бетаин, флавоноиды, стерингликозиды и алкалоиды) и максара (полифенолы древесины дальневосточного растения маакия амурская) при острых токсических гепатитах, вызванных у животных ССЬ, аллиловым спиртом, D-галактозамином и парацетамолом. Они в большей степени, чем эталоные гепатопротекторы эссенциале и легалон, оказывают антиоксидантное действие, ослабляют гинерфер-ментемию, нормализуют спектр мембранных фосфолипидов, стабилизируют лизосомы, улучшают биоэнергетику, экскреторную и антитоксическую функции печени [Саратиков A.C., Венгеровский А.И.,1995]. Поэтому представляет интерес изучение эффективности и механизма действия этих оригинальных гепатопротекторов при экспериментальном хроническом гепатите, в частности исследование их влияния на основной патологический процесс при хроническом поражении печени - формирование соединительной ткани внутри печеночных долек.

Цель работы. Экспериментальная оценка гепатозащитного действия оригинальных гепатопротекторов природного происхождения эплира, салсоколлина и максара для патогенетически обоснованной фармакотерапии хронического ССЦ -гепатита.

Работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательской работы Сибирского медицинского университета и комплексной

целевой программы СО РАМН "Здоровье человека в Сибири". Номер государственной регистрации темы 01. 85. 0069846.

Задачи исследований.

1. Оценить терапевтическую эффективность эплира, салсоколлина и максара в сравнении с действием эталонных препаратов эссенциале и легалона при экспериментальном хроническом поражении печени, вызванном у животных ССЬ.

2. Изучить влияние гепатопротекторов на структурно-метаболические изменения, нарушения белкового, углеводного и липидного обменов в печени и гиперферментемию при хроническом ССЬ-ге-патите.

3. Исследовать действие геиатозащитных средств на антитоксическую и экскреторную функции печени на фоне хронического ССЦ-гепа-тнта.

4. Установить влияние препаратов на перекисное окисление липи-дов и развитие соединительной ткани в печени в условиях длительной интоксикации ССЦ.

5. Выявить взаимосвязь между интенсивностью процессов липо-пероксидации, некроза и фиброгенеза при хроническом ССЬ-гепатите и действии гепатопротекторов.

Научная новизна работы. В результате проведенных исследований впервые выявлена гепатозащитная активность эплира, салсоколлина и максара при экспериментальном хроническом ССЬ-гепатите. Изученные гепатопротекторы подобно эссенциале и легалону уменьшают на фоне хронического токсического гепатита воспалительно-дистрофические нарушения в печени, препятствуют развитию некроза, цитолиза и холестаза вследствие мембраностабилизирующего действия и ингибирования перекисного окисления липидов. Препараты являются стимуляторами подавленной антитоксической и экскреторной функций печени. По терапевтической эффективности эплир, салсоколлин и максар не уступают легалону и эссенциале, а по действию на ряд показателей превосходят эти эталонные гепатопротекторы. Установлено, что при интоксикации ССЬ процессы липопероксидации, некроза и цитолиза являются важнейшими инициаторами фиброгенеза. Основной терапевтический эффект гепатопротекторов при хроническом поражении печени обусловлен уменьшением синтеза соединительной ткани и хронизации гепатита вследствие антиоксидантного и антинекротического влияния препаратов.

Практическая значимость работы. Полученные новые данные о ге-патозащитной активности эплира, салсоколлина и максара позволяют рекомендовать эти препараты в качестве гепатопротекторов при хронических поражениях печени.

Апробация и публикации. Материалы диссертационного исследования докладывались на 1-м съезде Российского научного общества фармакологов (Волгоград, 1995); 3-й начно-практической конференции

J

"Актуальные вопросы гастроэнтерологии" (Томск, 1995); заседании Томского отделения Всероссийского общества фармакологов (1995). По теме диссертации опубликовано 4 работы.

Основные положения выносимые па защиту.

1. Эплир, салсоколлин и максар подобно эссенциале и легалону оказывают гепатозащитное действие при экспериментальном хроническом CCU-гепатите.

2. Гепатопротекторы препятствуют дистрофии, некрозу гепатоци-тов, пролиферации фиброзной ткани, восстанавливают антитоксическую, экскреторную функции печени, оказывают антиоксидантное и мембраностабилизирующее действие в условиях хронического поражения печени, вызванного ССЦ.

3. Гепатопротекторы тормозят развитие соединительной ткани в печени вследствие ингибирования процессов липопероксидации, некроза и цитолиза гепатоцитов.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, посвященного механизму действия гепатопро-текторов и патогенезу ССЦ-гепатита, 7-и глав, отражающих результаты экспериментальных исследований. Работа изложена на 125 стр., иллюстрировала 5 таблицами и 6 рисунками. Библиография включает 276 источников, из них 122 зарубежных.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 1. Материал и методы исследования

В диссертации рассмотрено на модели хронического ССЦ-гепатита гепатозащитное действие природных препаратов эплира, максара и салсоколлина в сравнении с эффектами широко применяемых гепато-протекторов эссенциале и легалона.

ЭПЛИР ( аббревиатура от английских слов - extract polar lipids rock) - препарат, полученный в лаборатории геохимии НИИ химии нефти Сибирского отделения АН России, содержит полярные липиды озера Тухлое, которые сформировались из остатков планктонных микроорганизмов, переработанных донной шкрофлорой в условиях сильного сероводородного заражения. Эплир представляет собой порошок темно-коричневого цвета с специфическим бальзамическим запахом, не растворяется в воде, частично растворяется в гексане, бензоле, этаноле, диэтиловом эфире, растительных маслах, хорошо растворяется в хлороформе и диметилсульфоксиде; включает фосфолипиды (20%), каротины, ксантофиллы (8%), хлорины, хлорофиллы (22%), сульфолипиды (2%), тиоцикланы (7%), тиоалканы (5%), элементарную серу (17%), желчные кислоты (3%) и другие вещества. Среди фосфоли-пидов идентифицированы фосфатидилхолин (11%), фосфатидилэтано-

ламин (3%), кислые глицерофосфатиды (6%). Преобладающим пигментом является ß-каротин [ Буркова В.Н. и др., 1988].

САЛСОКОЛЛИН - водно-спиртовый экстракт травы интродуци-рованного растения Восточной Сибири солянки холмовой, полученный на кафедрах фармакологии и технологии Сибирского государственного медицинского университета. Экстракт выглядит как аморфный гигроскопичный светло-коричневый порошок с специфическим запахом; хорошо растворяется в воде; состоит из значительного количества неорганических солей калия, натрия, магния, кальция, алюминия, цинка (i0%), белков (1%), стеринов (ß-ситостерин, стигмастерин) (5%), присутствующих большей частью в составе гликозидов, полярных сапонинов (5%), неполярных сапонинов (1,5%), флавоноидов (2%), алкалоидов изохинолиновой структуры (0,2%), бетаина (7%) [Семенов A.A. и др.,1982; Чучалин B.C. и др.,1987; Сырчина А.И. и др., 1989].

МАКСАР - полифенольная фракция ядровой древесины маакии амурской, получена в лаборатории синтеза природных соединений Тихоокеанского института биоорганической химии Дальневосточного отделения АН России. Максар представляет собой порошок темно-коричневого цвета, обладающий специфическим бальзамическим запахом, без вкуса, не растворим в воде, растворим в этаноле, эфире. Среди полифенолов максара обнаружены изофлавоноиды, гидроксилиро-ванные стильбены и изофлавоностильбены. Изофлавоноиды представлены формонетином, пицитаинолом, генистеином, ретузином и 4,7-дигидрокси-3-метокси-изофлавоном; стильбены - развератолом, 3,3,4,5-тетрагидроксистильбеном. В растении присутствует уникальный изофлавоностильбен - маакиазин [Максимов О.Б. и др., 1985; Максимов О.Б. и др.,1987; Покушалова Т.В. и др., 1988].

Исследуемые препараты - эплир, салсоколлин и максар отличаются малой острой и хронической токсичностью, лишены аллергенных, им-мунотоксических, мутагенных, эмбриотоксических и тератогенных свойств. Эплир, салсоколлин и максар в дозах, существенно меньших, чем дозы эссенциале и легалона, при остром токсическом гепатите, вызванном введением крысам гепатотоксинов - CCU, парацетамола, ал-лилового спирта и D-галактозамина, препятствуют развитию структурно-метаболических нарушений в печени, интенсифицируют экскрецию бромсульфалеина, снижают проницаемость цитолеммы гепатоци-тов для диффузии в кровь трансаминаз, лактатдегидрогеназы, фосфо-липазы А, уроканиназы, повышают секрецию липопротеинов. В отличие от эссенциале эплир, салсоколлин и максар уменьшают активность щелочной фосфатазы в печени и крови и гипербилирубинемию. Максар сочетает' гепатозащитное действие с выраженным холеретиче-ским эффектом.

Механизм мембраностабилизирующего действия препаратов при остром токсическом гепатите обусловлен подавлением инициированной гепатотоксинами липопероксидации с потенцированием функции эндогенных липидорастворимых антиоксидантов и глутатионзависи-

мой антиперекисной системы гепатоцитов, а также восстановлением нормального фосфолипидного спектра мембран гепатоцитов [Венгеровский А.И., 1991; Власова Т.В.,1991; Саратиков A.C., Венгеровский А.И., 1995].

В качестве эталонных гепатопротекторов использовали эссенциале (ампулы, "Bosnalijek", Югославия) и легалон ( силимарин, "Madaus", ФРГ)- Эссенциале является комплексным препаратом, включающим фосфатидилхолин сои, ненасыщенные жирные кислоты (линолевая, линоленовая), пиридоксина гидрохлорид, цианокоболамин, никоти-намид, пантотенат натрия [Шманько В.В.,1987]. Легалон содержит полиоксифенилхроманоны силибинин, силидианин, силихристин, выделенные из семян расторопши пятнистой [ Димова П., Тасков М.,1987].

Эксперименты проводили в осенне-зимние сезоны на 200 нелинейных белых крысах - самцах массой 200-220 г. Животных содержали в условиях естественного светового цикла на стандартной диете. Исследования проводили в соответствии с Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных ( приказ МЗ СССР № 755 от 12.08.77). В каждую группу входило по 6-10 крыс.

Животным вводили внутрижелудочно ежедневно с помощью зонда изучаемые гепатопротекторы: эплир - в виде суспензии на растительном масле; легалон и максар - в виде суспензии на 1% крахмальной слизи, салсоколлин и эссенциале - в водном растворе. Дозы составляли для эплира 30 мг/кг, эссенциале - 60 мг/кг, салсоколлина - 100 мг/кг, максара и легалона - 200 мг/кг. В этих дозах препараты оказывают наиболее выраженный терапевтический эффект при остром ССЬ-ге-патите [Саратиков A.C.. Венгеровский А.И., 1994]. Наряду с гепаторо-текторами крысы получали внутрижелудочно CCU в дозе 2 мл/кг в виде масляного раствора 2 раза в неделю. Длительность эксперимента составляла 30 дней. Спустя сутки после последнего введения веществ животных декапитировали. У части из них предварительно определяли длительность гексеналового сна. Контрольным животным вводили по указанной схеме ССЦ и растворители гепатопротекторов.

Для оценки влияния гепатопротекторов на основные функции печени и патологические процессы, обусловливающие патогенез поражения органа тетрахлорметаном, использовали следующие методы исследования:

1. Выживаемость - количество животных, доживших до конца эксперимента, в процентах от числа животных, использованных в эксперименте.

2. Изменение массы тела животных за время эксперимента (в процентах к исходной массе).

3. Гексеналовая проба. После внутрибрюшинной инъекции гексе-нала в дозе 60 мг/кг (в виде 1% раствора) регистрировали длительность нахождения животных в боковом положении и отсутствия рефлекса переворачивания [Сперанский C.B., Крапива Г.Г.,1980].

b

4. Гистологическое строение печени. Кусочки органа фиксировали жидкостью Карнуа, проводили через спирты, целлоидин-касторовое масло, хлороформ и заливали в парафин. Срезы окрашивали гематоксилином Эрлиха-эозином и пикрофуксином по Ван-Гизон. С помощью окулярной сетки в 40 полях зрения измеряли площадь, занимаемую в печеночных дольках соединительной тканью, подсчитывали количество некротизированных гепатоцитов , имеющих ядра в состоянии лизиса, пикноза или безъядерных. РНК выявляли галло-цианином по Эйнарссону, сульфгидрильные группы - диоксидинаф-тилдисульфидом по Барнетту и Зелигману, гликоген - ШИК-реакцией по Мак-Манусу, кислые гликозаминогликаны (ГАГ) - ал-циановым синим по Стидмену [Автандилов Г.Г., Меркулов Г.А., 1969., Пирс Э., 1962]. Степень жировой дистрофии печени изучали гисто-химически с помощью окраски Суданом IV срезов, приготовленных на замораживающем микротоме из фиксированных 10% нейтральным формалином кусочков печени, проводили полуколичественную оценку содержания нейтрального жира [Венгеровский А.И., 1991].

5. Белок в сыворотке крови определяли биуретовым методом с использованием стандартного набора "Реахим" .

6. Глюкозу в сыворотке крови определяли ферментативио с использованием стандартного набора "Biotest" фирмы "Lachema"

7. Общие липиды сыворотки крови определяли спектрофотометри-чески по цветной реакции с фосфованилиновым реактивом с использованием стандартного набора "Biotest" фирмы "Lachema" [Колб В.Г., Камышников B.C., 1982].

8. Прямой и связанный билирубин в сыворотке крови измеряли спектрофотометрически по цветной диазореакции связанного пигмента с сульфаниловой кислотой с использованием стандартных наборов "Biotest" фирмы "Lachema" [ Чевари С. и др., 1983].

Коэффициент глюкуронирования билирубина вычисляли как отношение концентраций конъюгированного с глюкуроновой кислотой и общего пигмента [Крупникова Э.З., Сондоре В.Ю., 1973].

9. Активость ферментов печеночного происхождения в крови. Определяли спектрофотометрически сывороточную активность ферментов -индикаторов цитолиза и холестаза - аланинаминотрансферазы (AJIAT), аспартатаминотрансферазы (АСАТ) (набор "Реахим"), кислой фосфатазы (КФ) и щелочной фосфатазы (ЩФ) по методу Боданского [Колб В.Г., Камышников B.C., 1982].

10. Продукты перекисного окисления липидов выявляли в гомогена-тах печени. Малоновый диальдегид (МДА) исследовали реакцией с тиобарбитуровой кислотой. Скорость его образование регистрировали спектрофотометрически при стимуляции ПОЛ in vitro ионами Fe2+ и аскорбиновой кислотой [Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972]. Основания Шиффа выявляли в липидном экстракте [Folch 1. et al., 1957] гомогенатов печени на спектрофотометре "Chitachi-850" (Япония) [Tappel А., 1975].

11. Компоненты соединительной ткани в гомогенатах печени. Колла-геновые белки определяли по содержанию оксипролина в 3-х фракциях коллагена: нейтрально-солерастворимого, кислотнорастворимого и нерастворимого [Замараева Т.В., 1977], ГАГ в гомогенатах печени выявляли по методике Айала, Мура и Гссса в модификации Ларского [Мансурова И.Д., 1964].

12. Статистические методы анализа с использованием пакета прикладных комманд "StatgrafIca". Результаты обрабатывали по параметрическому критерию I Стьюдента с определением средней арифметической (М) и ее ошибки (ш) [Беленький М.Л.,1963]. При вычислении корреляционых связей использовали величину коэффициента корреляции [Поляков И.В., 1975; Григорьев С.Г. и др.,1992].

2. Результаты исследования и обсуждение

2.1. Влияние гепатопротекторов на структурно-метаболические нарушения при хроническом СС1 ггепатитс

Гепатозащитное действие эплира, салсоколлина, максара, эссенциа-ле и легалона исследовали в экспериментах на крысах с хроническим поражением печени, вызванном ССЦ. Критериями гепатозащитного эффекта препаратов служили выживаемость животных и показатели морфофункционального состояния печени. ССЦ уменьшал выживаемость животных до 60%. В результате терапии исследуемыми гепато-защитными средствами не наблюдалось гибели животных.

Структурно-метаболические нарушения при хроническом гепатите, вызванном длительным введением ССЦ, характеризовались диском-плексацией печеночных балок, белковой (зернистая, гидропическая), жировой дистрофией (3 балла) и колликвационным некрозом 8,2% ге-патоцитов (у интактных крыс - 0,9%) (рис.1) с уменьшением в их цитоплазме количества РНК, сульфгидрильных групп и исчезновением гликогена. Пролиферация фиброзной ткани и лимфоидно-гистио-цитарная инфильтрация не ограничивались портальными трактами, а распространялись по расширенным синусоидам. Соединительнотканные тяжи проникали вглубь долек на 1/3 длины печеночных балок. В зонах фиброза, занимавших 3,3% площади срезов (в норме на долю соединительной ткани приходилось 0,5%), выявлялись пролиферирую-щие фибробласты, новообразованные грубые, слабо окрашенные фуксином коллагеновые волокна и повышенное содержание кислых ГАГ.

Гепатопротекторы редуцировали возникающие при хроническом токсическом гепатите нарушения гистоархитектоники печени. У животных, защищенных исследуемыми препаратами от токсического действия ССЦ, печеночные балки имели правильное радиальное направление, белковой и жировой (1 балл) дистрофии подвергались лишь

единичные клетки неринортальной зоны ацинусов, содержание РНК, сульфгидрильных групп и гликогена в паренхиме возрастало до нормы. Лимфоидно-гистиоцитарные инфильтраты, фиброзные септы внутри долек отсутствовали, количество некротизированных гепато-цитов было практически таким же как у интактных животных, хотя портальные тракты сохранялись умеренно расширенными.

Пролиферация фиброзной ткани, представленной тонкими фукси-нофильными коллагеновыми волокнами и умеренным количеством кислых ГАГ, возникала в отдельных портальных трактах (0,55-0,75% площади срезов).

Гексеналовый сон у отравленных ССЦ крыс удлинялся с 26,5±1,6 мин (интактные животные) до 49,6±1,3 мин. Гексеналовая проба основана на том, что ксенобиотик инактивируется печенью с помощью микросомальной монооксигеназной системы. ССЦ-гепатит сопровождается ингибированием микросомальной монооксигеназной системы и значительно меньшим участием поврежденных гепатоцитов в окислении гексенала. Гепатопротекторы интенсифицируют функцию эндо-плазматического ретикулума (ЭПР), что проявляется укорочением гек-сеналового сна. У крыс, получавших эплир, эссенциале, салсоколлин, максар и легалон, гексеналовый сон сокращался до 21,6+0,9; 21,5±0,8; 32,4±0,9; 27,7±0,9; 25,0±1,0 мин соответственно. При этом эплир и эссенциале уменьшали продолжительность гексеналового сна в 2,3 раза, легалон - в 2 раза, максар - в 1,8 раза, салсоколлин - в 1,5 раза (статистически достоверно по сравнению с длительностью гексеналового сна при нелеченном хроническом ССЬ-гепатите). Легалон и максар нормализовали течение гексеналового сна, а эплир и эссенциале равноэффективно укорачивали его ниже уровня, регистрируемого у интактных животных (р<0,05).

Хронический ССЬ-гепатит характеризовался в наших экспериментах гипопротеинемией, гипогликемией и гиперлипидемией. В результате терапии исследуемыми гепатозащитными средствами в сыворотке крови не наблюдалось дефицита белка, глюкозы и избытка липидов, при этом в случае применения максара нормализовалось содержание белка и глюкозы, а эплир и салсоколлин оказывали нормализующее действие на уровень липидов.

Таким образом, гепатопротекторы препятствуют развитию дистрофии и некроза гепатоцитов, тормозят формирование внутридольково-го фиброза при экспериментальном хроническом ССЬ-гепатите. Препараты стимулируют антитоксическую функцию печени, улучшают углеводный, белковый и липидный обмен, нарушенные длительным введением ССЦ.

Количество некротизированных гепатоцитов

Г ** 7

ТЙР~ ^ *^ у

1лощадь фиброзной ткани в печеночной дольке

1 2 3 4 5 6 7

Рис.1. Влияние гепатопротекторов на гистологические показатели

печени крыс при хроническом ССЬ-гепатите 1- шгтактные животные; 2 - хронический ССЬ-гепатит; 3-7 - хронический ССЦ-гепатит + препараты: 3 - эплир; 4 - эссенциале; 5 - салсо-коллин; 6 - максар; 7 - легалон.

2.2. Влияние гепатопротекторов на гиперферментемию и нарушения экскреторной функции печени при хроническом СС1ггепатите у крыс

Для оценки эффективности и установления механизма действия ге-патозащитных средств на поврежденные мембраны гепатоцитов большое значение имеет определение активности ферментов, поступающих из печени кровь. Увеличение активности ферментов в сыворотке крови является объективным показателем поражения паренхимы печени. Ферментные тесты весьма чувствительны, поскольку концентрация ферментов в гепатоцитах значительно выше, чем в сыворотке крови. При повреждении гепатоцитов этот клеточно-плазматический градиент резко нарушается [Кавтиашвили К.Г., 1979].

В норме в небольших количествах в крови находятся индикаторные ферменты - трансаминазы (АЛАТ, АСАТ). АЛАТ присутствует в цитоплазме и сравнительно легко проникает в кровь, АСАТ, представленная цитоплазматическими и митохондриальными компонентами, элиминируется из печени с меньшей скоростью. При цитолизе паренхимы печени, сопровождающемся увеличением проницаемости клеточной мембраны гепатоцитов и мембран внутриклеточных органоидов, в циркуляторное русло транспортируются ферменты цитоплазмы, митохондрий, ЭГ1Р и лизосом [Хазанов А.И., 1988; Подымова С.Д., 1993]. КФ - фермент лизосомального происхождения, при повреждении мембраны лизосом вызывает некроз паренхимы печени и элиминируется в кровь. Экскреторным ферментом является ЩФ, которая представляет собой совокупность изоэнзимов разных тканей с преобладанием ферментов печеночного, костного и кишечного происхождения. Печеночные изоформы ЩФ выделяются в кровь в повышенных количествах при холестазе, вследствие увеличенного синтеза и затрудненной экскреции в желчь [Хазанов А.И., 1988].

В наших экспериментах ССЬ вызывал гиперферментемию, повышая активность АЛАТ в 1,4 раза, АСАТ и КФ - в 1,8 раза, ЩФ - в 1,6 раза (р<0,05 по сравнению с показателями интактных животных). Эплир, эссенциале, салсоколлин, максар и легалон в различной степени противодействовали выходу трансаминаз в кровь. Эссенциале, салсоколлин и максар нормализовали в сыворотке крови активность АЛАТ (р>0,05 по сравнению с интактным фоном), активность АСАТ снижали в 1,2-1,3 раза (р<0,05 по сравнению с активностью у нелеченных животных). Эплир и легалон статистически достоверно в равной степени ингибировали активность АЛАТ в 1,2-1,3 раза и АСАТ - в 1,1-1,2 раза (р<0,05 по отношению к активности при ССЬ-гепатите). Эссенциале, салсоколлин, максар и легалон нормализовали активность гидролитического некрозогенного фермента КФ (р>0,05 по сравнению с активностью интактных животных), эплир уменьшал активность КФ в сыворотке крови на 10% (р<0,05 относительно показателя при хроническом ССЦ-гепатите). Активность ЩФ нормализовал лишь эссенциале (р>0,05 по сравнению с активностью у интактных животных), эплир и салсоколлин снижали ее на 30%, а легалон уменьшал выход этого фермента в кровь на 10% (р<0,05) (табл.1).

Таким образом, мембраностабилизирующий эффект присущ всем исследуемым гепатопротекторам. Наиболее эффективными препаратами являются эссенциале, салсоколлин и максар. Эплир и легалон меньше препятствуют гипертрансаминаземии, легалон слабее других веществ тормозит выход ЩФ.

Одним из важных механизмов лечебного действия гепатопротекто-ров является коррекция нарушений экскреторной функции печени, которые возникают при токсических поражениях органа в виде торможения захвата билирубина гепатоцитами, нарушения конъюгации его с глюкуроновой кислотой и транспорта в желчь. Явление холестаза

Таблица 1. Влияние гепатозащитных средств на биохимические показатели сыворотки крови при

хроническом ССЬ-гепатите (М+ш; п=6).

Показатель Инактные животные Хронический ССЬ-гепатит Гепатопротекторы при хроническом ССЦ-гепатите

эплир эссенциале салсоколлии максар легален

Аланинамино-трансфера-за,мккат/л 1,37±0,07 1,94±0,05* 1,7410,04* 1,46±0,07*х 1,41 ±0,06*х 1,53±0,07*х 1,67±0,04*

Аспартат-аминотрансфера-за,мккат\л 0,53±0,03 0,95+0,04* 0,84±0,01* 0,69±0,03* 0,74±0,04* 0,75±0,03* 0,82±0,02*

АСАТ/АЛАТ 0,39 0,49 0,48 0,47 0,52 0,49 0,49

Кислая фосфата-за, мкмоль/л за 1 ч 0,93±0,07 1,67±0,02* 1,56±0,03* 0,88±0,04*х 0,96±0,05*х 0,96±0,04*х 0,93±0,03*х

Щелочная фос-фатаза, мкмоль/л за 1ч 4,44±0,11 7,47±0,13* 5,75±0,12* 4,82±0,24*х 5,68±0,17* 4,61±0,17*х 6,89±0,16*

Билирубин, мкмоль/л общий непрямой 24,6+1,4 6,5±0,4 34,4±1,0* 14,0±0,3* 26,7±1,1* 7,5±0,5* 25,1±1,2*х 5,4±0,3*х 26,1±0,7*х 5,3±0,4*х 26,3±1,2* 7,7±0,3* 25,6±1,3*х 5,6±0,5*х

Примечание: * - р<0,05 по сравнению с интактиыми животными для хронического ССЦ-гепатита и с ССЦ-гепатитом для препаратов; X - р>0,05 по сравнению с интактными животными для препаратов.

обусловлено деструкцией мембран синусоидного и билиарного полюсов, а также повреждением ЭПР, митохондрий, лизосом и других органоидов печеночных клеток [Хазанов А.И., 1988].

При нарушении экскреторной функции печени билирубин не может быть выведен из организма, а накопление его в гепатоцитах приводит к отравлению. По нашим данным длительное введение ССЦ вызывало рост концентрации общего билирубина в 1,4 раза, непрямого билирубина - в 2,2 раза. При поражении печени резко изменялось соотношение между свободным (непрямым) и связанным (прямым) билирубином. Как известно, в норме на долю связанного билирубина приходится 75-80% общего количества пигмента [Крупникова Э.З., Соодоре В.Ю., 1973]. В наших экспериментах коэффициент глюкуро-нирования билирубина, вычисленный в процентах как отношение концентраций связанного и общего пигмента, составлял у интактных животных 73,6%. При отравлении ССЦ этот показатель снижался до 59,3 %.

Все исследуемые препараты уменьшали вызванные ССЦ нарушения экскреторной функции печени. Эссенциале, салсоколлин и легален нормализовали концентрацию общего и свободного билирубина в сыворотке крови (р>0,05 но сравнению с интактным фоном). Эплир и максар в равной степени в 1,3 раза уменьшали количество общего билирубина (р<0,05 относительно показателя при хроническом ССЦ-гепатите). Исследуемые препараты активировали ферменты глю-куронирования билирубина, угнетенные гепатотоксином. Эплир и максар повышали коэффициент связывания билирубина до 70,3-71,9%), эссенциале, салсоколлин и легалон - до 78,1-79,7%, что выше определенного нами коэффициента глюкуронирования у интактных животных.

Таким образом, важным механизмом гепатозащитного действия препаратов при хроническом ССЦ-гепатите является предотвращение развития синдромов цитолиза и холестаза вследствие мембраностаби-лизурующего действия препаратов, а также нормализация активности ферментов глюкуронирования билирубина.

2.3. Влияние гепатопротекторов на перекисное окисление липидов при хроническом СС1 ¿-гепатите

Все исследованные нами гепатозащитные средства проявляют свойства прямых антиоксидантов при остром ССЦ-гепатите - инак-тивируют свободные радикалы и тормозят перекисное окисление поли-еновых жирных кислот мембранных фосфолипидов в клетках печени. Онаружение антиоксидантных свойств гепатопротекторов при хроническом поражении печени может объяснить их влияние на другие виды метаболизма и фиброгенез. ПОЛ играет существенную роль в нормальной жизнедеятельности клеток и участвует в патогенезе пораже-

ния печени различного типа. При этом в мембранах происходит сво-боднорадикальное цепное окисление жирных кислот с одной, двумя и тремя двойными связями с образованием перекисей и гидроперекисей. В паренхиме печени имеется достаточно высокий уровень субстратов перекисного окисления [Саватеев Н.В., 1985].

Интенсивность ПОЛ в биомембранах печени определяется как скоростью образования инициаторов переокисления - свободных радикалов, так и функционированием антиоксидантных систем гепатоцитов. При ССЬ- гепатите происходит усиление процессов липопероксидации на фоне ингибирования эндогенных антиоксидантов. Продукты биотрансформации ССЦ - свободные радикалы активируют ПОЛ в ЭПР и митохондриях. В ЭПР печени образуются трихлорметилпероксильные радикалы, взаимодействующие с липидами и способствующие накоплению диеновых конъюгатов - гидроперекисей с двумя ненасыщенными связями, которые легко подвергаются преобразованию в более устойчивые вторичные продукты ПОЛ [Воскресенский О.Н., Левицкий А.П., 1970; Козлов Ю.П. и др., 1976; Бащеу К., 1981]. Взаимодействие альдегидов, возникающих в ходе ПОЛ, с белками, аминокислотами и фосфолипидами ведет к образованию оснований Шиффа. При окислении гидроперекисей линолевой и арахидоновой кислот образуется малоновый диальдегид (МДА) цветной реакцией с 2-тиобарбитуровой кислотой [Воскресенский О.Н., Левицкий А.П.,1970; Арчаков А.И., Карузина И.И., 1973].

В наших экспериментах ССЦ при введении в течение 30 дней (табл.2) повышал в гомогенатах печени содержание оснований Шиффа в 2,3 раза, ускорял образование МДА в реакциях, катализирующихся аскорбатом и восстановленным НАДФ, в 9,5 и 4,2 раза соответственно. Исследуемые препараты ингибировали процессы ПОЛ. При введении всех гепатопротекторов на фоне хронического ССЦ-гепагита наблюдалась нормализация содержания оснований Шиффа в гомогенатах печени крыс. У животных, получавших салсоколлин, нормализовалось образование МДА, индуцированное НАДФ.Н (р>0,05 по сравнению с скоростью в интактной группе), и уменьшалась интенсивность образования аскорбатзависимого МДА в 4,4 раза по сравнению с показателем при нелеченном хроническом ССЬ-гепатите (р<0,05). Эс-сенциале, легалон и максар равноэффективно ингибировали накопления аскорбатзависимого МДА в 2,7-3 раза. Продукцию НАДФ.Н-зависимого МДА эплир и легалон уменьшали в 2,3-2,4 раза, а эссен-циале и максар - в 2,7-2,8 раза (р<0,05).

Таким образом, наибольшей способностью тормозить ПОЛ в мембранах гепатоцитов обладал салсоколлин, нормализовавший содержание в печени оснований Шиффа и скорость образования НАДФ.Н-индуцированного МДА, и в большей степени, чем другие препараты, уменьшавший скорость образования МДА, индуцированного аскорбиновой кислотой. Максар в равной степени с эталонными гепатопро-текторами эссенциале и легалоном ингибировал накопление продуктов

Таблица 2. Влияние гепатопротекторов на процессы перекисного окисления липидов при хроническом ССЦ-гепатите (М±ш; п=6).

Показатель Интакгные животные Хронический сси-гепатнт Гепатопротекторы при хроническом ССЬ-гепатите

эплнр эссенциале салсоколлин максар легалон

Основания Шиффа, УЕ/мг печени 3,19±0,42 7,38±1,03* 3,90±0,3*х 4,16±0,25*х 3,11+0,20*х 3,67±0,20*х 4,30+0,20*х

Аскорбат-зависимый МДА, мкмольна 1 г белка за 1 мин 0,39±0,08 3,70±0,90* 1,57+0,13* 1,36+0,11* 0.84±0,12* 1,21±0,1Г 1,39±0,15 *

НАДФ.Н зависимый МДА, мкмоль на 1 г белка за 1 мин 1,50+0,08 6,34±0,20* 2,77±0,16* 2,34+0,10* 1,85+0,81*х 2,29±0,17* 2,64±0,13*

Примечание: * - р<0,05 по сравнению с интактными животными для хронического СС1-К епатита и с ССЦ-гепатитом для препаратов; Х- р>0,05 по сравнению с интактными животными для препаратов.

ПОЛ в печени крыс, отравленных ССЦ (р>0,05 по сравнению с эссен-циале и легалоном). Эплир при этом, уступая эссенциале, но равноэф-фективно с легалоном, препятствовал ускорению образования НАДФ.Н-зависимого МДА, а продукцию аскорбат-зависимого МДА снижал равноэффективно с эталонными гепатопротекторами, хотя и слабее максара и салсоколлина (р<0,05 по сравнению с этими препаратами).

Угнетение гепатопротекторами процессов ПОЛ обусловлено химической природой соединений. Растительные полифенолы, включая флавоноиды салсоколлина, максара, флаволигнаны легалона, проявляют антирадикальную активность в процессе обратимого окисления восстановленных фенольных форм в хиноны. Полифенолы, обладающие липофильностью, встраиваются в мембраны гепатоцитов и угнетают в них процессы липопероксидации, превращая гидроперекиси полиеновых жирных кислот в нетоксичные оксикислоты с обрывом цепей ПОЛ. Кроме того, фенолы образуют хелатные комплексы с ионами железа и выключают эти катализаторы из реакций свободнора-дикального окисления [Сыров В.Н. и др., 1987].

Фосфолипиды и каротиноиды (в наибольшем количестве в эплире присутствует p-каротин) также проявляют антиоксидантную активность. Фосфолипиды, как структурные антиоксиданты, способствуют стабилизации мембран, ограничивают доступ свободных радикалов внутрь мембран к полиеновым жирным кислотам. Каротиноиды приобретают свойства ингибиторов свободных радикалов после превращения в организме в витамин А [Буркова В.Н. и др., 1988].

Таким образом, гепатопротекторы при хронической интоксикации ССЬ ингибируют образование вторичных продуктов липопероксидации (оснований Шиффа и МДА) в гепатоцитах. Следствием ингиби-рования ПОЛ является мембраностабилизирующее действие препаратов, что проявляется антинекротическим эффектом и снижением проницаемости мембраны для цитолитических (АСАТ, АЛАТ, КФ) и холестатических (ЩФ) ферментов.

2.4. Влияние гепатопротекторов на образование компонентов соединительной ткани

При хроническом поражении печени происходит активная продукция коллагена. В онтогенезе рассматривают несколько возрастных типов коллагена, характеризующихся различной организацией. Макромолекулы коллагена (тропоколлаген) представляют собой мономерные единицы, состоящие из трех спирализованных полипептидных цепей, которые, в свою очередь, закручены друг около друга.

Коллагеновая фибрилла возникает в результате агрегации макромолекул коллагена, происходящей в двух направлениях: латерально, бок о бок, линейно и конец к концу. Фибриллы, объединяясь, образуют прочные коллагсновые волокна. По мере увеличения числа и прочности межмолекулярных связей, растворимость коллагена снижается. Наиболее легко переходят в раствор щелочнорастворимая и нейграль-но-солерастворимая формы коллагена, макромолекулы в которых между собой практически не связаны. Затем формируются кислотно-растворимые или растворимые в кислом цитратном буфере фракции. В них макромолекулы связаны между собой в основном электростатически, поскольку эти связи разрываются и кислой среде. Нерастворимый коллаген может быть переведен в раствор при условиях, вызывающих гидротермическое или химическое сокращение коллагеновых волокон. В нерастворимых фракциях макромолекулы коллагена связаны между собой ковалентными связями [Утевская Л.А., 1970; Мазуров В.И., 1974; Серов В.В., Шехтер А.Б., 1981].

Наличие в коллагене характерной только для него аминокислоты -оксипролина делаег доступным изучение процессов синтеза и распада этого основного белка соединительной ткани. В наших экспериментах хроническое введение ССЦ вызывало увеличение содержания оксипролина в нейтрально-солерастворимой, кислотнорастворимой и нерастворимой фракциях коллагена в 1,3; 1,9 и 1,7 раза соответственно (рис.2).

Исследуемые гепатопротекторы предотвращали образование коллагена в печени. У крыс с хроническим ССЦ-гепатитом, леченных всеми препаратами, количество оксипролина в нейтрально-солерастворимой фракции коллагена становилось равным уровню, регистрируемому у интактных животных. Эплир, салсоколлин, максар и легалон в 1,3-1,6 раза уменьшали переход иейтрально-солерастворимого коллагена в кислотнорастворимый, эссенциале достоверно снижал количество последней фракции коллагена на 10% (р<0,05 по отношению к показателю у крыс, отравленных ССЦ). Препараты предотвращали образование не только молодых, но и зрелых типов коллагена. Максар препятствовал формированию нерастворимого коллагена таким образом, что его содержание в печени не отличалось от уровня интактных животных (р>0,05). Равноэффективными являлись эссенциале и салсоколлин, снижавшие количество оксипролина в нерастворимой фракции коллагена в 1,5 раза; эплир уменьшал созревание нерастворимого коллагена в 1,4 раза, а легалон - в 1,2 раза по сравнению с величиной при нелеченном ССЦ-гепагите (р<0,05).

Клеточные и волокнистые элементы соединительной ткани погружены в основное вещество, главными химическими компонентами которого являются белково-полисахаридные комплексы - протеогликаны и гликопротеины. Гликозаминогликаны (ГАГ) (углеводные компоненты протеогликанов) представляют собой линейные полимеры, построенные из повторяющихся дисахаридных единиц, каждая из ко го-

Гликозаминогпиканы

200 160 120 80 40' О-

Оксипролин нейтрально-солерастворимого коллагена

200 160 120 80 40-О-

Оксипролин кислоторастворимого коллагена

Оксипролин кислотоустойчивого коллагена

1 2 3 4 5 6

Рис.2. Влияние гепатопротекторов на содержание компонентов фиброзной ткани в гомогенатах печени крыс при хроническом ССЦ-гепатите

1 - хронический ССЦ-гепатит; 2 -6 - хронический ССЦ-гепатит + препараты: 2 - эплир; 3 - эссенциале; 4 - салсоколлин; 5 - максар; 6 - легалон.

рых содержит гсксозамин и гексуроновую кислоту (или галактозу). В спектре ГАГ преобладает гиалуроновая кислота [Мазуров В.И., 1974; Ерзикян K.J1., Трапков В.А., 1988].

ССЦ при длительном введении крысам повышал уровень ГАГ в печени в 2 раза. Гепатопротекторы в условиях хронического гепатита уменьшали их содержание . Салсоколлин, эссенциале и легалон нормализовали количество ГАГ (р>0,05 по сравнению с показателем интакт-ных животных), эплир снижал его в 1,8 раза, максар - в 1,7 раза по сравнению с величиной при хроническом ССЦ-гепатите (р<0,05).

Таким образом, исследуемые препараты предотвращают накопление коллагена и ГАГ, характерного для хронического поражения печени.

Для изучения связи интенсивности фиброгенеза в печени с другими патологическими процессами при хроническом ССЦ-гепатите и лечении гепатопротекторами нами был проведен анализ соответствующих корреляционных связей [Поляков И.В., 1975].

Данные литературы свидетельствуют о корреляции между процессами липопероксидации, некроза и образованием соединительной ткани в печени [Tappel А.,1975; Schriever Н. и. а.,1979; Ки D.,Billings R.,1984], Нами установлены умеренные и сильные корреляционные связи между процессами ПОЛ (содержание оснований Шиффа и скорость образования аскорбат- и НАДФ.Н-индуцированного МДА), развитием некроза в паренхиме печени (активность КФ в сыворотке крови, количество некротизированных гепатоцитов в печеночной дольке), с одной стороны, и развитием соединительной ткани в печени (содержание ГАГ и оксипролина различных фракций коллагена в го-могенатах печени и площадь печеночной дольки, пораженной фиброзом), с другой. Все исследованные гепатопротекторы (эплир, эссенциале, салсоколлин, максар и легалон) проявляют антиоксидантные и антинекротические свойства, которые коррелируют со способностью препаратов тормозить формирование фиброза в печени.

При этом в условиях терапии растительными препаратами поли-фенольной природы салсоколлином, максаром и легалоном наблюдается более четкая корреляция между показателями, отражающими активность некротических изменений и липопероксидации, и интенсивностью фиброгенеза. В результате терапии легалоном и максаром практически все связи имеют умеренный и сильный характер. При применении препаратов фосфолипидной природы эссенциале и эплира возникают более четкие корреляционные отношения между влиянием веществ на ПОЛ и фиброгенез.

Таким образом, гепатопротекторы являются средствами патогенетической терапии хронических заболеваний печени. Препараты этой фармакологической группы редуцируют возникающие в ходе длительного введения ССЦ структурно-метаболические нарушения, изменения белкового, углеводного и липидного обмена, проявления цитолиза и холестаза. Важнейшими метаболическим эффектами гепатопротекто-

ров при хронических токсических поражениях печени являются коррекция нарушенной антитоксической функции печени, уменьшением процессов липопероксидации и фиброгенеза.

Выводы

1. Оригинальные гепатозащитные средства эплир (комплекс полярных липидов илового осадка), салсоколлин (сухой экстракт интроду-цированной солянки холмовой) и максар (комплекс полифенолов ма-акии амурской) при хроническом ССЦ-гепатите у крыс препятствуют структурно-метаболическим нарушениям в печени - диском-плексации печеночных балок, развитию белковой, жировой дистрофии, колликвационного некроза гепатоцитов, пролиферации фиброзной ткани.

2. В условиях хронического ССЦ-гепатита эплир, салсоколлин и максар интенсифицируют антитоксическую функцию печени, укорачивая продолжительность гексеналового сна, а также уменьшают гипергликемию, гиперлипидемию, гипопротеинемию и гиперферментемию (трансаминазы, кислая и щелочная фосфатазы).

3. Гепатопротекторы в условиях длительной интоксикации ССЦ препятствуют развитию гипербилирубинемии, ускоряют обезвреживание б!ширубина и его выведение с желчью.

4. Рассматриваемые препараты являются ингибиторами свободнора-дикальных реакций, они уменьшают образование токсических продуктов липопероксидации - аскорбатзависимого и НАДФ.Н-индуциро-ванного МДА и оснований Шиффа.

5. Гепатопротекторы при хроническом поражении печени ССЦ препятствуют развитию соединительной ткани в печеночных дольках, ин-гибируя синтез гликозаминогликанов и оксипролина различных фракций коллагена.

6. Эплир, салсоколлин и максар по гепатозащитной активности при хроническом ССЦ-гепатите не уступают, а по влиянию на ряд показателей превосходят эталонные гепатопротекторы эссенциале и легален.

7. При хроническом ССЦ-гепатите и на фоне его терапии гепатопро-текторами установлены положительные корреляционные связи между активностью липопероксидации, количеством некротизированных гепатоцитов, с одной стороны, и интенсивностью фиброгенеза в печени, с другой.

Список работ, опубликованных но теме диссертации:

1. Влияние гепатопротекгоров на развитие цитолиза и холесгаза при хроническом экспериментальном гепатите // Сборник трудов аспирантов и соискателей Сибирского медицинского универистста "Молодые ученые теориии и практике медицины". - 1995. - С. 18.

2. Влияние гепатопротекторов на развитие фиброза при хроническом токсическом поражении печени // Сибирский журнал гастроэнтерологии и гепатологии. - 1995. - N1. - С.34.

3. Терапевтическая эффективность и механизм действия природных гепатозащитных средств // Сб. тезисов 1-го съезда Российского научного общества фармакологов "Фундаментальные исследования как основа создания лекарственных средств". - Волгоград, 1995. - С.77 (совместно с

A.И.Венгеровским, Т.П.Прищеп, В.С.Чучалиным, И.М.Седых).

4. Гепатозащитное действие препаратов растительного происхождения при экспериментальном хроническом гепатите // Растительные ресурсы. -1995. - Вып,31, N4. - С. 94-97 (совместно с А.И.Венгеровским,

B.С.Чучалиным, А.С.Саратиковым).